Pharmakologie der ADP-Rezeptoren auf humanen Thrombozyten
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(v/v) Essigsäure kurz angefärbt und <strong>der</strong> Hintergrund durch Schwenken in deionisiertem Wasser<br />
entfärbt. Nach erfolgter Dokumentation mittels Fotokopie werden die Proteine in PBS vollständig<br />
entfärbt.<br />
Ponceau-S Lösung:<br />
0,1% Ponceau-S in 5% Essigsäure<br />
PBS, pH 7,4:<br />
NaH2PO4 pH 7,4 10 mM<br />
Na2HP04, pH 7,4 10 mM<br />
NaCl 150 mM<br />
3.6.4 Absättigung unspezifischer Bindungsstellen<br />
Die unspezifischen Bindungsstellen werden durch Inkubation <strong>der</strong> Nitrocellulose in Blockmedium für<br />
mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur abgesättigt.<br />
Blockmedium:<br />
1% Rin<strong>der</strong>-Hämoglobin in PBS-TT<br />
PBS-TT:<br />
0,05% Tween und 0,3% Triton X 100 in PBS (s.o.)<br />
3.6.5 Inkubation mit spezifischen Antiseren<br />
Die geblockten Nitrocellulosen werden mit in Blockmedium verdünnten Antiseren (Konzentrationen<br />
siehe Tabelle 3) für mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schwenken inkubiert.<br />
Daran anschließend werden die Nitrocellulose-Filter fünfmal mit PBS-TT für jeweils 5 Minuten<br />
gewaschen.<br />
3.6.6 Nachweis <strong>der</strong> Proteine<br />
3.6.6.1 Nachweis durch jodiertes Protein A bzw. jodierte Anti-Maus-Antikörper<br />
Der Nachweis von polyklonalen Anti-VASP-Antikörper M4 erfolgt durch 125 Jod-Protein A (3,7 kBq/ml<br />
Blockmedium), <strong>der</strong> von monoklonalem Anti-Phospho-VASP-Antikörper 16C2 durch 125 Jod-Schafanti-Maus-Antikörper<br />
(7,4 kBq/ml Blockmedium). Dazu werden die Nitrocellulosen mit den in<br />
Blockmedium verdünnten 125 Jod-markierten Proteinen für 60 Minuten bei Raumtemperatur<br />
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