Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen
mit Hilfe von überkritischem Kohlendioxid
zur Bestimmung von Pflanzenbehandlungsmitteln
und anderen Bestandteilen
Abschlußbericht
M. Anastassiades
15. Nov. 1995 bis 15. Aug. 1998
Chemisches- und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Inhaltsverzeichnis
0. ZUSAMMENFASSUNG 6
1. EINLEITUNG 9
1.1 ZIELSETZUNG 9
1.2 APPARATIVE VORAUSSETZUNGEN 9
1.3 SFE ALS ALTERNATIVE ZU HERKÖMMLICHEN EXTRAKTIONSVERFAHREN 9
2. DAS EXTRAKTIONSVERFAHREN 11
2.1 EINFÜHRUNG IN DIE SFE 11
2.2 PHYSIKALISCHE GRUNDLAGEN DES VERFAHRENS 13
2.3 MÖGLICHKEITEN ZUR OPTIMIERUNG VON SFE-EXTRAKTIONEN 14
2.3.1 DIE ROLLE DER TEMPERATUR 15
2.3.2 DIE ROLLE DES DRUCKES 15
2.3.3 DIE ROLLE DER MATRIX 15
2.3.4 DIE ROLLE VON MODIFIERN 16
2.4 AUFBAU EINES SFE-EXTRAKTORS 16
2.5 ABLAUF EINER EXTRAKTION 17
2.6 ENTWICKLUNG EINER SFE-METHODE 18
2.6.1 PROBENVORBEREITUNG 18
2.6.2 GERÄTEEINSTELLUNGEN - OPTIMIERUNG DER EXTRAKTIONSBEDINGUNGEN 19
3. APPLIKATIONEN 20
3.1 ANALYTIK VON PFLANZENSCHUTZMITTELRÜCKSTÄNDEN IN OBST UND GEMÜSE 20
3.1.1 EINLEITUNG 20
3.1.2 OPTIMIERUNG DER MEßBEDINGUNGEN 22
3.1.2.1 Wahl des Einspritz- und Detektionsystems 22
3.1.2.2 Einflüsse des Injektionssystems und „Matrixeinflüsse“ 24
3.1.2.3 Berücksichtigung der „Matrixeinflüsse“ bei der Bestimmung 29
3.1.3 OPTIMIERUNG DER PROBENVORBEREITUNG 32
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2

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3.1.3.1 Zerkleinerung (Erzeugung repräsentativer Teilproben) 32
3.1.3.2 Entfernung bzw. Immobilisierung von Wasser 35
3.1.3.2.1 Wasserentfernung durch Gefriertrocknung 35
3.1.3.2.2 Wasserbindung durch Adsorbentien 35
3.1.4 SFE-MULTIMETHODEN FÜR PESTIZIDE IN OBST UND GEMÜSE 36
3.1.4.1 Optimierung der Extraktionsbedingungen 36
3.1.4.2 Durchführung der Multimethode 39
3.1.4.3 Wiederfindungsversuche 41
3.1.4.3.1 Vorgehensweise bei Dotierungen 41
3.1.4.3.2 Wiederfindungen mit HP 7680T 41
3.1.4.3.3 Wiederfindungen mit ISCO SFX 3560 46
3.1.4.4 Nachweis- und Bestimmungsgrenzen 47
3.1.4.5 Methodenvergleich 48
3.1.4.6 Matrixbezogene Multimethoden 51
3.1.4.6.1 Pestizide in Zitrusfrüchten 51
3.1.4.6.2 Pestizide in Kernobst 54
3.1.4.6.3 Pestizide in Beerenobst 55
3.1.4.6.4 Pestizide in Tafeltrauben 56
3.1.4.7 Einflüsse verschiedener Parameter auf die Extraktionsausbeuten 59
3.1.4.7.1 Einfluß der Zerkleinerung auf die Probenhomogenität 59
3.1.4.7.2 Einfluß der Polarität der Analyten auf die Extrahierbarkeit 59
3.1.4.7.3 Einfluß des Wassergehaltes auf die Extrahierbarkeit unpolarer Analyten 60
3.1.4.7.4 Abbau von Pestiziden während der Lagerung im Autosampler 62
3.1.5 ENTWICKLUNG VON SCHNELLEN BESTIMMUNGSMETHODEN FÜR SPEZIELLE
PESTIZIDKLASSEN MIT ANALYTISCHEN DEFIZITEN 64
3.1.5.1. Einleitung 64
3.1.5.2 Naßchemische Untersuchungen im Vorfeld 65
3.1.5.2.1 Rolle des pH-Wertes bei Extraktion und Flüssig-Flüssig-Verteilung 65
3.1.5.2.2 Wechselwirkungen von Wirkstoffen mit Oberflächen 65
3.1.5.3 Pestizide mit basischen Eigenschaften 70
3.1.5.3.1 Einfluß des pH-Wertes auf die Extrahierbarkeit (vgl. Kap. 3.1.4.7.2) 70
3.1.5.3.2 Carbendazim, Benomyl und Thiophanat-Methyl 73
3.1.5.3.2.1 Umwandlung von Benomyl zu Carbendazim 74
3.1.5.3.2.2 Thiophanat-Methyl 76
3.1.5.3.2.3 Derivatisierung von Carbendazim mit PFB-Br im GC-Vial 81
3.1.5.3.2.4 Bestimmung mittels GC-MSD 81
3.1.5.3.2.5 Validierung 82
3.1.5.3.2.6 Extraktion von „gewachsenen“ Carbendazim-Rückständen aus
Keltertrauben 83
3.1.5.3.2.7: SFE- und DFG-Methode zur Bestimmung der Carbendazim-Gruppe im
Kostenvergleich 84
3.1.5.4 Saure Pestizide 86
3.1.5.4.1 Einführung 86
3.1.5.4.2 2,4-D-Rückstände in Zitrusfrüchten 86
3.1.5.4.3 Extraktion von freiem 2,4-D 87
3.1.5.4.4 Freisetzung von gebundenen 2,4-D-Rückständen 87
3.1.5.4.5 Derivatisierungsmöglichkeiten von Phenoxyalkancarbonsäuren 89
3.1.5.4.6 Bestimmung mittels GC-MSD 92
3.1.5.4.7 Validierung 93
3.1.5.4.8 Behandlung von Zitronen mit 2,4-D und Lagerungsversuch 94
3.1.5.4.9 Freisetzung von gebundenem 2,4-D aus Zitrusfrüchten bei simulierter
Verdauung und simulierter Verarbeitung 97
3.1.5.5 N-Methyl-Carbamate 100
3.1.5.5.1 Einführung 100
3.1.5.5.1.1 Analytik 103
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3

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3.1.5.5.2 Bestimmung von N-Methyl-Carbamaten nach Extraktion mittels SFE 103
3.1.5.5.2.1 Übersicht 103
3.1.5.5.2.2 Extraktion mit SFE 105
3.1.5.5.2.3 Direkte Bestimmung mittels GC-MSD (KAS3-Gerstel) 105
3.1.5.5.2.4 Bestimmung mittels GC-MSD nach Derivatisierung 106
3.1.5.5.2.5 Bestimmung mittels LC-MSD 108
3.1.5.5.2.6 Wiederfindungen 113
3.1.5.5.2.7 Abbau in der Extraktionshülse 114
3.1.5.6 Organozinn-Pestizide 117
3.1.5.6.1 Einleitung 117
3.1.5.6.2 Extraktion mit SFE 119
3.1.5.6.3 Optimierung der Derivatisierung mit Grignard-Reagenz 119
3.1.5.6.4 Bestimmung mittels GC-MSD 124
3.1.5.6.5 Bestimmung mittels LC-MSD (API-Elektrospray) 127
3.1.5.6.6 Wiederfindungsversuche 129
3.1.6 BEISPIELE AUS DER PRAXIS DER LEBENSMITTELÜBERWACHUNG 131
3.1.6.1 Bestimmung von Pyrimethanil und Diethofencarb in Keltertrauben 131
3.1.6.2 Untersuchung von Carbendazim in Obst und Gemüse 133
3.1.6.3 Untersuchung von 2,4-D in Zitrusfrüchten 136
3.1.7 UNTERSUCHUNG VON RINGVERSUCHSPROBEN 137
3.1.7.1 European Commission´s Proficiency Tests on Pesticide Residues in Fruit and
Vegetables 1996/1997 137
3.1.7.1.1 Proficiency Test I 137
3.1.7.1.2 Proficiency Test II 139
3.2 EINSATZ DER SFE IN DER ANALYTIK VON BEDARFSGEGENSTÄNDEN 141
3.2.1 EINLEITUNG 141
3.2.2 DI-ISOPROPYL-NAPHTHALIN IN PAPIER 142
3.2.2.1 Einführung 142
3.2.2.2 Bestimmungsverfahren 142
3.2.2.2.1 naßchemisches Verfahren 142
3.2.2.2.2 Extraktion mittels SFE 142
3.2.2.2.3 Bestimmung mittels GC/MSD 143
3.2.2.3 Extraktion von Proben aus dem Handel 146
3.2.3 PCP (PENTACHLORPHENOL) AUS HOLZ UND TEXTILIEN 149
3.2.3.1 Einführung 149
3.2.3.2 Bestimmung von PCP 149
3.2.3.2.1 naßchemisches Verfahren 149
3.2.3.2.2 SFE-Methode 149
3.2.3.2.2.1 Probenaufarbeitung 149
3.2.3.2.2.2 Extraktion mit ISCO SFX 3560 150
3.2.3.2.2.3 Derivatisierung mit PFB-Br 150
3.2.3.2.3 Wiederfindungen und Untersuchung PCP-haltiger Seide 151
3.2.3.2.4 Optimierung der Extraktion 151
3.2.3.3 Untersuchung von Planproben 153
3.2.3.4 Fazit 153
3.2.4 EXTRAKTION VON ANTIOXIDANTIEN AUS KUNSTSTOFF 154
3.2.4.1 Einführung 154
3.2.4.2 Bestimmung von Antioxidantien 154
3.2.4.2.1 naßchemisches Verfahren 154
3.2.4.2.2 SFE-Methode 154
3.2.4.2.2.1 Probeneinbringung in die SFE-Hülse 154
3.2.4.2.2.2 Extraktion mit ISCO SFX 3560 155
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4

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3.2.4.2.3 Untersuchung von Proben mit bekannter Rezeptur 155
3.2.4.2.3.1 untersuchte Antioxidantien 155
3.2.4.2.3.2 Probenmaterial 156
3.2.4.2.3.3 Untersuchungsergebnisse 156
3.2.4.2.3.4 Variation der SFE-Parameter 157
3.2.4.2.4 Fazit 157
4. SCHLUßFOLGERUNGEN 159
4.1 BEWERTUNG DER SFE ALS EXTRAKTIONSVERFAHREN 159
4.2 BEWERTUNG DER VERWENDETEN EXTRAKTIONSGERÄTE 160
4.3 ALLGEMEINE ANALYTISCHE ERKENNTNISSE 161
4.4 AUSBLICK 161
5. ABKÜRZUNGEN 163
6. LITERATUR 166
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5

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Problemstellung
0. ZUSAMMENFASSUNG
Die amtliche Lebensmittelüberwachung steht ständig vor neuen analytischen Herausforderungen
(neue Wirkstoffe und Kontaminanten, Monitoring-Programme). Deshalb
besteht bei den Untersuchungseinrichtungen zunehmend Bedarf an schnellen,
kostengünstigen und automatisierten Analysenverfahren. Aus wirtschaftlichen, gesundheitlichen
und ökologischen Gründen sind die Laboratorien zudem bemüht, den
Lösungsmittelverbrauch soweit wie möglich zu senken.
Ziel
Die Möglichkeiten und Grenzen der SFE (Supercritical Fluid Extraction) als Extraktionsverfahren
im Bereich der Lebensmittelanalytik sollten untersucht werden. Dieses
Verfahren, bei dem das zu untersuchende Probenmaterial, statt wie herkömmlich mit
organischen Lösungsmitteln, mit überkritischem Kohlendioxid extrahiert wird, ist erst
seit wenigen Jahren durch die Entwicklung entsprechender automatisierter Geräte in
Laboratorien einsetzbar. Für bestimmte analytische Fragestellungen wie z.B. Pestizidrückstände
in Obst und Gemüse und Additive und Verunreinigungen in Bedarfsgegenständen
sollten Methoden entwickelt werden, die im Vergleich zu den
herkömmlichen schneller sind, einen geringeren Lösungsmittelverbrauch haben,
weniger manuelle Arbeitsschritte benötigen und dadurch wirtschaftlicher sind.
Vorgehensweise
Zunächst wurden Versuche zur Optimierung der Probenvorbereitung durchgeführt. Da
bei der SFE nur geringe Probenmengen eingesetzt werden können, ist eine gründliche
aber dennoch schonende Feinzerkleinerung des Probenmaterials erforderlich. Um eine
möglichst effiziente aber dennoch selektive Extraktion zu erreichen, wurden die SFE-
Geräteparameter wie Extraktionszeit, -druck, -temperatur und -flußrate variiert. Um auf
eine aufwendige Reinigung der Extrakte verzichten zu können, wurden selektive
Meßverfahren eingesetzt und optimiert. Für bestimmte Substanzen wurden
Derivatisierungsmethoden entwickelt, und so eine empfindlichere und selektivere
Messung erzielt. Die entwickelten SFE-Methoden wurden validiert und die erzielten
Ergebnisse mit denen herkömmlicher Methoden verglichen.
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Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Ergebnis
1. Bei Extraktion von Obst und Gemüse mittels SFE ist auf den Wassergehalt der
eingesetzten Proben zu achten, da Wasser sowohl den Extraktionsprozeß positiv wie
negativ beeinflussen als auch ggf. das Gerät beschädigen kann. Durch Vermengung
der Proben mit speziellen Adsorbentien (z.B. auf Silikatbasis) konnte der
Feuchtigkeitsgrad eingestellt werden.
2. Es wurden Wiederfindungsversuche für mehr als 120 verschiedene Pestizide
durchgeführt. Für fast alle der untersuchten Stoffe wurden Wiederfindungen
zwischen 70 und 110 %, in der Regel zwischen 80 und 95 % erreicht. Für einige
ausgewählte Verbindungen wurden die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen nach
dem DFG Eichgeradenverfahren ermittelt. Bei Mehrfachbestimmungen von Proben
aus dem Handel wurde eine gute Wiederholbarkeit (Variationskoeffizienten meist
zwischen 2 und 6 %) festgestellt. Die mit Hilfe der entwickelten SFE-Methoden
erzielten Untersuchungsergebnisse von Proben aus dem Handel stimmen mit den
Ergebnissen herkömmlichen Verfahren gut überein. Die gewonnenen Ergebnisse
zeigen, daß die SFE zur Routineanalytik von Pestizidrückständen in Obst und
Gemüse hervorragend eingesetzt werden kann, dies hat sich auch bei einer
Laborvergleichsuntersuchung gezeigt (EU Proficiency Test I und II 1996,1997).
3. Neben den Einstellungen des Extraktionsgerätes wurde auch der Einfluß weiterer
analytischer Parameter auf die Extrahierbarkeit verschiedener Analyten am Beispiel
ausgesuchter Pestizide untersucht.
3.1 Polarität der Analyten: Da überkritisches Kohlendioxid ein recht unpolares
Lösungsmittel ist, ist es gut zur Extraktion von unpolaren bis mittelpolaren
Pestiziden geeignet. Polarere Pestizide werden dagegen nur unvollständig
extrahiert.
3.2 pH-Wert: Bei Verbindungen mit sauren oder basischen Eigenschaften kann die
Extrahierbarkeit bedeutend verbessert werden, wenn der pH-Wert der zu
extrahierenden Proben entsprechend alkalisch oder sauer eingestellt wird (Bsp.
Carbendazim und 2,4-D).
3.3 Feuchtigkeitsgehalt: Bei unpolaren Pestiziden spielt der Feuchtigkeitsgehalt der
Probe eine wichtige Rolle. Mit zunehmendem Wasseranteil werden für diese
Substanzen schlechtere Wiederfindungen erzielt. Durch Zugabe von größeren
Mengen Adsorbens können solche Substanzen wesentlich besser extrahiert werden
(Bsp. Pyrethroide, chlororganische Pestizide).
3.4 Abbau: Es wurde festgestellt, daß einige Pestizide einen signifikanten Abbau
zeigen, wenn die Extraktionshülsen bei Raumtemperatur gelagert werden. Um
diesen Abbau zu minimieren, sollten Proben, die solche empfindlichen Stoffe enthalten,
bis zur Extraktion im Gefrierschrank aufbewahrt und erst kurz vor der
Extraktion in den Probengeber eingestellt werden.
4. Umfassende Untersuchungen wurden auch im Bereich der Messung durchgeführt.
Für viele Substanzen ist eine Kalibrierung nach dem Standardadditionsverfahren
notwendig, da anderenfalls infolge der Matrixeinflüsse falsche Ergebnisse erzielt
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7

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werden. Für einige Verbindungen, deren gaschromatographische Bestimmung
Schwierigkeiten bereitet, wurden einfach durchzuführende Derivatisierungsmethoden
entwickelt, die direkt nach der SFE-Extraktion in den Vorlagegefäßen durchgeführt
werden können (Bsp. N-Methyl-Carbamate, Carbendazim, Thiabendazol, Organo-
Zinn-Verbindungen).
5. Im Bereich der Bedarfsgegenstände wurden Methoden zur Extraktion von
Pentachlorphenol aus Holz- und Stoffproben sowie von Di-Isopropyl-Naphthalin aus
Recycling-Papier entwickelt. Desweiteren wurden Additive mit antioxidativer Wirkung
aus Kunststoffen extrahiert, und dabei mit herkömmlichen Methoden vergleichbare
Ergebnisse erzielt.
Konsequenz für die Praxis
Die erarbeiteten Methoden wurden noch während der Forschungsarbeiten in der Praxis
der amtlichen Lebensmittelüberwachung erprobt und eingesetzt. Verschiedene
Pestizide, die bisher routinemäßig nicht erfaßt wurden, konnten somit als Rückstände in
Lebensmitteln festgestellt werden. Mit SFE-Methoden wurde 1996 und 97 erstmalig in
größerem Umfang auf Rückstände der Carbendazim-Gruppe in Obst und Gemüse und
auf Rückstände an 2,4-D in Zitrusfrüchten untersucht. Damit wurde ein wichtiger Beitrag
zur Beschreibung der Rückstandssituation dieser Stoffe geleistet.
Die erarbeiteten Multimethoden erfordern einen geringen Arbeitsaufwand und
ermöglichen einen hohen Probendurchsatz. Daher bietet sich die Möglichkeit die SFE
für routinemäßige Pestizidrückstandsuntersuchungen z.B. für Monitoringprogramme
einzusetzen.
Den durchgeführten Untersuchungen zufolge kann die SFE auch im Bereich der
Bedarfsgegenständeanalytik sehr erfolgreich eingesetzt werden, wie am Beispiel von
PCP in Holz und Di-Isopropyl-Naphthalin in Papier gezeigt wurde.
Bisherige Veröffentlichungen:
• Bestimmung von Carbendazim, Benomyl, Thiophanat-Methyl und 2,4-D in pflanzlichen
Proben nach Extraktion mit überkritischem Kohlendioxid
Lebensmittelchemie 52 (1998) 13 und Lebensmittelchemie 52 (1998) 74
• Analysis of Carbendazim/Benomyl, Thiophanate Methyl and 2,4-D in Fruits and
Vegetables after Supercritical Fluid Extraction
Journal of Chromatography A 825 (1998) 45-54
• Analysis of Several N-Methyl-O-Aryl-Carbamates in Fruits and Vegetables after
Supercritical Fluid Extraction (SFE)
9th IUPAC International Congress - Pesticide Chemistry, Books of Abstracts, Volume
II
• Analysis of Pesticide Residues in Fruits and Vegetables by SFE and GC-MSD / LC-
MSD
Tagungsband Int. SFE/SFC/XSE-Forum, Siegen 1998
Schlagworte: SFE, Rückstandsanalytik, Lebensmittel, Bedarfsgegenstände
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1.1 ZIELSETZUNG
1. EINLEITUNG
Erste Versuche mit der SFE an der CLUA Stuttgart Anfang 1995 [4], sowie einzelne
Veröffentlichungen [1,2] ließen die vielfältigen Möglichkeiten, die die SFE im Bereich
der Lebensmittelanalytik und insbesondere der Rückstandsanalytik bietet, vermuten.
Um diese potentiellen Möglichkeiten zu konkretisieren, wurde im Frühsommer 1995 ein
Antrag auf Forschungsmittel mit dem Titel:
„Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem
Kohlendioxid zur Bestimmung von Pflanzenbehandlungsmitteln und
anderen Bestandteilen“
gestellt.
Im Juli 1995 wurde der Antrag genehmigt:
Die Chemische Landesuntersuchungsanstalt Stuttgart wird gebeten, ein
Forschungsprojekt zur Überprüfung der Anwendbarkeit der „Extraktion von
Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem Kohlendioxid
zur Bestimmung von Pflanzenbehandlungsmitteln und anderen Bestandteilen“
durchzuführen. Im Rahmen dieses Projekts soll in einer wissenschaftlichen Arbeit
untersucht werden, inwieweit die Extraktion mit überkritischem Kohlendioxid in der
Praxis der Untersuchungen im Rahmen der Lebensmittelüberwachung eingesetzt
werden kann, um
• umweltbelastende Lösungmittel zu vermeiden,
• durch Automatisierung Einsparungen zur erzielen,
• Stoffe aus Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen zu extrahieren.
1.2 APPARATIVE VORAUSSETZUNGEN
Für die Durchführung der SFE-Extraktionen stand ein automatisiertes Gerät der Fa.
HP (7680T) zur Verfügung. Im Verlauf des Projektes stellte die Fa. ISCO einen
weiteren Extraktor zur Verfügung. Zur Bestimmung standen Gaschromatographen
mit verschiedenen Detektortypen sowie ein HPLC-DAD zur Verfügung. Gegen Ende
des Projektes war es möglich einige Messungen mit einem LC-MSD bei der Fa. HP
durchzuführen.
1.3 SFE ALS ALTERNATIVE ZU HERKÖMMLICHEN EXTRAKTIONSVERFAHREN
Seit einigen Jahren werden von verschiedenen Herstellern Geräte angeboten, die eine
Extraktion von Proben mit überkritischem Kohlendioxid im analytischen Maßstab
ermöglichen. Die günstigen physikalischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften
des überkritischen Kohlendioxids machen es möglich, Extraktionen schnell und selektiv
durchzuführen. Die SFE (Supercritical Fluid Extraction) entwickelt sich damit zu einer
attraktiven Alternative zu herkömmlichen Extraktionsmethoden.
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Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Herkömmliche Lösungsmittel-Extraktionen liefern in der Regel stark mit Matrixbestandteilen
verunreinigte Extrakte. Daher ist oft, vor der Bestimmung an einem
chromatographischen System, eine aufwendige Reinigung der Extrakte erforderlich.
Dies ist stets mit einem hohen Arbeits-, Zeit- und Kostenaufwand verbunden. Im
Gegensatz dazu liefert die SFE Extrakte, die in der Regel ohne weiteres für
chromatographische Bestimmungen eingesetzt werden können. Im Vergleich zu den
herkömmlichen Methoden liegen die Vorteile der SFE vor allem im hohen Probendurchsatz,
sowie bei der Einsparung von Lösungsmitteln und Personalkosten. Die
Probenaufarbeitung ist weitgehend automatisiert und erfordert, im Gegensatz zu den
herkömmlichen Aufarbeitungsmethoden, nur wenig manuelle Arbeitsschritte. Dies
erleichtert die Dokumentation des Analysengangs und dürfte zudem zu einer Verbesserung
der Vergleichbarkeit zwischen Laboratorien führen. Der extrem geringe
Lösungsmittelbedarf macht die SFE auch unter dem Aspekt des Umweltschutzes
interessant.
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Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
2.1 EINFÜHRUNG IN DIE SFE
2. DAS EXTRAKTIONSVERFAHREN
SFE (Supercritical Fluid Extraktion) ist eine Extraktionsverfahren, bei dem die zu
untersuchenden Proben unter Einsatz eines überkritischen Fluids (meist Kohlendioxid,
CO2) als Extraktionsmittel extrahiert werden.
Als überkritische Fluide werden Substanzen im überkritischen Zustand bezeichnet.
Dieser Zustand kann erreicht werden, wenn beide kritische Daten (kritische Temperatur
und kritischer Druck) gleichzeitig überschritten werden. Beim Kohlendioxid liegt
beispielsweise die kritische Temperatur bei 31,1 °C und der kritische Druck bei 73,7
bar.
Überkritische Fluide sind weder Gase noch Flüssigkeiten. Ihre physikalischen und
physikalisch-chemischen Eigenschaften können sowohl mit denen von Gasen als auch
mit denen von Flüssigkeiten verglichen werden. Aufgrund ihrer hohen Dichte besitzen
überkritische Fluide ähnlich gute Solvenseigenschaften (Löseeigenschaften) wie
Flüssigkeiten. Geringe Viskositäten und hohe Diffusionskraft verleihen überkritischen
Fluiden für Extraktionen günstige gasähnliche Transporteigenschaften (Mobilität). Wie
Gase haben überkritische Fluide ein gutes Kompressionsverhalten. Durch Änderungen
des Druckes und der Temperatur kann die Dichte, und somit das damit verbundene
Lösungsvermögen, über weite Bereiche variiert werden.
Extraktionen mit überkritischen Fluiden werden schon seit längerer Zeit großtechnisch
betrieben. Einige Beispiele hierfür sind die Entkoffeinierung von Kaffee, die schonende
Extraktion von ätherischen Ölen, die Reinigung von Medikament-Präparaten, die
Extraktion von Hopfen, die Entölung von Lecithin, die Extraktion von Erdölprodukten
und anderes mehr [20]. Milde und selektive Extraktionsbedingungen führen zu reineren
und qualitativ höherwertigen Extrakten als bei den herkömmlichen Verfahren. Dies
macht die SFE auch für den Einsatz im analytischen Bereich interessant.
Seit einigen Jahren bieten verschiedene Hersteller SFE-Extraktionsgeräte an, die für
analytische Zwecke geeignet sind.
Ähnlich wie bei Extraktionen mit Flüssigkeiten (Soxhlet) wird die Probe in eine Hülse
gebracht und mit dem Extraktionsmittel (hier das Fluid) extrahiert. Da im Unterschied zu
den klassischen Extraktionen mit Flüssigkeiten unter relativ hohen Drucken gearbeitet
wird, muß die zu extrahierende Probe in eine druckfeste Spezialhülse (mit einer HPLC-
Säule vergleichbar) gebracht werden.
Das mit Extrakten aus der Probe beladene Fluid wird an einer speziellen Vorrichtung
(Restriktor) schlagartig auf Atmosphärendruck gebracht. Das Kohlendioxid wird
gasförmig und entweicht und die Extrakte schlagen sich auf einer gekühlten Falle
nieder. Mit einem flüssigen Lösungsmittel werden die Extrakte von der Falle in ein
Vorlagegefäß eluiert. Bei einigen Geräten taucht der Restriktor direkt in eine Lösungs-
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Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
mittelvorlage ein. Die auf diese Weise erhaltene extrakthaltige Lösung kann meist direkt
zur chromatographischen Bestimmung eingesetzt werden.
Das analytische Laboratorium von heute steht unter ständigem Druck, seinen Probendurchsatz
zu vergrößern, seine Betriebskosten zu senken und anfallende Abfälle zu
reduzieren. Die Zuverlässigkeit, Exaktheit und Reproduzierbarkeit der analytischen
Methoden muß dabei erhalten bleiben oder sogar verbessert werden.
In der Vergangenheit wurde, sowohl seitens der Forschung als auch der Anwender in
die Automatisierung und Verbesserung chromatographischer Trennmöglichkeiten,
sowie in die Verbesserung der Empfindlichkeit und der Auswertungsmethoden von
Detektorsignalen viel investiert. Zur Optimierung und Automatisierung der Probenaufbereitung
wurde bisher jedoch nur wenig geleistet.
Ein Blick auf die heute angewendeten Methoden in der Rückstandsanalytik zeigt aber,
daß der größte Arbeitsaufwand und der größte Materialverbrauch gerade in diesem
Bereich (Probenaufbereitung) liegt. Klassische Extraktionsmethoden zeichnen sich
durch eine Vielzahl schwieriger manueller Arbeitsschritte aus (z.B. Zweiphasenextraktionen,
Einengen von Lösungen mit Rotationsverdampfern, säulenchromatographische
Reinigungen). Solche Arbeitsschritte bei der Probenaufarbeitung sind in der
Regel sehr aufwendig und müssen, um den heutigen Anforderungen zu entsprechen,
durch zuverlässigere automatisierbare Prozesse ersetzt werden.
Die SFE entwickelt sich zu einer interessanten Alternative zu den klassischen
Extraktionsverfahren, die mit organischen Lösungsmitteln arbeiten. Bei der SFE sind
viele Arbeitsschritte automatisiert worden (Extraktion, z.T. auch Clean-up, Aufnahme
der Extrakte in das für die chromatographischen Prozesse geeignete Lösungsmittel),
wodurch sich erhebliche Raum-, Arbeitszeit- und Kostenersparnisse ergeben [5,6,15].
Mit Hilfe der SFE kann auch der hohe Verbrauch an Lösungsmitteln, der derzeit bei der
Rückstandsanalytik anfällt, reduziert werden. Zum einem wird die Exposition des
Laborpersonals mit den oft gesundheitlich bedenklichen Lösungsmitteln vermieten, zum
anderen werden die Probleme, die bei der umweltgerechten Lösungsmittel-Entsorgung
bzw. der Rückgewinnung auftreten, minimiert. Dies macht die SFE auch unter dem
Aspekt des Umweltschutzes attraktiv [12].
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12

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
2.2 PHYSIKALISCHE GRUNDLAGEN DES VERFAHRENS
Stoffe können in verschiedenen Aggregatszuständen vorliegen: gasförmig, flüssig, fest
und überkritisch. Diese Zustände können durch Variation von Druck und Temperatur
ineinander übergehen, siehe Abb. 2.2-1 [21].
Abb. 2.2-1: Phasendiagramm von Kohlendioxid
Druck [P]
Pc=7,3 MPa
1= Schmelzkurve
2= Sublimationskurve
3= Verdampfungskurve
fest
2
1
flüssig
3
gasförmig
überkritisches
Fluid
kritischer
Punkt
Tc=31,1°C Temperatur [T]
Entlang der Verdampfungskurve koexistieren der flüssige und der gasförmige Zustand.
Bewegt man sich entlang dieser Kurve, beobachtet man für CO2 bei einem Druck von
73,7 bar (kritischer Druck) und einer Temperatur von 31,1°C (kritische Temperatur) das
Verschwinden der Phasengrenze. Bei diesem Punkt erreichen die beiden Phasen
„flüssig“ und „gasförmig“ die gleiche Dichte und vermischen sich zu einer einzigen
Phase. Dieser Punkt, der im P/T-Diagramm das Ende der Verdampfungskurve darstellt,
wird als kritischer Punkt bezeichnet. Der kritische Druck und die kritische Temperatur
sind charakteristische Stoffkonstanten. Zur Erreichung des überkritischen Zustandes
müssen beide Größen (sowohl die kritische Temperatur als auch der kritische Druck)
überschritten werden. Eine Substanz im überkritischen Zustand ist weder flüssig noch
gasförmig, sie wird im allgemeinen als überkritisches Fluid bezeichnet. Temperatur- und
Druck-Veränderungen überhalb der kritischen Daten führen lediglich zu Änderungen der
Dichte, können also nicht wie bei Flüssigkeiten und Gasen zu Phasenumwandlungen
führen.
Überkritische Fluide zeigen interessante physikalische und physikalisch-chemische
Eigenschaften (siehe Tab. 2.2-1). Die Dichte überkritischer Fluide ist größenordnungsmäßig
vergleichbar mit der von flüssigen Lösungsmitteln. Sie zeichnen sich
deshalb durch ein hohes Lösungsvermögen aus, das teils vergleichbar, teils größer ist
als das von flüssigen Lösungsmitteln. Andererseits haben überkritische Fluide im
Vergleich zu Flüssigkeiten viel höhere Diffusionskoeffizienten und niedrigere
Viskositäten. Das Penetrationsvermögen und die Transporteigenschaften (Mobilität) von
überkritischen Fluiden sind somit in etwa vergleichbar mit denen von Gasen. Diese
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13

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Eigenschaften machen überkritischen Fluide als Extraktionsmittel außerordentlich
interessant.
Tab. 2.2-1: Gegenüberstellung der physikalischen Eigenschaften [21].
Aggregatszustände Dichte Diffusionskoeffizient
(g/ml)
(cm 2 Viskosität
/s)
(Ns/m 2 )
Gase 10 -4 - 10 -3 ca. 10 -1 ca. 10 -4
überkritische Fluide 0,1 - 1 10 -3 - 10 -4 10 -3 - 10 -4
Flüssigkeiten 0,6 - 1,4 ca. 10 -5 ca. 10 -2
Bisher wurden bereits einige Fluide für die SFE erprobt: Kohlendioxid, Ammoniak,
Stickstoffmonoxid, Pentan, Freone und andere mehr. Von diesen hat sich jedoch nur
das überkritische Kohlendioxid für den Routineeinsatz im Laboratorium bewährt.
Kohlendioxid bietet einige Vorteile: es ist leicht in den überkritischen Zustand überführbar
(vgl. Tab. 2.2-2), zeigt ein recht gutes Lösungsvermögen und wird in einem
hohen Reinheitsgrad zu einem relativ günstigen Preis angeboten. Es ist einfach zu
handhaben, ungiftig und umweltfreundlich. Kohlendioxid ist außerdem im Gegensatz zu
Wasser oder Ammoniak chemisch inert.
Tab. 2.2-2: Kritische Daten verschiedener Stoffe [22]
Fluid kritische Temperatur Tc (°C) kritischer Druck Pc (MPa)
CHF3 25,9 4,83
CClF3 28,8 3,92
CO2 31,1 7,37
N2O 36,4 7,24
NH3 132,2 11,27
n-Pentan 196,6 4,22
CH3OH 239,4 8,09
H2O 374,1 22,04
2.3 MÖGLICHKEITEN ZUR OPTIMIERUNG VON SFE-EXTRAKTIONEN
Das Lösungsvermögen ist von der Dichte des Fluids abhängig. Diese kann durch
Variation des Druckes und der Temperatur eingestellt werden. Bei höheren Dichten
werden die Extraktionseigenschaften verbessert.
Je dichter ein überkritisches Fluid ist, desto effektiver kann es die elektrostatischen
Wechselwirkungen zwischen Ionen abschirmen und abschwächen. Dies erklärt die
bessere Löslichkeit von polaren Substanzen bei hohen Dichten.
Da überkritisches Kohlendioxid relativ unpolare Eigenschaften besitzt (je nach Dichte in
der Größenordnung von Hexan bis Dichlormethan) kann es gut unpolare bis
mittelpolare Substanzen lösen. Große polare Moleküle wie Zucker oder Proteine lösen
sich kaum und sind daher nicht extrahierbar.
Eine zentrale Rolle bei SFE spielen die Einflüsse der Matrix. Das Extraktionsmedium
muß die zu extrahierenden Substanzen nicht nur lösen können, es muß auch die
Wechselwirkungen zwischen den aktiven Stellen der Matrix und den Analyten
überwinden können.
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14

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Im folgenden werden die Einflüsse einiger wichtiger Parameter auf die Extraktion näher
erläutert.
2.3.1 Die Rolle der Temperatur
Die Extraktionskinetik wird im wesentlichen durch Diffusions- und Desorptionsprozesse
limitiert. Bei höheren Temperaturen ist die Extraktionskinetik stark verbessert. Moleküle
besitzen eine höhere kinetische Energie (Mobilität) und intermolekulare
Wechselwirkungen können besser überwunden werden, dadurch werden Diffusions-
und Desorptionsprozesse erleichtert und die Extraktionszeiten verkürzt. Allerdings
werden, um die Dichte hoch zu halten und damit die Lösefähigkeit aufrecht zu erhalten,
höhere Drücke benötigt. Die einsetzbare Temperatur ist somit vom maximal einsetzbaren
Druck des Fluidextraktors abhängig. Meist sind aber die thermische Stabilität der
zu extrahierenden Substanzen oder die Menge der mitextrahierbaren Begleitstoffe die
Faktoren, die die Extraktionstemperatur limitieren.
2.3.2 Die Rolle des Druckes
Bei gleichbleibender Temperatur führt eine Erhöhung des Druckes zu einer Dichteerhöhung
und somit auch zu einer Verbesserung der Lösungseigenschaften des Fluids.
Bei höheren Dichten verliert das überkritische Kohlendioxid allerdings an Diffusionskraft
und wird viskoser, wodurch die Extraktionskinetik verschlechtert wird.
Es wird ersichtlich, daß hier viele gegenläufige Faktoren eine Rolle spielen. Diese
müssen für das jeweilige Problem richtig abgewogen werden, um optimale Ergebnisse
zu erzielen.
2.3.3 Die Rolle der Matrix
Eine zentrale Rolle bei Extraktionen mit überkritischem Kohlendioxid spielt die Matrix.
Wechselwirkungen zwischen dem Analyten und der Matrix erschweren die Extraktion
und erfordern schärfere Extraktionsbedingungen. Die Teilchengröße und Oberflächenbeschaffenheit
der zu extrahierenden Partikel spielt auch eine Rolle. In den Partikeln
eingeschlossene, und dadurch schwer zugängliche Analyten erfordern höhere
Extraktionszeiten und eine starke Diffusionskraft des Fluids.
Ein zu hoher Gehalt an mobilem Wasser in der Matrix bringt Schwierigkeiten (auch
gerätetechnischer Art, siehe Kap. 3.1.3.2.) mit sich. Das Wasser kann jedoch durch den
Einsatz von Adsorbentien mit großer Oberfläche wie z.B. Diatomeenerden physikalisch
gebunden werden, wodurch sich gleichzeitig die zur Extraktion bestimmten Stoffe leicht
zugänglich über eine große Oberfläche verteilen.
Die Wechselwirkungen zwischen dem Analyten und der Matrix können durch den
Einsatz geringer Mengen an Lösungsmitteln (sog. Modifiern) geschwächt werden.
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15

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
2.3.4 Die Rolle von Modifiern
Modifier sind in der Regel organische Lösungsmittel (z.B. Methanol, Acetonitril, Aceton),
die entweder direkt der Matrix oder auch in einer Mischkammer dem überkritischen
Fluid zugemischt werden.
Durch Modifier kann die Lösungskraft des Fluids beeinflußt werden, z.B. hat ein mit
Methanol modifiziertes CO2-Fluid eine größere Polarität als reines CO2-Fluid. Polarere
Substanzen werden dadurch besser solvatisiert [8].
Die Wirkung von Modifiern beschränkt sich nicht nur auf die Verbesserung der
Löslichkeit von Verbindungen, sondern auch auf die Überwindung von Wechselwirkungen
zwischen Matrix und Analyten. Dies ist insbesondere im Bereich der
Spurenanalytik interessant, da hier die Löslichkeit meist nicht der begrenzende Faktor
ist. Modifier wie Methanol und Wasser können aktive polare Zentren der Matrix, die mit
polaren Molekülen wechselwirken können, maskieren, wodurch die Extraktion dieser
Stoffe erleichtert wird.
Da durch den Zusatz von Modifiern die Löslichkeit von polaren Stoffen erhöht wird,
werden Extrakte erhalten, die in der Regel mit erheblich mehr störenden Matrixkomponenten
belastet sind, die Extraktionsselektivität nimmt demnach ab [1]. Viele
Autoren, die Untersuchungen zu diesem Thema durchgeführt haben, berichten, daß ein
Zusatz von Modifiern oft keine Verbesserung der Extraktionsausbeuten bewirkt [1].
2.4 AUFBAU EINES SFE-EXTRAKTORS
Allen SFE-Geräten gemeinsam ist eine Pumpe zum Verdichten des Kohlendioxids, eine
beheizbare Extraktionskammer in der die Probe extrahiert wird, ein für die Expansion
des Fluids zuständiger, sog. Restriktor und eine Vorrichtung zur Sammlung der
Extrakte (Falle)(siehe Abb. 2.2-2).
Die wesentlichen Unterschiede zwischen Geräten verschiedener Anbieter liegen in der
Art der Falle (fest oder flüssig) und in der Art der Fluid-Expansion (Restriktor) aber auch
in der Höhe des maximal einsetzbaren Druckes.
Die Extraktionshülsen (thimbles) sind druckfeste Behälter, in welche die Proben
eingefüllt werden. Sie bestehen aus einem Edelstahlrohr, das mit zwei speziellen
Schraubkappen verschlossen wird. Diese Kappen sind mit einem Ventil versehen durch
das das überkritische Fluid in die Hülsen geleitet wird. Bei Geräten, bei denen in der
Hülse und dem sie umgebenden Raum (Extraktionskammer) der gleiche Druck
vorherrscht (z.B. Extraktoren der Fa. ISCO) können wesentlich kostengünstigere
Hülsen aus Kunststoffmaterial verwendet werden.
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16

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 2.2-2: Schematischer Aufbau eines SFE-Extraktors mit Festphasenfalle
CO2
Modifier
Thimble
Nozzle
ODS
Solvent
Vial
Der Restriktor (nozzle) ist das Kernstück des Extraktors. Hierbei handelt sich um eine
Kapillare oder ein Ventil durch die/das das überkritische Fluid entweicht. Er ist
beheizbar, um die bei der Expansion des Kohlendioxids entstehende Kälte (Joule-
Thompson-Effekt) zu kompensieren und somit Kondensationen oder das Gefrieren von
Stoffen (z.B. Fett oder Wasser) und damit Verstopfungen zu vermeiden. Es gibt
statische und variable Restriktoren. Der Vorteil variabler Restriktoren ist, daß sie den
Gasfluß unabhängig vom eingesetzten Extraktionsdruck regeln können.
Die Fallen (traps) verschiedener Geräte zeigen ebenfalls prinzipielle Unterschiede. Bei
der On-line-SFE, bei der dem Extraktionsvorgang direkt ein chromatographischer
Vorgang nachgeschaltet ist, werden die Extrakte am Säulenanfang der chromatographischen
Säule aufgefangen [23]. Bei flüssigen Fallen werden die Substanzen direkt
in ein Vorlagegefäß, das ein Lösungsmittel enthält, geleitet. Dies kann bei der
Extraktion von leichtflüchtigen Stoffen nützlich sein. Bei den Festphasenfallen werden
die Extrakte in einer gekühlten Festphasenfalle mit großer Oberfläche aufgefangen. Die
Extrakte werden dann von der Falle mit einem organischen Lösungsmittel in eine
Vorlage eluiert. Der Vorteil dieser Fallen besteht darin, daß man durch gezielte Wahl
des Festphasenmaterials und der Elutionsmittel eine Fraktionierung der Extrakte und
somit einen zusätzlichen Reinigungseffekt erzielen kann.
2.5 ABLAUF EINER EXTRAKTION
Das Kohlendioxid wird mit Hilfe einer Pumpe und einer Heizeinrichtung auf den nötigen
Druck und die nötige Temperatur gebracht. In überkritischem Zustand gelangt es dann
in die beheizbare Extraktionszelle, in der sich die Probe befindet. Hier findet die
Extraktion statt.
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Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Es wird zwischen statischer und dynamischer Extraktion unterschieden. Bei der
statischen Extraktion findet kein Fluß statt. Die Probenmatrix wird mit dem Extraktionsfluid
unter bestimmten Bedingungen (Druck, Temperatur) durchdrängt
(„eingeweicht“). Bei der dynamischen Extraktion findet ein Fluß statt. Die Probe wird
von dem Fluid unter vordefinierten Bedingungen durchflossen und somit extrahiert.
Nachdem das Fluid die Extraktionskammer verlassen hat, erfolgt im Restriktor eine
Expansion, das überkritische Fluid wird in den gasförmigen Aggregatzustand überführt
und verliert dabei seine Lösekraft. Somit kommt es zu einer Präzipitation der Extrakte
im Restriktor selbst und in der nachgeschalteten Falle. Bei Festphasenfallen werden die
ausgefallenen Substanzen mit einem Lösungsmittel (etwa 1-1,5 ml) in eine Vorlage
eluiert. Dabei wird auch der Restriktor mit durchflossen. Hierbei werden sowohl die
Falle als auch der Restriktor beheizt. Die Temperatur darf hier nicht zu hoch sein, um zu
vermeiden, daß thermolabile Komponenten zersetzt werden oder daß das
Lösungsmittel bereits verdampft. Es folgt eine Nachreinigung des Restriktors und der
Falle mit einer größeren Menge an Lösungsmittel (ca. 5 ml). Das Gerät ist dann für
einen erneuten Extraktionsvorgang bereit.
2.6 ENTWICKLUNG EINER SFE-METHODE
Bei der Entwicklung einer SFE-Methode ist die Optimierung mehrerer Parameter,
sowohl im Bereich der Geräteeinstellung, als auch im Bereich der Probenvorbehandlung
notwendig.
Die Extrahierbarkeit von Stoffen aus der Matrix ist von vielen, oft gegenläufigen
Faktoren abhängig, die gegeneinander abgewogen werden müssen.
2.6.1 Probenvorbereitung
Die Probenvorbereitung muß sich vor allem nach der zu extrahierenden Matrix, aber
auch nach den zu extrahierenden Analyten richten. Es muß so verfahren werden, daß
bei möglichst wenig Verlusten eine für die Gesamtprobe repräsentative und zudem
leicht extrahierbare Teilprobe erhalten wird.
Bei Proben mit hohem Gehalt an mobilem Wasser muß dieses entweder entfernt oder
ausreichend immobilisiert werden.
Im folgenden werden beispielhaft für verschiedenen Fragestellungen mögliche
Probenvorbereitungen aufgelistet:
• Pestizide und andere organische Kontaminanten aus Wasserproben können an
einer Festphasenfalle (z.B. RP-C18) adsorbiert werden. Diese Falle kann dann
mittels SFE extrahiert werden.
• Andere flüssige Proben, in denen höhere Rückstandskonzentrationen (als in Wasser)
zu erwarten sind, wie z.B. Säfte oder Wein können mit einem Adsorbens (z.B.
Hydromatrix) vermengt werden und dann mit der SFE extrahiert werden.
• Obst und Gemüseproben werden nach einer Zerkleinerung ebenfalls mit einem
wasserbindenden Adsorbens versetzt.
• Proben mit hohem Fettgehalt (z.B. Ölsamen, Schokolade, Öle) bereiten oft
Schwierigkeiten bei der SFE. Große Mengen an mitextrahiertem Fett können zu
Überladungen der Falle und zu Verstopfungen führen. Es besteht prinzipiell die
Möglichkeit, das Fett durch gezielte Wahl der Extraktionsbedingungen von der Probe
abzutrennen, um bei einer darauffolgenden Extraktion die erwünschten Stoffe
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18

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
selektiver zu erhalten (fraktionierte Extraktion). Bei diesem Verfahren muß jedoch
meist mit Verlusten an Analyten gerechnet werden.
• Halbflüssige und pasteuse Proben mit hohem Zuckergehalt (z.B. Honig) bereiten
ebenfalls Schwierigkeiten, da die zu extrahierenden Analyten abgeschirmt werden
können. Um eine möglichst optimale Extraktion zu gewährleisten, und die
Extraktionsoberfläche zu vergrößern müssen derartige Proben durch Vermengung
z.B. mit Seesand oder Papier aufgelockert werden.
• Trockene Proben (wie z.B. Mehle, Getreideerzeugnisse) müssen gegebenenfalls
mit Modifiern (z.B. Wasser oder Methanol) angefeuchtet werden, um eine Extraktion
der Wirkstoffe zu erleichtern. Sehr fein zerkleinerte, pulverisierte Proben müssen vor
der Extraktion aufgelockert werden (z.B. mit Seesand) um den Fluß des Fluids zu
erleichtern.
Eine wesentliche Rolle bei der Extraktion spielen auch die zu extrahierenden Analyten.
Ist der Analyt wegen schlechter Löslichkeit im Fluid oder aufgrund von
Wechselwirkungen mit der Matrix nicht leicht extrahierbar, kann gegebenenfalls durch
Zugabe von Modifiern in die Extraktionshülse die Extraktion verbessert werden.
Gegebenenfalls besteht die Möglichkeit die Analyten direkt innerhalb der
Extraktionshülse zu derivatisieren und sie dadurch in eine leichter extrahierbare Form
zu überführen (in-situ-Derivatisierungen [13,14]).
Eigene Untersuchungen zur Optimierung der Probenvorbereitung im Bereich der
Pestizidanalytik werden in Kap. 3.1.3 dargestellt.
2.6.2 Geräteeinstellungen - Optimierung der Extraktionsbedingungen
Die theoretischen Überlegungen zur Optimierung von Extraktionsbedingungen sind in
Kapitel 2.3 dargestellt. Das Verständnis der physikalischen und physikalischchemischen
Zusammenhänge, die bei den Extraktionen eine Rolle spielen, ist zwar
hilfreich bei der Entwicklung von Extraktionsmethoden, da diese jedoch sehr komplex
sind, spielt die Erfahrung eine genauso große Rolle. Die optimalen Extraktionsbedingungen
für Stoffe aus komplexen Matrizes müssen daher oft experimentell
ermittelt werden.
Die wichtigsten Geräte-Parameter, die variiert werden können sind:
1. Extraktionstemperatur, Extraktionsdruck (bzw. Dichte),
2. Extraktionsflußrate,
3. Extraktionszeit,
4. Zumischung von Modifiern zum Fluid (auch direkt in die Extraktionshülse),
5. Festphasenfalle (Material und Temperatureinstellung bei der Extraktion),
6. Elutionsparameter nach der Extraktion (Wahl der Lösungsmittel,
Temperatureinstellung von Festphasenfalle und Restriktor).
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19

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3. APPLIKATIONEN
3.1 ANALYTIK VON PFLANZENSCHUTZMITTELRÜCKSTÄNDEN IN OBST UND
GEMÜSE
3.1.1 Einleitung
Der Einsatz von Pflanzenschutzmitteln ist in der modernen Landwirtschaft nicht mehr
wegzudenken. Gemäß Pflanzenschutzgesetz sind „ ... Pflanzenschutzmittel ... dazu
bestimmt, Pflanzen oder Pflanzenerzeugnisse vor Schadorganismen oder Krankheiten
zu schützen „ [34]. Weltweit sind schätzungsweise 500-600 verschiedene Wirkstoffe im
Einsatz, die entsprechend ihrer Wirkung in verschiedene Gruppen eingeteilt werden
können [92,89] (siehe Tab. 3.1.1-1).
Tab. 3.1.1-1: Einteilung von Pflanzenschutzmitteln nach ihrer Wirkung
Gruppe Wirkung Einige Vertreter
Herbizide gegen Unkräuter Phenoxyalkancarbonsäuren, Triazine,
Uronsäurederivate
Fungizide gegen Pilze Dithiocarbamate, Benzimidazole, Triazole
Insektizide gegen Insekten Carbamate, Pyrethroide,
Organophosphorsäureester
Synergisten potenzieren die Wirkung von
Insektiziden
Piperonylbutoxid
Akarizide gegen Milben Carbamate, Pyrethroide, Zinnorganische
Verbindungen
Nematizide gegen Nematoden Organophosphorsäureester
Molluskizide gegen Schnecken Metaldehyd
Rodentizide gegen Nagetiere
Kumarinderivate
Zu den Pflanzenschutzmitteln werden im allgemeinem auch Wachstumsregulatoren und
Keimhemmungsmittel gezählt.
Die Anwendung von Pflanzenschutzmitteln ist gesetzlich geregelt. Ihre Zulassung in der
Bundesrepublik Deutschland erfolgt durch die Biologische Bundesanstalt für Land- und
Forstwirtschaft (BBA). Eine Zulassung erfolgt nur dann, wenn „das Pflanzenschutzmittel
bei bestimmungsgemäßer und sachgerechter Anwendung ... keine schädlichen
Auswirkungen auf die Gesundheit von Mensch und Tier hat, die nach dem Stande der
wissenschaftlichen Erkenntnisse nicht vertretbar sind“ [34].
Mit der Zulassung wird die Anwendung geregelt und gegebenenfalls werden einzuhaltende
Wartezeiten festgesetzt. Trotz Einhaltung der festgelegten Wartezeiten
zwischen Einsatz der Pestizide und Ernte können noch Rückstände der Pflanzenschutzmittel
im Endprodukt verbleiben. Zum Schutz der Verbraucher werden in der
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20

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Rückstandshöchstmengenverordnung (RHmV) für alle Pflanzenschutzmittel maximal
zulässige Gehalte (Höchstmengen) festgesetzt [34]. Die Einhaltung der festgelegten
Höchstmengen muß durch geeignete Analysenmethoden kontrolliert werden. Dies ist
Aufgabe der amtlichen Lebensmittelüberwachung. Darüber hinaus werden bundesweit
im Rahmen des nationalen Monitoring-Programmes Daten zu Rückständen in
Lebensmitteln gesammelt und ausgewertet, um u.a. zeitliche Trends festzustellen und
die Aufnahme von Pflanzenschutzmitteln durch den Verbraucher über die Nahrung
abzuschätzen.
Zur Analytik werden überwiegend Multimethoden eingesetzt, die eine große Anzahl an
Wirkstoffen erfassen können [3]. Da sich Pflanzenschutzmittel in ihren Eigenschaften
(z.B. Polarität) sehr stark unterscheiden, ist es jedoch nicht möglich alle Stoffe mit einer
einzigen Methode zu erfassen. Zur Erfassung bestimmter Wirkstoffe oder
Wirkstoffgruppen sind Einzelbestimmungs-Methoden erforderlich, da sie z.B. aufgrund
ihrer hohen Polarität oder geringen Stabilität nicht mit den Multimethoden erfaßbar sind.
Die derzeit üblichen Multimethoden beinhalten folgende Arbeitsschritte: Zerkleinerung,
Extraktion, Clean-up, ggf. Derivatisierung und Messung und sind in der Regel sehr
arbeitsaufwendig [3].
Pestizidrückstandslaboratorien stehen ständig vor neuen Aufgaben und Herausforderungen
(neue Wirkstoffe, Qualitätssicherungsmaßnahmen, Absenkung der
Nachweisempfindlichkeit, Monitoring-Programme). Deshalb besteht großes Interesse
an schnellen, kostengünstigen und automatisierten Analysenverfahren, um die Analytik
effizienter zu gestalten. Möglichkeiten hierzu bietet die SFE, die sich zur Extraktion von
mittel- bis unpolaren Pestiziden anbietet.
Der Einsatz der SFE in der Pestizidanalytik würde viele Vorteile mit sich bringen, da die
Extraktion automatisiert abläuft und durch eine selektive Extraktion auf eine Reinigung
der Extrakte verzichten werden könnte. Extraktion und Nachreinigung sind in der Regel
die arbeitsintensivsten Schritte im Bereich der Rückstandsanalytik.
Besonders attraktiv ist die Entwicklung von SFE-Multimethoden zur gleichzeitigen
Extraktion und Bestimmung von mehreren Pestiziden. Die Entwicklung von Methoden
zur Bestimmung einzelner Pestizide oder Pestizidklassen ist jedoch ebenfalls sehr
wichtig, da gerade in diesen Fällen die herkömmliche Analytik sehr arbeitsaufwendig ist
und in der Praxis oft selten durchgeführt wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurden eine
SFE-Multimethode sowie verschiedene Einzelbestimmungsmethoden entwickelt.
Eine Schlüsselstellung bei jeder Methodenentwicklung nehmen die Probenvorbereitung
und die Messung ein.
Die Sicherstellung einer ausreichend guten Meßgenauigkeit ist bei der Entwicklung
analytischer Verfahren von hoher Priorität. Nur anhand zuverlässiger Meßergebnisse
kann die Optimierung vorausgehender analytischen Teilschritte effektiv gestaltet
werden.
Durch die Optimierung der Probenvorbereitung wird gewährleistet, daß die zu untersuchenden
Teilproben für die Gesamtprobe repräsentativ sind.
Demnach sind diese beiden Arbeitsschritte bei der Entwicklung analytischer Methoden
von großer Wichtigkeit und müssen vorrangig optimiert werden.
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21

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.2 Optimierung der Meßbedingungen
3.1.2.1 Wahl des Einspritz- und Detektionsystems
Als Bestimmungssystem wurde ein GC/MSD gewählt. GC/MSD-Systeme werden
wegen ihrer vielfältigen Vorteile immer verbreiteter im Bereich der Rückstandsanalytik
eingesetzt. MS-Detektoren bieten im Gegensatz zu den herkömmlich EC-, NP-, FP-
Detektoren eine universelle und gleichzeitig sehr spezifische Detektionsmöglichkeit, je
nach Modus. Durch die hohe Aussagekraft, der durch die Massenspektrometrie
gelieferten Daten, wird die Unsicherheit bei der Identifizierung von Substanzen
minimiert. Die im SIM-Modus, durch die gezielte Registrierung bestimmter Massen
erreichbare, recht hohe Detektionsempfindlichkeit, genügt den Anforderungen der
Lebensmittelanalytik in den allermeisten Fällen. Da die Messung mit Hilfe des GC/MSD
besonders selektiv erfolgen kann, kann meist auf eine Reinigung der Extrakte (Cleanup)
verzichtet werden.
Für die Identifizierung unbekannter Verbindungen im Chromatogramm können, die im
SCAN-Modus aufgenommenen Massenspektren mit Hilfe eines Suchprogramms
(automatische Bibliotheksuche) mit den Spektren mehrerer Tausend Verbindungen
verglichen werden. Die Zuordnung von Massenspektren unbekannter Peaks zu
Substanzen anhand der Vorlagen der Spektrenbibliothek ist jedoch, selbst bei ausreichender
Abtrennung der Substanz von Begleitstoffen, nicht immer einfach. Bei
Substanzen, die in geringer Konzentration vorliegen, werden die Massenspektren vom
Untergrundrauschen oft derart verfälscht, daß eine Identifizierung des Spektrums sehr
erschwert wird oder kaum möglich ist (vgl. Abb. 3.1.2-1, 1µl).
In diesen Fällen ist es vorteilhaft eine größere Menge an Extrakt einzuspritzen (vgl.
Abb. 3.1.2-1, 5µl). Ein zu starkes Einengen von Probenextrakten sollte vermieden
werden, da es häufig zu einem Ausfallen von mitextrahierten Begleitstoffen kommt,
wobei Wirkstoffe mitgerissen werden können und zudem die Gefahr besteht, daß
Pestizide sich teilweise verflüchtigen.
Im SIM-Modus ist eine gezielte Aufnahme ausgewählter Massen mit höherer
Empfindlichkeit möglich. Durch eine geeignete Auswahl dieser Massen können durch
begleitende Stoffe verursachte Störungen meist ausgeschaltet werden. Auch die
Bestimmungsgrenzen im SIM-Modus können durch den Einsatz höherer Mengen des
Extraktes verbessert werden, da das Verhältnis von Peakhöhe zu Untergrundrauschen
günstiger wird (vgl. Abb. 3.1.2-2).
Größere Volumina bis z.B. 10 µl können mit einem Kaltaufgabesystem (KAS) als
Injektionssystem aufgegeben werden, das die Möglichkeit einer Lösungsmittelausblendung
bietet. Durch Verwendung eines KAS (Fa. Gerstel) konnten die Nachweis-
und Bestimmungsgrenzen deutlich erniedrigt werden. Die Verwendung des KAS als
Injektionssystem bietet noch weitere Vorteile: Durch die Aufgabe der Probe in ein kaltes
Injektionssystem werden die Analyten im Vergleich zu anderen Injektionsmöglichkeiten
thermisch weniger belastet. Der Großteil der schwerflüchtige Begleitstoffe aus dem
Probenextrakt verbleiben in dem etwa 10 cm langen Injektionsliner. Dadurch wird die
analytische Säule geschont. In der Praxis ist ein regelmäßiges Austauschen der
Injektionsliner erforderlich, da Verschmutzungen an der Oberfläche mit Analyten
unerwünschte Wechselwirkungen eingehen können (siehe Kap. 3.1.2.2).
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22

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.2-1: Massenspektren von Malathion in einem Clementinen-Extrakt
(0,5 g/ml) bei verschiedenen Injektionsvolumina, Malathion 0,25 ng/µl
Abundance
750
700
650
600
550
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
Abundance
0
m/z-->
16000
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
m/z-->
7000
6000
5000
4000
3000
2000
69
69 79
83
63 79
93
97
111
Scan 485 (15.505 min): 0802007.D
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280
111
125
127
125
127
143
149
158
158
173
173
187
201
185 199
207
229
211 229
243
255
243 256
261
276
271
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280
93
143
158
1000
100
211
256
285
0
m/z-->
60 80 100 120 140 160
184 199
180 200
227238
220 240
286
271
260 280
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
1 µl
5 µl
Vergleichsspektrum aus der
Spektrenbibliothek (HPPest)
285
287
23

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.2-2: Nachweis von Brompropylat bei unterschiedlichen Injektions
volumina (GC/MSD-SIM-Modus) 0,5 g Orangenextrakt/ml,
nach der GPC
96
94
92
90
88
86
84
82
80
78
76
74
72
70
68
66
64
62
60
58
56
54
1µl
Brompropylat
1,5 pg
52
50
Time-->
21.20 21.40 21.60 21.80 22.00 22.20 22.40 22.60 22.80
50
Time-->
21.20 21.40 21.60 21.80 22.00 22.20 22.40 22.60 22.80
130
125
120
115
110
105
100
95
90
85
80
75
70
65
60
55
3µl
Brompropylat
4,5 pg
Bei Betrachtung der Abb. 3.1.2-2 fällt eine überproportionale Zunahme der Peakfläche
des Brompropylat bei Einspritzung eines höheren Volumens auf. Die Gründe hierfür
liegen zum einen an der Verbreiterung der Peaks, wodurch Anteile des Analyten im
Untergrundrauschen verschwinden und zum anderen an Abbauvorgängen,
insbesondere im Injektionssystem. Diese Effekte fallen bei niedrigen Konzentrationen
stärker ins Gewicht. Dieser Sachverhalt wird im folgenden Kapitel näher erläutert.
3.1.2.2 Einflüsse des Injektionssystems und „Matrixeinflüsse“
Bei der gaschromatographischen Bestimmung einiger Substanzen wird das Verhältnis
zwischen der in das GC-System eingebrachten Substanzmenge und dem
resultierenden Detektorsignal durch verschiedene Faktoren stark beeinflußt. Es ist z.B.
seit langem bekannt, daß das Lösungsmittel, in dem die zu messende Probe gelöst ist,
einen Einfluß auf die Bestimmung haben kann („Lösungsmitteleinflüsse“).
Der Zustand der mit der Probe in Kontakt kommenden Flächen des jeweiligen Einspritzsystems
hat ebenfalls einen großen Einfluß. Die Probe wird z.B. bei einer split/splitless-
Injektion oder bei einem KAS primär in einen durch Silylierung oberflächlich
desaktivierten Injektionsliner eingespritzt. Der „Aktivitätsgrad“ der Oberfläche des
Injektionsliners nimmt mit zunehmender Benutzungsdauer zu, da durch Abspaltung von
Silylresten freie Silanol-Gruppen entstehen. Die Oberflächen von Injektionsliner und
Vorsäule werden von Einspritzung zu Einspritzung immer mehr mit einem Film
schwerflüchtiger Verbindungen belegt. Diese „Schmutzbeläge“ weisen ebenfalls eine
„aktive“ Oberfläche auf. Substanzen können mit diesen aktiven Stellen im
Injektionssystem in Wechselwirkung treten, wodurch Abbaureaktionen quasi katalysiert
werden.
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24

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Bei zahlreichen Stoffen wie Dicofol, Captan, Folpet und einigen N-Methyl-Carbamaten
machen sich die beschriebenen Effekte nachweislich in Form eines Abbaus bemerkbar.
Die Bildung ihrer Abbauprodukte (p,p’-Dichlorbenzophenon, Tetrahydrophthalimid,
Phthalimid und die korrespondierenden Phenole der N-Methyl-Carbamate) nimmt mit
dem Benutzungs- und Verschmutzungsgrad des Injektionssystems zu. Zum Beispiel
wurde beobachtet, daß die Verbindung Azinphos-Methyl nach längerem Gebrauch des
Injektionsliners kaum mehr detektierbar ist.
Die Wechselwirkung zwischen diesem „Schmutzbelag“ und verschiedenen Verbindungen
bewirkt eine unerwünschte Retention und macht sich auch in der Peakform z.B.
bei Thiabendazol, Imazalil und Prochloraz als Tailing deutlich bemerkbar (vgl. Abb.
3.1.5-28 in Kap. 3.1.5.5.2.3). Dieses Tailing ist um so ausgeprägter je stärker der
Verschmutzungsgrad des Injektionssystems und der Vorsäule ist.
Matrixeinflüsse:
Eine wesentliche Rolle spielen aber auch die Art und Konzentration der in der Probelösung
befindlichen Matrixbestandteile [vgl. 27,28]. Es wurde beispielsweise festgestellt,
daß ein mit Thiabendazol versetzter Probenextrakt wesentlich höhere Signale
erbrachte, als eine Lösung dieses Stoffes in reinem Lösungsmittel, obwohl beide
Lösungen die gleiche Konzentration an Thiabendazol aufwiesen und gleiche chromatographische
Bedingungen vorlagen [29].
Matrixbestandteile in den Probeextrakten wirken offenbar „schützend“ auf die Wirkstoffe,
in dem sie aktive Stellen im Injektionssystem besetzen. In Abb. 3.1.2-3 wird die
„Schutzwirkung“ der Matrix am Beispiel der Substanz Dicofol verdeutlicht. Auffällig ist,
daß bei Anwesenheit von Matrix die Zersetzung von Dicofol zu p,p´-Dichlorbenzophenon
in erheblich kleinerem Umfang abläuft.
Es wurde untersucht, in welchem Maße die Bestimmung verschiedener Wirkstoffe
durch die oben beschriebenen Effekte beeinflußt wird. Hierzu wurden Kalibrierungen in
reinem Lösungsmittel und in Lösungen mit unterschiedlichem Matrixanteil erstellt und
verglichen. Wie aus Tab. 3.1.2-1 zu entnehmen ist, spielen für viele der Stoffe (unter
den genannten Bedingungen) „Matrixeinflüsse“ eine vernachlässigbare Rolle (vgl. Abb.
3.1.2-4, Ethion). Bei anderen Stoffen dagegen können diese Effekte bei der
Quantifizierung der Rückstände auf keinen Fall außer acht gelassen werden (vgl. Abb.
3.1.2-4, Azinphos-Methyl). Derartige „Matrixeinflüsse“ auf die gaschromatographische
Bestimmung von Wirkstoffen wurden sowohl bei den Extrakten der DFG-Methoden S8
oder S19 als auch bei den SFE-Extrakten festgestellt. In der Regel zeigen die
ungereinigten Extrakte der klassischen (naßchemischen) Aufarbeitungsmethoden viel
stärkere Matrixeffekte als SFE-Extrakte, während die über Gelpermeationschromatographie
(GPC) gereinigten Extrakte in etwa vergleichbare Effekte zeigen.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zum Einfluß der Matrix bei der gaschromatographischen
Bestimmung wurden in [29] veröffentlicht.
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25

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.2-3: Matrixeinflüsse, thermisch bedingter Abbau des Dicofols im
Injektionssystem
FlV
FlV
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
Dicofol
Matrix-Eichung
Lösungsmittel-Eichung
0 2 4 6 8 10
p,p´- Dichlorbenzophenon
Lösungsmittel-Eichung
Matrix-Eichung
Konzentration [µg/ml]
0 2 4 6 8 10
Konzentration [µg/ml]
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Cl
Cl
HO CCl3
Dicofol
O
CHCl3
Cl
p,p´-Dichlorbenzophenon
26
Cl

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.2-4: Matrixeinflüsse am Beispiel Ethion und Azinphos-Methyl
FlV
FlV
7
6
5
4
3
2
1
0
2,5
1,5
0,5
Ethion
Matrix-Eichung
Lösungsmittel-Eichung
0 2 4 6 8 10
Konzentration
2
1
0
Azinphos-Methyl
Matrix-Eichung
Lösungsmittel-Eichung
0 2 4 6 8 10
Konzentration
CH3CH2O
CH3CH2O P
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S
O
S S P
N
N N
Ethion
S
S
S P
Azinphos-Methyl
OCH2CH3
OCH2CH3
OCH3
OCH3
27

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.1.2-1: Auftreten von „Matrixeinflüssen“, GC/MSD (Säule HP5, 30 m),
Injektor: KAS, silylierter Glasliner, Einspritzmenge 3 µl [29]
Matrix - und Lösungsmittel-Eichungen im Vergleich
Substanz
vor der GPC:
Matrixkonzentration
0,6 g Zitrone/ml
Wirkstoffkonzentration in
mg/kg bez. auf Frucht
nach der GPC:
Matrixkonzentration
1,25 g Zitrone/ml
Wirkstoffkonzentration in
mg/kg bez. auf Frucht
0,2 0,4 1 4 0,1 0,25 0,5 1,0 3,5
Azinphos-Methyl +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
Bromacil + +
Brompropylat +++ +++ ++ 0 ++ ++ ++ + 0
Carbaryl + +
Chlorfenvinphos 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Chlorfenson 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Chlorpyrifos 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Chlorpyrifos-Methyl 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Chlorthalonil ++ + 0 0 + 0 0 0 0
Diazinon 0 0 0 0 - - 0 0 0
Dichlofluanid 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Dichloran 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Dicofol +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ ++
Dimethoat ++ ++ 0 0 ++ ++ + 0 0
Endosulfan (-beta) 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Endosulfan (-alpha) 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Endosulfansulfat + + 0 0 + 0 0 0 0
Ethion 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Fenarimol + 0 0 0 0 0 0 0 0
Fenitrothion ++ + + 0 + + 0 0 0
Fenpropimorph - - 0 0 0 0 0 0 0
Fenthion - - - - - - - - 0
Fonofos 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Imazalil* +++ +++ +++ +
Malathion + 0 0 0 0 0 0 0 0
Mecarbam + 0 0 0 + 0 0 0 0
Metalaxyl 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Methidathion ++ + + 0 + + + 0 0
Myclobutanil + 0 0 0 + + + 0 0
Orthophenylphenol ++ + 0 0 + 0 0 0 0
p,p´-Dichlorbenzophenon --- --- --- --- --- --- --- --- ---
Parathion 0 0
Parathion-Methyl ++ ++ 0 0 + 0 0 0 0
Pirimiphos-Methyl 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Prochloraz +++ ++ +
Procymidon 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Propiconazol + + 0
Pyridaphenthion 0 0
Quinalphos 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Tetradifon 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Thiabendazol +++ +++ +++ +++
Tolylfluanid + + 0 0 0 0 0 0 0
Vinclozolin 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Verhältnis von Eichung auf Matrix zu Eichung in reinem Lösungsmittel in %: --- = unter 20% ,
- = 75-89% , 0 = 90-112% , + = 113-124% , ++ = 125-150% , +++ = über 150%
Die Auswertung erfolgte über zwei interne Standards.
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28

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.2.3 Berücksichtigung der „Matrixeinflüsse“ bei der
Bestimmung
Die Verwendung von „Eichungen auf Matrix“ ist zur korrekten Quantifizierung von
Substanzen, bei denen deutliche „Matrixeinflüsse“ auftreten, unumgänglich. Eine
Möglichkeit hierfür sind „externe Matrix-Eichungen“ d.h. zur Kalibrierung werden
matrixhaltige Standards verwendet. In diesem Fall muß für jede zu untersuchende
Probe eine gleichartige, pestizidfreie Blindprobe aufgearbeitet werden. Die Eichlösungen
werden durch Zusatz der entsprechenden Wirkstoffe zu den Extrakten der
Blindprobe hergestellt. Um „Matrixeinflüsse“ auszugleichen, muß darauf geachtet
werden, daß Eichlösungen und Probenextrakt in etwa die gleiche Konzentration an
Matrix aufweisen.
Eine weitere Möglichkeit sind „innere Eichungen“ nach dem Standardadditionsverfahren.
Dazu wird der Probenextrakt in mehrere Aliquote geteilt, die mit den entsprechenden
Wirkstoffen in unterschiedlichen Mengen dotiert werden (parallele
Standardaddition, vgl. Abb. 3.1.2-5).
Abb. 3.1.2-5: Prinzip der “inneren Eichung“ nach einer Aliquotierung
(„parallele“ Standardaddition)
Probenextrakt
(mit internem Standard)
Aliquotierung
Aliquot 1 Aliquot 2 Aliquot 3 Aliquot 4
Standardaddition Standardaddition Standardaddition
Volumenausgleich Volumenausgleich Volumenausgleich Volumenausgleich
Meßlösung 1 Meßlösung 2
Meßlösung 3
29
Meßlösung 4
Messung Messung Messung Messung
Kalibrierung
Vorteilhaft bei diesem Verfahren ist, daß eine zusätzliche Aufarbeitung von pestizidfreier
Matrix, die von der Probenmatrix mehr oder weniger abweichen kann (Sorte,
Reifegrad, Schalen- u/o Kernanteil), entfällt. Abb. 3.1.2-6 zeigt das Prinzip einer solchen
Kalibrierung und Abb. 3.1.2-7 eine Kalibrierung am Beispiel Imazalil.
Abb. 3.1.2-6: „Innere Eichung“ nach dem Standardadditionsverfahren
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Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Flächenverhältnis
Analyt/ISTD
|x|
zugegebene Menge an Analyt (Aufstockung)
|x|: Absolute Menge an Analyt im Probenextrakt vor der Dotierung (y=0)
Abb. 3.1.2-7: „Innere Eichung“ („parallele“ Standardaddition)
beispielhaft für Imazalil in Orangenextrakt
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
ermittelte Gehalte:
über innere Eichung: 0,83 ppm
über Lösungsmitteleichung: 1,9 ppm
undotiert
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y = 233,82x + 57,882
R 2 = 0,9997
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
zudotierte Menge an Imazalil in µg pro 0,3 g Probenaliquot
In Anbetracht der geringen Probenmenge, die bei der SFE extrahiert wird, ist diese Art
der inneren Eichung, bei der Aliquotierungen vorgenommen werden, häufig nicht
praktikabel. „Innere Eichungen“ nach dem Standardadditionsverfahren können aber
auch ohne eine Aliquotierung erstellt werden, in dem die gleiche Probelösung mehrfach
mit Standard aufgestockt und gemessen wird. Die Tatsache, daß die Matrixeffekte nach
jeder Standardzugabe verringert werden (Matrixkonzentration nimmt ab) bleibt hier
allerdings unberücksichtigt, weshalb es wichtig ist kleine Volumina zu dotieren
(vergleiche Abb. 3.1.2-8).
30

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.2-8: Prinzip der „inneren Eichung“ (Standardadditionsverfahren)
Probelösung
(mit ISTD)
Messung
Standardaddition
Messung Erstellung einer
Kalibrierung
Standardaddition
Messung
In der Regel zeigen Eichungen auf Matrix im Vergleich zu den entsprechenden
„Lösungsmittel-Eichungen“ eine deutlich bessere Linearität.
Zur Minimierung gerätebedingter Effekte, ist auf jeden Fall der regelmäßige Austausch
des Injektionsliners und/oder der Vorsäule zu empfehlen. Damit möglichst gleiche
Gerätebedingungen bei der Bestimmung vorliegen, empfiehlt es sich, die zu vergleichenden
Lösungen (Probelösung und Eichlösung) in kleinem zeitlichen Abstand zu
chromatographieren.
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31

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.3 Optimierung der Probenvorbereitung
3.1.3.1 Zerkleinerung (Erzeugung repräsentativer Teilproben)
Ziel der Probenvorbereitung ist es, Teilproben zu erhalten, die für die Gesamtprobe
repräsentativ sind. Hierbei muß jedoch darauf geachtet werden, daß die Verluste von
Substanzen durch Abbauvorgänge so gering wie möglich gehalten werden. Geeignete
Probenvor- und aufbereitungsstrategien sind daher erforderlich.
Da bei der SFE relativ wenig Probemenge pro Versuch eingesetzt wird (z.B. bis zu ca. 3
g bei Verwendung des HP 7680 Extraktors), muß besonders darauf geachtet werden,
daß die eingesetzten Obst- und Gemüseproben gut homogenisiert werden. Bei einigen
Matrizes wie Salaten, Kernobst und Erdbeeren bereitet dies in der Regel keine
Probleme. Bei anderen Proben ist jedoch die Erzielung einer ausreichenden
Homogenität schwieriger. Zum Beispiel werden bei Trauben mit den üblichen Zerkleinerungsmethoden
die Schalen, auf denen sich oberflächlich aufgebrachte Wirkstoffe
zum Großteil befinden, nicht in dem gewünschten Grad zerkleinert, wodurch bei
Gehaltsbestimmungen zwangsläufig hohe statistische (zufällige) Fehler auftreten (vgl.
Kap. 3.1.4.7.1).
Während der Probenvorbereitung (Grob- und Feinzerkleinerung) treten in größerem
oder kleineren Umfang Wirkstoffverluste auf. Durch die Feinzerkleinerung der Probe
wird die Kompartimentierung der Zellen aufgehoben, wodurch Enzyme, die für Abbauvorgänge
verantwortlich sind, freigesetzt werden. Darüber hinaus wird sauerstoffhaltige
Luft in die Matrix eingeschlagen. Verschiedene enzymatische und chemische
Reaktionen (auch Verknüpfungsreaktionen mit Matrixbestandteilen) werden dadurch
ermöglicht oder begünstigt. Zudem kann die bei dem Feinzerkleinerungsprozeß
freigesetzte Wärme zu einer Beschleunigung von Abbauprozessen führen.
Bei den Abbauvorgängen im zerkleinerten Probenmaterial spielen enzymatisch
katalysierten Reaktionen (Oxidationen, Hydrolysen u.a.) eine wichtige Rolle. Um solche
Reaktionen zu vermeiden, muß die Aktivität der Enzyme so weit wie möglich
unterdrückt oder ausgeschaltet werden.
Enzyme sind biochemische Katalysatoren. Ihre Aktivitäten hängen stark von den
vorherrschenden Bedingungen im Reaktionsmedium ab. So zeigen z.B. viele Enzyme
bei Verringerung des verfügbaren Wassers (aw-Wert), z.B. durch Zusatz von Salzen,
einen Aktivitätsrückgang. Oxidasen zeigen in der Regel ein pH-Optimum im neutralen
pH-Bereich. Unterhalb pH=3 werden Phenolasen irreversibel denaturiert. Ähnliches gilt
auch für Temperaturen oberhalb 85°C (Blanchieren). Solch drastische Bedingungen
können aber nicht zum Schutz der Proben vor enzymatischer Oxidation angewendet
werden, ohne die Zersetzung empfindlicher Pestizide befürchten zu müssen.
Desweiteren ist es theoretisch möglich unerwünschte enzymatische Reaktionen z.B.
durch Vergiftung von Enzymen zu unterdrücken (z.B. bei Oxidasen durch
Komplexierung des Kupfers im aktiven Zentrum mit EDTA, Sulfid oder Zitronensäure).
Enzymatische und chemische Oxidationen können z.B. durch Zusatz antioxidativ
wirksamer Stoffe, wie zum Beispiel Ascorbinsäure oder Schwefeldioxid unterdrückt
werden.
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32

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Die Anwendbarkeit von Antioxidantien, Enzymvergiftern, Säuren und Salzen wurde im
Rahmen dieser Arbeit allerdings nicht näher untersucht.
Ein eleganter Weg Oxidationen zu vermeiden ist, die Verdrängung der sauerstoffhaltigen
Luft in der Probe durch Trockeneis oder flüssigem Stickstoff, wobei gleichzeitig
die Probe auch gekühlt wird [2,128].
Durch Einhaltung niedriger Temperaturen werden chemische und enzymatische
Prozesse, die zu einem Wirkstoffabbau führen können, erheblich verlangsamt.
Eine sehr einfache Möglichkeit die Temperaturen während der Zerkleinerung tief zu
halten ist die Proben in gefrorenem Zustand feinzuzerkleinern. Diese Vorgehensweise
ist sehr einfach durchzuführen und hat sich als sehr vorteilhaft auch im Hinblick auf den
Zerkleinerungsgrad erwiesen. Die Zerkleinerung wird durch die Eiskristalle in den Zellen
unterstützt. Das Material ist nach der Feinzerkleinerung in der Regel ausreichend
homogen und befindet sich noch in gefrorenem Zustand. Eine Separierung der
wäßrigen (Saft) von der festen Phase (Zellwände) findet praktisch nicht statt. Die
zerkleinerten Proben lassen sich schnell wieder tiefgefrieren. Auf diese Weise wird in
der Regel eine bedeutend bessere Homogenität erreicht als bei einer Zerkleinerung der
Proben bei Raumtemperatur. Dies wurde am Beispiel einer Traubenprobe gezeigt
(siehe Tab. 3.1.3-1 und Abb. 3.1.3-1).
Die bessere Homogenität macht sich auch in der geringeren Streuung der Analysenwerte
bei der gefroren zerkleinerten Traubenprobe bemerkbar (siehe auch Kap.
3.1.4.7.1).
Tab. 3.1.3-1: Auswirkungen unterschiedlicher Zerkleinerungsarten
(vgl. Abb. 3.1.3-1).
Zustand der Beobachtungen nach der Feinzerkleinerung
Probe vor der Zerkleinerungs- Durchmesser der Zustand der Sonstiges
Feinzerkleinerung dauer Schalenfragmente Kerne
„frisch“ etwa 40 s etwa 0,5-1 cm meist ganz größere
Fruchtfleischstücke
noch vorhanden
tiefgefroren etwa 15 s etwa 0,5-3 mm zerkleinert Fruchtfleisch fein
verteilt, zahlreiche
Luftbläschen
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33

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.3-1: „frisch“ und tiefgefroren zerkleinerte Trauben „Alphonse Lavallee“
(vgl. Tab. 3.1.2-1)
„frisch“ zerkleinert
Abbildungs-Maßstab 1:1
tiefgefroren zerkleinert
Abbildungs-Maßstab 1:1
Der höhere Zerkleinerungsgrad der durch die Zerkleinerung in tiefgefrorenem Zustand
erreicht wird, wirkt sich auch positiv auf die Extrahierbarkeit aus. Bei einem
entsprechenden Versuch wurden aus einer gefroren zerkleinerten Orange bedeutend
bessere Ausbeuten der Fungizide Imazalil und Thiabendazol erzielt. Die unterschiedlich
zerkleinerten Orangenproben wurden je zwei Mal extrahiert (erster Extraktionsschritt mit
Aceton:Wasser 3:1, pH 3-4, zweiter Extraktionsschritt mit Aceton:Wasser 4:1, pH∼9,5).
Während bei der zweiten Extraktion von frisch zerkleinerten Proben noch beträchtliche
10-15 % dieser Wirkstoffe erfaßt wurden, wurden bei gefroren zerkleinerten Proben nur
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34

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
noch 4-7 % gefunden [vgl. 29]. Die verbesserte Extraktion der gefroren zerkleinerten
Orange war darüber hinaus auch an der deutlich geringeren Farbintensität, die der
extrahierte Filterkuchen nach der ersten Extraktion aufwies, erkennbar.
3.1.3.2 Entfernung bzw. Immobilisierung von Wasser
Obst- und Gemüseproben haben einen hohen Gehalt an Wasser. Dieses Wasser muß
vor der SFE-Extraktion gebunden oder entfernt werden. Zur Entfernung oder
Immobilisierung von Wasser werden in der Literatur verschiedene Vorgehensweisen
beschrieben wie z.B. Gefriertrocknung [40], die Verwendung von chemischen Trockenmitteln
wie Magnesiumsulfat, Natriumsulfat [8,41,42] und der Zusatz von Wasser
adsorbierenden Materialien, die eine große Oberfläche besitzen und dadurch in der
Lage sind, große Mengen an Wasser physikalisch zu binden. Durch die Vermengung
der Probe mit dem Adsorbens kommt es zu einer starken Oberflächenvergrößung,
wodurch die Extraktion erleichtert wird [1,2,12,9].
3.1.3.2.1 Wasserentfernung durch Gefriertrocknung
Die Gefriertrocknung ist eine relativ schonende Methode, einer Probe Wasser zu
entziehen und die Probe aufzukonzentrieren. Dadurch ist es theoretisch möglich, mehr
Probe für die Extraktion einzusetzen und somit die Nachweisgrenzen herabzusetzen.
Der Trocknungsvorgang dauert jedoch einige Stunden. Bei Proben mit relativ viel
Zucker wie z.B. Südfrüchten bilden sich karamelartige, pasteuse Massen, die den
Trocknungsvorgang verzögern und ggf. Rückstände einschließen. Getrocknete Proben
nehmen schnell Luftfeuchtigkeit auf, so daß ihre Handhabung Sorgfalt verlangt.
Desweiteren bestehen Bedenken, daß es unter den Bedingungen der Gefriertrocknung
zu einer Verflüchtigung von Wirkstoffen kommen kann.
Die Gefriertrocknung ist nach unserer Erfahrung mit einem großen Arbeitsaufwand
verbunden und bringt keine entscheidenden Vorteile.
3.1.3.2.2 Wasserbindung durch Adsorbentien
Zur Wasserbindung werden verschiedene Adsorbentien auf Basis von Diatomeenerde
eingesetzt, die natürlicherweise eine sehr große Oberfläche aufweisen (z.B. Hydromatrix
(Varian), Kieselgur, Celite) [1,2,12].
Die vorzerkleinerte und homogenisierte Obst- oder Gemüseprobe wird hierbei in einem
bestimmten Verhältnis (z.B. 2,5:2) mit einem Adsorbens vermengt. Aliquote des
homogenen Gemisches werden in Extraktionshülsen gefüllt und bis zur Extraktion
tiefgefroren aufbewahrt.
Diese Art der Probenvorbereitung ist einfach durchzuführen, erfordert wenige
Arbeitsschritte und ermöglicht eine effiziente Extraktion von Rückständen.
Versuche haben gezeigt, daß das Mischungsverhältnis von Probe zu Adsorbens einen
großen Einfluß auf die Extrahierbarkeit von unpolaren Analyten hat (vgl. hierzu Kap.
3.1.4.7.3 und 3.1.7.1).
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35

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.4 SFE-Multimethoden für Pestizide in Obst und Gemüse
Eine Multimethode ist in der Regel nur ein Kompromiß. Nicht alle Substanzen sind unter
den ausgearbeiteten Bedingungen optimal extrahierbar. Verluste von Substanzen
werden oft bewußt in Kauf genommen, um ein möglichst gutes Gesamtergebnis bei
einem angemessenen Aufwand zu erzielen.
In Rahmen dieser Arbeit wurde eine SFE-Multimethode zur Aufarbeitung von Obst- und
Gemüseproben ausgearbeitet. Sehr hilfreich für die Entwicklung dieser Methode waren
die Arbeiten von Lehotay et al [1,2]. Im folgenden werden Versuche zur Optimierung der
Extraktionsbedingungen vorgestellt.
3.1.4.1 Optimierung der Extraktionsbedingungen
Selbst bei hoher CO2-Dichte weisen SFE-Extrakte von Obst und Gemüse noch eine
relativ hohe Reinheit auf. Daher wurden bei der Methodenoptimierung nur Dichtebereiche
von >0,85 g/ml ausgewählt.
Prinzipiell ist es möglich durch die Einstellung einer geringeren Dichte, Extraktionen
selektiver zu gestalten. Dies war jedoch bei den Applikationen im Bereich der
Pestizidrückstandsanalytik nicht erforderlich.
Selbst als die SFE-Extraktionen bei relativ drastische Extraktionsbedingungen
durchgeführt wurden, waren im allgemeinen die gewonnenen Extrakte in ihrer Reinheit
mit den Extrakten herkömmlicher Multimethoden vergleichbar obwohl bei diesen z.T.
sehr arbeits- und zeitaufwendige Clean-up Arbeitsschritte durchgeführt werden (siehe
hierzu auch Abb. 3.1.4-1).
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36

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.4-1: MSD-Chromatogramme eines SFE-Extraktes und eines DFG S8-
Extraktes [3] aus Birnen im Vergleich (SCAN-Modus)
(SFE-Bedingungen siehe Anlage1)
Abundance
1400000
1300000
1200000
1100000
1000000
900000
800000
700000
600000
500000
400000
300000
200000
100000
0
Time-->
Abundance
1200000
1100000
1000000
900000
800000
700000
600000
500000
400000
300000
0
Time-->
11.39
12.41
13.20
13.26
12.87
12.83
12.13
11.28
12.63
11.39
14.45
TIC: 0301001.D
Birne, SFE-Extrakt 2g/ml Acetonitril, 1 µl in KAS, SCAN
Diphenylamin
Fettsäuren
15.41
15.29
14.93
16.94
16.85
Fettsäuren
17.37 17.67 17.75
17.31
17.21
Procymidon
Fettsäuren
ISTD
20.99
Iprodion
21.74
Phthalat
Phosalon
12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00
12.41
Diphenylamin
13.20
200000
10.24 10.37
10000010.42
11.28
13.26
15.42
12.76 13.23
12.88
12.83 14.45
12.13
11.66 12.01 12.05
11.89 11.96 12.24 12.72
12.5313.46
14.93
14.51
14.70 15.29 15.56
TIC: 0401002.D
Birne, S8-Extrakt 2g/ml Isooktan, 1 µl in KAS, SCAN
Fettsäuren
16.94
16.85
Fettsäuren
Procymidon
17.77
17.67
17.04 17.21
(KAS= Kaltaufgabesystem)
Fettsäuren
ISTD
20.99
Iprodion
21.75
Phthalat
23.41
23.59
Phosalon
12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00
Um festzustellen, wie sich eine Veränderung der Extraktionsparameter (Temperatur,
Druck, Dichte, Modifier) auf die Extraktionsausbeuten auswirkt, wurde eine mit
Hydromatrix im Verhältnis 3:2 vermengte Salatprobe bei unterschiedlichen Bedingungen
extrahiert.
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37

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.1.4-1: Untersuchungsergebnisse eine Salatprobe bei Variation der
Extraktionsparameter
Extraktionsbedingungen ermittelte Gehalte
in mg/kg
Modifier
Temperatur Druck Dichte Procymidon Oxadixyl direkt in die
(°C) (bar) (g/ml)
Extraktionshülse
45 376 0,93 0,021 0,027
50 350 0,9 0,025 0,032
55 347 0,88 0,022 0,029
60 329 0,85 0,026 0,031
50 350 0,9 0,022 0,020 0,5 ml Methanol
55 347 0,88 0,021 0,030 0,5 ml Methanol
60 329 0,85 0,020 0,025 0,2 ml Methanol
60 329 0,85 0,024 0,029 0,5 ml Methanol
Wie in Tab. 3.1.4-1 ersichtlich, ließen sich durch die Variation der aufgeführten
Parameter keine signifikanten Unterschiede bei den Extraktionsausbeuten der Pestizide
feststellen. Die Abweichungen liegen innerhalb der üblichen analytischen Streubereiche
[18].
Variation des Elutionsmittels der Festphasenfalle:
Bei Verwendung des HP-Gerätes werden die Extrakte auf einer Festphasenfalle (z.B.
ODS) aufgefangen. Nach der Extraktion werden sie mit Hilfe eines organischen
Lösungsmittels aus der Festphasenfalle in ein 1,5-ml Vorlagegläschen eluiert. Dabei
kann die Falle beheizt werden. Um die gewünschten Analyten in das 1,5 ml Vorlagegläschen
zu eluieren, ist es wichtig ein Lösungsmittel auszuwählen das gute Lösungseigenschaften
aufweist.
In einem Versuch wurden die Lösungsmittel Acetonitril und Methanol diesbezüglich miteinander
verglichen (siehe Tab. 3.1.4-2).
Unpolare Lösungsmittel wie Isooctan wurden nicht in den Versuch miteinbezogen, da
sie das nach der Extraktion oft etwas feuchte Festphasenmaterial nicht benetzen
können.
Auch bei diesem Versuch lagen die Unterschiede in den erzielten Ergebnissen innerhalb
der üblichen analytischen Streubreite (siehe Tab. 3.1.4-2).
Acetonitril ist prinzipiell wegen seines höheren Siedepunktes und der geringeren
Polarität besser für die Gaschromatographie geeignet als Methanol.
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38

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.1.4-2: Vergleich von Acetonitril und Methanol als Elutionslösungsmittel,
extrahierte Probe: Salat
Pestizid
Lösungsmittel
(in mg/kg)
Dimethoat Vinclozolin Procymidon Oxadixyl Benalaxyl
Methanol 0,53 0,82 2,7 0,70 0,008
0,54 0,89 2,76 0,76 0,006
0,61 0,98 2,95 0,88 0,010
0,66 1,16 3,21 0,85 0,010
Mittelwert
0,59 0,96 2,91 0,80 0,009
Acetonitril 0,57 1,31 3,35 0,78 0,007
0,57 1,17 3,00 0,77 0,008
0,57 1,21 3,05 0,73 0,008
0,61 1,00 2,62 0,78 0,008
Mittelwert
0,58 1,17 3,01 0,77 0,008
Gesamt-Mittelwert (n=8) 0,58 1,07 2,96 0,78 0,008
Variationskoeffizient
in %
7,3 15,9 8,6 7,5 16,7
3.1.4.2 Durchführung der Multimethode
In Abb. 3.1.4-2 sind schematisch die Arbeitsschritte der ausgearbeiteten SFE-
Multimethode aufgeführt. Eine detaillierte Analysenvorschrift findet sich in Anlage 1
(Code 100E3101). Die allermeisten Obst- und Gemüsesorten können nach diesem
Verfahren aufgearbeitet werden. Je nach Matrix können geringfügige Abweichungen
von diesem Schema erforderlich sein (vgl. Kap. 2.6.2).
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39

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.4-2: Durchführungsschema der Multimethode (siehe auch Anlage 1)
Analyse mit
LC/MS
Extraktionsbedingungen:
SFE-Parameter für HP 7680T:
Probenvorbereitung
ggf. pH-Wert-Einstellung
Probe mit Hydromatrix vermischen
(Verhältnis: z.B. 3:2,5)
ein Aliquot in die Extraktionshülse füllen
Supercritical Fluid Extraction (SFE)
• Extraktionsdruck: 329 bar, Temperatur: 55°C
• Dichte: 0,89 g/ml
• statische Extraktion: 2 min
• dynamische Extraktion: 25 min
• CO2-Fluß: 1,8 ml/min
• Fallenmaterial: ODS, 10°C während der Extraktion
• Elutions-Lösungsmittel: Acetonitril
ggf.
Derivatisierung
GC/MSD Analyse
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40

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
SFE-Parameter für ISCO SFX 3560:
• Extraktionsdruck: 330 bar, Temperatur: 55°C
• Dichte: 0,89 g/ml
• statische Extraktion: 2 min
• dynamische Extraktion: 25 min
• CO2-Fluß: 1,8 ml/min
• Lösungsmittel in der Vorlage: 10 ml Aceton:Acetonitril (4:1)
• Temperatur der Vorlage: 0°C
3.1.4.3 Wiederfindungsversuche
3.1.4.3.1 Vorgehensweise bei Dotierungen
Für Wiederfindungsversuche wurde unbehandeltes Probenmaterial zerkleinert und
portionsweise (z.B. 3 g oder 2,5 g) in 50 ml Bechergläser (hohe Form) eingewogen.
Anschließend wurde mit den Standardlösungen in Aceton dotiert. Die Konzentration
der Standardlösungen wurde so gewählt, daß bis max. 200 µl der Lösung zugegeben
werden mußten. Nach Zugabe von z.B. 2 g Hydromatrix wurde der Ansatz intensiv
mit einem Spatel vermischt, für einige Minuten zur Verdampfung des Lösungsmittels
stehen gelassen und quantitativ in die Extraktionshülse überführt.
Auf ähnliche Art und Weise wurden weitere Probenaliquote mit der gleichen Menge
reinen Acetons versetzt und wie oben beschrieben weiter aufgearbeitet. Die daraus
erhaltenen Extrakte dienten zur Herstellung von „Matrix-Eichungen“.
Wenn eine pH-Wert Einstellung nötig war, wurde zunächst das Probenmaterial auf
den gewünschten pH-Wert eingestellt (z.B. durch Zugabe von 50 %iger K2CO3-
Lösung) und wie oben beschrieben weiter verfahren.
Bei flüssigen Proben wie Orangensaft wurden auch größere Probenmengen dotiert
und mit Hydromatrix im entsprechenden Verhältnis vermischt. In die Extraktionshülsen
wurden dann Aliquote dieser Mischung eingewogen. Diese Vorgehensweise
bereitete bei zerkleinertem Obst und Gemüse Probleme, da keine ausreichende
Homogenität erzielt werden konnte.
3.1.4.3.2 Wiederfindungen mit HP 7680T
Für die Durchführung von Wiederfindungsversuchen wurde zunächst eine Mischung
von Pestiziden aus unterschiedlichen Pestizidklassen zusammengestellt. Die Dotierung
erfolgte auf pestizidfreie Apfelmus-Matrix (Dotierung 0,5 µg pro 3 g Probe,
entsprechend 0,167 ppm). Die hierbei erzielten Wiederfindungen und Variationskoeffizienten
sind in Tab. 3.1.4-3 angegeben.
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41

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.1.4-3: Wiederfindungen verschiedener Pestizde mit der SFE-Multimethode
Probe: Apfelmus, Dotierung: 0,5µ/Ansatz (0,167 ppm)
Extraktor: HP 7680T
Pestizid Ansatz Ansatz Ansatz Ansatz MittelWiederVariations- 1 2 3 4 wertfindungkoeffizient Wiederfindungen
Sollwert 0,5µg/3g Ansatz
[%] [%]
HCB 0,478 0,474 0,492 0,479 0,481 96 1,4
Carbofuran 0,504 0,495 0,478 0,486 0,491 98 2,0
Dimethoat 0,492 0,497 0,429 0,490 0,477 95 5,8
Pirimicarb 0,513 0,514 0,496 0,480 0,501 100 2,8
Thiabendazol 0,159 0,157 0,172 0,144 0,158 32 6,3
p,p-DDE 0,448 0,446 0,440 0,421 0,439 88 2,4
Cyproconazol 0,502 0,488 0,486 0,517 0,498 100 2,5
Iprodion 0,480 0,479 0,497 0,500 0,489 98 2,0
Azinphos-Methyl 0,493 0,460 0,494 0,488 0,484 97 2,9
Fenarimol 0,459 0,461 0,472 0,499 0,473 95 3,4
Permethrin 0,429 0,414 0,421 0,405 0,417 83 2,1
Analysenmethode: siehe Anhang 1
Mit Ausnahme von Thiabendazol wurden für die extrahierten Substanzen sehr gute
Wiederfindungen erzielt. Es ist zu beachten, daß Thiabendazol zwei basische Stickstoffatome
in seinem Molekül aufweist und aus diesem Grund eine Extraktion unter
sauren Bedingungen, wie sie in Apfelmus vorliegen, erschwert ist (siehe Kap. 3.1.4.7.2
und 3.1.5.3.1). Zudem wurde festgestellt, daß die Elution von Thiabendazol von der
Festphasenfalle in die Vorlage vermutlich wegen Wechselwirkungen mit freien Silanol-
Gruppen an der Oberfläche des ODS-Fallenmaterials ebenfalls erschwert ist (vgl. hierzu
Kap. 3.1.5.2.2, Wechselwirkung von Wirkstoffen mit Oberflächen). Zu berücksichtigen
ist hier auch die geringe Löslichkeit, die Thiabendazol in Acetonitril hat.
In Tab. 3.1.4-4 werden die Wiederfindungsraten und Variationskoeffizienten (n=5) für
zahlreichen Verbindungen angegeben die auf pestizidfreie Pfirsich-Martix dotiert
wurden (Dotierung: 0,5 µg pro 3 g entsprechend 0,167 ppm).
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42

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.1.4-4: Wiederfindungen verschiedener Pestizde mit der SFE-Multimethode
Probe: Pfirsich, Dotierung 0,5µ/Ansatz (0,167 ppm)
Extraktor: HP 7680T
Pestizid Wiederfindung
Mittelwert
%
Variationskoeffizient
in %
Nachweisgrenze
(3-faches
Grundlinienrauschen)
in ppm
Azinphos-Ethyl 86,3 3,2 0,015
Azinphos-Methyl 77,1 6,8 0,02
Benalaxyl 94,7 3,4 0,013
Binapacryl 90,9 3,8 0,013
Biphenthrin 87,0 4,4 0,005
Biphenyl 86,4 5,5 0,005
Bitertanol 86,8 3,6 0,006
Bromazil 80,3 5,7 0,02
Bromophos 94,7 2,7 0,005
Bromophos-Ethyl 108,8 4,3 0,005
Brompropylat 85,2 5,5 0,005
Bupirimat 90,8 7,7 0,025
Buprofezin 90,3 4,6 0,01
Carbaryl 79,0 7,0 0,005
Carbofuran 88,8 2,9 0,005
Chinomethionat 93,7 1,6 0,005
Chlorfenvinphos 95,5 5,9 0,005
Chlorpyrifos 85,9 4,2 0,005
Chlorpyrifos-Methyl 82,9 5,0 0,005
Chlorthalonil 90,9 2,9 0,005
Chlozolinat 94,0 2,2 0,01
Cyfluthrin 103,8 4,0 0,02
Cyhalothrin lambda 81,8 6,3 0,02
Cypermethrin 83,4 6,5 0,04
Cyproconazol 89,1 3,9 0,005
Deltamethrin 71,6 10,2 0,04
Demeton-S-Methyl 83,8 11,4 0,02
Demeton-S-Methyl-Sulfon 64,5 4,2 0,02
Diazinon 84,6 5,5 0,005
Dichlofluanid 76,5 6,8 0,005
Dichloran 83,5 3,2 0,01
p,p-Dichlorbenzophenon* 112,3 24,9
Dicofol* 66,4 5,9 0,04
Dicofol o,p 96,3 9,3 0,007
Dieldrin 108,5 6,3 0,015
Diethofencarb 105,8 1,3 0,005
Dimethoat 81,8 5,2 0,04
Diniconazol 96,3 1,6 0,01
Dioxathion 85,4 5,7 0,008
Diphenylamin 82,7 6,7 0,005
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43

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Pestizid Mittelwert
in %
Variationskoeffizient
in %
Nachweisgrenze
(3-faches
Grundlinienrauschen)
in ppm
Disulfoton 70,3 2,1 0,01
Endosulfan alpha 87,6 5,7 0,02
Endosulfan beta 90,7 2,8 0,02
Endosulfansulfat 117,8 4,1 0,006
Endrin 88,8 4,0 0,01
Ethion 89,3 6,4 0,005
Fenarimol 94,0 3,5 0,025
Fenchlorfos 95,8 1,8 0,005
Fenitrothion 84,9 3,5 0,006
Fenoxycarb 97,2 5,5 0,013
Fenpropathrin 86,5 4,0 0,01
Fenpropimorph 87,8 3,1 0,005
Fenson 89,0 4,2 0,007
Fenthion 86,6 5,0 0,005
Fenthionsulfoxid 85,4 2,3 0,01
Fenvalerat** 118,6 13,1 0,05
Flusilazol 82,8 5,1 0,005
Folpet 67,3 8,0 0,005
Fonofos 91,3 5,4 0,005
Hexaconazol 93,8 3,5 0,01
Hexythiazox 80,8 10,0 0,1
Imazalil 73,4 9,7 0,08
Iprodion 79,3 4,2 0,015
Lindan 94,4 1,6 0,005
Malaoxon 94,4 6,3 0,005
Malathion 86,7 2,8 0,007
Mecarbam 91,4 7,1 0,015
Metalaxyl 92,9 1,7 0,01
Metazachlor 99,3 1,9 0,02
Methidathion 87,9 2,9 0,01
Methiocarb 96,2 5,5 0,015
Mevinphos 85,4 2,4 0,01
Myclobutanil 83,8 1,7 0,033
Nuarimol 88,8 4,4 0,03
Omethoat*** 9,0 14,7 -
Orthophenylphenol 89,3 4,8 0,005
Oxadixyl 90,7 5,5 0,025
Parathion 82,6 4,7 0,005
Parathion-Methyl 86,1 4,9 0,01
Penconazol 86,3 3,1 0,005
Permethrin 106,7 3,7 0,01
Phosalon 78,4 4,7 0,007
Phosmet 83,2 6,9 0,005
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44

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Pestizid Mittelwert
in %
Nachweisgrenze
(3-faches
Grundlinienrauschen)
in ppm
Pirimicarb 81,9 3,2
0,005
Pirimiphos-Methyl 93,2 2,8 0,005
Prochloraz 71,7
Variationskoeffizient
in %
16,5 0,1
Procymidon 83,9 5,2 0,005
Profenofos 92,6 3,5 0,005
Propargit 72,0 5,4 0,013
Propiconazol 84,6 3,4 0,01
Propoxur 88,6 3,2 0,007
Propyzamid 92,3 1,6 0,005
Prothiophos 89,3 3,0 0,005
Pyrazophos 85,3 3,3 0,01
Pyrifenox 1 88,2 3,5
0,015
Pyrifenox 2 84,4 5,9 0,01
Pyrimethanil 90,8 2,7 0,005
Quinalphos 83,3 4,7 0,015
Quintozen 85,8 1,8 0,01
Tebuconazol** 130,0 2,5 0,05
Tebufenpyrad 89,6 2,8 0,005
Tecnazen 88,4 1,2 0,005
Tetradifon 83,2 5,4 0,007
Tetramethrin 86,7 3,7 0,005
Thiabendazol 70,8 9,5 0,015
Tolclofos-Methyl 95,6 1,7 0,005
Tolylfluanid 78,4 5,5 0,005
Triadimefon 91,1 4,2 0,013
Triadimenol 92,9 3,4 0,01
Triazophos 90,2 2,5 0,02
Vinclozolin 83,3 4,6 0,005
Analysenmethode: siehe Anlage 1
* Dicofol wird im Injektor teilweise zu p,p’-Dichlorbenzophenon abgebaut
** gestört
*** hohe Polarität
Im Bereich der Pestizidrückstandsanalytik gilt eine Methode als für einen Stoff geeignet,
wenn die Wiederfindung im Bereich zwischen 70 und 110 % liegt. Bei den hier
aufgeführten Stoffen wurde dies lediglich für Omethoat und Demeton-S-Methyl-Sulfon
nicht erreicht.
Bei den Stoffen Folpet und Dicofol u.a. kommt es, je nach Zustand des Injektionssystems
zu Zersetzungen. Hier ist nicht die Extraktion, sondern die Bestimmung
problematisch.
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
45

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.4.3.3 Wiederfindungen mit ISCO SFX 3560
Einer pestizidfreien Karottenprobe wurde eine Mischung von Pestiziden zudotiert (0,167
ppm). Pro Extraktionsansatz wurden je 3 g Probe eingesetzt, die mit 2,5 g Hydromatrix
vermengt wurden. Die folgende Tab. 3.1.4-5 gibt die erzielten Wiederfindungen und
Variationskoeffizienten an.
Tab. 3.1.4-5: Wiederfindungen verschiedener Pestizde mit der SFE-Multimethode
Probe: Karotte, Dotierung: 0,5µ/Ansatz (0,167 ppm)
Extraktor: ISCO SFX-3560
Pestizid Ansatz Ansatz Ansatz Mittelwert mittlere Variations-
1 2 3
Wieder- koeffizient
Wiederfindung in µg/3g Ansatz findung [%]
(Sollwert 0,5)
HCB 0,454 0,420 0,444 0,439 88 4,0
Carbofuran 0,473 0,462 0,464 0,466 93 1,3
Dimethoat 0,513 0,519 0,531 0,521 104 1,8
Pirimicarb 0,479 0,454 0,464 0,466 93 2,7
Thiabendazol 0,363 0,331 0,369 0,354 71 5,8
p,p-DDE 0,446 0,426 0,451 0,441 88 3,0
Cyproconazol 0,487 0,441 0,450 0,459 92 5,3
Iprodion 0,452 0,425 0,449 0,442 88 3,3
Azinphos-Methyl 0,495 0,447 0,505 0,482 97 6,4
Fenarimol 0,421 0,448 0,466 0,445 89 5,1
Permethrin 0,444 0,414 0,439 0,432 87 3,7
Probe/Hydromatrix 3 g : 2,5 g
Extraktor: ISCO SFX 3560, Extraktionsbedingungen: siehe Kap. 3.1.4.2
Bestimmung GC/MSD: siehe Anlage 1
Die hierbei erzielten Wiederfindungen liegen, wie auch bei Verwendung des Extraktors
der Fa. HP, sehr hoch (vgl. Tab. 3.1.4.-3). Bei Thiabendazol ist allerdings hier eine
höhere Wiederfindungsrate erzielt worden. Dies läßt sich zum einen begründen durch
den höheren pH-Wert den die Karottenmatrix im Vergleich zur Apfelmusmatrix hat und
zum anderen durch die Tatsache, daß beim ISCO- Extraktor die Extrakte direkt in eine
flüssige Phase eingeleitet werden.
Da Carbendazim nicht direkt gaschromatographisch bestimmbar ist, wurde nach der
Extraktion eine Derivatisierung mit Pentafluorbenzylbromid durchgeführt. Bei dieser
Reaktion werden auch Thiabendazol und Carbofuran umgesetzt (siehe Tab. 3.1.4-6).
Auffällig ist, daß bei Thiabendazol die ermittelte Wiederfindung von 71 % ohne
Derivatisierung auf 59 % nach der Derivatisierung gesunken ist. Die Gründe für diese
Abnahme liegen nicht bei der Derivatisierung sondern eher an der Neigung des
Thiabendazols sich an Oberflächen zu adsorbieren. Eine Abnahme der Konzentration
von Thiabendazol in Lösungen mit fortschreitender Zeit wurde häufiger festgestellt.
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
[%]
46

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.1.4-6: Wiederfindungen nach Derivatisierung mit PFB-Br
Pestizid Ansatz Ansatz Ansatz Mittelwert mittlere Variations-
1 2 3
Wieder- koeffizient
Wiederfindung in µg/3g Ansatz findung [%]
(Sollwert 0,5)
[%]
Carbofuran 0,461 0,434 0,440 0,445 89 3,2
Thiabendazol 0,288 0,288 0,302 0,293 59 2,8
Carbendazim 0,411 0,423 0,453 0,429 86 5,0
Probe/Hydromatrix 3 g : 2,5 g
Extraktor: ISCO SFX 3560, Extraktionsbedingungen: siehe Kap. 3.1.4.2
Bestimmung GC/MSD: siehe Anlage 1
3.1.4.4 Nachweis- und Bestimmungsgrenzen
Wie in Tab. 3.1.4-4 bereits dargestellt, wurden die Nachweisgrenzen für eine Vielzahl
von Stoffen abgeschätzt (3-faches Grundlinien-Rauschen). Für einige ausgewählte
Stoffe aus verschiedenen Stoffgruppen wurden die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen
nach dem DFG-Eichgeradenverfahren ermittelt (siehe Tab. 3.1.4-7). Hierzu
wurden Wiederfindungsversuche bei vier verschiedenen Konzentrationen jeweils 4 mal
durchgeführt (16 Aufarbeitungen) [80]. Die Dotierungen erfolgten auf Apfelmatrix, wobei
die niedrigste dotierte Konzentration im Bereich der erwarteten Nachweisgrenze lag und
die höchste ein Zehnfaches hiervon [81].
Tab. 3.1.4-7: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen nach DFG [82]
Pestizid
NG (µg/kg) BG (µg/kg) kleinste **
Höchstmenge [34]
(µg/kg)
Azinphos-Methyl 8 12 50
Carbofuran 5 8 200
Cyproconazol 3 8 50
Dimethoat 8 14 50
Fenarimol 9 13 20
Thiabendazol* 6 11 10
Permethrin 6 13 50
Iprodion 11 16 20
HCB 9 16 10
Pirimicarb 8 13 50
p,p´-DDE
Probe/Hydromatrix 3 g : 2,5 g
5 8 50
Extraktor: ISCO SFX 3560, Extraktionsbedingungen: siehe Kap. 3.1.4.2
Bestimmung GC/MSD: siehe Anlage 1
*nach Derivatisierung mit PFB-Br, **für Säuglingsnahrung 10 µg/kg
Diese Ergebnisse zeigen, daß die SFE erfolgreich in einem Rückstandslaboratorium zur
routinemäßigen Pestizidanalytik eingesetzt werden kann.
Eine detaillierte Analysenvorschrift zur Bestimmung von Pestiziden in Obst und
Gemüse befindet sich im Anlage 1 (Code 100E3101).
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47

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.4.5 Methodenvergleich
Um die hier vorgestellte SFE-Multimethode (siehe Anlage 1) mit den herkömmlichen in
der Routineanalytik eingesetzten Multimethoden (DFG-S8 und DFG-S19) zu
vergleichen, wurden zahlreiche Proben aus dem Handel parallel untersucht. Die
Ergebnisse sind in Anlage 5 tabellarisch dargestellt.
Aus den Ergebnissen wird ersichtlich, daß durch SFE-Extraktion für fast alle Wirkstoffe,
mit den DFG-Methoden vergleichbare Ergebnisse erzielt werden.
Für die zum Teil unterschiedlichen Ergebnisse kommen zusätzlich zu den Unterschieden
bei den Extraktionsausbeuten auch weitere Ursachen in Frage:
1. Analytische Sreubreite:
Insbesondere bei Einfach- aber auch bei Doppelbestimmungen ist die statistische
Sicherheit gering. Bei geringen Gehalten ist die analytische Streubreite sehr hoch. Im
allgemeinen wird bei der gängigen Rückstandsanalytik von Pestiziden eine
Streubreite von:
100 % bei Meßwerten von 0,01 mg/kg,
50 % bei Meßwerten von 0,1 mg/kg und
25 % bei Meßwerten von 1 mg/kg
angegeben [18]. Diese Größenordnung hat sich oft bei Ringversuchen bestätigt.
2. Inhomogenitäten der Proben (vgl. Kap. 3.1.4.7.1 und 3.1.3.1)
3. Fehlerquellen bei der Messung z.B. durch Matrixeffekte (vgl. Kap. 3.1.2.2).
Bedingt durch die analytische Streuung sind einzelne Analysenergebnisse stets mit
einer Unsicherheit behaftet. Um diese Unsicherheit zu verringern werden Mehrfachbestimmungen
durchgeführt und Mittelwerte gebildet. Aus diesem Grund wurde eine
Erdbeerprobe aus dem Handel mehrfach untersucht. Insgesamt wurden 5 Untersuchungen
nach DFG-S8 und 12 Untersuchungen mit SFE gemacht. Die Untersuchungsergebnisse
sind in Tab. 3.1.4-8 aufgelistet.
5-fach-Bestimmung nach der DFG-S8 Methode:
Die DFG-S8-Methode wurde in einer leicht abgewandelten Form wie folgt durchgeführt:
50 g zerkleinerte Probe werden mit Aceton (Endvolumen 200ml) am Ultra-Turrax
homogenisiert. Der Extrakt wird durch eine Nutsche filtriert. Ein Aliquot (40 ml) des
filtrierten Acetonextraktes wird mit 5 ml gesättigter Natriumchloridlösung und 50 ml
Wasser versetzt und zwei mal mit je 10 ml Dichlormethan ausgeschüttelt. Die vereinigten
Dichlormethanphasen werden mit Natriumsulfat getrocknet und am
Rotationsverdampfer eingeengt. Der eingeengte Extrakt wird in 10 ml Cyclohexan/Essigester
(1:1) aufgenommen. Ein Aliquot davon (4 ml) wird gelpermeationschromatographisch
(GPC) gereinigt. Das Eluat wird an der Rotationszentrifuge eingeengt
in Isooctan (mit ISTD) aufgenommen und zur Chromatographie verwendet.
Die bei diesem Methodenvergleich erzielten Ergebnisse werden in Tab. 3.1.4-8 sowie in
den Abb. 3.1.4-3 und 3.1.4-4 aufgeführt.
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48

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.1.4-8: Ergebnisse des Methodenvergleiches DFG-S8 (mod.) und
SFE-Multimethode
Pestizid Mittelwerte Standard-
Variationsabweichungen
koeffizienten
SFE S8 SFE S8 SFE S8*
α-Endosulfan 0,009 0,009 0,0013 0,0009 17% 10%
β-Endosulfan 0,023 0,020 0,0029 0,001 13% 5%
Endosulfansulfat 0,027 0,024 0,0033 0,001 12% 4,2%
Metalaxyl 0,106 0,082 0,0067 0,005 6% 6,1%
*Alle 5 Bestimmungen mit der DFG-S8-Methode wurden nebeneinander aufgearbeitet (keine echten
Wiederholbestimmungen)
Abb. 3.1.4-3: Mehrfachbestimmung einer Erdbeerprobe mit der SFE-Multimethode
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 MW
Nummer des Versuchs
Metalaxyl
Endosulfansulfat
ß-Endosulfan
a-Endosulfan
49
Mittelwerte in ppm
Metalaxyl 0,106
a-Endosulfan 0,009
ß-Endosulfan 0,023
Endosulfansulfat 0,027
Abb. 3.1.4-4: Mehrfachbestimmung einer Erdbeerprobe mit der DFG-S8-Methode
mg/kg
0,14
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
1 2 3 4
5
Nummer des Versuchs
6 MW
Metalaxyl
Endosulfansulfat
ß-Endosulfan
a-Endosulfan
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Mittelwerte in ppm
Metalaxyl 0,082 mg/kg
a-Endosulfan 0,009
ß-Endosulfan 0,020
Endosulfansulfat 0,024

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
In Tab. 3.1.4-9 werden die einzelnen Arbeitsschritte die bei der SFE-Multimethode
(siehe Anlage 1) und der DFG S8 Methode anfallen, gegenübergestellt.
Tab. 3.1.4-9: Gegenüberstellung der DFG-S8 und der SFE-Methode:
SFE
DFG S8 (modifiziert)
Arbeitsschritte:
• Probenzerkleinerung und
• Probenzerkleinerung und
Homogenisierung
Homogenisierung
• einwiegen
• einwiegen
• Zugabe von Adsorbens
• mit Aceton homogenisieren
• Einfüllen in die Extraktionshülse
• Aliquotierung
• Vorlage mit ISTD-Lösung versetzen • Kochsalzlösung zugeben
• Extraktion
• mit Dichlormethan ausschütteln
• Chromatographie
• mit Natriumsulfat trocknen
• am Rotationsverdampfer konzentrieren
• in 10 ml Ethylacetat/Cyclohexan
aufnehmen
• Gelpermeationschromatographie
• Lösungsmittel entfernen
• mit ISTD-Lösung aufnehmen
• Chromatographie
Chemikalienverbrauch:
40 g hochreines Kohlendioxid
techn. Kohlendioxid zur Kühlung der Falle
3 g Hydromatrix
6,5 ml Acetonitril
5 ml Cyclohexan: Ethylacetat 1:1
Arbeitszei für Aufarbeitung:
4 Stunden/12 Proben
200 ml Aceton
20 ml Dichlormethan
300 ml Cyclohexan/Essigester (1:1)
Natriumsulfat
Natriumchlorid
Arbeitszeit für Aufarbeitung:
16 Stunden/12 Proben
Der Vergleich zeigt, daß die Vorteile der SFE vor allem in der Effizienz und der
Einsparung von Lösungsmitteln und Personalkosten liegen.
Die wenigen Arbeitsschritte und die weitgehende Automatisierung bei der SFE
minimieren die Fehlerquellen und müßten zu einer besseren Vergleichbarkeit
zwischen Laboratorien führen.
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Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.4.6 Matrixbezogene Multimethoden
Unsere Erfahrungen der letzten Jahre haben gezeigt, daß in die Praxis der Lebensmittelüberwachung
die Entwicklung und Verwendung von matrixbezogenen Multimethoden
viele Vorteile hat. Eine matrixbezogene Multimethode berücksichtigt ggf. die
Eigenheiten der betreffenden Matrix (pH-Wert, Wasser- und Fettgehalt) und zielt nur auf
Stoffe ab, die in dieser Matrix zu erwarten sind. Die selektive Erfassung der
betreffenden Pestizide wird durch die Verwendung eines GC/MSD im SIM-Modus als
Bestimmungssystem ermöglicht.
Um festzustellen, welche Wirkstoffe für die einzelnen Probenarten relevant sind, wurden
Daten aus Jahresberichten von Untersuchungseinrichtungen der Bundesrepublik
Deutschland, Monitoring-Daten verschiedener Staaten sowie Literaturangaben
ausgewertet. Darüber hinaus wurden z.B. aus dem INTERNET Anwendungsempfehlungen
und Angaben zu angewendeten Pestizidmengen gesammelt.
Die Anwendung von matrixbezogenen analytischen Verfahren ermöglicht ein zielgerichteteres
und dadurch effektiveres Arbeiten, da der Umfang der Untersuchungen
auf Stoffe begrenzt wird, die für die jeweilige Matrix relevant sind. Auch im Hinblick auf
die Qualitätssicherung hat diese Vorgehensweise Vorteile, da die Methodenvalidierung
nur für die relevanten Stoff-Matrix-Kombinationen erfolgen muß.
Für folgende Matrizes wurden spezifische Bestimmungsmethoden entwickelt und
teilweise validiert: Trauben, Kernobst, Zitrusfrüchte und Beerenobst.
3.1.4.6.1 Pestizide in Zitrusfrüchten
Zitrusfrüchte zählen zu den Obstsorten die weltweit am meisten konsumiert werden.
Beim Anbau von Zitrusfrüchten werden üblicherweise mehrfach Pflanzenschutzmittel
(überwiegend Fungizide und Insektizide) eingesetzt. Meist findet nach der Ernte auch
eine Behandlung der Oberfläche mit Fungiziden statt. Die Früchte beinhalten daher oft
eine Vielzahl unterschiedlicher Wirkstoffe. Bei Untersuchungen von Zitrusfrüchten im 2.
Halbjahr 1996 am CVUA Stuttgart wurde eine mittlere Anzahl von 6,0 verschiedenen
Wirkstoffen pro Probe festgestellt [29].
Die in Zitrusfrüchten vorkommenden Wirkstoffe unterscheiden sich zum Teil erheblich in
ihrem chemischen Verhalten, so daß derzeit zu ihrer Erfassung der Einsatz mehrerer
analytischer Verfahren notwendig ist [vgl. 29]. Diese Verfahren sind z.T. sehr zeit- und
arbeitsaufwendig und benötigen hohe Mengen an organischen Lösungsmitteln.
Ein Ersatz einiger dieser Methoden durch weitgehend automatisierte SFE-Methoden
würde viele Vorteile mit sich bringen. Dies wurde am Beispiel 2,4-D und Carbendazim
gezeigt (siehe Kap. 3.1.5.4.2 und 3.1.5.3.2). Diese bei Zitrusfrüchten (2,4-D) und Obst
allgemein (Carbendazim) häufig angewendeten Verbindungen lassen sich mit Hilfe der
SFE bedeutend schneller und einfacher als mit den derzeit gebräuchlichen naßchemischen
Einzelbestimmungs-Methoden bestimmen.
Um festzustellen, inwieweit sich die für Zitrusfrüchte relevanten Stoffe auch mittels SFE
erfassen lassen, wurden Wiederfindungsversuche durchgeführt.
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Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Die erzielten Wiederfindungsraten werden in Tab. 3.1.4-10 und in Abb. 3.1.4-5 aufgeführt.
Zum Vergleich sind in Abb. 3.1.4-5 auch die entsprechenden Daten einer
kürzlich in unserem Hause entwickelten naßchemischen Methode [29] mit aufgeführt.
Tab. 3.1.4-10: Wiederfindung von Stoffen aus dotierten Orangen (n=5)
Wiederfindung in % Variationskoeffizienten %
Pestizid SFE naßchemisch SFE naßchemisch
(0,167 ppm) nach [29]
(0,25 ppm)
nach [29]
Biphenyl 94 85 3,5 6,5
Brompropylat 70 91 6,9 3,1
Chlorfenvinphos 79 87 6 3,9
Chlorpyriphos-Methyl 82 96 5,8 5,1
Diazinon 84 89 4,1 5,2
Dichloran 90 70 17,4 8,1
Dicofol* 81 95 9,9 5
Dimethoat 87 84 9,1 9,9
α-Endosulfan 71 90 6,8 5,1
ß-Endosulfan 92 91 4,8 4,7
Endosulfansulfat 80 94 20,5 3,2
Fenarimol 100 76 9,5 6,1
Fenitrothion 72 90 6,4 4,8
Fenthion 81 80 12,9 5,1
Fonofos 95 100 7,7 3,9
Mecarbam 90 92 10,1 4,6
Metalaxyl 108 80 3,1 3,4
Methidathion 76 87 14,1 5,4
Myclobutanil 105 96 3,5 4,7
Parathion 83 92 4,5 4,6
Parathion-Methyl 96 89 12,2 4,2
Pirimiphos-Methyl 74 84 5,4 9,8
Prochloraz 92 106 3,6 5,3
Procymidon 103 89 3,3 3,6
Propiconazol 87 90 4,8 6,1
Pyridaphenthion 99 82 11,6 6,4
Quinalphos 79 89 4,5 5,1
Tetradifon 84 94 4,4 3,4
Vinclozolin 89 91 2,8 3,4
Analysenmethode: siehe Anlage 1, Code: 100E3101
Probe: gefroren zerkleinerte Orangen, Probenmenge 3g, Hydromatrix 1,5g
Bestimmung: mittels GC/MSD
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Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.4-5: Wiederfindungen bei Dotierungsversuchen nach der SFE-Methode und
nach [29], dotierte Matrix: Orange (je n=5), Dotierungen 0,167 ppm (SFE),
0,25 ppm (naßchemische Methode)
Vinclozolin
Tetradifon
Quinalphos
Pyridaphenthion
Propiconazol
Procymidon
Prochloraz
Pirimiphos-Methyl
Parathion-Methyl
Parathion
Myclobutanil
Methidathion
Metalaxyl
Mecarbam
Fonofos
Fenthion
Fenitrothion
Fenarimol
Endosulfan-Sulfat
b-Endosulfan
a-Endosulfan
Dimethoat
Dicofol*
Dichloran
Diazinon
Chlorpyriphos-Methyl
Chlorfenvinphos
Brompropylat
Biphenyl
0 35 70 105
SFE naßchemisch [3]
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Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.4.6.2 Pestizide in Kernobst
Äpfel und Birnen gehören zu den am meisten konsumierten Obstsorten in Deutschland.
Während des Anbaus werden mehrfach Insektizide und Fungizide eingesetzt.
Insbesondere Äpfel werden häufig über einen längeren Zeitraum unter klimatisierten
Bedingungen gelagert. Vor der Einlagerung werden die Früchte oft durch Eintauchen in
Lösungen, die Fungizide und/oder Bräunungsverhütungsmittel (z.B. Diphenylamin)
enthalten, behandelt. Nach den Untersuchungen der letzten Jahre zeigt Kernobst eine
vergleichsweise geringe Pestizidbelastung, wobei im allgemeinen in Birnen mehr
Fungizide gefunden werden als in Äpfel.
Zur Ermittlung der Wiederfindungen wurde jeweils 0,33 ppm der Wirkstoffe auf
pestizidfreies Apfelmus dotiert. Die folgende Tab. 3.1.4-11 gibt die erzielten Wiederfindungen
und Variationskoeffizienten für n=5 an.
Tab. 3.1.4-11: ermittelte Wiederfindungen von Pestiziden aus dotiertem Apfelmus
, Dotierungsmenge 0,33 ppm, Extraktionsgerät ISCO SFX 3560
Pestizid Mittlere StandardVariations- Bemerkungen
Wiederfindung abweichungkoeffizient in %
in %
Azinphos-Methyl 104,2 9,6 9,2
Biphenthrin 76,1 3,2 4,2
Brompropylat 91,0 4,5 4,9
Captan 75,6 6,3 8,4 zersetzt sich im Injektor
Carbaryl 97,0 3,3 3,4
Chlorpyrifos 89,8 4,9 5,4
Chlorpyrifos-Methyl 87,7 5,7 6,5
Cyhalothrin lambda 81,4 5,1 6,3
Cypermethrin 71,7 4,2 5,8
Deltamethrin 71,0 6,3 8,8
Diazinon 86,6 6,7 7,8
Dichlofluanid 92,4 7,7 8,4
Dicofol 70,8 17,3 24,4 zersetzt sich im Injektor
Dimethoat 99,0 5,8 5,8
Diphenylamin 108,0 17,4 16,1
α-Endosulfan 88,9 4,8 5,4
ß-Endosulfan 75,1 7,8 10,4
Fenpropathrin 80,7 3,0 3,8
Fenthion 84,6 5,0 6,0
Fenvalerat 81,2 3,2 3,9
Flusilazol 84,2 2,4 2,9
Folpet 76,0 4,9 6,4
Imazalil 89,4 8,0 9,0
Iprodion 87,1 11,1 12,7 Zersetzung im Injektor
Malathion 93,1 3,4 3,7
Omethoat 14,7 1,4 9,3 hohe Polarität
Parathion-Methyl 87,3 4,6 5,3
Phosalon 93,3 4,7 5,0
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54

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Pestizid Mittlere
Wiederfindung
in %
Standardabweichung
Variationskoeffizient
in %
Bemerkungen
Phosmet 94,2 3,7 3,9
Pirimicarb 98,2 5,2 5,3
Procymidon 93,8 3,7 3,9
Propargit 78,7 9,1 11,5
Quinalphos 92,8 9,7 10,5
Tetradifon 93,4 4,4 4,8
Thiabendazol 43,8 5,5 12,6 pH-Wert nicht eingestellt
Tolylfluanid 92,7 4,4 4,7
Vinclozolin 90,8 6,1 6,7
Probe/Hydromatrix 3 g : 2,5 g
Extraktor: ISCO SFX 3560, Extraktionsbedingungen: siehe Kap. 3.1.4.2
Bestimmung GC/MSD: siehe Anlage 1
Während Dimethoat (Löslichkeit in Wasser 39,8 mg/L, Po/w 0,74 [136]) sich noch gut
mittels SFE extrahieren läßt, sind die Wiederfindungen beim polareren Abbauprodukt
Omethoat (Po/w -0,74 [136]) unbefriedigend.
3.1.4.6.3 Pestizide in Beerenobst
Beerenobst ist stark anfällig gegen Pilzbefall und wird daher häufig mehrfach mit
Fungiziden behandelt. Neben der einheimischen Produktion, die im Frühsommer
vermarktet wird, werden in den Monaten Januar bis April große Mengen Erdbeeren aus
Marokko, Spanien und Italien importiert.
In den letzten Jahren wurden in spanischen Erdbeeren eine ganze Reihe auch neuer
Pestizide nachgewiesen.
Für einige der vorkommenden Pestizide wurden Wiederfindungsversuche durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in Tab. 3.1.4-12 aufgeführt.
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Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.1.4-12: Wiederfindungen von Pestiziden aus dotierten Erdbeeren
, Dotierungsmenge 0,33 ppm, Extraktionsgerät HP 7680T, (n=5)
Pestizid Mittlere Wiederfindung Variationskoeffizient
in %
in %
Chlorpyrifos-Methyl 93 10,2
Cyfluthrin 63 7,2
Cypermethrin 62 7,7
Cyproconazol 97 1,4
Dicofol 101 10,4
Dimethoat 95 6,2
α-Endosulfan 81 9,5
ß-Endosulfan 95 9,1
Endosulfansulfat 85 10,5
Fenarimol 99 2,9
Folpet 86 14,4
Lindan 87 5,9
Myclobutanil 101 2,6
Pyrifenox 1 92 2,5
Pyrifenox 2 93 2,7
Procymidon 100 6,9
Tolclofos-Methyl 93 9,2
Analysenmethode: siehe Anlage 1
3.1.4.6.4 Pestizide in Tafeltrauben
Trauben werden mittlerweile über das ganze Jahr hinweg angeboten. Während
europäische Ware hauptsächlich im Sommer und Herbst angeboten wird, werden in der
restlichen Zeit die Früchte vor allem aus Südamerika und Südafrika importiert. Da
Trauben anfällig gegen Schimmelbefall sind, werden sie häufig mehrfach mit
Fungiziden behandelt. Insbesondere Trauben aus dem Mittelmeerraum (Türkei,
Griechenland, Italien) weisen häufig Mehrfachrückstände auf.
Für einige der vorkommenden Pestizide wurden Wiederfindungsversuche durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in Tab. 3.1.4-13 und tab. 3.1.4-14 aufgeführt.
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Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.1.4-13: Wiederfindungen von Pestiziden aus dotierten Trauben
, Dotierungsmenge 0,167ppm, Extraktionsgerät ISCO SFX 3560
Pestizid Mittlere StandardVariations- Wiederfindung abweichungkoeffizient in %
in %
Brompropylat 91,3 3,8 4,2
Chlorpyrifos 86,6 2,7 3,1
Chlorthalonil 85,9 4,8 5,6
Chlozolinat 81,9 4,1 5,0
Deltamethrin 65,4 9,5 14,6
Dichlofluanid 82,1 3,1 3,8
Diethofencarb 98,9 3,6 3,6
Dimethoat 85,5 7,4 8,6
Endosulfan, alpha 86,5 2,9 3,3
Endosulfan, beta 86,3 4,6 5,3
Endosulfansulfat 91,3 8,7 9,5
Folpet 81,2 12,4 15,3
Folpet Abbau 87,4 9,1 10,4
Iprodion 86,3 6,8 7,9
Iprodion Abbau 78,4 6,9 8,8
L-Cyhalothrin 78,5 3,9 5,0
Myclobutanil 84,7 5,0 5,9
Oxadixyl 89,7 3,7 4,1
Parathion-Methyl 79,9 4,8 6,0
Penconazol 92,1 3,2 3,5
Procymidon 93,2 2,9 3,1
Pyrazophos 102,8 3,1 3,1
Pyrimethanil 99,1 4,3 4,4
Tebuconazol 89,6 6,1 6,8
Tetradifon 89,5 4,4 4,9
Tolylfluanid 87,3 2,7 3,1
Triadimefon 91,8 4,9 5,3
Triadimenol 102,8 4,4 4,3
Vinclozolin 92,5 3,5 3,8
Probe/Hydromatrix 3 g : 2,5 g
Extraktor: ISCO SFX 3560, Extraktionsbedingungen: siehe Kap. 3.1.4.2
Bestimmung GC/MSD: siehe Anlage 1
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Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.1.4-14: Wiederfindungen von Pestiziden aus dotierten Trauben
Dotierungsmenge 0,6 ppm, Extraktionsgerät HP 7680T
Pestizid Mittlere Standard- Variationskoeffizient
Wiederfindung
in %
abweichung
in %
Brompropylat 87,5 28,6 5,5
Chlorpyrifos 88,7 19,1 3,6
Chlozolinat 95,1 32,8 5,7
Cyhalothrin 74,0 15,6 3,5
Diethofencarb 89,0 25,0 4,7
Endosulfan, alpha 94,2 18,3 3,2
Endosulfan, beta 96,9 23,4 4,0
Endosulfansulfat 97,6 24,9 4,3
Myclobutanil 95,4 5,7 1,0
Oxadixyl 97,5 22,0 3,8
Penconazol 92,3 26,0 4,7
Procymidon 97,8 18,1 3,1
Pyrimethanil 97,6 33,4 5,7
Tebuconazol 76,2 14,9 3,3
Tetradifon 74,8 31,0 6,9
Tolylfluanid 65,0 46,2 11,9
Triadimefon 95,5 30,5 5,3
Triadimenol 97,9 16,3 2,8
Vinclozolin 99,0 28,7 4,8
Analysenmethode: siehe Anlage 1
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58

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.4.7 Einflüsse verschiedener Parameter auf die
Extraktionsausbeuten
3.1.4.7.1 Einfluß der Zerkleinerung auf die Probenhomogenität
Wegen der geringen Probenmenge, die bei der SFE eingesetzt werden kann, ist es
erforderlich eine sehr gute Probenhomogenität zu erzielen, damit ein statistisch
repräsentatives Ergebnis erzielt werden kann. Eine sehr gute Feinzerkleinerung und
damit auch Homogenität kann erreicht werden, wenn die grob zerkleinerte Teilprobe
zunächst tiefgefroren und erst in gefrorenen Zustand feinzerkleinert wird (siehe auch
Kap. 3.1.3.1).
Dies wurde in folgendem Versuch demonstriert: Trauben mit Rückständen an
Carbendazim wurden sowohl in frischem als auch in tiefgefrorenem Zustand zerkleinert.
Die auf dieser Weise zerkleinerten Proben wurden je 7 mal extrahiert. Die dabei
ermittelten Carbendazim-Gehalte waren nahezu gleich. Die gefroren zerkleinerte Probe
wies jedoch eine wesentlich geringere Schwankung der Analysenergebnisse auf (vgl.
Tab. 3.1.4-15)
Tab. 3.1.4-15: Einfluß der Feinzerkleinerung auf die Probenhomogenität
Matrix: Tafeltrauben (Alphonse Lavallee)
„frisch“ zerkleinert gefroren zerkleinert
Mittlerer
Carbendazim-Gehalt
Standardabweichung
in %
Analysenmethode: siehe Anlage 2
1,76 mg/kg 1,73 mg/kg
10,9 (n=7) 4,4 (n=7)
3.1.4.7.2 Einfluß der Polarität der Analyten auf die Extrahierbarkeit
Überkritisches Kohlendioxid ist ein recht unpolares Lösungsmittel und ist daher gut
zur Extraktion von unpolaren Analyten geeignet. Bei Gegenwart von Wasser in der
Probe wirkt dieses als Modifier, so daß eine gute Extrahierbarkeit von mittelpolaren
Pestiziden gegeben ist. Die Extraktion von Analyten mit hoher Polarität ist jedoch
schwieriger. Dies hat sich bei verschiedenen Versuchen gezeigt. So ist zum Beispiel
Dimethoat besser extrahierbar als Omethoat und Methomyl besser extrahierbar als
das polarere Oxamyl. In der Reihe Methiocarb, Methiocarb-Sulfon und Methiocarb-
Sulfoxid verschlechtert sich die Extrahierbarkeit mit zunehmender Polarität (siehe
Tab. 3.1.5-34 in Kap. 3.1.5.5.2.6).
Die Extrahierbarkeit von basischen Verbindungen ist bei niedrigen pH-Werten und
von sauren Verbindungen bei hohen pH-Werten schlecht, da unter diesen Bedingungen
die Verbindungen zu einem Großteil ionisch vorliegen und daher eine hohe
Polarität aufweisen.
So entzieht sich z.B. die Substanz 2,4-D, die unter alkalischen Bedingungen fast
ausschließlich als polares Anion vorliegt, der Extraktion. Unter sauren Bedingungen
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59

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
dagegen liegt die leicht extrahierbare Säureform vor. Analoges gilt auch für weitere
Substanzen wie z.B. Thiabendazol, Carbendazim und Imazalil, die unter sauren
Bedingungen zu einem erheblichen Anteil als Kationen vorliegen. Diese Verbindungen
lassen sich am besten im Alkalischen extrahieren (siehe auch Kap. 3.1.5.3.2).
Wie in Abb. 3.1.4-6 ersichtlich, können auch bei Extraktionen mit überkritischem
Kohlendioxid die Extraktionsausbeuten durch eine geeignete Einstellung des pH-Wertes
verbessert werden (siehe auch Kap. 3.1.5.3.1 und 3.1.5.4.3).
Abb. 3.1.4-6: Einfluß des pH auf die Extrahierbarkeit von 2,4-D und Carbendazim
Recoveries (%)
100
80
60
40
20
0
Carbendazim 2,4-D
pH 2.5
pH 4
pH 7
pH 9.5
3.1.4.7.3 Einfluß des Wassergehaltes auf die Extrahierbarkeit unpolarer Analyten
Hohe Wassergehalte behindern die Extraktion von unpolaren Verbindungen wie
Organochlorpestiziden und Pyrethroiden. Für diese Verbindungen können bessere
Wiederfindungsraten erreicht werden, wenn die Proben mit mehr Adsorbens (Hydromatrix,
Hymx) vermischt werden.
Aus Abb. 3.1.4-7 wird ersichtlich, daß bei einigen Verbindungen mit zunehmendem
Proben / Hydromatrix Verhältnis eine starke Abnahme der Wiederfindungen einhergeht.
Insbesondere bei lipophilen Verbindungen mit sehr geringer Wasserlöslichkeit wie bei
den Pyrethroiden (Löslichkeit in Wasser 1 - 500 µg/L [119]) sind diese Effekte stärker
ausgeprägt als bei Verbindungen mit einer verhältnismäßig größeren Löslichkeit wie
z.B. Lindan (7 mg/L) (siehe hierzu auch Kap. 3.1.7.1).
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60

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.4-7: Einfluß des Wassergehaltes auf die Extrahierbarkeit unpolarer
Pestizide
Recoveries %
100
80
60
40
20
0
0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
Sample/Hymx
Ratio
Biphenthrin
Deltamethrin
Cyhalothrin
Die Polarität des überkritischen Kohlendioxids nimmt mit steigendem Gehalt an
gelöstem Wasser zu („modifier“-Wirkung von Wasser). Die Fähigkeit des Fluids
lipophile Substanzen zu lösen nimmt somit mit steigendem Wassergehalt ab. Man
könnte annehmen, daß dies die Ursache für die schlechtere Wiederfindung von
Cypermethrin ist. Die Löslichkeit von Wasser in überkritischem Kohlendioxid ist
jedoch sehr gering (Sättigungskonzentration etwa 3 mg/g [11]). Zudem weist das auf
der Oberfläche des Adsorbens verteilte Wasser eine sehr große Oberfläche auf, so
daß eine rasche Gleichgewichtseinstellung (Sättigung) zu erwarten ist. Die
Absättigung des überkritischen Kohlendioxids mit Wasser dürfte demnach kurz nach
dem ersten Kontakt mit der wasserhaltigen Probe erfolgen. Ein unterschiedlicher Absättigungsgrad
des Fluids kommt demnach als Ursache für den oben genannten
Befund eher nicht in Frage.
Die ziemlich unpolaren Substanzen neigen dazu sich an unpolare Oberflächen wie
Wachs-, Cutin- und Ölschichten zu adsorbieren. Es ist vorstellbar, daß beim Verreiben
der Probe mit Hydromatrix solche lipophilen Bestandteile teilweise an der
unregelmäßigen Oberfläche der Hydromatrix haften bleiben und dort mehr oder
weniger von einer Wasserfilm überzogen und abgeschirmt werden. Die darin/darüber
liegenden Wirkstoffe wären in diesem Fall für das lipophile Extraktionsfluid nur
schwer zugänglich.
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Permethrin
Cyfluthrin
Cypermethrin
Fenpropathrin
Fenvalerat
DDE
Heptachlor
Dieldrin
Lindan
61

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.4.7.4 Abbau von Pestiziden während der Lagerung im Autosampler
Im Gegensatz zu herkömmlichen naßchemischen Analysenmethoden, bei denen die
Proben in der Regel direkt nach ihrer Wägung extrahiert werden, lagern bei der SFE die
aufgearbeiteten Proben oft mehrere Stunden im Probengeber des Extraktionsgerätes
bei Raumtemperatur.
Bei zahlreichen Wiederfindungsversuchen hat sich gezeigt, daß oxidations- oder
hydrolyseempfindliche Substanzen bereits abgebaut werden, wenn die Extraktion nicht
unmittelbar nach der Probenvorbereitung erfolgt, sofern die Proben nicht bis dahin
tiefgefroren werden. Abb. 3.1.4-8 und 3.1.4-9 zeigt das Abbauverhalten einiger dieser
empfindlichen Verbindungen in zwei verschiedenen Matrizes auf.
Abb. 3.1.4-8: Abbau von Pestiziden während der Lagerung in der Extraktionshülse
Wiederfindung [%]
Salat
pH∼6
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Diazinon
Dioxacarb
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Disulfoton
Ethiofencarb
Tolylfluanid
Chlozolinate
Dichlofluanid
Folpet
16
30
8
5
Zeit (h)
3
0
62

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.4-9: Abbau von Pestiziden während der Lagerung in der Extraktionshülse
Wiederfindung [%]
Trauben
pH∼3,5
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Tolylfluanid
Diazinon
Dichlofluanid
Fenvalerat
Chlozolinate
Folpet
Disulfoton
Ethiofencarb
Dioxacarb
20
8
Zeit (h)
Wie Abb. 3.1.4-8 zeigt, ist die Matrix nicht ohne Einfluß. So wird zum Beispiel Dioxacarb
unter sauren Bedingungen viel schneller abgebaut als unter neutralen Bedingungen
(siehe hierzu Kap. 3.1.5.5.2.6). Um Abbauvorgänge vor der Extraktion möglichst zu
vermeiden, ist es daher erforderlich die Proben bis zur Extraktion tiefgefroren
aufzubewahren.
Um die Möglichkeiten der Autosampler der SFE-Geräte nutzen zu können, müßten
diese unbedingt kühlfähig sein.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen wurden in [104] vorgestellt.
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4
0
63

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.5 Entwicklung von schnellen Bestimmungsmethoden für
spezielle Pestizidklassen mit analytischen Defiziten
3.1.5.1. Einleitung
Mit Hilfe der in Kap. 3.1.4 vorgestellten Multimethode kann eine Vielzahl von
Pestiziden bestimmt werden. Es gibt jedoch eine ganze Reihe von weiteren Verbindungen
für die diese Methode nicht geeignet ist:
Wegen zu geringer Wiederfindung:
Als Ursachen für schlechte Wiederfindungen bei SFE-Extraktionen kommen verschiedene
Faktoren in Betracht:
• schlechte Extrahierbarkeit der Wirkstoffe (z.B. wegen zu hoher Polarität
(siehe Kap. 3.1.4.7.2) und/oder starker Wechselwirkungen mit der Matrix)
• schlechte Elution der präzipitierten Stoffe von der Festphasenfalle in die
Vorlage (siehe Kap. 3.1.4.3 und Kap. 3.1.5.6.2)
• Abbauvorgänge (vgl. Kap. 3.1.4.7.4 und Kap. 3.1.5.5.2.7).
Wegen Problemen bei der Gaschromatographie:
z.B. bei polaren Verbindungen wie Phenoxyalkancarbonsäuren (siehe Kap.
3.1.5.4.2), Carbendazim (siehe Kap. 3.1.5.3.2) und thermolabilen Verbindungen wie
z.B. N-Methyl-Carbamate (siehe Kap. 3.1.5.5) und Organo-Zinn-Verbindungen (siehe
Kap. 3.1.5.6).
Für eine Reihe von Verbindungen, die sich nicht mit der vorgestellten Multimethode
bestimmen lassen, wurden im Rahmen dieser Arbeit spezielle SFE-Methoden
entwickelt.
Viele der Stoffe, die bei der SFE-Extraktion Probleme bereiten, sind auch bei den
klassischen (naßchemischen) Verfahren bei der Aufarbeitung als „problematisch“
aufgefallen. Zum Beispiel werden für die Stoffe Fenpropimorph, Imazalil und
Thiabendazol auch bei der DFG-S19 Multimethode [3] sehr geringe Ausbeuten erzielt.
Um die Ursachen hierfür besser zu verstehen und eventuelle molekulare Zusammenhänge
zu erkennen, wurden zunächst einige naßchemische Voruntersuchungen
durchgeführt. Dabei sollte ein „Gefühl“ für die Eigenschaften der Wirkstoffe bezüglich
Löslichkeit, Polarität und Affinität zu Oberflächen entwickelt werden. Die Erkenntnisse
aus diesen Versuchen sollten bei der Entwicklung von SFE-Extraktionsmethoden
adaptiert werden, um die Wiederfindungen dieser Verbindungen zu verbessern.
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64

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.5.2 Naßchemische Untersuchungen im Vorfeld
3.1.5.2.1 Rolle des pH-Wertes bei Extraktion und Flüssig-Flüssig-Verteilung
Homogenate pflanzlicher Proben weisen oft recht niedrige pH-Werte auf: z.B.
Zitronen pH∼2,5, Grapefruit und Orangen pH∼3,3, Trauben, Steinobst und Kernobst
pH 3 bis 4. Bei den derzeit in der Rückstandsanalytik gängigen Multimethoden wird
der pH-Wert bei der Extraktion und Flüssig-Flüssig-Verteilung nicht berücksichtigt.
Unvollständige Extrahierbarkeit von sauren und basischen Verbindungen sind die
Folge.
Unter sauren Bedingungen liegen verschiedene Wirkstoffe mit basischen Stickstoffatomen
zu einem nicht vernachlässigbaren Anteil in protonierter Form vor. Diese
protonierten Wirkstoffanteile entziehen sich, aufgrund ihres polaren Charakters, der
Extraktion in die organische Phase. Zur vollständigeren Erfassung derartiger
Wirkstoffe wie Thiabendazol, Carbendazim und Imazalil (Formeln siehe Tab. 3.1.5-1)
muß demnach die Extraktion bei höheren pH-Werten erfolgen.
Bei der Aufarbeitung von dotierten Zitrusfruchtproben nach [29] wurde z.B. festgestellt,
daß Thiabendazol und Imazalil bei der Flüssig-Flüssig-Verteilung nach den
ersten zwei Verteilungsschritten (unter sauren Bedingungen) nur zu 10 bis 20 % in
die organische Phase übergingen. Erheblich bessere Wiederfindungsraten wurden
nach einer zusätzliche Extraktion im Alkalischen erzielt.
Ein ähnliches Prinzip gilt auch bei der Extraktion von sauer reagierenden Verbindungen.
In diesem Fall sind saure Bedingungen für die Extraktion der Wirkstoffe
günstiger. Dies ist z.B. bei der Extraktion der Phenoxyalkancarbonsäuren der Fall
[29,19]. Die Einflüsse des pH-Wertes auf die Extrahierbarkeit einiger Wirkstoffe
werden ausführlicher in [29] dargestellt.
Eine andere Problematik liegt im Fall von Orthophenylphenol vor, das üblicherweise
als Natrium-Salz zur Oberflächenbehandlung von Zitrusfrüchten eingesetzt wird [30].
Bei der Extraktion der Oberflächenbehandlungsmittel nach [4,31] werden die Schalen
der Früchte ohne Wasserzusatz direkt mit überkritischem Kohlendioxid bzw. mit
Dichlormethan extrahiert. Da die Schalenoberfläche der Zitrusfrüchte im Gegensatz
zum Fruchtfleisch nicht sauer reagiert und kaum Wasser enthält, sind die
Bedingungen für eine Auflösung des Salzes und für die Protonierung des Phenolates
zur Phenolform nicht günstig. Es ist demnach, bei diesen Methoden, mit einer
unvollständigen Extraktion des Orthophenylphenol zu rechnen.
3.1.5.2.2 Wechselwirkungen von Wirkstoffen mit Oberflächen
Theoretische Betrachtung:
Adsorptionen von Wirkstoffen an Oberflächen (z.B. über Ionen-Ionen-Wechselwirkungen
oder über Wasserstoffbrücken-Bindungen) sind oft die Ursache für
schlechte Extrahierbarkeit, für Verluste bei der Aufarbeitung und für Schwierigkeiten
bei der Chromatographie. Daher sind Kenntnisse über die möglichen Ursachen und
Mechanismen dieser Erscheinungen für die Entwicklung von SFE-Methoden sehr
hilfreich.
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65

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Mögliche Oberflächen mit adsorptiven Eigenschaften sind z.B.:
1. bei der Probenaufarbeitung
Bestandteile der Probe (Wachse, Cutin, Öle, Zellulose, Pektin),
Glasoberflächen (Glasgeräte, Glasfaserpapier),
Cellulose (Papierfilter),
Adsorbentien (Hydromatrix, Kieselgel)
2. bei der Gaschromatographie
Glasoberflächen (GC-Injektions-Liner)
Schmutzablagerungen auf der Oberfläche von GC-Injektions-Liner und -Vorsäule.
Die Adsorptionskraft bestimmter Oberflächen kann erheblich variieren. Bei Polysilikaten
wie Kieselgel spielt z.B. der Wassergehalt (Aktivitätsstufe) eine erhebliche
Rolle, da Wasser die Oberfläche benetzen und maskieren kann.
Eine entscheidende Abschwächung der Aktivität kann z.B. durch Sättigung freier
Silanolgruppen an der Oberfläche durch Silanisierung erreicht werden (z.B.
silanisierte Glasgeräte, GC-Glasliner, Füllmaterialien von LC-Säulen).. Die Restmenge
an freien Silanolgruppen bestimmt den Restaktivitätsgrad der Oberfläche
Zu Adsorptionen neigen u.a.:
1. Verbindungen, die als Lewis Säuren oder Basen fungieren und dadurch direkt
oder über Wasserstoffbrücken-Bindungen (vgl. Abb. 3.1.5-1) mit der Oberfläche
des Adsorbens in Wechselwirkung treten können (z.B. Verbindungen mit Alkohol-
oder Säuregruppen und Verbindungen die basische Stickstoffatome aufweisen),
2. ionische Verbindungen (adsorbieren an Oberflächen die entgegengesetzte
Ladungen aufweisen),
3. lipophile Verbindungen und Verbindungen mit lipophilen Resten (neigen zur
Adsorption an lipophile Oberflächen).
Eine wichtige Rolle bei Adsorptionsprozessen spielen auch die beteiligten flüssigen
Phasen (Lösungsmittel). Lösungsmittel treten sowohl mit den Analyten als auch mit
aktiven Stellen der Oberfläche der festen Phase in Wechselwirkung und können
damit die Affinität von Analyt zu Oberfläche schwächen.
Zum Beispiel wird die Adsorption von Verbindungen an einem hydrophilen Adsorbens
(wie Kieselgel) erheblich abgeschwächt, wenn die aktiven Stellen an seiner
Oberfläche durch Lösungsmittelmoleküle wie Wasser oder Methanol „besetzt“
(desaktiviert) werden. Unpolare Lösungsmittel (z.B. Hexan) konkurrieren dagegen
kaum um solche aktive Stellen und können in diesem Fall die Adsorptionsprozesse
nur wenig beeinflussen.
Die Adsorption unpolarer Analyten an lipophilen Oberflächen (z.B. Wachsoberflächen)
ist dagegen günstiger, wenn die beteiligte flüssige Phase polar (z.B.
wasserhaltig) ist.
I.a. sind Wechselwirkungen elektrostatischer Art zwischen dem Analyt und der
Oberfläche des Adsorbens um so schwächer ausgeprägt, je höher die Dielektrizitätskonstante
des Lösungsmittels ist.
Abb. 3.1.5-1: Wechselwirkung von Verbindungen mit aktiven Oberflächen
über Wasserstoffbrückenbindungen, am Beispiel eines
Benzimidazolderivates (Vorschlag)
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66

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
H
O
H
H
N
H
O
N H
R
H
O
H
N
H
H O
H
O
H H
N
H
O
H
N
H
H O
Praktische Erfahrungen - Adsorptionserscheinungen bei der GPC:
Im folgenden Kapitel werden derartige Adsorptionsvorgänge beschrieben, die zu
Verlusten von Analyten führen. Ein praktisches Beispiel bei dem Wechselwirkungen
von Verbindungen mit Oberflächen festgestellt wurden, ist die bei zahlreichen
Methoden der Rückstandsanalytik zur Abtrennung höhermolekularer Begleitstoffe
eingesetzte GPC. Bei diesem Verfahren werden Substanzen nach ihrer Größe
(räumliche Ausdehnung) getrennt. Als Säulenmaterial wird meist ein in seiner
Porosität definiertes Copolymerisat auf Basis von Styren und Divinylbenzol (zu 3 %
quervernetzt) verwendet (Bio-Beads S-X3).
Die Trennung bei der GPC basiert auf folgendem Prinzip:
Die Porengrößen des Säulenmaterials sind so verteilt, daß höhermolekulare Stoffe
z.B. Triglyceride und Wachse, aufgrund ihrer Ausdehnung in die Mehrzahl der Poren
nicht eindringen können. Dadurch erfahren solche Moleküle nur eine kleine Retention
durch die stationäre Phase. Dagegen können kleinere Moleküle, wie z.B. Pestizide, in
die Poren eindringen und legen somit längere Wegsstrecken zurück.
Bei GPC-Elutionsversuchen wurden für verschiedene Substanzen besonders
niedrige Wiederfindungen festgestellt. Auffällig ist, daß diese Substanzen in ihrem
Molekül sterisch nicht gehinderte basische Stickstoffatome aufweisen, die (bis auf
Fenpropimorph) an aromatischen Heterosystemen beteiligt sind (siehe Tab. 3.1.5-1).
Bei Fenpropimorph ist wegen der relativ starren Struktur des Morpholin-Sechsringes
(Sesselkonformation) das basische N-Atom ebenfalls leicht zugänglich.
Die molekularen Verhältnisse spielen hier eine große Rolle, da sie für die Ausprägung
der Basizität entscheidend sind. Bei Pestiziden, wie etwa Diazinon, Pirimiphos-
Methyl und Chlorpyrifos, deren Stickstoffatome durch benachbarte Gruppen sterisch
abgeschirmt oder sonst in ihrer Nucleophilie geschwächt sind (siehe Abb. 3.1.5-2)
wurden, erwartungsgemäß, geringere Verluste bei der GPC festgestellt.
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N
H
R
R
H
O
67
H

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.5-2: Beispiele für N-haltige Pestizide mit abgeschwächter Nucleophilie
H3CO
O
P O
N
N
H3CO
OCH3
OCH3
Diazinon Pirimiphos-methyl
O
P O
N
N
N
H5C2O
Cl
O
P O
OC2H5
N
Chlorpyrifos
Tab. 3.1.5-1: Einige Fungizide mit schlechter Wiederfindung bei der GPC
Verluste festgestellt bei GPC-
Elutionsversuchen*
Wirkstoff Gruppen-
zugehörigkeit
Thiabendazol:
N
N
H
Carbendazim:
Imazalil:
N
N
N
H
N
N CH2 CH
Prochloraz:
N
CH3CH2CH2
NH C
O
S
OCH3
O CH2 CH CH2
Cl
O
Cl
N C
N CH2CH2O
Myclobutanil:
N
N CH2
N
CN
CH2
Fenpropimorph:
Cl
Cl
C Cl
CH2CH2CH3
N
CH3
O
CH3
Cl
Benzimidazolderivat
Benzimidazolderivat
Wirkstoffe in
reinem
Elutionsgemisch
68
Cl
Cl
bei Gegenwart von
Probenextrakt
(1 g Zitrone/ml)
bis zu 80 % bis zu 95 %
nicht durchgeführt bis zu 90 %
Imidazolderivat bis zu 50 % bis zu 90 %
Imidazolderivat nicht durchgeführt bis zu 60 %
Triazolderivat bis zu 50 % bis zu 60 %
Morpholinderivat
* eingesetztes Probevolumen je 4 ml, Wirkstoffkonzentration: 1 µg/ml
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bis zu 70% bis zu 80 %

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Bei Thiabendazol, Imazalil und Fenpropimorph wurde ein über längere Zeit andauerndes
„Schleichen“ festgestellt. Bei einem Elutionsversuch waren Spuren dieser
Substanzen in der GPC-Fraktion 70-90 min noch nachweisbar (Durchflußrate von 5
ml/min, Collect-Fraktion für Pestizide 18-30 min), obwohl diese nach ihrer Größe in
der Fraktion zwischen 18 und 30 min zu erwarten wären.
Auffällig ist, daß es bei Gegenwart von Matrixbestandteilen in der zu eluierenden
Probelösung zu einer Verschlechterung der Wiederfindungen bei der GPC kommt
(siehe Tab. 3.1.5-1). Beobachtet wurde zudem, daß bei Gegenwart von Matrix,
Anteile von Imazalil und Thiabendazol früher als erwartet im GPC-Eluat auftreten (vor
17 min). Hier könnten Wechselwirkungen zwischen den Wirkstoffen und
Matrixbestandteilen eine Rolle spielen.
Wechselwirkungen zwischen dem Säulenmaterial und Wirkstoffen (etwa über π-
Elektronen-Systeme) spielen bei diesen Effekten sicherlich kaum eine Rolle. Einige
denkbare, mit der GPC in Zusammenhang stehende, zu Verlusten führende Effekte
werden im folgenden aufgeführt:
• Wirkstoffanlagerung an Schwebstoffe, die sich entweder schon vor der GPC
absetzen oder sich am Anfangsbereich der GPC-Säule ablagern.
• Anlagerung weiterer Wirkstoffe an diese Ablagerungen am vorderen Teil der GPC-
Säule. (Die kontinuierliche Abgabe aus diesem „Depot“ könnte für das
Schleichen/Bluten dieser Wirkstoffe verantwortlich sein).
• Wirkstoffanlagerungen an gelöste höhermolekulare Matrixbestandteile, wodurch
diese Moleküle eine kürzere Retention erfahren, als aufgrund ihrer räumlichen
Ausdehnung zu erwarten wäre. Sie eluieren dadurch vor der „collect“ Fraktion in
der die Pestizide eluieren.
Die hier beschriebenen Beobachtungen werden auch in [29] erläutert.
Die oben aufgeführten theoretischen Überlegungen und die durchgeführten naßchemischen
Untersuchungen haben wertvolle Erkenntnisse zum Verhalten verschiedener
Pestizide bezüglich Extrahierbarkeit und Adsorptionsverhalten gebracht.
Diese waren für die Entwicklung von speziellen SFE-Methoden für saure und
basische Pestizide von großem Nutzen.
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69

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.5.3 Pestizide mit basischen Eigenschaften
3.1.5.3.1 Einfluß des pH-Wertes auf die Extrahierbarkeit (vgl. Kap. 3.1.4.7.2)
Basische Pestizide können mit ihren freien Elektronenpaaren in Wechselwirkungen
z.B. mit anderen Verbindungen oder verschiedenen Oberflächen treten. Aufgrund
dieser Eigenschaft treten bei Extraktion und Chromatographie Probleme auf (siehe
auch Kap. 3.1.5.2.2), so daß die Analytik dieser Verbindungen ein besonderes
Vorgehen erfordert und z.T. sehr aufwendig ist. Häufig handelt es sich bei diesen
Stoffen um Fungizide, die in ihrem Molekül basische Stickstoffatome z.B. als Teil
eines aromatischen Systems aufweisen. Zu den verbreitetsten Vertretern basischer
Fungizide zählen die Benzimidazolderivate Thiabendazol (pKb 9,3 und 11,5) [130]
und Carbendazim (pKb 9,52), die Imidazolderivate Imazalil und Prochloraz (pKb 10,2)
sowie das Morpholinderivat Fenpropimorph (pKb 9,4) (siehe Abb. 3.1.5-3).
Wie in Kap. 3.1.4.7.2 gezeigt, kann die Extrahierbarkeit von basischen Verbindungen
bei der SFE durch Erhöhung des pH-Wertes deutlich verbessert werden.
Es wurde ein Versuch durchgeführt um festzustellen, wie sich der pH-Wert auf die
Extrahierbarkeit der oben genannten Fungizide sowie von Diphenylamin auswirkt.
Hierzu wurde eine unveränderte (pH-Wert 2,5) und eine auf pH 9 eingestellte
(Zugabe von 50%iger K2CO3-Lösung) Zitronenmatrix mit einer Mischung dieser
Verbindungen dotiert und nach Vermengung mit Hydromatrix extrahiert. Zur
Extraktion wurde das Extraktionsgerät der Fa. ISCO gewählt, da hier die Extrakte
direkt in eine Lösungsmittelvorlage geleitet werden. Bei Verwendung des Gerätes der
Fa. HP, bei dem die Extrakte zunächst an einer mit ODS befüllten Falle aufgefangen
werden, wurde beobachtet, daß einige basische Pestizide, insbesondere
Thiabendazol aber auch Imazalil und Fenpropimorph nur sehr schleppend von der
Falle in das Vorlagegläschen eluiert werden. Grund hierfür sind Wechselwirkungen
dieser Pestizide mit aktiven Stellen an der Oberfläche des ODS-Adsorptionsmaterials
(vgl. Kap. 3.1.5.2.2).
Die dabei erzielten Wiederfindungen sind in Tab. 3.1.5-2 dargestellt.
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70

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.5-3: Strukturformeln einiger Pestizide mit basischen Eigenschaften
N
NH
C
N
O
H
Carbendazim
N
N
H
N
S
OCH 3
N
N
N C
CH 3CH 2CH 2
N CH2 CH
Cl
Imazalil
O
O CH2 CH CH2
N CH 2CH 2O
Thiabendazol Prochloraz
H
N
Diphenylamin
Wie aus der Tab. 3.1.5-2 ersichtlich spielt der pH-Wert bei der Extraktion von
Thiabendazol, Imazalil und Carbendazim aus Zitrone eine wichtige Rolle. Bei
Diphenylamin und Prochloraz dagegen wurden sowohl im Sauren als auch im
Alkalischen gute Wiederfindungen erzielt. Auffällig ist, daß bei Imazalil der pH-Wert
einen viel größeren Einfluß auf die Wiederfindungen hat als bei Prochloraz, obwohl
es sich bei beiden Molekülen um Imidazolderivate handelt. Im Unterschied zu
Imazalil steht jedoch das aromatische System bei Prochloraz in Konjugation mit der
angrenzenden Carbonylgruppe, so daß die Elektronenverteilung im Molekül
verschoben wird und die Basizität des Stickstoffs am Imidazolring geschwächt wird
(siehe Abb. 3.1.5-4).
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Cl
Cl
Cl
71
Cl

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.1.5-2: Wiederfindungen verschiedener basischer Pestizide bei
unterschiedlichen pH-Werten
mittlere Wiederfindungen in %
Bedingungen Thiabendazol Carbendazim* Imazalil Diphenylamin Prochloraz
pH∼2,5
pH 9
pH 9, 2. Extr.
15 12 44 96 92
62 94 91 98 95
16 - - - -
* nach Derivatisierung mit Pentafluorbenzylbromid (siehe Kap. 3.1.5.3.2.3)
Abb. 3.1.5-4: Konjugation des Imidazolsystems mit der Carbonylgruppe
bei Prochloraz
H
H
N
N
N C
N C
O
N R 1
R 2
O
N R 1
R2
N
N C
O
N R 1
Prochloraz
N
N
N C
N C
O
N R1
R2
O
R2
H
H
N R 1
Fazit:
Durch diese einfache Maßnahme, der pH-Wert-Einstellung vor der SFE-Extraktion,
wird die Bestimmung verschiedener basischer Pestizide ermöglicht. Mit Ausnahme
von Carbendazim, das vor einer gaschromatographischen Bestimmung derivatisiert
werden muß, lassen sich die untersuchten Verbindungen bei Berücksichtigung der
Matrixeffekte (vgl. Kap. 3.1.2.3) gut mittels GC/MSD bestimmen.
Obwohl Carbendazim eines der am häufigsten in der Landwirtschaft verwendeten
Fungizide ist, wird es wegen der Aufwendigkeit bestehender analytischer Methoden
bisher nicht routinemäßig untersucht. Stellvertretend für basische Pestizide wurde im
Rahmen dieser Arbeit eine schnelle Methode zur Bestimmung von Carbendazim
entwickelt.
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R 2
72

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.5.3.2 Carbendazim, Benomyl und Thiophanat-Methyl
Bei der Entwicklung von analytischen Methoden zur Bestimmung von Carbendazim
muß berücksichtigt werden, daß diese Verbindung der Hauptmetabolit und die
fungizid wirksame Form von zwei weiteren landwirtschaftlich oft eingesetzten
Verbindungen, Benomyl und Thiophanat-Methyl, ist (siehe Abb. 3.1.5-5).
Üblicherweise erfolgt die Bestimmung der drei Fungizide, nach Umwandlung zu
Carbendazim, gemeinsam. In der RHmV ist daher eine Summen-Höchstmenge
berechnet als Carbendazim festgesetzt [34,46].
Abb. 3.1.5-5: Strukturformeln von Carbendazim, Thiophanat-Methyl und Benomyl
(Carbendazim-Gruppe)
N
H
N NH COOCH3
Carbendazim
NH
NH
S
C
C
S
Thiophanat-Methyl
NH COOCH3
NH COOCH3
O
C
N
N NH
Benomyl
NH C 4H 9
COOCH3
Während der Wachstumsperiode werden diese Fungizide häufig im Kernobstanbau,
beim Anbau von Tafeltrauben, Steinobst, Salat und Getreide verwendet. Als
Nacherntebehandlungsmittel finden sie bei Bananen, Zitrusfrüchten, Kernobst,
Mangos und Kartoffel zum Schutz vor zahlreichen Pilzkrankheiten Verwendung
[30,47].
Carbendazim, Benomyl und Thiophanat-Methyl werden nicht mit den gängigen
Multimethoden erfaßt, da sie bei der Extraktion Schwierigkeiten bereiten und da eine
Umwandlung zu Carbendazim sowie eine Derivatisierung vor der GC-Bestimmung
durchgeführt werden muß. Vorhandene Einzelbestimmungsverfahren sind daher sehr
arbeitsintensiv, verbrauchen große Mengen an Lösungsmittel und sind für die
Routineanalytik wenig attraktiv [48,51-58].
Wegen des verbreiteten Einsatzes und der unzureichenden Rückstandsdaten ist es
jedoch notwendig diese Stoffe im Rahmen der Lebensmittelüberwachung und des
Lebensmittel-Monitoring routinemäßig zu untersuchen [48,49].
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
73

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Jimènez et al [40] entwickelten eine SFE-Methode zur Bestimmung von Carbendazim
in gefriergetrocknetem Salat, bei der Methanol als Modifier des Kohlendioxids
verwendet wurde. Die Gefriertrocknung von Probenmaterial ist jedoch sehr
zeitaufwendig und nicht für alle Obst- und Gemüsesorten geeignet (siehe Kap.
3.1.3.2.1). Aharonson et al. [9] beschreiben eine Methode zur Bestimmung der
Benzimidazol-Fungizide einschließlich Carbendazim und Thiophanat-Methyl unter
Verwendung von SFE und HPLC-UV. Sie erzielten gute Wiederfindungen für
Bananen, Kartoffel und Äpfel. Allerdings sind die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen
dieses Verfahrens nicht ausreichend zur Überprüfung kleiner Höchstmengen.
Desweiteren wird nach unserer Erfahrung Carbendazim aus sauren
Lebensmitteln nicht vollständig extrahiert (siehe Kap. 3.1.4.7.2).
3.1.5.3.2.1 Umwandlung von Benomyl zu Carbendazim
Benomyl ist eine labile Verbindung. Zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die
Kinetik der Zersetzung von Benomyl in organischen Lösungsmitteln [64-66] und in
wäßrigen Lösungen [66-69]. Ältere Arbeiten berichten, daß Benomyl in wäßrigen
Lösungen [28,45] und auf Pflanzen [71] schnell und vollständig zu Carbendazim
umgewandelt wird. Baude et al [74] zeigten jedoch bei Feldversuchen, daß Benomyl
sowohl in wäßriger Suspension als auch als Rückstand auf der Pflanze eine gute
Stabilität besitzt. Wegen seiner geringen Wasserlöslichkeit (3,8 ppm bei 20°C [69])
liegt Benomyl in wäßrigen Präparaten als Suspension vor (übliche Konzentration 250
ppm) und wird dort nur langsam abgebaut [65].
Da Benomyl-Standardsubstanzen stets einen kleinen Anteil an Carbendazim enthalten
und Benomyl sich in organischen Lösungsmitteln rasch zu Carbendazim
umwandelt, ist es nicht möglich carbendazimfreie Benomyl-Lösungen herzustellen
[68]. Für Dotierungsversuche wurde eine Benomyl-Lösung in kaltem Acetonitril
hergestellt (500µg/ml). Diese Lösung wurde unmittelbar nach ihrer Herstellung mit
HPLC/DAD untersucht und dabei ein Carbendazimgehalt von etwa 40 µg/ml ermittelt,
was etwa 60 µg/ml Benomyl entspricht. Bei einer Lagerung dieser Lösung bei -18°C
stieg der Anteil an Carbendazim über längere Zeit nicht merklich an. Bei
Raumtemperatur setzte sich jedoch das Benomyl rasch zu Carbendazim um. Nach
einer anfänglich hohen Umsetzungsrate (t0,5 = etwa 40 min), erreichte die Reaktion
schnell einen Gleichgewichtszustand, bei dem etwa 20 % des ursprünglichen
Benomyl noch intakt vorlag. Diese Beobachtungen stimmen sehr gut mit kinetischen
Studien über das Verhalten von Benomyl in Acetonitril überein, die von Singh et al.
[66] durchgeführt wurden. Auch sie beobachteten das Auftreten eines
Gleichgewichtszustandes.
In neutralen wäßrigen Lösungen ist die Umwandlungsrate von Benomyl zu
Carbendazim geringer als in organischen Lösungsmitteln, sie steigt jedoch im Sauren
und im Alkalischen an [67,68,75]. Im Alkalischen tritt neben der Bildung von
Carbendazim eine weitere dazu konkurrierende Reaktion auf, die mit steigendem pH-
Wert zunehmend an Bedeutung gewinnt (siehe Abb. 3.1.5-6). Zunächst bildet sich
aus Benomyl unter Ringschluß STB (3-Butyl-2,4-Dioxo[1,2-a]-s-Triazinobenzimidazol),
das bei höheren pH-Werten weiter zu BBU (1-(2-Benzimidazoyl)-3-n-
Butylharnstoff) abgebaut wird [76].
Abb. 3.1.5-6: Abbaupfade von Benomyl [69,74,77]
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74

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
N
N
C
O NH
C4H9
Benomyl
H +
N
O
NH C OCH3
N NH C OCH3
H
Carbendazim
O
OH -
OH -
N
N
C
O N
C4H9
STB
NH
N
O
N NH2
H
2-Aminobenzimidazole
OH -
N
N NH
H C O
NH
Diese Konkurrenzreaktion zur Bildung von Carbendazim unter alkalischen Bedingungen
bringt analytische Schwierigkeiten mit sich. Vor einer Extraktion unter
alkalischen Bedingungen muß Benomyl zu Carbendazim umgewandelt werden, da
sonst unerwünschtes STB und BBU entsteht.
Eine quantitative Umwandlung von Benomyl zu Carbendazim kann nach Literaturangaben
durch Erhitzen angesäuerter Proben erreicht werden [51,54]. Allerdings
berichten Calmon et al. [67], daß die Umwandlung bei pH-Werten unterhalb 2,5
wegen der Protonierung des Benomyl gehemmt ist.
Die Umwandlung von Benomyl zu Carbendazim wurde deshalb bei pH∼3 durch
Erhitzen der Probe durchgeführt. Bei Wiederfindungsversuchen wurde gezeigt, daß
unter diesen Bedingungen eine sehr hohe Umwandlungsrate von Benomyl zu
Carbendazim (über 90 %) erreicht wird (Bem.: der pH-Wert wurde vor der Extraktion
auf 8 eingestellt). Zudem wurde gezeigt, daß weder Thiophanat-Methyl noch
Carbendazim unter diesen Bedingungen beeinträchtigt werden. Die Wiederfindung
an Benomyl war wesentlich schlechter (73 % als Carbendazim), wenn die dotierten
Proben ohne saure Vorbehandlung direkt alkalisiert (pH=8) und extrahiert wurden
(siehe Tab. 3.1.5-3). Dies ist vermutlich auf die kompetitive Bildung von STB
zurückzuführen. Die Wiederfindungsraten waren noch niedriger, wenn die bereits in
die Extraktionshülsen gefüllten Proben vor der Extraktion bei Raumtemperatur
gelagert wurden (siehe Tab. 3.1.5-3, Bem.: etwa 12 % des Benomyls lag bereits vor
der Dotierung als Carbendazim in der Standardlösung vor).
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C4H9
BBU
75

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.1.5-3: Wiederfindung von Benomyl als Carbendazim
(dotierte Menge 3,3 mg/kg), Extraktion bei pH 8
Lagerzeit in der Wiederfindungsrate Bemerkungen
Extraktionshülse vor als Carbendazim
der Extraktion bei RT
%
0 h 73 keine Vorbehandlung
2 h 41 im Sauren
8 h 28
0 h 94 mit Vorbehandlung
2 h 90 im Sauren
8 h 92 (20 min, 65° C, pH 3)
Der Umwandlungsfaktor 1,52 wurde für die Berechnung verwendet
Anmerkung zur Analytik von Benomyl:
Die Umwandlung von Benomyl zu STB und BBU im Alkalischen eröffnet die Möglichkeit
zur indirekten Bestimmung von Benomyl-Rückständen in Proben. Dies wurde
jedoch nicht weiter verfolgt, da in der RHmV eine Summenhöchstmenge für Benomyl
Carbendazim und Thiophanat-Methyl angegeben ist. Die gesonderte Bestimmung
von Benomyl-Rückständen in Proben ist daher für die Überwachung nicht
interessant.
3.1.5.3.2.2 Thiophanat-Methyl
Thiophanat-Methyl ist beständiger als Benomyl und kann oft über längere Zeit in
behandelten Erntegütern nachgewiesen werden [51,78]. Wie Abb. 3.1.5-7 zeigt ist die
Umwandlung von Thiophanat-Methyl zu Carbendazim während der SFE-Extraktion,
selbst bei alkalischen Bedingungen, vernachlässigbar. Folglich kann Thiophanat-
Methyl nach einer SFE-Extraktion als solches bestimmt werden (HPLC/DAD).
Allerdings wurde eine nicht unwesentliche Umwandlung von Thiophanat-Methyl zu
Carbendazim beobachtet, wenn die Extraktion nicht direkt durchgeführt wurde,
sondern die Extraktionshülsen einige Stunden bei Raumtemperatur (z.B. im
Autosampler des Extraktions-Gerätes) lagerten. Diese Umwandlung wird mit
steigendem pH-Wert begünstigt. Allerdings treten auch hier Konkurrenzreaktionen
auf, so daß die Wiederfindungsrate als Carbendazim relativ niedrig lag (bei max. 60%
nach 24 h, pH 8,5) (Abb. 3.1.5-8). Bei -18°C wurde dagegen selbst nach längerer
Lagerung kein wesentlicher Abbau von Thiophanat-Methyl beobachtet. (siehe Abb.
3.1.5-7).
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76

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.5-7: Unerwünschter Abbau von Thiophanat-Methyl in der
Extraktionshülse während der Lagerung bei Raumtemperatur
µg/Extraktionshülse
25
20
15
10
5
0
100 % Wiederfindung ber. als Carbendazim
0 1 2 3 4 5 6 7 10 72*
Lagerzeit der Extraktionshülsen in Stunden bei pH 8,5
Carbendazim Thiophanat-Methyl Summe ber. als Carbendazim
* diese Probe wurde bei -18° C gelagert
Abb. 3.1.5-8: Unerwünschter Abbau von Thiophanat-Methyl in der
Extraktionshülse während der Lagerung bei Raumtemperatur
.
Wiederfindung als
Carbendazim in %
100
80
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6 7 10 24
Stunden
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
pH 7
pH 8,5
pH 9,5
77

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Umwandlung von Thiophanat-Methyl zu Carbendazim nach der Extraktion:
Eine nahezu vollständige Umwandlung von Thiophanat-Methyl zu Carbendazim
wurde durch Zugabe von Kaliumcarbonat-Lösung als Katalysator in den GC-Vials,
die den SFE-Extrakt in Acetonitril enthalten, durchgeführt.
Um diese Umwandlung zu optimieren wurde eine einfache kinetische Studie
gemacht. Der Fortgang der Umwandlung wurde mit Hilfe eines RP-HPLC/DAD
verfolgt und ist in Abb. 3.1.5-9 dargestellt.
Abb. 3.1.5-9: Kinetik der Umwandlung von Thiophanat-Methyl zu Carbendazim in
Acetonitril/K2CO3
Der erste Schritt dieser basisch katalysierten Reaktion läßt sich anhand der raschen
Abnahme der Peakfläche des Thiophanat-Methyl verfolgen. Diese Abnahme scheint
den Gesetzen einer Reaktion 1. Ordnung zu folgen (Linearität der Beziehung
zwischen dem Logarithmus der Peakfläche von Thiophanat-Methyl gegen die
Reaktionszeit, siehe Abb. 3.1.5-10). Wie in Abb. 3.1.5-9 und Abb. 3.1.5-11 zu sehen
ist, entstehen einhergehend mit der Abnahme des Thiophanat-Methyl Zwischenprodukte,
die hier nicht näher untersucht wurden.
Die Halbwertszeiten (HWZ) der Abnahme von Thiophanat-Methyl bei verschiedenen
Temperaturen wurden aus den Steigungen der Geraden in Abb. 3.1.5-10 berechnet
(HWZ=ln 2/Steigung). Die Bildung von Carbendazim kann durch die Erhöhung der
Temperatur beschleunigt werden. Allerdings sollte die Temperatur unterhalb 70°C
liegen um zu vermeiden, daß Carbendazim zu 2-Aminobenzimidazol abgebaut wird
(siehe Abb. 3.1.5-7 und Abb. 3.1.5-2).
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78

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.5-10: Kurven des Logarithmus der relativen Peakflächen von Thiophanat-
Methyl gegen die Zeit
ln (signalx100/Int.Std)
6
5
4
3
2
1
0
60°C
t 0.5 =1.1 min
50°C
t 0.5 =1.8 min
40°C
t 0.5 =3.4 min
20°C
t 0.5 =21 min
0 10 20 30 40
Zeit [min]
Abb. 3.1.5-11: Fortgang der Umwandlung von Thiophanat-Methyl zu Carbendazim
in Acetonitril/K2CO3 bei Raumtemperatur (HPLC/DAD, 285 nm)
mAu
100
80
60
40
20
0
0 min 60 min 160 min 300 min
Thiophanat-Methyl
2 4 6 8
mAu
100
80
60
40
20
0
Zwischenprodukte
Carbendazim
Thiophanat-Methyl
2 4 6 8
mAu
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
80
60
40
20
0
Zwischenprodukte
Carbendazim
2 4 6 8
mAu
100
80
60
40
20
0
Zwischenprodukte
Carbendazim
79
2 4 6 8

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.5-12: Bildung von Carbendazim bei der Umwandlung von Thiophanat-
Methyl in Acetonitril/K2CO3 bei verschiedenen Temperaturen
Die Bildung der Zwischenprodukte erfolgt rasch. Wesentlich langsamer und daher
geschwindigkeitsbestimmend erfolgt die nachfolgende Bildung des Carbendazim.
(Abb. 3.1.5-9 und Abb. 3.1.5-11). Dies hat Auswirkungen auf die Analytik. Die HPLC-
Bestimmung kann erst dann durchgeführt werden, wenn sich die Zwischenprodukte
quantitativ in Carbendazim umgewandelt haben und nicht sobald kein Thiophanat-
Methyl mehr vorhanden ist, da sonst zu niedrige Werte ermittelt werden. Analog dazu
sollte eine nachfolgende Derivatisierung des Carbendazim erst nach vollständig
erfolgter Umwandlung durchgeführt werden, da andernfalls das Derivatisierungsmittel
mit Thiophanat-Methyl selbst oder den Zwischenprodukten reagiert, wodurch andere
Produkte als das gewünschte Carbenazim-Derivat entstehen können.
Bestimmung von Thiophanat-Methyl als solches:
Es wurde gezeigt, daß sich Thiophanat-Methyl bei pH-Werten zwischen 4 und 9,5 gut
extrahieren läßt. Wegen der Instabilität des Thiophanat-Methyl im Alkalischen sind
jedoch niedrigere pH-Werte günstiger. Wird die Extraktion jedoch bei höheren pH-
Werten durchgeführt, ist darauf zu achten, daß unter alkalischen Bedingungen in den
Extraktionshülsen ein Abbau erfolgen kann. Sowohl die Extraktion als auch die
Bestimmung müssen ohne Verzögerung möglichst rasch durchgeführt werden, da
Thiophanat-Methyl selbst in den in Acetonitril gelösten Extrakten innerhalb einiger
Stunden teilweise zu Carbendazim umgewandelt wird.
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80

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.5.3.2.3 Derivatisierung von Carbendazim mit PFB-Br im GC-Vial
Die direkte Bestimmung von Carbendazim mittels HPLC-DAD ist relativ unempfindlich.
Eine gaschromatographische Bestimmung ist nur nach Derivatisierung
möglich. Da für Carbendazim und Thiophanat-Methyl eine gemeinsame
Höchstmenge, berechnet als Carbendazim, gilt und Carbendazim sehr empfindlich
als PFB-Derivat mit GC-MSD bestimmt werden kann, ist es sinnvoll beide Stoffe
zusammen als Carbendazim zu bestimmen (Benomyl wird schon vor der Extraktion
zu Carbendazim umgewandelt). Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher eine Methode
entwickelt bei der die Umwandlung von Thiophanat-Methyl und die anschließende
Derivatisierung des Carbendazim direkt in dem GC-Gläschen durchgeführt wird, in
dem der SFE-Extrakt anfällt. Beide Reaktionen werden durch K2CO3-Lösung
katalysiert.
Sie ist einfach durchzuführen und erfordert nur wenige Arbeitsschritte (siehe Anlage
2, Code 101E3102).
3.1.5.3.2.4 Bestimmung mittels GC-MSD
Die derivatisierten Extrakte können ohne weitere Reinigung direkt zur Messung
eingesetzt werden.
Tab. 3.1.5-4 zeigt die Strukturformel des Derivates, seine Retentionszeit sowie die
zur Quantifizierung und Identifizierung verwendeten SIM-Massen auf.
Tab. 3.1.5-4: GC-MS-Daten des Carbendazim-bis-PFB-Derivates
Strukturformel Retentionszeit
(min)
N
N
CH2C6F5
CH2C6F5
N C
O
OCH3
24,10
GC-Bedingungen: siehe Anlage 2 (Code 101E3102)
Quantifizierungs-
Masse
(m/z)
551
Bestätigungs-
Massen
(m/z)
492, 292
Zur Kompensation von Matrix-Effekten bei kleinen Carbendazim-Konzentrationen ist
es günstig Kalibrierungen nach dem Standard-Additionsverfahren durchzuführen.
Abb. 3.1.5-13 zeigt die Matrix-Effekte des Carbendazim-bis-PFB-Derivates am
Beispiel eines Orangensaft-Extraktes.
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81

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.5-13: Matrixeffekte, die bei niedrigen Konzentrationen an Carbendazim-
Derivat auftraten, Eichlösungen auf Orangensaft-Extrakt
Fläche vs. Internen Standard
120
100
80
60
40
20
3.1.5.3.2.5 Validierung
Wiederfindungen:
"Matrix Eichung"
0
0 20 40 60 80 100 120 140 160
ng Carbendazim/ml
"Lösungsmittel-Eichung"
Zur Ermittlung der Wiederfindungsraten wurden zerkleinerte Grapefruit-, Trauben-
und Eisbergsalat-Proben mit Thiophanat-Methyl oder Carbendazim dotiert. Die
verwendete Analysenvorschrift befindet im Anlage 2. Tab. 3.1.5-5 zeigt die
ermittelten Wiederfindungen.
Tab. 3.1.5-5: Wiederfindung von dotiertem Carbendazim (0,33 mg/kg) und
Thiophanat-Methyl (0,66 mg/kg) aus verschiedenen Lebensmitteln
Lebensmittel Carbendazim Thiophanat-Methyl
Grapefruit
Trauben
Eisbergsalat
Analysenmethode: siehe Anlage 2
Mittlere Wiederfindung in %
91 85
92 79
93 -
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82

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Nachweis- und Bestimmungsgrenzen:
Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen für Carbendazim wurden nach dem DFG-
Eichgeradenverfahren ermittelt (siehe Tab. 3.1.5-6) [80]. Hierzu wurden Wiederfindungsversuche
bei vier verschiedenen Konzentrationen jeweils 4 mal durchgeführt
(16 Aufarbeitungen). Die Dotierungen erfolgten auf Apfelmatrix, wobei die niedrigste
dotierte Konzentration im Bereich der erwarteten Nachweisgrenze lag [81].
Tab. 3.1.5-6: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen nach dem DFG-Eichgeradenverfahren
[80-82]
Parameter Carbendazim
(als Bis-PFB-Derivat)
dotierte Menge (µg/kg) 4,8/9,5/19/28,6
berechnete Nachweisgrenze 3 µg/kg
berechnete Bestimmungsgrenze* 5 µg/kg
Korrelation der Geraden (r) 0,998
Korrelationskoeffizient (%RSD) 3,6
Analysenmethode: siehe Anlage 2
* kleinste Höchstmenge für Obst und Gemüse 100 µg/kg, für Säuglingsnahrung 10
µg/kg [34]
Laborvergleichsuntersuchung
Eine zerkleinerte, mit einer unbekannten Menge an Carbendazim dotierte Apfelprobe
wurde mit der in Anlage 2 vorgestellten SFE-Methode untersucht. Diese Probe wurde
von der Europäischen Kommission im März 1997 im Rahmen einer
Laborvergleichsuntersuchung (Proficiency Test) zur Verfügung gestellt [83]. Tab.
3.1.5-7 zeigt die Ergebnisse, die mit der SFE-Methode erzielt wurden, im Vergleich
zu denen der 58 teilnehmenden Laboratorien.
Tab. 3.1.5-7: European Commission’s Proficiency Test II (März 1997)
Teilnehmerzahl 58
Mittelwert 0,507 mg/kg
Median 0,513 mg/kg
dotierte Menge 0,653 mg/kg
Ergebnis der SFE-Methode 0,66 mg/kg
Wiederfindung 1) 100% (0,5 mg/kg)
1 ) pestizidfreie Apfelmatrix, die von den Organisatoren zur Verfügung gestellt wurde,
wurde mit 0,5 mg/kg Carbendazim dotiert
Analysenmethode: siehe Anlage 2
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen wurden in [101, 102] veröffentlicht.
Untersuchungsergebnisse von zahlreichen Proben aus dem Handel werden in Kap.
3.1.6.2 vorgestellt.
3.1.5.3.2.6 Extraktion von „gewachsenen“ Carbendazim-Rückständen aus
Keltertrauben
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83

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Im Rahmen eines Feldversuches im Überwachungsgebiet der CVUA Stuttgart wurde
die Wirksamkeit der botriticiden Präparate „Skala“ und „Botrylon“ im Weinbau
untersucht. Zur Überprüfung der Rückstandssituation der enthaltenen Wirkstoffe
Carbendazim, Pyrimethanil und Diethofencarb zum Zeitpunkt der Lese wurden von
Weinkontrolleuren entsprechende Proben entnommen.
Die Trauben wurden nach der Zerkleinerung zu je 3 g in 50 ml Bechergläser
eingewogen und zum Teil mit NaHCO3-Lösung zur Einstellung des pH-Wertes auf
etwa 6,5 („neutral“) bzw. 8,5 („alkalisch“) versetzt. Die restlichen Proben wiesen
einen pH-Wert von etwa 3 auf („sauer“). Alle Proben wurden anschließend mit 2 g
Hydromatrix verrührt und zur SFE-Extraktion eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Tab.
3.1.5-8 dargestellt.
Tab. 3.1.5-8: Einfluß des pH-Wertes auf die Extrahierbarkeit von
Carbendazim aus Trauben mittels SFE
Carbendazimgehalt (in ppm) bestimmt nach Derivatisierung
mit PFBB/K2CO3
SFE-Methode DFG-Methode
„alkalisch“ „neutral“ „sauer“
pH∼8,5 pH∼6,5 pH∼3
Probe 1 0,18 (n=5) 0,035 (n=4)
Probe 2 0,10 (n=6) 0,053 0,018 (n=3)
Probe 3 0,16 (n=6) 0,039 (n=4)
Probe 4 0,17 (n=6) 0,042 (n=3)
Probe 5 0,37 (n=4) 0,38 (n=2)
Probe 6 0,16 (n=5) 0,045 0,019 (n=2)
Analysenmethode: siehe Anlage 2
Wie zu erwarten war, spielt der pH-Wert auch bei der SFE-Extraktion von gewachsenen
Carbendazim-Rückständen eine große Rolle. Unter alkalischen Bedingungen
wurden für Carbendazim Werte ermittelt, die mit denen der DFG-Methode
vergleichbar sind. Unter sauren Bedingungen konnte dagegen nur ein Bruchteil des
Carbendazim erfaßt werden.
Die Ergebnisse der Untersuchung auf Pyrimethanil und Diethofencarb sind in Kap.
3.1.6.1 dargestellt.
3.1.5.3.2.7: SFE- und DFG-Methode zur Bestimmung der Carbendazim-Gruppe im
Kostenvergleich
In Tab. 3.1.5-9 werden die einzelnen Arbeitsschritte, die bei der SFE-Methode (siehe
Anlage 2) und der DFG-Methode 261, 378 zur Bestimmung von Carbendazim,
Benomyl und Thiophanat-Methyl anfallen, gegenübergestellt. Darüber hinaus werden
die Kosten für die beiden Verfahren geschätzt. Es wird ersichtlich, daß die SFE-
Methode im Vergleich zu der herkömmlichen Methode deutlich effizienter ist. Die
Vorteile liegen vor allem in der Einsparung von Lösungsmittel- und Personalkosten.
Tab. 3.1.5-9: Gegenüberstellung der DFG-261, 378 und der SFE-Methode zur
Bestimmung der Stoffe der Carbendazim-Gruppe
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
84

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
SFE-Methode DFG 261, 378
Arbeitsschritte
• einwiegen
• einwiegen
• alkalisieren
• mit Methanol homogenisieren
• Zugabe von Adsorbens
• ausschütteln
• einfüllen in die Extraktionshülse • abnutschen, nachwaschen,
• Extraktion
auffüllen
• Derivatisierung
• Aliquotierung
• Chromatographie
• mit DMF am Rotationsverdampfer
konzentrieren
• mit DMF und Ammoniak versetzen
• auf dem Wasserbad erwärmen
• am Rotationsverdampfer
konzentrieren
• mit Phosphatpuffer und Salzlösung
versetzen
• 3 x mit Dichlormethan ausschütteln
• mit Natriumsulfat trocknen
• am Rotationsverdampfer
konzentrieren
• aufnehmen
• Al2O3-Säulen herstellen
• säulenchromatographische
Reinigung
• Lösungsmittel entfernen
• Derivatisierung
• Chromatographie
Arbeitszeit pro Serie in Stunden
6 Arbeitsstunden für 12 Proben 20 Arbeitsstunden für 6 Proben
Chemikalienverbrauch
• 40 g hochreines Kohlendioxid
• 250 ml Methanol
• techn. Kohlendioxid zur Kühlung der • 240 ml Dichlormethan
Falle
• 150 ml Hexan/Essigester
• 10 g Hydromatrix
• 10 ml DMF
• 8 ml Acetonitril
• Natriumsulfat
• 5 ml Hexan
• Natriumchlorid
Kosten für die Aufarbeitung pro Probe in DM
Personalkosten: ca. 15 DM Personalkosten: ca. 100 DM
Chemikalien /
ca. 10 DM Chemikalien /
ca. 55 DM
Verbrauchsmaterial
Verbrauchsmaterial:
Summe
ca. 65 DM ca. 155 DM
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85

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.5.4 Saure Pestizide
3.1.5.4.1 Einführung
Ähnlich wie im Fall basischer Verbindungen ist bei sauren Pestiziden zur Verbesserung
der Extrahierbarkeit eine pH-Wert-Einstellung notwendig. Eine Ansäuerung
der Matrix ist hier erforderlich um das Säure-Base-Gleichgewicht in Richtung der
leicht extrahierbaren protonierten Form zu verschieben. Die meisten Pestizide mit
Carbonsäure-Funktion sind herbizid und/oder wachstumsregulatorisch wirksam.
Zu den wichtigsten Vertretern gehören die Phenoxyalkancarbonsäuren, die als
Selektivherbizide im Getreideanbau verwendet werden. Beispiele hierfür sind
2,4-D und Mecoprop, die weltweit zu den mengenmäßig am häufigsten verwendeten
Pestiziden gehören. Pestizide mit Säuregruppen sind in der Regel gut wasserlöslich
und daher systemisch wirksam, d.h. sie dringen z.B. über die Wurzeln in die Pflanzen
ein und verteilen sich über die Assimilatenbahnen über die ganze Pflanze. Hier
können sie über die Säuregruppe Bindungen mit verschiedenen Pflanzeninhaltsstoffen,
wie Kohlenhydraten und Proteinen eingehen (Ausbildung gebundener
Rückstände).
Analytisch bereiten Pestizide mit Säuregruppen einige Schwierigkeiten, da sie
besondere Extraktionsbedingungen erfordern und nicht ohne Derivatisierung
gaschromatographisch bestimmt werden können. Sie werden daher nicht mit den
gängigen Multimethoden erfaßt und somit routinemäßig kaum untersucht.
Die Entwicklung einer einfachen Methode zur Bestimmung solcher Pestizide ist daher
erforderlich.
Stellvertretend für Phenoxyalkancarbonsäuren wurde 2,4-D für die Entwicklung einer
Bestimmungsmethode ausgewählt. 2,4-D wird nicht nur als Herbizid im Getreideanbau
eingesetzt, sondern auch in geringen Konzentrationen als Wachstumsregulator beim
Anbau von Obst und Gemüse. In Getreide werden üblicherweise nur geringe Gehalte
an Phenoxyalkancarbonsäuren gefunden, da die Behandlung bereits zu einem sehr
frühen Zeitpunkt des Anbaus erfolgt. Bei Zitrusfrüchten wird 2,4-D zudem häufig auch
zur Nacherntebehandlung eingesetzt, weshalb hier am ehesten mit Rückständen zu
rechnen ist.
3.1.5.4.2 2,4-D-Rückstände in Zitrusfrüchten
Seit den späten 40 iger Jahren wird 2,4-D im Zitrusanbau als Wachstumsregulator
eingesetzt [9]. In den USA werden beispielsweise Zitrusbäume vor der Ernte mit
schwach konzentrierten 2,4-D-Isopropylester-Lösungen behandelt [4,9]. 2,4-D bewirkt
eine Verlangsamung der Reifungsprozesse in den Früchten, wodurch der Fruchtabfall
verzögert wird. Dadurch kann die Erntezeit erheblich verlängert werden. Die Belastung
der Früchte mit 2,4-D durch diese Behandlung ist relativ gering [9].
In Ländern wie Argentinien, Uruguay und Südafrika werden Zitrusfrüchte vor der
Einschiffung zum Export nach Europa mit wäßrigen Wachsemulsionen behandelt, die
etwa 500 ppm 2,4-D enthalten. Der Wirkstoff wird hier meist als Salz (z.B. Natrium-
oder Dimethylammonium-Salz) oder als Ester (z.B. Isopropylester) eingesetzt
[5,9,125,132]. In USA und Spanien wird 2,4-D nur bei Früchten verwendet, die zur
Lagerung bestimmt sind [125,131]. Hier wird das 2,4-D-haltige Wachs vor dem
Verkauf abgewaschen und durch ein 2,4-D-freies Glanzwachs ersetzt.
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
86

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Mit 2,4-D behandelte Zitrusfrüchte sind beständiger gegen Pilzbefall. Dies ist darauf
zurückzuführen, daß biologische Prozesse, die für die natürliche Alterung der Früchte
verantwortlich sind, mit Hilfe von 2,4-D verzögert werden. Dadurch bleiben die
Resistenzmechanismen der Früchte gegenüber Pilzen länger intakt [9,47,50].
Die zur Oberflächenbehandlung von Zitrusfrüchten eingesetzten 2,4-D-Ester
hydrolysieren in der Regel kurze Zeit nach ihrer Anwendung zu der Säureform [5,9].
Der als Säure vorliegende Wirkstoff kann sich nun an verschiedene Moleküle mit
reaktionsfähigen Gruppen (z.B. Hydroxyl- oder Epoxid-Gruppen [vgl. 33]) anbinden. In
Betracht kommen hier in erster Linie Wachse, die zur Oberflächenbehandlung der
Früchte eingesetzt werden, fruchteigene Wachse und Cutin-Makromoleküle,
Wachsalkohole und Polysaccharide. Reaktionen mit stickstoffhaltigen Substanzen
(z.B. Aminosäuren) unter Ausbildung von Amidbindungen spielen auf der Schalenoberfläche
eine untergeordnete Rolle.
Über Esterbindungen gebundene Rückstände können mittels einer alkalischen
Hydrolyse, wie sie auch bei anderen Methoden zur Bestimmung von Phenoxyalkancarbonsäuren
in Getreide eingesetzt wird [2,6], freigesetzt werden.
3.1.5.4.3 Extraktion von freiem 2,4-D
Einfluß des pH-Wertes:
Zur Extraktion von 2,4-D mit überkritischem Kohlendioxid wird das Probenmaterial
angesäuert, wodurch das Säure-Base-Gleichgewicht (pKs=2,73) in Richtung der gut
extrahierbaren protonierten Form verschoben wird (siehe auch Kap. 3.1.4.7.2).
Der Einfluß des pH-Wertes auf die Extrahierbarkeit von 2,4-D wird in Tab. 3.1.5-10
dargestellt. Es wird ersichtlich, daß unter alkalischen Bedingungen, nur geringe
Anteile des 2,4-D extrahiert werden.
Tab. 3.1.5-10: Wiederfindungen von 2,4-D in Abhängigkeit
vom pH-Wert, Grapefruit-Matrix 0,5 ppm
„sauer“ pH 1-2 „alkalisch“ pH∼9,5
Wiederfindung in %
100 (n=2) 6 (n=4)
Analysenmethode: siehe Anlage 3
Einfluß des Wassergehaltes:
Zur Überprüfung des Einflusses von vorhandenem Wasser wurden Wiederfindungsversuche
mit unterschiedlichem Probe/Hydromatrix-Verhältnis durchgeführt. Dabei
wurden bei Orangensaft für Probe/Hydromatrix-Verhältnisse von 0,75:1 bis 1,65:1
nahezu identisch Wiederfindungsraten für 2,4-D festgestellt. Noch größere Anteile an
Probe (höherer Wasseranteil) führten jedoch zu einer Verschlechterung der
Wiederfindung.
3.1.5.4.4 Freisetzung von gebundenen 2,4-D-Rückständen
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
87

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Nach der Ernte wird 2,4-D häufig als Isopropyl-Ester oder Dimethylamin-Salz eingesetzt.
2,4-D-Ester hydrolysieren nach der Anwendung rasch zur freien Säure
[30,59,60]. Die Säure kann dann teilweise an Wachsüberzüge und natürliche
Schalenbestandteile unter Esterbildung binden. Derartig „gebundene“ 2,4-D-
Rückstände werden bei einer Extraktion mit Lösungsmitteln nicht mit erfaßt.
Es wurde festgestellt daß sich der Anteil an extrahierbarem 2,4-D deutlich erhöht,
wenn Proben mit gewachsenen 2,4-D-Rückständen unter alkalischen Bedingungen
erhitzt werden (Tab. 3.1.5-11, Abb. 3.1.5-14). Eventuell gebundene 2,4-Dichlorphenol-Anteile
(Abbauprodukt von 2,4-D) dürften bei dem alkalischen Aufschluß [29]
ebenfalls freigesetzt werden.
Eine Erhöhung des extrahierbaren 2,4-D wurde ebenfalls festgestellt, wenn die
Proben im Sauren erhitzt wurden, allerdings wurde in diesem Fall deutlich weniger
2,4-D freigesetzt als bei alkalischer Hydrolyse.
Zur Optimierung dieses alkalischen Aufschlusses wurde der pH-Wert und die
Erhitzungszeit variiert, um die Bildung unerwünschter Artefakte, die bei der GC-
Bestimmung stören können, möglichst klein zu halten. Es zeigte sich, daß bereits
relativ milde Bedingungen ausreichen, um den Großteil des „gebundenen“ 2,4-D
freizusetzen. Keine weitere Erhöhung des extrahierbaren 2,4-D aber deutlich
dunklere Extrakte wurden bei längerer Erhitzungszeit und höheren pH-Werten erzielt
(Tab. 3.1.5-11).
Tab. 3.1.5-11: Einfluß der Erhitzungszeit und des pH-Wertes während der
Hydrolyse auf die Freisetzung von 2,4-D
Erhitzungszeit pH-Wert während 2,4-D Menge
(min) der Hydrolyse
1) Fruchtart
(Herkunftsland)
- 2) - 0,22 mg/kg
15 ∼9,5 0,47 mg/kg
20 ∼9,5 0,48 mg/kg Orange
30 ∼9,5 0,44 mg/kg (Südafrika)
45 ∼9,5 0,47 mg/kg
15 >13 0,46 mg/kg
- 2) - 0,11 mg/kg Zitrone
30 ∼2,5 3) 0,17 mg/kg (Argentinien)
20 ∼9,5 0,31 mg/kg
- 2) - 0,60 mg/kg
60 ∼3,3 3) 0,62 mg/kg Orange
30 2 0,88 mg/kg (Simbabwe)
60 2 0,94 mg/kg
20 ∼9,5 1,60 mg/kg
1)
alle Proben wurden bei pH∼2,5 extrahiert, SFE-Bedingungen: siehe Anlage 3
2) es wurde keine Hydrolyse durchgeführt
3) natürlicher pH Wert
Die Auswirkung eines alkalischen Aufschlusses vor der SFE-Extraktion von 2,4-Dhaltigen
Zitrusproben aus dem Handel wird aus Abb. 3.1.5-14 ersichtlich.
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
88

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.5-14: Freisetzung gebundener 2,4-D Rückstände aus Zitrusfrüchten
durch alkalische Hydrolyse
2,4-D (mg/kg)
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ohne alkalische Hydrolyse nach alkalischer Hydrolyse
Nr. Fruchtart Herkunftsland Verhältnis
1 Orange Simbabwe 1,6
2 Orange Uruguay 1,7
3 Orange Südafrika 2,1
4 Grapefruit Südafrika 6,3
5 Grapefruit Argentinien 2,4
6 Grapefruit Honduras 3,0
7 Zitrone Argentinien 4,0
8 Zitrone Argentinien 5,7
9 Zitrone Argentinien 2,8
3.1.5.4.5 Derivatisierungsmöglichkeiten von Phenoxyalkancarbonsäuren
Die Derivatisierung des 2,4-D, sowie auch weiterer Phenoxyalkancarbonsäuren zu
den 2,2,2-Trichlorethyl- (TCE) Derivaten ist einfach in der Durchführung und hat sich
als sehr zuverlässig und robust erwiesen. Durch die Zugabe von 20 %iger statt
konzentrierter Schwefelsäure als Katalysator konnte die Reinheit der Extrakte nach
der Derivatisierung weiter erhöht werden. Diese Derivatisierungsmethode wird in [19]
eingehend erläutert.
Als Alternative zu der Trichlorethylierung wurde eine Derivatisierung mit 1,3-Dichlor-
Isopropanol (DCIP) vorgenommen [29]. Reagentienverteilung und Ablauf der
Reaktion entsprechen der Trichlorethylierung. Zu den DCIP- und TCE-Derivaten
wurden neben 2,4-D auch weitere Phenoxyalkancarbonsäuren und andere Säuren
derivatisiert. Wie in Abb. 3.1.5-15 und 3.1.5-16 zu sehen ist, lassen sich die Derivate
gaschromatographisch gut trennen.
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
89

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.5-15: TIC der 1,3-Dichlorisopropylester saurer Pestizide
340000
320000
300000
280000
260000
240000
220000
200000
180000
160000
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
15.51
15.78
16.15
16.70
16.50
17.06
17.40
18.01
18.64
19.32
20.05
20.22
21.26
0
Time-->
15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00
Abb. 3.1.5-16: TIC der 2,2,2-Trichlorethylester saurer Pestizide
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
Time-->
14.42
14.79
15.85
15.36
15.07
16.65
16.27
17.75
17.13 17.39
18.47
19.30
19.08
20.29
21.67
15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00 23.00 24.00 25.00
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90
1,3-Dichlorpropan-2-ol Derivate
15.51 Dichlorbenzoesäure
15.78 Clopyralid
16.15 4-Chlorphenoxyessigsäure
16.50 MCPP (Mecoprop)
16.70 Dicamba
17.06 MCPA
17.40 2,4-DP (Dichlorprop)
18.01 2,4-D
18.64 Triclopyr
19.32 2,4,5-TP (Fenoprop)
20.05 2,4,5-T
20.22 MCPB
21.26 2,4-DB
24.50
2,2,2-Trichlorethyl Derivate
14.42 Reagenz-Blindpeak
14.79 Dichlorbenzoesäure
15.07 Clopyralid
15.36 4-Chlorphenoxyessigsäure
15.84 MCPP (Mecoprop)
15.86 Dicamba
16.27 MCPA
16.65 2,4-DP (Dichlorprop)
17.14 2,4-D
17.39 Interner Standard PCB 101
17.75 Triclopyr
18.47 2,4,5-TP (Fenoprop)
19.09 2,4,5-T
19.30 MCPB
20.29 2,4-DB
21.67 Picloram
24.50 p,p´-DDA

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Charakteristisch für die Massenspektren der DCIP-Derivate ist, daß die, wegen ihrer
höheren Massen in der Regel weniger störungsanfälligen höhermolekularen Ionen,
i.a. stark vertreten sind. Die Bestimmungen mittels GC/MSD gewinnen dadurch an
Empfindlichkeit und Spezifität. Problematisch für den Einsatz von DCIP ist allerdings
dessen cancerogenes Potential [32].
2,4-Dichlorphenol als Abbauprodukt von 2,4-D wird bei den oben beschriebenen
Derivatisierungsreaktionen nicht umgesetzt. Als Alternative bietet sich hier eine
Umsetzung mit Pentafluorbenzylbromid an, siehe [29], bei der auch phenolische
Gruppen derivatisiert werden.
Die Massenspektren der verschiedenen 2,4-D-Derivate sind in den Abbildungen
3.1.5-17 bis 19 dargestellt.
Abb. 3.1.5-17: Massenspektrum von 2,4-D-TCE-Ester
9500
9000
8500
8000
7500
7000
6500
6000
5500
5000
4500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
m/z-->
61
77
111
133
145 161
175
175
205
2,4-D-TCE-Ester
220238 271 277
316 318
352
374384 408
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
Abb. 3.1.5-18: Massenspektrum von 2,4-D-DCP-Ester
9500
9000
8500
8000
7500
7000
6500
6000
5500
5000
4500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
m/z-->
63
75
111
133
145
175
177
210
220
255
269 284
100 150 200 250 300 350 400
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
175
2,4-D-DCIP-Ester
317
332
344
380 387 417
91

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.5-19: Massenspektrum von 2,4-D-PFB-Ester
9500
9000
8500
8000
7500
7000
6500
6000
5500
5000
4500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
m/z--> 0
63 75
111
133
145
181
175
100 150 200 250 300 350 400
3.1.5.4.6 Bestimmung mittels GC-MSD
()
2,4-D-PFB-Ester
219 224 243 279288 307 342 365380
Die derivatisierten Extrakte können ohne weitere Reinigung direkt zur Messung
eingesetzt werden.
Tab. 3.1.5-12 zeigt die Sturkturformeln der Derivate, deren Retentionszeiten sowie
die zur Quantifizierung und Identifizierung verwendeten SIM-Massen auf.
Die beschriebenen „Matrix-Effekte“, die die gaschromatographische Bestimmung
beeinflussen können, erwiesen sich im Fall der 2,4-D-TCE-Derivate als sehr gering.
Lediglich bei sehr geringen Gehalten (

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.5.4.7 Validierung
Wiederfindung:
Zur Ermittlung der Wiederfindungsrate wurden zerkleinerte Grapefruit mit 2,4-D
dotiert (0,25 ppm) und nach der Analysenvorschrift 102E3102 (siehe Anlage 3) fünf
mal aufgearbeitet. Die ermittelte Wiederfindungsrate betrug 93 %.
Nachweis- und Bestimmungsgrenzen:
Die Nachweis- und Bestimmungsgrenzen für 2,4-D wurden nach dem DFG-Eichgeradenverfahren
ermittelt (siehe Tab. 3.1.5-13) [80]. Hierzu wurden Wiederfindungsversuche
bei vier verschiedenen Konzentrationen jeweils 4 mal durchgeführt
(16 Aufarbeitungen). Die Dotierungen erfolgten auf Apfelmatrix, wobei die niedrigste
dotierte Konzentration im Bereich der erwarteten Nachweisgrenze lag [81].
Tab. 3.1.5-13: Nachweis- und Bestimmungsgrenzen nach dem DFG-
Eichgeradenverfahren [80,81]
Parameter 2,4-D
(als TCE-Derivat)
dotierte Menge (µg/kg) 7,1/14,2/22,8/71
berechnete Nachweisgrenze 6 µg/kg
berechnete Bestimmungsgrenze * 14 µg/kg
Korrelation der Geraden (r) 0,999
Korrelationskoeffizient (%RSD) 3,8
Analysenvorschrift: siehe Anlage 3
* die kleinste Höchstmenge für Obst und Gemüse beträgt 100µg/kg, für Säuglingsnahrung
10 µg/kg
Methodenvergleich:
Zur weiteren Überprüfung der Methode wurden Proben, die gewachsene 2,4-D-
Rückstände enthielten, mit der SFE-Methode zur Bestimmung von 2,4-D und parallel
dazu mit einer naßchemischen Methode untersucht [29].
Die Ergebnisse sind in Tab. 3.1.5-14 zusammengefaßt. Bei beiden Methoden wird
ein alkalischer Aufschluß vor der Extraktion durchgeführt. Es wurden nahezu
identische Ergebnisse erzielt.
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
93

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.1.5-14: Vergleich der SFE-Methode zur Bestimmung von 2,4-D in
Zitrusfrüchten mit einer Extraktionsmethode die organische
Lösungsmittel verwendet
Fruchtart Herkunftsland 2,4-D in mg/kg
SFE-Methode „Lösungsmittel“
Methode [29]
Zitrone Argentinien 0,16 0,17
Zitrone Argentinien 0,15 0,16
Zitrone Argentinien 0,12 0,13
Grapefruit Argentinien 0,19 0,21
Grapefruit Argentinien 0,13 0,14
Grapefruit Südafrika 0,63 0,60
Grapefruit Südafrika 0,59 0,64
Clementine Argentinien 0,29 0,29
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen wurden in [101,102] veröffentlicht.
Untersuchungsergebnisse von zahlreichen Zitrusfruchtproben aus dem Handel
werden i Kap. 3.1.6.3 vorgestellt.
3.1.5.4.8 Behandlung von Zitronen mit 2,4-D und Lagerungsversuch
Um festzustellen, mit welcher Kinetik 2,4-D auf der Oberfläche von Zitrusfrüchten
nach einer Behandlung gebunden wird, wurden unbehandelte Zitronen wie folgt
behandelt: Ein Teil der Proben wurde in eine wäßrige 2,4-D-Lösung (1000 ppm)
eingetaucht, der andere Teil der Proben wurde mit einer 2,4-D-haltigen
Wachsemulsion auf Polyethylen-Basis überzogen (500 ppm). Gelagert wurden die
Proben bei Temperaturen zwischen 3 und 7°C in einem Kellerraum. Gegen Ende des
Versuches (ab etwa dem 100. Tag) stieg die Temperatur witterungsbedingt
allmählich auf etwa 12°C-14°C an.
Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Früchte entnommen, zerkleinert und tiefgefroren.
Der Gehalt an 2,4-D in den jeweiligen Einzelfrüchten wurde mit und ohne
die Durchführung einer alkalischen Hydrolyse bestimmt (freies 2,4-D und „Gesamt-
2,4-D“). Zur Extraktion wurde die SFE eingesetzt (Analysenvorschrift siehe Anlage 3.
Die Ergebnisse sind in Tab. 3.1.5-15 / Abb. 3.1.5-20 und Tab. 3.1.5-16 / Abb. 3.1.5-
21 zusammengefaßt.
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
94

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.1.5-15: Zitronen behandelt mit wäßriger 2,4-D-haltiger Lösung
Lagerzeit
(Tage)
Proben-
nummer
mit Hydrolyse
("Gesamt-2,4-D")
2,4-D (mg/kg)*
ohne Hydrolyse
(freies 2,4-D)
Faktor
freies 2,4-D /
"Gesamt-2,4-D"
95
Mittlerer
Faktor
0 1 7,39 6,97 0,94
2 5,44 5,20 0,96 0,95
10 3 3,28 3,10 0,95
4 7,22 6,80 0,94 0,94
28 5 3,67 2,75 0,75
6 5,39 3,63 0,67 0,71
7 5,61 4,00 0,71
50 9 6,39 3,80 0,59
10 7,39 3,90 0,53 0,57
11 5,49 3,40 0,62
12 8,77 4,75 0,54
71 13 4,56 2,38 0,52
14 5,56 2,90 0,52 0,52
* Mittelwerte aus mindestens 2 Bestimmungen pro Probe
Abb. 3.1.5-20: Bindung des 2,4-D an die Matrix während der Lagerung behandelter
Zitronen
Faktor:
freies 2,4-D /
"Gesamt-2,4-D"
1,0
0,5
0,0
2,4-D in wässriger Lösung aufgebracht
0 10 28 50 71
Lagerzeit (Tage)
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.1.5-16: Zitronen behandelt mit wäßriger 2,4-D-haltiger Wachsemulsion
Lagerzeit
(Tage)
Proben-
nummer
mit Hydrolyse
("Gesamt-2,4-D")
2,4-D (mg/kg)*
ohne Hydrolyse
(freies 2,4-D)
Faktor
freies 2,4-D /
"Gesamt-2,4-D"
96
Mittlerer
Faktor
0 1 1,53 1,59 1,04
2 1,04
5 3 1,83 1,82 1,00
4
1,86 1,83 0,98 0,99
14 5 1,36 1,28 0,94
6 1,14 1,08 0,94 0,94
28 7 1,50 1,29 0,86
8 1,36 1,23 0,90 0,88
35 9 1,39 1,13 0,82
10 0,82
50 11 1,58 1,18 0,75
12 1,38 1,13 0,82 0,78
71 13 1,40 0,94 0,67
14 1,59 1,05 0,66 0,67
99 15 1,32 0,81 0,62
16 1,32 0,84 0,63 0,62
130 17 1,20 0,50 0,42
18 1,22 0,49 0,40 0,41
* Mittelwerte aus mindestens 2 Bestimmungen pro Probe
Abb. 3.1.5-21: Bindung des 2,4-D an die Matrix während der Lagerung behandelter
Zitronen
Faktor:
freies 2,4-D /
"Gesamt-2,4-D"
1,0
0,5
0,0
2,4-D mit Wachs aufgebracht
0 5 14 28 35 50 71 99 130
Lagerungszeit (Tage)
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Der Anteil an gebundenem 2,4-D stieg sowohl bei den mit Wachs behandelten als
auch bei den mit wäßriger 2,4-D-Lösung behandelten Zitronen im Verlauf der
Lagerung deutlich an (siehe Tab. 3.3.5-15 und 3.1.5-16)
Bemerkenswert ist, daß sich trotz der sehr langen Lagerzeit von über 4 Monaten kein
signifikanter 2,4-D Abbau feststellen ließ (vgl. Abb. 3.1.5-22).
Abb. 3.1.5-22: Mittlere Gehalte an "Gesamt-2,4-D" einzelner Früchte während der
Lagerung
Gehalt an 2,4-D (mg/kg)
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Mittelwert
0 14 28 35 50 71 99 130
97
Lagerungszeit (Tage)
3.1.5.4.9 Freisetzung von gebundenem 2,4-D aus Zitrusfrüchten bei simulierter
Verdauung und simulierter Verarbeitung
Die in der RHmV festgesetzten Höchstmengen für 2,4-D [34] beziehen sich auf das
freie 2,4-D, seine Salze und Ester, wobei unter 2,4-D-Ester die Esterverbindungen zu
verstehen sind, die als Pflanzenschutzmittel eingesetzt werden und in den Proben
noch unhydrolysiert als Rückstände vorliegen. Das über Konjugate an Matrixbestandteile
gebundene 2,4-D ist hierbei nicht berücksichtigt [127].
Derartiges gebundenes 2,4-D kann aber ebenfalls von Relevanz sein, da es bei der
Verarbeitung von Zitrusfrüchten und im Verdauungsapparat des Menschen
freigesetzt und dadurch bioverfügbar werden kann.
Um dies zu überprüfen, wurde eine 2,4-D-haltige argentinische Zitronenprobe, die
einen großen Anteil an gebundenem 2,4-D enthielt, einer simulierten Magen- und
Dünndarmverdauung unterzogen (Durchführung siehe Anlage 8) [135].
Für die Verdauungsversuche wurde Pepsin sowie Galle und Dünndarmenzyme aus
Schwein verwendet. Magen- und Dünndarmverdauung wurden isoliert betrachtet.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Abb. 3.1.5-23 und 3.1.5-24 dargestellt.
Es wird ersichtlich, daß unter den Bedingungen einer simulierten Dünndarmverdauung
große Anteile des gebundenen vorliegenden 2,4-D freigesetzt werden
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Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
können (57 % nach 1 h und 86 % nach 3 h); bei einer simulierten Magenverdauung
dagegen, innerhalb von 3 h, nur 14 %.
Auch ohne Zusatz von Enzymen bei einem pH-Wert von 7,4 und 37°C wurde eine
erhebliche 2,4-D-Freigesetzung festgestellt (70%).
Abb. 3.1.5-23: Gegenüberstellung der ermittelten 2,4-D-Gehalte in Zitronen bei
unterschiedlicher Probenvorbehandlung
Alkalische Hydrolyse
Dünndarmverdauung (3h)
Ohne Enzyme (3h) pH
7,4/ 37°C
Dünndarmverdauung (1h)
Magenverdauung 3h
Freies 2,4-D
29%
39%
69%
78%
90%
100%
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5
2,4-D in ppm
Abb. 3.1.5-24: Freisetzung von gebundenem 2,4-D durch verschiedene Verfahren
Alkalische Hydrolyse
Dünndarmverdauung (3h)
Ohne Enzyme (3h)
Dünndarmverdauung (1h)
Magenverdauung 3h
14
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
57
Freigesetzter Anteil von gebundenem 2,4-D in %
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70
86
100
98

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Simulierung einer Zitrusfruchtverarbeitung
Zur Simulierung der Herstellung einer Zitronenmarmelade wurde eine Probe zerkleinerter
argentinischer Zitronen (die oben aufgeführte Probe), die einen hohen
Anteil an gebundenem 2,4-D enthielt, 1 h lang in einem siedenden Wasserbad
erhitzt. Unter diesen Bedingungen wurde etwa 25 % des gebundenen 2,4-D
freigesetzt, so daß der Gehalt an freiem 2,4-D von 0,121 auf 0,174 mg/kg anstieg.
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99

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.5.5 N-Methyl-Carbamate
3.1.5.5.1 Einführung
N-Methyl-Carbamate werden häufig in der Landwirtschaft eingesetzt. Es handelt sich
meist um Insektizide, einige zeigen jedoch auch akarizide, nematizide oder
molluskizide Wirkung [92,89].
Als gemeinsames Strukturmerkmal weisen die Vertreter dieser Pestizidklasse eine N-
Methyl-Carbamat-Gruppe auf:
R
O
O C
NHCH3
In Abbildung 3.1.5-25 werden die Strukturformeln, die Wasserlöslichkeit und die
Wirkung einiger N-Methyl-Carbamate aufgeführt [92,119]. Nach der Art des Restes R-
werden die N-Methyl-Carbamate im allgemeinen in zwei Grundtypen unterteilt:
• Aryl-Carbamate
• Oxim-Carbamate.
Im Vergleich zu den Aryl-Carbamaten weisen Oxim-Carbamate eine deutlich höhere
Polarität auf und wirken daher meist systemisch, d.h. sie werden über die
Leitungsbahnen über das ganze Pflanzensystem verteilt.
Wegen ihrer vergleichsweise geringen Persistenz und dem schwachen Bioakkumulationspotential
konnten die N-Methyl-Carbamate, zusammen mit den
Organophosphorsäureestern, die Organochlorinsektizide, die in den 40iger und
50iger Jahren weit verbreitet waren, verdrängen.
Ähnlich wie bei Organophosphorsäureestern basiert die insektizide Wirkung der
Carbamate auf der Hemmung des Enzyms Chlolinesterase. Carbamate werden
jedoch in der Regel schneller metabolisiert und sind daher für Warmblüter im allgemeinen
weniger toxisch. In den letzten Jahren sind allerdings Bedenken hinsichtlich
ihre toxikologischen Wirkung beim Menschen aufgekommen. So wird von
einer subchronischen Neurotoxizität, infolge einer längeren Anwendung der Substanz
Carbaryl in Wohnräumen berichtet. Weiterhin führt bei einigen Vertretern, wie
beispielsweise Aldicarb, die Metabolisierung der Thioethergruppe zum Sulfoxid und
Sulfon, zu einer deutlichen Erhöhung des toxikologischen Potentials.
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100

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.5-25: Strukturformeln einiger N-Methyl-Carbamate [92]:
DIOXACARB (6g/l)
Insektizid
O
CH 2
O
O C
ETHIOFENCARB (1,8g/l)
Insektizid
O
O C
NHCH3
SCH 2CH 3
NHCH3
CARBOFURAN (0,32g/l)
Insektizid und Nemadizid
N
O
O
C
C
S
CH3
O
O C
N
O
NHCH3
O
O C
NHCH 3
OXAMYL (280g/l)
Insektizid und Nematizid
ARYL-CARBAMATE
O
O
O
C
NHCH3
PROPOXUR (1,9g/l)
Insektizid
O
C
CH3S O NHCH3 METHIOCARB (0,027g/l)
Insektizid und Molluskizid
O O
O
O C
NHCH 3
BENDIOCARB (0,26g/l)
Insektizid
OXIM-CARBAMATE
H 3CS
C N
H
O
O
C
101
NHCH 3
PROMECARB (0,091g/l)
Insektizid
N
O
O
C
NHCH3
AMINOCARB (0,92mg/l)
Insektizid und Akarizid
CARBARYL (0,12g/l)
Insektizid und Nemadizid
Anmerkung: In Klammern ist die Löslichkeit der Substanzen in Wasser bei 20°C aufgeführt.
O
O C
NHCH 3
ALDICARB (9g/l)
Insektizid, Nematizid und Akarizid
H3C
C
S
CH3
N
O
O
C
O
O C
NHCH3
NHCH 3
METHOMYL (58g/l)
Insektizid und Akarizid
Zu den wichtigsten Metabolisierungsreaktionen der N-Methyl-Carbamate zählen,
neben der erwähnten Oxidation von Thioethergruppen zu Sulfonen und Sulfoxiden,
die Hydroxylierung des aromatischen Restes sowie die Hydrolyse der Carbamat-
Gruppe unter Bildung von Methylamin, Kohlendioxid und des korrespondierenden
Phenols bzw. Oxims [133]. Im Gegensatz zu den Organophosphorsäureestern
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Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
zeigen sich die N-Methyl-Carbamate in der Regel in der Pflanze widerstandsfähiger
gegen Hydrolyse und werden eher durch Ringhydroxylierung abgebaut [123].
Dioxacarb (siehe Abb. 3.1.5-25) wird hauptsächlich über die hydrolytische Spaltung
des cyclischen Acetals abgebaut, wobei neben Benzaldehyd, Ethylenglykol freigesetzt
wird. Darüber hinaus zeigen einige Vertreter einen starken photochemischen
Abbau (z.B. Ethiofencarb und Propoxur) [105,106,134].
Zu den N-Methyl-Carbamaten werden im weitesten Sinne auch die Verbindungen
Furathiocarb, Benfuracarb und Carbosulfan gezählt. Diese drei Verbindung werden
sowohl auf der Pflanze selbst, als auch während der Probenvor- und aufarbeitung zu
Carbofuran umgewandelt (siehe Abb. 3.1.5-26).
Abb. 3.1.5-26: Umwandlung von Furathiocarb, Benfuracarb und Carbosulfan zu
Carbofuran
O
O
O
O
C
O
O
C
N
CH3
S
CH3
N
C O
O
FURATHIOCARB
N
CH3
O
S
CH3
CH
N
BENFURACARB
O
C
O N S N
CH3
CH3
C2H4 C
CARBOSULFAN
C4H9
OC2H5
O
C4H9
C4H9
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
O
O
C
O NH
CH3
CARBOFURAN
102

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.5.5.1.1 Analytik
Analytisch bereiten N-Methyl-Carbamate gewisse Schwierigkeiten. Aufgrund der
Thermolabilität der Carbamatgruppe und der hohen Polarität einiger Vertreter werden
sie in den gängigen Multimethoden, bei denen die Bestimmung mittels
Gaschromatographie erfolgt, in der Regel nicht erfaßt.
Eine gaschromatographische Bestimmung von N-Methyl-Carbamaten ist nach ihrer
Umsetzung zu thermostabilen Derivaten möglich. In der Literatur werden verschiedene
Möglichkeiten hierzu beschrieben, wie beispielsweise die Umsetzung mit
Dinitrofluorbenzol [107,108], mit Essigsäureanhydrid [122] oder mit verschiedenen
Perfluoracylanhydriden wie z.B. Heptafluorpropionsäueanhydrid [109].
Die meisten in der Literatur beschriebenen Methoden zur Bestimmung der N-Methyl-
Carbamate basieren auf eine flüssigkeitschromatographischen Auftrennung und
anschließender Fluoreszenzdetektion [121]. Dabei werden die N-Methyl-Carbamate
nach ihrer Auftrennung mittels RP-LC mit Lauge hydrolysiert und das dabei entstehende
Methylamin mit o-Phthalsäureanhydrid in Gegenwart von 2-Mercaptoethanol
(OPA/2-Me) zu einem fluoreszierenden Isoindol-Derivat umgesetzt. Dieses
wird fluorimetrisch mit hoher Empfindlichkeit detektiert [110-114].
3.1.5.5.2 Bestimmung von N-Methyl-Carbamaten nach Extraktion mittels SFE
3.1.5.5.2.1 Übersicht
In diesem Abschnitt wird zunächst eine SFE-Extraktionsmethode für die N-Methyl-
Carbamate vorgestellt und anschließend folgende drei Bestimmungsmöglichkeiten
gegenübergestellt und ihre Vor- und Nachteile erläutert:
1. direkte Bestimmung mittels GC/MSD bei Verwendung eines Kaltaufgabesystems,
2. Bestimmung mittels GC/MSD nach Derivatisierung mit PFB-Br,
3. Bestimmung mittels LC/MSD im API-Elektrospray-Modus.
Abb. 3.1.5-27: zeigt den Analysengang zur Bestimmung der N-Methyl-Carbamate
auf. Eine detaillierte Analysenvorschrift befindet sich in Anlage 4.
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103

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.5-27: SFE-Methode zur Bestimmung der N-Methyl-Carbamate
Bestimmung
mit LC/MS
Feinzerkleinerung der Probe
3 Teile der Probe werden intensiv
mit 2 Teilen Hydromatrix vermengt
5g Aliquot (3g Probe) wird
in eine Extraktionshülse eingewogen
Supercritical Fluid Extraction (SFE)
3. 1.
2.
Derivatisierung mit
PFB-Br/K2CO3
GC/MSD Bestimmung
Anmerkungen:
Zu 1: Im Rahmen der Vorversuche zur Optimierung der gaschromatographischen
Bedingungen (siehe Kap. 3.1.2.1 und 3.1.2.2) wurde festgestellt, daß verschiedene
polare und thermolabile Verbindungen (u.a. auch Carbamate) bei Verwendung eines
Kaltaufgabesystems (Kaltinjektion und Lösungsmittelausblendung, vgl. Kap 3.1.2.1)
gaschromatographisch auch ohne Derivatisierung bestimmt werden können. Daraus
ergibt sich die Möglichkeit eine ganze Reihe von N-Methyl-Carbamaten in die
üblichen Multimethoden zu integrieren, wodurch für diese Verbindungen auf eine
gesonderte Bestimmung mittels HPLC verzichtet werden kann (effizientere Analytik).
Zu 3: Für die Bestimmung aller N-Methyl-Carbamate und deren Umwandlungsprodukte
bietet sich die LC-MSD als Methode der Wahl an. Es bot sich die Möglichkeit
dieses Verfahren, das durch die Entwicklung verbesserter Geräte für die
Routineanalytik interessant geworden ist, für einige Messungen zu verwenden. Die
Messungen wurden in den Laboratorien der Fa. HP in Waldbronn durchgeführt.
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104

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.5.5.2.2 Extraktion mit SFE
Die Mehrzahl der N-Methyl-Carbamate sind unpolare bis mittelpolare Verbindungen
und lassen sich gut unter den Extraktionsbedingungen der in Kapitel 3.1.4.2
aufgeführten Multimethode extrahieren. Dies haben auch erste Versuche mit einigen
N-Methyl-Carbamaten gezeigt.
SFE-Parameter: Extraktionsgerät: HP 7680T
• Extraktionsdruck: 329 bar, Temperatur: 55°C
• Dichte: 0,89 g/ml
• statische Extraktion: 2 min
• dynamische Extraktion: 25 min
• CO2-Fluß: 1,8 ml/min
• Fallenmaterial: ODS, 10°C während der Extraktion
• Lösungsmittel: Acetonitril
3.1.5.5.2.3 Direkte Bestimmung mittels GC-MSD (KAS3-Gerstel)
N-Methyl-O-Aryl-Carbamate können direkt gaschromatographisch bestimmt werden.
Infolge von Wechselwirkungen mit aktiven Stellen im GC-Injektionssystem werden sie
jedoch bei erhöhten Temperaturen teilweise zu ihren korrespondierenden Phenolen
abgebaut. So kommt es, daß in den erhaltenen Chromatogrammen sowohl die
Muttersubstanz (das Carbamat) als auch das Abbauprodukt (Phenol) auftritt. Das
Ausmaß der Zersetzungen hängt in erster Linie von der Aktivität der Oberflächen ab,
mit denen die Pestizide in Kontakt kommen. So ist z.B. bei Verwendung eines stark
verschmutzten Injektionsliners der Abbau viel größer und auf Grund unerwünschter
Wechselwirkungen (Retention) die Peakform viel schlechter als bei Verwendung eines
sauberen Liners (stärkeres Tailing). Interessant ist, daß bei Gegenwart von
Matrixbestandteilen in den zu messenden Lösungen, dieser Abbau viel geringer
ausfällt und die Peaks eine schärfere Form aufweisen (siehe Abb. 3.1.5-28). Grund
hierfür ist die Maskierung von aktiven Stellen durch Matrixbestandteile
(Konkurrenzreaktion). Aus diesem Grund erhält man bei Verwendung von
Kalibrierstandards in reinen Lösungsmitteln Ergebnisse die deutlich überhöht sind. Die
Verwendung von Kalibrierlösungen, die Matrix enthalten ist daher unerläßlich (vgl.
Kap. Matrixeffekte 3.1.2.3).
Bei diesem Verfahren muß auf jeden Fall darauf geachtet werden, daß das
Injektionssystem in einer guten Kondition ist. Darüber hinaus sollten zu Kontrollzwecken
die korrespondierenden Phenole mit erfaßt werden.
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105

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.5-28: Unerwünschter Abbau und Retention im GC-Injektor-System:
0,8
0,6
0,4
0,2
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
"Lösungsmittel-Kalibrierung"
Methiocarb
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
µg/ml
"Matrix-Kalibrierung"
Methiocarb
Korresp. Phenol
Korresp. Phenol
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
µg/ml
Abundance
1500
1000
500
Ion 168.00 (167.70 to 168.70): 1301019.D
15.83
0
Time-->
15.70 15.75 15.80 15.85 15.90 15.95 16.00 16.05 16.10 16.15 16.20
Abundance
1500
Abundance 1000
8000
500
7000
6000
5000 0
Time-->
15.70 15.75 15.80 15.85 15.90 15.95 16.00 16.05 16.10 16.15 16.20
4000
3000
2000
1000
15.74
Ion 153.00 (152.70 to 153.70): 0201002.D
0
Time-->
15.70 15.75 15.80 15.85 15.90 15.95 16.00 16.05 16.10 16.15 16.20
Abundance
3.1.5.5.2.4 Bestimmung mittels GC-MSD nach Derivatisierung
Methiocarb
Ion 326.00 (325.70 to 326.70): 1301019.D
Methiocarb
Ion 326.00 (325.70 to 326.70): 0201002.D
Zur Erzeugung thermostabiler Derivate werden die N-Methyl-Carbamate (NMC) mit
Pentafluorbenzylbromid (PFB-Br) umgesetzt. Die eingesetzte Derivatisierungsmethode
ist identisch mit derjenigen, die zur Umsetzung von Carbendazim,
Thiabendazol und 2,4-D eingesetzt wird (siehe auch Kap. 3.1.5.3.2.3 und 3.1.5.4.5,
Anlage 2 sowie [29]). Sie kann gut zu Screeningzwecken eingesetzt werden, da
Verbindungen mit unterschiedlichen reaktiven Gruppen wie Säure-, Alkohol- und z.T.
Amino-Gruppen gut mit PFB-Br umgesetzt werden. Sie ist einfach in der Durchführung
und wird in dem GC-Vial durchgeführt in dem die SFE-Extrakte anfallen.
Bei dieser Reaktion werden sowohl die N-Methyl-O-Aryl-Carbamate als auch ihre
korrespondierende Phenole zum gleichen Derivat umgesetzt und gemeinsam erfaßt
(siehe Abb. 3.1.5-29).
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106

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.5-29: Reaktionsgleichung zur Bildung der PFB-Derivate
Derivatisierung der NMC mit Pentafluorbenzylbromid
R
O
Hydrolyse
O
C
R O H
NHCH3
Korr. Phenol
+ C6F5CH2 Br
K2CO3/ H2O
Katalyse
R O CH2C6F5
PFB-Derivat
Die Oxim-Carbamate lassen sich jedoch nicht zu analytisch interessanten Derivaten
umsetzen.
Ethiofencarb läßt sich im Vergleich zu den anderen Aryl-Carbamaten erheblich
schlechter umsetzen. Dies könnte auf sterische Gründe zurückzuführen sein, denn
Ethiofencarb besitzt als einziger Vertreter in ortho-Position zur Phenolgruppe einen
vergleichsweise sperrigen Rest (-CH2SCH2CH3). Eine Oxidation von Ethiofencarb am
Schwefelatom während der Derivatisierung ist ebenfalls nicht auszuschließen.
Eine weitere Besonderheit tritt bei der Derivatisierung von Dioxacarb auf. Hier kommt
es nicht zu einer Abspaltung der Carbamatgruppe, sondern primär zu einer
Hydrolyse der Acetalfunktion. Die Anlagerung des Pentafluorbenzylrestes erfolgt erst
nach einer Cyclisierung. In Abb. 3.1.5-30 wird ein möglicher Reaktionsmechanismus
für die Entstehung des Derivatisierungsproduktes von Dioxacarb vorgestellt.
Abb. 3.1.5-30: Reaktionsmechanismus zur Entstehung des Dioxacarb-PFB-Derivates
Derivatisierung von Dioxacarb mit PFB-Br
O O
O
O C
Dioxacarb
C 6F 5CH 2
O
H
NHCH3
N
O
CH3
C O
Derivatisierungsprodukt
HOCH2CH2OH
H2O
C6F5CH2 Br K2CO3
Derivatisierung
Gaschromatographische Bestimmung:
O H
H
O
O
O C
H
N
NHCH3
O
CH 3
C O
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
- H
H
H
O
H
H
O
H
H
N
N
O
107
C O
CH3
O
C
O
CH3

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
In Tabelle 3.1.5-17 sind die zur GC-MSD Bestimmung der Aryl-Carbamat-Derivate
verwendeten Quantifizierungs- und Identifizierungsmassen angegeben. Die
apparativen Einstellungen sind in Anlage 4 aufgeführt.
Tabelle 3.1.5-17: Verwendete Identifizierungs- und Quantifizierungsmassen
Verbindung Target-/Qualifier-Ionen (m/z)
Aminocarb 331, 150, 181
Bendiocarb 346, 331, 125
Carbanolat 336, 155, 181
Carbaryl 324, 143, 115
Carbofuran 344, 163, 135
Dioxacarb 345, 188, 181
Ethiofencarb 348, 287, 181
Fenobucarb 330, 301, 181
Isoprocarb 316, 135, 181
Landrin 316, 135, 181
Methiocarb 348, 167, 139
Promecarb 330, 287, 181
Propoxur 332, 290, 109
GC/MSD Bedingungen: siehe Anlage 4
Rechtliche Problematik:
Da sich die Höchstmengen in der Rückstandshöchstmengenverordnung nur auf die
N-Methyl-Carbamate beziehen und die Abbauprodukte nicht berücksichtigt werden,
ergibt sich bei deren gemeinsamer Bestimmung ein rechtliches Problem, da eventuell
bereits in der Probe vorliegendes Phenol (Abbauprodukt) mit erfaßt wird. Für die
korrespondierenden Phenole der Verbindungen Carbaryl (α-Naphthol), Propoxur (o-
Isopropoxyphenol), Promecarb (3-Isopropyl,2-methyl-phenol) und Carbofuran (2,3
Dihydro-2,2-dimethyl-7-benzofuranol) wurden Wiederfindungsversuche durchgeführt
und dabei Wiederfindungen von über 90% festgestellt.
3.1.5.5.2.5 Bestimmung mittels LC-MSD
Unter den schonenden Bedingungen der Flüssigkeitschromatographie findet kein
Abbau der N-Methyl-Carbamate statt. Durch den Einsatz der LC/MSD konnte eine
sehr empfindliche und selektive Bestimmung dieser Verbindungen erzielt werden. Die
Empfindlichkeit und Robustheit der HPLC-MSD-Geräte konnte in den letzten Jahren
durch Optimierung der Interface-Techniken bedeutend verbessert werden. Die
Messungen wurden an einem HP 1100 series LC/MSD im API-Elektrospray-Modus
durchgeführt.
Bei diesem Verfahren kommt es durch Protonierung in der flüssigen Phase zu einer
Ionisierung von Analyten. Die LC-Eluate werden nach der Säule in eine Kammer
gesprüht und das Elutionsmittel im Stickstoffstrom verdampft. Durch die zunehmende
Ladungsdichte in den erzeugten Tröpfchen werden diese aufgrund von
aufeinanderfolgenden Coulomb-Explosionen, zu immer kleineren Einheiten reduziert.
Durch Einwirkung eines elektrischen Feldes kommt es letztendlich zu einer
Freisetzung von Ionen in die Gasphase. Die erzeugten Ionen werden in Richtung des
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108

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Analysators beschleunigt. Vor dem Eintritt in den Quadrupol erfolgt eine
Fragmentierung der Ionen aufgrund von Kollisionen, die auf ein angelegtes
Spannungsfeld (Fragmentorspannung) zurückzuführen sind (collision induced
dissociation) [126]. Die zur Quantifizierung und Identifizierung verwendeten Massen
werden in Tab. 3.1.5-18 aufgeführt.
Tab. 3.1.5-18: Zur Quantifizierung und Identifizierung herangezogene m/z
N-Methyl-Carbamat M+1 M-56 weitere
Fragmentionen
Bemerkungen
Aldicarb Sulfon 223 240 (M+18)
Aminocarb 209 152 M+1:
Bendiocarb 224 167 protoniertes Molekülion
Carbanolat 214 157
Carbaryl 202 145 219 (M+18)
Carbofuran 222 165
Dioxacarb 224 165 M-56:
Ethiofencarb 226 169 164 (M-61) protoniertes
Fenobucarb 208 151 korrespondierendes
Isoprocarb 194 137 Phenol
Landrin 226 169
Methiocarb 226 169
Methiocarb Sulfon 258 185
Methiocarb Sulfoxid 242 185 M+18:
Methomyl 163 106 180 (M+18) Ammonium-Addukt
Metolcarb 166
Oxamyl 220
Promecarb 208 151
Propoxur 210 153 168 (M-41)
Benfuracarb 411 - 190, 252
Furathiocarb 383 - 252, 195
Carbosulfan 381 - 222
Das Fragmentierungsmuster der N-Methyl-Carbamate ist im Vergleich zur GC meist
sehr einfach, durch Abspaltung der Carbamatgruppe tritt das protonierte
korrespondierende Phenol als Hauptfragmention auf. Vereinzelt treten bei einigen
Vertretern wie z.B. bei Ethiofencarb durch Spaltung der Thioethergruppe auch
weitere nennenswerte Fragmente auf (vgl. Abb. 3.1.5-31). Im allgemeinen kann das
Fragmentierungsmuster durch Variation der Fragmentorspannung verändert werden.
Bei höherer Fragmentorspannung kommt es zu einer stärkeren Bildung von
Fragmentionen. Die Intensität der Hauptfragmentionen nimmt jedoch dabei meist ab.
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109

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.5-31: Fragmentierung von Ethiofencarb
CH 2
O
O C
SCH 2CH 3
Ethiofencarb
O
O C
NHCH3
CH2 SCH2CH3
M+1
CH2
H
O
O C
N
H
CH3
CH3CH2SH
NHCH3
H
M-61
H 3C N C O
+
H
O
NH
C
CH3
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
O
CH2 SCH2CH3
H
O
H
H
O
H
M-56
110
CH2 SCH2CH3

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
LC-MSD-Einstellungen:
LC-Parameter:
• Säule: 2,1x 30 mm, 3,5µ, ZORBAX XDB C-18,
• mobile Phasen: A: 1 mM wäss. CH3COONH4, B: Methanol/Acetonitril 1:1,
10%B → 90%B in 5 min,
• Fluß 0,3 ml/min,
• Ofentemperatur: 50°C,
• Injektionsvolumen: 0,5-2µl.
MSD-Parameter:
• API-Elektrospray,
• Fragmentor 40 V,
• drying gas: Stickstoff 10 l/min, 300°C
Abb. 3.1.5-32 zeigt für einige N-Methyl-Carbamate mehrere SIM-Chromatogramme
übereinander gelegt. Dabei wird deutlich, daß für Carbaryl, Fenobucarb und
Promecarb, bei der hier gewählten Fragmentorspannung von 40 V, die Fragmentionen
in ausreichender Ausbeute entstehen, so daß eine Identifizierung relativ gut
möglich ist. Für Aminocarb und Isoprocarb sind die erzeugten Fragmentionen jedoch
sehr schwach ausgeprägt. Hier ist eine Identifizierung, vor allem bei kleinen Gehalten
problematisch. Durch eine Erhöhung der Fragmentorspannung ist es jedoch möglich,
die Fragmentierung so zu gestalten, daß durch verstärkte Bildung von
Fragmentionen, die Identifizierung dieser Verbindungen verbessert wird.
Das Meßsystem bietet die Möglichkeit die Fragmentorspannung je nach Fragestellung
für jede Substanz individuell zu wählen. Dies wurde aus zeitlichen Gründen
nicht durchgeführt, da alle Messungen bei HP in Waldbronn durchgeführt wurden (zu
diesem Zeitpunkt war das entsprechende Analysengerät beim CVUA Stuttgart noch
nicht vorhanden).
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111

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.5-32: SIM-Chromatogramme übereinander gelegt,
Dotierung auf Apfel 0,166 ppm, Endvol. 1,5 ml, Injektionsvol. 0,5 µl,
m/z 208, 151, 145, 202, 137, 194, 152, 209
Aminocarb
Carbaryl
Isoprocarb
Promecarb
Fenobucarb
166 pg
9 10 11 12
Empfindlichkeit des Verfahrens:
Durch die API (Atmospheric Pressure Ionisation) Elektrospray-Technik können ohne
vorherige Derivatisierung für die N-Methyl-Carbamate Nachweisgrenzen erreicht
werden, die im Bereich dessen liegen, was mittels GC-MSD möglich ist. Wie Abb.
3.1.5-33 zeigt sind die Hauptmassen von Promecarb und Fenobucarb bei einer
Konzentration von 0,003 ppm bezogen auf die Probe (3,3 pg absolut) noch deutlich in
einem Apfelextrakt nachweisbar. Allerdings waren unter den gewählten Bedingungen
die Hauptfragmentionen mit der Masse 151 nicht mehr nachweisbar. (Anmerkung:
beide Verbindungen geben ein Fragmention mit der Masse 151). Durch eine
Erhöhung des Injektionsvolumens oder einer Verschiebung der Fragmentorspannung
könnte die Nachweisempfindlichkeit der Fragmentionen jedoch noch weiter gesteigert
werden und dadurch die Selektivität erhöht werden.
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112

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.5-33: Abschätzung der Nachweisempfindlichkeit
Dotierung auf Apfel 0,003 ppm, Endvol. 1,5 ml, Injektionsvol. 0,5 µl
Vorteile der LC/MSD:
m/z 151
Promecarb
m/z 208
Fenobucarb
3,3 pg
Die Vorteile der LC/MSD Methode lassen sich wie folgt zusammenfassen:
• hohe Selektivität und Empfindlichkeit,
• keine Derivatisierung erforderlich,
• Erfassung aller N-Methyl-Carbamate (Oxim- und Aryl-),
• gleichzeitige Bestimmung der Abbauprodukte möglich,
• Schnelligkeit.
3.1.5.5.2.6 Wiederfindungen
Es wurden mehrere Wiederfindungsversuche mit verschiedenen Matrizes (Apfel,
Orangensaft, Traube, Karotte, Blumenkohl) durchgeführt und mit den drei beschriebenen
Bestimmungsmethoden untersucht. Die dabei erzielten Wiederfindungen
lagen unabhängig von der gewählten Bestimmungsmethode in der gleichen
Größenordnung. In Abb. 3.1.5-34 sind die mittels SFE und LC-MSD erzielten
Wiederfindungen für eine mit 0,167 ppm dotierte Traubenmatrix aufgeführt. Mit
diesem Verfahren können, im Gegensatz zu den beiden gaschromatographischen
Verfahren, nicht nur die Aryl- sondern auch die Oxim-Carbamate und Benfuracarb,
Furathiocarb und Carbosulfan erfaßt werden.
Die erzielten Wiederfindungen bei Verwendung der anderen Bestimmungs-
verfahren werden nicht gesondert aufgeführt. Im Vergleich wiesen die mittels LC-
MSD erzielten Ergebnisse von Wiederholbestimmungen die kleinsten Schwankungen
auf (Variationskoeffizienten zwischen 1,3% und 4,8%, meist im Bereich von 2%).
Erwartungsgemäß waren die Wiederfindungen der polaren Oxim-Carbamate
Aldicarbsulfon, Oxamyl und Methomyl schlecht (vgl. Kap. 3.1.4.7.2).
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
113

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.5-34: Wiederfindungen verschiedener Carbamate (SFE-LC-MSD)
dotierte Matrix: Traube, Dotierungs-Level: 0,167 ppm
Aldicarb Sulfon
Aminocarb
Bendiocarb
Carbaryl
Carbofuran
Dioxacarb
Ethiofencarb
Fenobucarb
Isoprocarb
Landrin
Methioc. Sulfon
Methioc. Sulfoxid
Methiocarb
Methomyl
Metolcarb
Oxamyl
Promecarb
Propoxur
Var. Koeff.: 1,3-4,8 %
280 g/l
58 g/l
10g/l
Abbau
0 20 40 60 80 100
114
Wiederfindung in %
Anmerkung: Die neben den Balken aufgeführten Werte zeigen die Löslichkeit der Carbamate in
Wasser bei 20°C.
3.1.5.5.2.7 Abbau in der Extraktionshülse
Im Gegensatz zu den herkömmlichen Analysenverfahren, bei denen die Proben
unmittelbar nach der Einwaage extrahiert werden, werden die Proben bei der SFE bis
zur Extraktion manchmal über mehrere Stunden im Autosampler des SFE-Gerätes
bei Raumtemperatur gelagert. Dabei kann es zu einem signifikanten Abbau
bestimmter empfindlicher Verbindungen kommen:
Abbau von Dioxacarb:
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Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Dioxacarb weist eine Acetalgruppe auf, die insbesondere säurekatalysiert leicht
hydrolysierbar ist. So wurde z.B. beobachtet, daß bei Dotierungen auf Traube
(pH∼3,5) die Wiederfindungen mit der Lagerzeit der zu extrahierenden SFE-Hülsen
rasch abnahmen. Bei Salat dagegen (pH∼6) war unter vergleichbaren Bedingungen
praktisch kein Rückgang der Wiederfindungen festzustellen (siehe Kap. 3.1.4.7.4). In
der folgenden Abbildung (3.1.5-35) wird der Abbau von Dioxacarb in Apfelmus-Matrix
(pH∼5) gezeigt.
Abb. 3.1.5-35: Abbau von Dioxacarb in Apfelmus/Hydromatrix-Gemisch 3:2 bei
Lagerung in der Extraktionshülse bei Raumtemperatur
80
60
40
20
0
Umwandlung zu Carbofuran:
Wiederfindung in %
0 h 2 h 12 h
Lagerzeit bei RT
O
O
O
O
C
NHCH3
Wie bereits erwähnt, werden Carbosulfan, Benfuracarb und Furathiocarb leicht zu
Carbofuran abgebaut. Dieser Abbau erfolgt sowohl auf der behandelten Pflanze als
auch während der Analyse. Abb. 3.1.5-36 zeigt den Fortgang der Umwandlung von
Benfuracarb und Furathiocarb zu Carbofuran während der Lagerung der Extraktionshülsen
bei Raumtemperatur . Dabei werden die Wiederfindungen als Carbofuran
angegeben. Zur Berechnung wurden hierbei die Umwandlungsfaktoren 1,73 für
Furathiocarb und 1,86 für Benfuracarb herangezogen. Wie aus der Graphik
ersichtlich, erfolgt bei Benfuracarb eine raschere Umwandlung zu Carbofuran als bei
Furathiocarb.
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115

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.5-36: Umwandlung zu Carbofuran in Apfelmus/Hydromatrix-Gemisch 3:2
bei Lagerung in der Extraktionshülse bei Raumtemperatur
80
60
40
20
0
Fazit:
Wiederfindung in %
0 h 2 h 20 h
Lagerzeit bei RT
O
O
O
C
O
N
CH3
S
CH3
CH
N
C2H4 C
BENFURACARB
O
C
N
CH3
FURATHIOCARB
CH3
CH3
N
C O
O
116
OC2H5
Mit Hilfe der SFE können N-Methyl-O-Aryl-Carbamate mit sehr guten Ausbeuten
extrahiert werden. Oxim-Carbamate zeigen dagegen wegen ihrer hohen Polarität
geringere Wiederfindungen. Es wurden drei verschiedene Verfahren zur Bestimmung
dieser Verbindungen miteinander verglichen: die direkte Bestimmung mittels
GC/MSD bei Verwendung eines Kaltaufgabesystems, die Bestimmung mittels
GC/MSD nach Derivatisierung mit PFB-Br und die Bestimmung mittels LC/MSD. Mit
der LC/MSD ist eine direkte schnelle und einfache Bestimmung aller N-Methyl-
Carbamate und Ihrer Abbauprodukte mit guter Empfindlichkeit möglich.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen wurden als Poster beim 2nd European
Pesticide Residue Workshop in Almería, beim 9th IUPAC International Congress-
Pesticide Chemistry und beim 3. SFE-SFC-XSE Forum in Siegen, sowie als Vortrag
beim MS-Anwendertreffen der Fa. HP in Fulda (1998) vorgestellt [103,104].
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O
S
O
C4H9

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.5.6 Organozinn-Pestizide
3.1.5.6.1 Einleitung
Organozinn-Verbindungen werden in der Industrie z.B. als Hilfsmittel bei der Verarbeitung
von PVC, als Holzschutzmittel und als Bestandteil von Anstrichmitteln für
Schiffsteile, die vor Anlagerung von Pflanzen und Tieren geschützt werden sollen,
verwendet [84,85]. In der Landwirtschaft werden sie seit den 50 iger Jahren [86] als
Akarizide und Fungizide eingesetzt.
Die Strukturformeln der Organozinn-Pestizide werden in Abb. 3.1.5-37 aufgeführt.
Triphenylzinn-Verbindungen (Fentinhydroxid und Fentinacetat) werden hauptsächlich
wegen ihrer fungiziden Wirkung und als Antifraßmittel gegen blattfressende Larven
im Kartoffel-, Rüben- und Sellerieanbau verwendet [85]. Fentinacetat hat darüber
hinaus algizide und mulluscizide Eigenschaften. Es wird nach dem Aufbringen innerhalb
kurzer Zeit zu Fentinhydroxid umgewandelt [93].
Die Trialkyl-Zinn-Verbindungen Azocyclotin, Cyhexatin und Fenbutatinoxid sind
gegen alle beweglichen Entwicklungsstadien der Spinnmilbe wirksam [92]. Cyhexatin
wurde lange Zeit bei der Produktion von Obst eingesetzt. 1987 wurde allerdings das
Produkt (Handelsname Plictran) vom Hersteller aufgrund von Studien, die eine
teratogene Wirkung bei Versuchstieren nachwiesen, vom Markt genommen.
Dennoch ist Cyhexatin ist in mehreren EU-Staaten noch zugelassen [120].
Analytik:
Organo-Zinn-Pestizide werden in Deutschland im Rahmen der Lebensmittelüberwachung
nicht routinemäßig untersucht [124], da zu ihrer Bestimmung eine gesonderte
Aufarbeitung und Derivatisierung erforderlich ist.
Zur Beseitigung analytischen Defizite im Bereich der Pestizid-Rückstandsanalytik
wurde vom BMG eine Liste von Substanzen zusammengestellt, für die schwerpunktmäßig
analytische Methoden entwickelt werden sollen. In dieser Prioritätenliste
stehen die Organo-Zinn-Pestizide Fentinacetat, Fentinhydroxid und Azocyclotin unter
den ersten sechs und Fenbutatinoxid, Cyhexatin und Fentinchlorid unter den ersten
25 Stoffen mit größter Priorität [124].
Für die Spurenanalytik zinnhaltiger Pestizide sind in der Literatur verschiedene
Analysenmethoden beschrieben worden. Diese Methoden lassen sich in zwei
Gruppen einteilen.
Bei den indirekten Bestimmungsverfahren werden die Organozinn-Verbindungen
durch einen Aufschluß zerstört. Das freigesetzte Zinn wird z. B. polarographisch
[94,95], über AAS [93] oder ICP/MS bestimmt. Für die Bestimmung der unzersetzten
Pestizide werden in der Literatur u.a. flüssigkeitschromatographische, gaschromatographische
und dünnschichtchromatographische Verfahren beschrieben. Für
gaschromatographische Untersuchungen muß durch Alkylierung oder Hydrierung die
Thermostabilität erhöht und die Siedetemperatur der Moleküle erniedrigt werden, da
bei allen hier vorgestellten Verbindungen eine direkte gaschromatographische
Analyse nicht möglich ist. Für eine Bestimmung mittels HPLC ist, bei Verwendung
eines DAD-Detektors, ebenfalls eine Derivatisierung notwendig, weil nicht alle
zinnhaltigen Pestizide ein Chromophor enthalten.
Abb.3.1.5-37: Strukturformeln der Organozinn-Pestizide
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117

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Sn
OH
Organozinn-Pestizide
Fentinhydroxid
(Triphenylzinnhydroxid)
Sn
O
C
O CH3
Fentinacetat
(Triphenylzinnacetat)
CH 2
CH2
Sn
CH2
N
Sn
OH
Cyhexatin
(Tricyclohexylzinnhydroxid)
Sn
N
N
Azocyclotin
(Tri(cyclohexyl)-1-1H-1,2,4-triazol-1-yl-zinn)
O
CH2
Sn
CH2
CH 2
Fenbutatinoxid
(Bis[tris(2-methyl-2-phenylpropyl)zinn]oxid)
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118

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.5.6.2 Extraktion mit SFE
Organozinn-Pestizide weisen eine geringe Polarität auf und werden bei den in der
Literatur beschriebenen Analysenmethoden mit unpolaren Lösungsmitteln wie Hexan
oder Dichlormethan extrahiert. Überkritisches Kohlendioxid bietet sich daher
ebenfalls als Extraktionsmittel an.
Es wurden Extraktionsversuche mit beiden zu Verfügung stehenden Extraktionsgeräten
durchgeführt. Die dabei verwendeten Bedingungen werden im folgenden
aufgeführt:
SFE-Parameter HP 7680T:
• Extraktionsdruck: 329 bar, Temperatur: 55°C
• Dichte: 0,89 g/ml
• statische Extraktion: 2 min
• dynamische Extraktion: 25 min
• CO2-Fluß: 1,8 ml/min
• Fallenmaterial: ODS, 10°C während der Extraktion
• Elutionslösungsmittel: Hexan
SFE-Parameter ISCO SFX 3560:
• Extraktionsdruck: 330 bar, Temperatur: 55°C
• Dichte: 0,89 g/ml
• statische Extraktion: 2 min
• dynamische Extraktion: 25 min
• CO2-Fluß: 1,8 ml/min
• Lösungsmittel in der Vorlage: 10 ml Hexan
• Temperatur der Vorlage: 0°C
Während bei Verwendung des Gerätes der Fa. ISCO gute Wiederfindungen erzielt
werden konnten (siehe unter Wiederfindungen) wurden bei Verwendung des HP-
Extraktors, bei dem die Extrakte zunächst an einer Festphasenfalle gesammelt
werden, niedrige und schwankende Ergebnisse erzielt. Wie aus den oben aufgeführten
Bedingungen ersichtlich, wurde bei diesem Gerät zur Elution der Extrakte aus
der Festphasenfalle in die Vorlagen, Hexan verwendet. Dies könnte auch die
Ursache für die schlechten Wiederfindungen sein. Bei der SFE-Extraktion von Obst -
und Gemüseproben gelangt, trotz der Verwendung von Adsorbentien stets eine
gewisse Menge an Wasser bis zur Falle. Die Elution mit Hexan ist gestört, da dieses
Lösungsmittel sich mit dem Wasser nicht mischt, so daß die präzipitierten Analyten
vom Wasser abgeschirmt werden. Aus Zeitgründen konnte diese Problematik jedoch
nicht weiter verfolgt werden.
3.1.5.6.3 Optimierung der Derivatisierung mit Grignard-Reagenz
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119

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Um die gaschromatographische Bestimmung der Organo-Zinn-Pestizide zu ermöglichen,
müssen diese derivatisiert werden, wobei ein vierter organischer Rest am
Zinnatom eingeführt wird (siehe Abb. 3.1.5-38).
Abb. 3.1.5-38: Derivatisierung schematisch
R
R Sn
R
R
X R Sn
R: Alkyl, Aryl; R’: Alkyl; X: Hydroxid, Acetat, Triazol
In der Literatur werden zur Derivatisierung der Organo-Zinn-Verbindungen verschiedene
Möglichkeiten beschrieben.
Eine Alkylierung am Zinnatom ist durch eine Umsetzung mit Tetraalkylborat möglich.
Die Ethylierung mit Tetraethylborat wird in der Literatur zum Beispiel für die
Umsetzung der Organozinn-Verbindungen aus Trinkwasser und Abwasser sowie aus
Bodenproben beschrieben [97].
Die am häufigsten beschriebene Derivatisierungsmethode von Organozinn-Verbindungen
ist die Umsetzung mit Grignard-Reagenzien [3,88,90,93,98], vgl. Abb.
3.1.5-39.
Abb. 3.1.5-39: Umsetzung mit Grignard-Reagenz
R
R Sn
R
X + CH3MgCl R
R
Sn
R
CH3 +
R
R'
MgClX
Dort beschriebenen Verfahren zur Derivatisierung mit Grignard-Reagenz sind
allerdings etwas langwierig und daher für die Routineanalytik wenig attraktiv. Die
Derivatisierung wird oft in aufwendigen Apparaturen unter Stickstoffatmosphäre
durchgeführt. Es folgt dann meist eine mehrmalige Ausschüttelung der Derivate aus
dem Derivatisierungsansatz sowie in einigen Fällen eine Nachreinigung durch
Säulenchromatographie.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine erheblich einfachere Variante dieser Derivatisierung
ausgearbeitet.
Derivatisierungsreaktion:
Bei Verwendung des ISCO-Gerätes werden die Extrakte in 20 ml Vorlagegläschen, in
denen 10 ml Hexan vorgelegt wurde aufgefangen. Nach Beendigung der Extraktion
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120

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
sind etwa 4-5 ml des Hexans noch im Vorlagegefäß vorhanden. Diese Lösung wird
direkt zur Derivatisierung eingesetzt.
Nach Zugabe von Internem Standard (PCB IUPAC Nr. 101) in Isooctan und der
Grignard-Reagenz-Lösung wird der Ansatz 15 min unter Rühren (Magnetrührer) bei
Raumtemperatur derivatisiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 15 %iger
Ammoniumchlorid-Lösung gestoppt.
Nach kräftigem Schütteln wird die obere organische Phase mit Stickstoff bis auf etwa
1,5 ml eingeengt, in ein GC-Vial überführt und zur GC-MSD-Bestimmung eingesetzt.
Bei der Derivatisierung entstand neben dem Hauptderivat Triphenyl-methyl-zinn in
geringen Mengen ein weiteres Produkt, das Diphenyl-dimethyl-zinn. Möglicherweise
findet hier als Nebenreaktion eine Substitution des Phenyl-Restes durch einen
Methyl-Rest statt. Auffällig war, daß mit der Zunahme der Bildung des Dimethyl-
Derivates eine geringere Ausbeute an Methyl-Derivat einherging. Das Dimethyl-
Derivat wird in Abb. 3.1.5-40 abgebildet:
Abb. 3.1.5-40: Strukturformel von Diphenyl-dimethyl-zinn (unerwünschtes
Nebenprodukt bei der Derivatisierung von Fentinacetat und -hydroxid)
Sn CH 3
Diphenyl-dimethyl-zinn
Abb. 3.1.5-41 zeigt die Entstehung der Derivatisierungsprodukte aus den Organo-
Zinn-Verbindungen.
CH 3
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121

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.5-41: Entstehung der Derivatisierungsprodukte aus den Organo-Zinn-
Verbindungen nach Umsetzung mit Grignard-Reagenz
Bildung der Derivatisierungsprodukte
OH
Sn
Fentinhydroxid
OH
Sn
Cyhexatin
CH2
Sn
CH2
CH 2
CH2
CH3
Tricyclohexyl-methyl-zinn
CH3
Sn
Tricyclohexyl-methyl-zinn
CH2
Sn
CH 3
O
CH 2
Tris(2-methyl-2-phenyl-propyl)-methyl-zinn
Fenbutatinoxid
CH 2
Sn
CH2
CH 2
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Sn
CH 3
C O
O
Sn
Fentinacetat
N
N
Sn
N
Azocyclotin
122

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Wie erwähnt, enthalten SFE-Extrakte von Obst und Gemüseproben geringe Mengen
an Wasser. Da Wasser mit Grignard-Reagenz reagieren kann, wurde überprüft, ob
diese kleinen Wassermengen die Derivatisierung beeinflussen können. Darüber
hinaus wurde die Reaktion in drei verschiedenen Reaktionsmedien durchgeführt und
die Derivatisierungsausbeuten wurden verglichen:
• Isooctan:Hexan 1:4 (IO:HEX),
• Cyclohexan: Ethylacetat 1:1 (CH:EA),
• tert.-Butyl-Methyl-Ether (TBME).
In diesen Fällen wurden Extrakte aus 3 g Mango verwendet, die zuvor mit
Natriumsulfat getrocknet wurden. Dotiert wurde kurz vor der Derivatisierung mit je 1
µg an Cyhexatin, Fentinhydroxid und Fenbutatinoxid. Die Ergebnisse dieser
Untersuchungen werden in Tab. 3.1.5-19 dargestellt.
Tab. 3.1.5-19: Derivatisierungsausbeute der Organo-Zinn-Pestizide bei Variation
der Derivatisierungsparameter
Verwendetes Cyhexatin Fentin- Fentin Abbau** Anmerkungen
Lösungsmittel
hydroxid
TPME
1 1 1 auf 1 normiert
TPME* 0,99 0,96 1,36 *Wasser nicht
entfernt
CH:EA
1:1
0,98 1,04 0,10
IO:HEX
1:4
0,91 0,88 1,87
** Zur Entstehung des Diphenyl-dimethyl-zinn-Derivates aus Fentinhydroxid siehe oben
Die Unterschiede in den Derivatisierungsausbeuten bei Verwendung verschiedener
Lösungsmittel waren nur gering. Bei Derivatisierung in Cyclohexan-Ethylacetat wurde
deutlich weniger unerwünschtes Diphenyl-dimethyl-zinn gebildet, als in den anderen
Reaktionsmedien. Dieser Sachverhalt sollte noch weiter untersucht werden. Das in
den Probenextrakten vorhandene Wasser störte die Derivatisierungsreaktion nicht.
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
123

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.5.6.4 Bestimmung mittels GC-MSD
Die Bestimmung der Derivate wurde mittels GC-MSD im EI-Modus durchgeführt. Es
wurden die Meßbedingungen der im Anhang 1 aufgeführten SFE-Multimethode
eingesetzt.
Die Bestimmung der Organozinn-Verbindungen mittels GC/MSD bietet sich an, da
diese charakteristische Isotopenmuster im Massenspektrum aufweisen. Das Element
Zinn besitzt zehn Isotope, von denen 120 Sn (natürliche Häufigkeit: 32,4 %), 118 Sn
(24,3 %) und 116 Sn (14,7 %) am häufigsten vorkommen. Massenspektren zinnhaltiger
Verbindungen zeigen daher ein charakteristisches Isotopenmuster. Abb. 3.1.5-42
verdeutlicht dies am Massenspektrum von Triphenyl-methyl-zinn, dem Derivat von
Fentinhydroxid und Fentinacetat.
Abb. 3.1.5-42: Massenspektrum von Triphenyl-methyl-zinn
Abundance
120000
110000
100000
90000
80000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
m/z-->
77
91
120
Scan 819 (19.275 min): 9301002.D
124 154
169
197
210
289
118 Sn +
251271
294 335
351
365
100 150 200 250 300 350 400
3
116 Sn +
124
120 Sn +
393 414434
Cyhexatin und Azocyclotin werden bei der Derivatisierung zu Tricyclohexyl-methylzinn
umgesetzt (vgl. Abb. 3.1.5-41). In der Rückstands-HöchstmengenVO wird für
beide Pestizide eine Summenhöchstmenge, berechnet als Cyhexatin, angegeben
[34]. Ähnliches gilt auch für Fentinacetat und Fentinhydroxid, die beide zu Triphenylmethyl-zinn
umgesetzt werden. Hier besteht ebenfalls eine Summenhöchstmenge,
berechnet als Fentinhydroxid [34].
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
3
3

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Zur Bestimmung der Substanzen im SIM-Modus, wurden die in Tab 3.1.5-20 aufgeführten
Quantifizierungs- und Identifizierungs-Ionen (Target- und Qualifier-Ionen)
ausgewählt.
Tab 3.1.5-20: Übersicht der Derivatisierungsprodukte, Retentionszeiten und
detektierten Massen im SIM-Modus
Target-/ Retentions-
Organo-Zinn-
Pestizid
Derivatisierungsprodukt Qualifier-Ionen
[m/z]
zeit
[min]
Azocyclotin Tricyclohexyl-methyl-zinn 301/
Cyhexatin 299; 219
Fentinacetat
Fentinhydroxid
Fenbutatinoxid
Triphenyl-methyl-zinn
Tris(2-methyl-2phenylpropyl)-methyl-zinn
351/
349; 347
401/
399; 397
19,05
19,28
34,30
Unerwünschtes Nebenprodukt aus Fentinhydroxid und Fentinacetat
Diphenyl-
zinn-dihydroxid
Diphenyl-dimethyl-zinn
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
289/
287; 285
13,22
125

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb.3.1.5-43: Massenspektren der Derivatisierungsprodukte zinnhaltiger Pestizide
Abundance
140000
130000
120000
110000
100000
90000
80000
70000
60000
50000
Tricyclohexyl-methyl-zinn aus Cyhexatin und Azocyclotin
(19.016 min)
135
137
40000
30000
83
20000
67
10000
m/z--> 0
60 80
116
100 120 140
159 175
160 180
203
200 220
249 251
240 260
287 307 327 355
280 300 320 340 360 380
365 384
150000
140000
130000
120000
110000
100000
90000
80000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
m/z--> 0
Triphenyl-methyl-zinn aus Fentinhydroxid und Fentinacetat
Abundance (19.263 min)
120
197
219
77
91
124
154
169
201
221 247
289
273 293 318
373 405
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380
Tris(2-methyl-2-phenyl-propyl)-methyl-zinn aus Fenbutatinoxid
Abundance (38.956 min)
85000
80000
75000
70000
65000
60000
55000
50000
45000
40000
35000
91
30000
25000
20000
15000
10000
5000
m/z--> 0
60
77
80
117
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
135
197
289
405
201 227 253
145 161
281 303 341
345
369
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
301
351
349
401
126

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Kalibrierung
Zur Erstellung von Kalibrierungen wurden folgende Standardlösungen angefertigt:
• Azocyclotin/Fentinacetat-Standardgemisch
• Cyhexatin/Fentinhydroxid/Fenbutatinoxid-Standardgemisch.
Bei der Zusammenstellung der Standardlösungen wurde beachtet, daß Verbindungen,
die das gleiche Derivat ergeben, nicht zusammen vorkommen.
Während die Kalibrierkurven der Derivate von Cyhexatin und Azocyclotin eine sehr
gute Linearität aufwiesen, war bei Fentinhydroxyd/-acetat und bei Fenbutatinoxid bei
Abwesenheit von Matrixbestandteilen die Linearität schlecht. Dies deutet auf eine
Zersetzung dieser Substanzen im Injektionssystem hin. Dagegen zeigte sich bei
Anwesenheit von Matrixbestandteilen in den Meßlösungen ein linearer Verlauf der
Kalibrierkurven, was auf Matrixeffekte hindeutet (vgl. Kap. 3.1.2.3).
Um den Einfluß verschiedener Matrizes auf die Derivatisierungsausbeute und die
Steigung der Kalibriergeraden zu untersuchen, wurden Extrakte verschiedener
Matrizes (Petersilie, Mango, Zitrone), mit unterschiedlichen Mengen an Organo-Zinn-
Pestiziden dotiert und derivatisiert. Dabei wurde festgestellt, daß die Art der Matrix
keinen nennenswerten Einfluß auf die Steigung der Kalibriergeraden hatte.
3.1.5.6.5 Bestimmung mittels LC-MSD (API-Elektrospray)
Für die Bestimmung der Organo-Zinn-Pestizide mittels LC-MSD ist keine Derivatisierung
erforderlich.
Erste Messungen wurden mit einem HP 1100 series MSD-Gerät im Elektospray-
Modus (Fragmentorspannung 80V) durchgeführt. Hierbei wurden die Verbindungen
mittels LC aufgetrennt und Massenspektren für die einzelnen Verbindungen
aufgenommen. Es wurde festgestellt, daß nicht das protonierte Molekülion als
Hauptmasse im Massenspektrum auftritt, sondern die Triphenyl-/Trialkyl-Zinn-
Kationen. Mögliche Mechanismen, die zur Entstehung dieser Hauptfragmentionen bei
Cyhexatin, Azocyclotin, Fentinhydroxid und Fentinacetat führen, werden in Abb.
3.1.5-44 dargestellt.
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127

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.5-44: Entstehung der Hauptfragmentionen aus Fentin, Fentinacetat,
Azocyclotin und Cyhexatin.
Sn
O
H
Fentinhydroxid
O
Sn
O
C
CH3
Fentinacetat
O
H
Cyhexatin
N
Sn
Sn
N
N
Azozyclotin
+H
+H
+H
+H
O
Sn
O
H H
Sn
O
C H
N
CH3
Sn
O
H H
Anmerkung: Die angegebenen Massen beziehen sich auf das 120 Sn-Isotop
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Sn
N
N
H
N
H2O
H2O
Sn
Sn
128
Triphenylzinnkation
(Hauptfragmention)
m/z 351
CH3COOH
Tricyclohexylzinnkation
(Hauptfragmention)
m/z 369
N
NH

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Bei der Fragmentierung von Cyhexatin und Azocyclotin im MSD entsteht nach Abspaltung
von Cyclohexen und Wasser ein weiteres Fragmention mit hoher Intensität
(siehe Abb. 3.1.5-45) .
Abb. 3.1.5-45: Abspaltung von Cyclohexen aus Cyhexatin und Azocyclotin (Vorschlag)
Sn
O
H
H
H
Cyhexatin
H
O
H H
Sn H
Fragmention
m/z 287
N
N
NH
N
Sn
N
N
Azocyclotin
Die Entwicklung einer vollständigen Bestimmungsmethode war leider nicht möglich,
da alle Messungen bei der Fa. HP in Waldbronn erfolgten.
Die bisherigen Erfahrungen zeigen jedoch, daß diese Bestimmungsmethode für
Organo-Zinn-Verbindungen gut geeignet ist. Sie ist nicht nur schnell in der
Durchführung, sondern erlaubt auch prinzipiell die Erfassung von Azocyclotin und
Cyhexatin sowie von Fentinhydroxid und Fentinacetet nebeneinander.
Die Untersuchungen sollten daher fortgeführt werden.
3.1.5.6.6 Wiederfindungsversuche
Zur Ermittlung der Wiederfindungsraten wurde Apfelmus mit je 0,166 ppm sowie 1,11
ppm der Organo-Zinn-Pestizide dotiert, mit SFE extrahiert und nach Derivatisierung
mittels GC-MSD bestimmt.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden in Tab. 3.1.5-21 aufgeführt.
Leider konnten Wiederfindungen mit dem LC-MSD-System als Bestimmungs-
verfahren nicht mehr durchgeführt werden.
Tab. 3.1.5-21: Wiederfindungen der Organozinn-Pestizide,
dotierte Probe: Apfelmus,
dotierte Menge: je 0,166 ppm und 1,11 ppm, (n=4)
Organozinn-
Dotierung
Dotierung
Pestizide
0,166 ppm
1,11 ppm
Mittlere Wiederfindungen in %
Azocyclotin 73 (10)
83
Fentinacetat 76 (9) 69
Cyhexatin 73 (6) 71
Fentinhydroxid
77 (8) 73
Fenbutatinoxid 75 (6) 71
Anmerkung: In Klammern sind die Wiederfindungen, die bei einer Nachextraktion der
Probe unter den gleichen Bedingungen erzielt wurden, aufgeführt
Angesichts der relativ hohen Wiederfindungen bei der zweiten Extraktion
(Nachextraktion), erscheint es notwendig und möglich die Extraktionsbedingungen zu
optimieren, so daß noch bessere Wiederfindungen erzielt werden können.
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129
H
H

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Da Organo-Zinn-Verbindungen bekanntermaßen oxidationsempfindlich sind, könnten
bei weiterführenden Untersuchungen, zu ihrem Schutz, Antioxidantien wie
Ascorbinsäure eingesetzt werden.
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130

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.6 Beispiele aus der Praxis der Lebensmittelüberwachung
3.1.6.1 Bestimmung von Pyrimethanil und Diethofencarb in
Keltertrauben
Bei einem Feldversuch im Weinbau wurden Pyrimethanil und Diethofencarb sowie
Carbendazim zur Überprüfung ihrer Wirksamkeit bei der Bekämpfung von Botrytis
cinerea eingesetzt. Verschiedene Traubenproben wurden der CVUA Stuttgart zur
Bestimmung der Wirkstoffgehalte zum Zeitpunkt der Lese vorgelegt (vgl. Kap.
3.1.5.3.2.6).
Pyrimethanil und Diethofencarb sind erst in den letzten Jahren auf den Markt gekommen.
In den Wirkstofflisten der gängigen DFG-Multi-Methoden für Pestizide
waren sie noch nicht aufgeführt. Für Pyrimethanil war in der RHmV zu diesem
Zeitpunkt noch keine Höchstmenge festgesetzt worden.
Abb. 3.1.6-1: Strukturformeln von Pyrimethanil und Diethofencarb
C2H5O
O
C
C2H5O NH O
Diethofencarb
CH3
CH
CH3
H
N
N
N
CH3
Pyrimethanil
Wiederfindungsversuche mit dotierten Traubenproben zeigten, daß diese Stoffe sich
sehr gut mittels SFE extrahieren lassen. Eine Änderung des pH-Wertes von ∼3 auf
∼6,5 und ∼8,5 zeigte im Gegensatz zu Carbendazim (siehe Kap. 3.1.5.3.2.6) keinen
Einfluß auf die Extraktionsausbeuten (siehe Tab. 3.1.6-1). Die Carbamatgruppe des
Diethofencarb zeigt sich im Alkalischen stabil. Die Basizität der drei Stickstoffatome
des Pyrimethanil ist relativ schwach, so daß bei einem pH von ∼3 nur ein kleiner
Anteil protoniert vorliegt.
Tab. 3.1.6-1: Wiederfindungsversuche für die Stoffe Pyrimethanil und
Diethofencarb, je 0,33 ppm
Stoffe Wiederfindungen in % Mittelwert
pH∼3 pH∼6,5 pH∼8,5
(natürlicher pH)
Pyrimethanil 100 106 103 103
Diethofencarb 99 99 98 99
SFE-Bestimmungsmethode: siehe Anlage1
Probe: tiefgefroren zerkleinerte Weintrauben, Probenmenge 3 g / Hydromatrix 2 g
Bestimmung: mittels GC/MSD
CH3
Die ermittelten Wirkstoffgehalte, die die untersuchten Weintrauben und die daraus
hergestellten Weine aufwiesen, werden in Tab. 3.1.6-2 dargestellt.
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
131

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.1.6-2: Untersuchungsergebnisse von Keltertrauben aus einem Feldversuch
Probennummer Pyrimethanil Diethofencarb
Trauben Wein Trauben Wein
(ppm) (ppm) (ppm) (ppm)
unbehandelt Probe 1 0,05 < 0,005
Probe 2
0,024

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.6.2 Untersuchung von Carbendazim in Obst und Gemüse
Da die in der Literatur beschriebenen Analysenverfahren für Benomyl, Thiophanat-
Methyl und Carbendazim zeitaufwendig und arbeitsintensiv sind, werden diese
Verbindungen kaum routinemäßig bestimmt. Mit Hilfe der in Anlage 2 aufgeführten
Methode lassen sie sich jedoch problemlos und schnell bestimmen.
Die Untersuchung von über 250 Obst- und Gemüseproben aus dem Handel zeigt,
daß diese Verbindungen in der Landwirtschaft sehr häufig eingesetzt werden und
daß durchaus Überschreitungen der Höchstmengen auftreten (siehe Tab. 3.1.6-3
sowie Abb. 3.1.6-2).
Tab. 3.1.6-3: Carbendazim* Rückstände in Proben aus dem Handel (1997)
Probenzahl
Proben mit
Rückständen
Höchstmenge
[34]
>Höchstmenge
Gehalt in
mg/kg
Salate 131 21 (16%) 1,0 2

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.6-2: Carbendazim Rückstände in Proben aus dem Handel (1997)
Salat (131)
Steinobst (20)
Erdbeeren (46)
Zitrusfrüchte (24)
Papayas und Mangos (25)
max. 11 ppm
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
< HM: 15%
> HM: 2%
< HM: 40%
> HM: 10%
< HM: 48%
> HM: 0%
< HM: 42%
> HM: 0%
< HM: 24%
> HM: 12%
134

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.1.6-3 zeigt einen Vergleich der beim CVUA Stuttgart gefundenen Pestizid-
Rückstände in Obst in den letzten vier Jahren. Aufgeführt sind jeweils die 15 am
häufigsten quantifizierten Pestizide. Die starke Zunahme der Carbendazim-Befunde
im Jahr 1997 ist auf die Einführung der hier vorgestellten Analytik für Routinezwecke
zurückzuführen. Ähnliches gilt auch für die Verbindung 2,4-D im Jahr 1996.
Abb. 3.1.6.-3: Pestizid-Rückstände in Obst in den letzten vier Jahren
(CVUA-Stuttgart)
Carbendazim
Procymidon
Chlorpyriphos
Dichlofluanid
Imazalil
Thiabendazol
Brompropylat
Pyrimethanil
o-Phenyl-Phenol
Endosulfan
Vinclozolin
Ipro dio n
Captan
Prochloraz
Dicofol
Vinclozolin
Procymidon
Chlorpyrifos
Endosulfan
Tetradifon
Dichlofluanid
Brompropylat
Dicofol
Thiabendazol
Prochloraz
M ethidathion
Ipro dio n
Parathion
Mecarbam
Captan
% der Proben
0 5 10 15 20 25 30
1997
376 Proben
77 % mit Rückständen
73 versch. Pestizide
2,8 Wirkstoffe/Probe
8,2 % der Proben >HM
0 5 10 15 20 25 30
Procymidon
Thiabendazol
Chlorpyrifos
Imazalil
Brompropylat
Vinclozolin
Dichlofluanid
Dicofol
Endosulfan
o-Phenyl-Phenol
Captan
Tetradifon
M ethidathion
Ipro dio n
2,4-D
Vinclozolin
Dicofol
Endosulfan
Brompropylat
135
0 5 10 15 20 25
0 5 10 15 20 25
1995
Tetradifon
Chlorpyrifos
Procymidon
1994
M ethidathion
Thiabendazol
Dichlofluanid
Ipro dio n
Azinphos-M ethyl
Carbendazim
Parathion
o-Phenyl-Phenol
% der Proben
427 Proben
71 % mit Rückständen
69 versch. Pestizide
2,7 Wirkstoffe/Probe
4,0 % der Proben >HM
% der Proben % der Proben
324 Proben
72 % mit Rückständen
49 versch. Pestizide
1,9 Wirkstoffe/Probe
8,0 % der Proben >HM
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
1996
329 Proben
68 % mit Rückständen
47 versch. Pestizide
2,1 Wirkstoffe/Probe
6,2 % der Proben >HM

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.6.3 Untersuchung von 2,4-D in Zitrusfrüchten
Da die herkömmlichen Verfahren zur Bestimmung von 2,4-D relativ arbeitsaufwendig
sind, wird diese Verbindung nur äußerst selten untersucht. Deshalb liegen nur
wenige Daten über die Häufigkeit und Höhe von 2,4-D-Rückständen in Zitrusfrüchten
vor.
Mit der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten SFE-Methode (Anlage 3, Code
102E3102) wurden deshalb 140 Zitrusproben aus verschiedenen Herkunftsländern
untersucht. Die Ergebnisse sind in Tab. 3.1.6-4 dargestellt. In Proben aus
Mittelmeerländern wurden bei dieser Untersuchung selten Rückstände an 2,4-D
nachgewiesen. Dagegen wiesen nahezu alle Proben aus Süd- und Mittelamerika und
aus Südafrika 2,4-D-Rückstände auf. Der höchste Befund wurde in einer Probe aus
Simbabwe mit 1,6 ppm festgestellt. Die Höchstmenge von 2 ppm wurde jedoch in
keinem Fall überschritten.
Tab. 3.1.6-4: Rückstände an 2,4-D in Proben des Handels (1996 und 1997)
Herkunft
Anzahl Proben mit Gehalt in
Proben Rückständen mg/kg
Südafrika und Simbabwe 23 16 (70 %) 0,01-1,6
Süd- und Mittelamerika 12 11 (92 %) 0,01-0,38
Mittelmeerländer 83 7 (8 %) 0,01-0,29
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136

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.1.7 Untersuchung von Ringversuchsproben
3.1.7.1 European Commission´s Proficiency Tests on Pesticide
Residues in Fruit and Vegetables 1996/1997
Das CVUA Stuttgart hat Anfang 1997 an einem Ringversuch der Europäischen
Kommission (European Commission´s Proficiency Tests on Pesticide Residues in
Fruit and Vegetables 1996/1997, Proficiency Test I und II) teilgenommen.
3.1.7.1.1 Proficiency Test I
Eine dotierte Probe Gemüsepaprika sollte auf folgende Stoffe untersucht werden:
Acephat, Benalaxyl, Binapacryl, Bromophos-Ethyl, Captafol, Chlorthalonil,
Chlorpyrifos, Chlorpyrifos-Methyl, Cyfluthrin, Cypermethrin, DDT, Deltamethrin,
Diazinon, Dioxathion, Endosulfan, Endrin, Fenarimol, Fenchlorphos, Fenvalerat,
Heptachlor, Iprodion, Lambda-Cyhalothrin, Mecarbam, Metalaxyl,
Methamidophos, Methidathion, Permethrin, Pirimiphos-Methyl, Procymidon,
Propoxur, Propyzamid, TEPP und Triazophos.
Daneben sollten für die positiven Stoffe Wiederfindungen aus einer dotierten
Blindprobe ermittelt werden. Die Kalibrierung sollte entweder mit Standards in
Lösungsmittel oder mit Standards in Matrixextrakt erfolgen.
Für die Bestimmung wurden folgende Methoden eingesetzt:
1) DFG S19 (modifiziert, ohne Mini-Kieselgelsäulen)
2) SFE Methode (siehe Anlage 1, Code: 100E3101)
Folgende Substanzen wurden identifiziert: Diazinon, Chlorpyrifos, Procymidon,
Endosulfan, Cypermethrin. Tab. 3.1.6-5 zeigt die nach beiden Methoden ermittelten
Wiederfindungen. Zur Herstellung der Kalibrierlösungen wurden Extrakte der
Blindprobe mit Standards versetzt (Eichung auf Matrix).
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137

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.1.7-1: Wiederfindungen von Wirkstoffen aus Paprika.
Diazinon Chlorpyrifos Procymidon Endosulfan Cypermethrin
α- β- -sulfat
Wiederfindung in %
SFE-Methode: 3g Probe + 2g Hydromatrix, Zusatz: 0,8µg/3g (0,267 ppm)
Ansatz 1 106 96 109 102 105 101 73
Ansatz 2 101 99 105 107 104 104 83
Ansatz 3 88 91 105 103 98 83 83
Ansatz 4 95 90 100 104 97 87 84
Ansatz 5 84 87 92 92 92 80 82
Mittelwert 95 92 102 102 99 91 81
Variationskoeff.
in %
9,7 5,2 6,4 5,5 5,3 12,1 5,6
SFE-Methode: 2g Probe + 2g Hydromatrix, Zusatz: 0,8 µg/2g (0,4 ppm)
Ansatz 1 100 102 105 100 103 87 97
Ansatz 2 93 105 107 107 103 75 98
Ansatz 3 100 102 106 106 104 88 91
Ansatz 4 86 98 99 97 98 81 105
Ansatz 5 97 101 105 100 105 76 93
Mittelwert 95 101 104 102 102 81 97
Variationskoeff.
in %
6,4 2,6 2,9 4,2 2,4 7,4 5,6
Methode DFG S19: Zusatz 0,32 ppm
Mittelwert 85 88 97
SFE-Bestimmungsmethode: siehe Anlage 1
Probe: tiefgefroren zerkleinerte Paprika
Dotierung: auf 3g bzw. 2g Probe je 100µl Standardlösung (Aceton: Isooctan 1:1)
Bestimmung: mittels GC/MSD
95 91
Wie aus Tab. 3.1.7-1 ersichtlich wurden sowohl mit der DFG S19 als auch den SFE-
Methoden für alle Stoffe hohe Wiederfindungen erzielt.
Auffällig ist, daß die Wiederfindung von Cypermethrin bei einem Probe/ Hydromatrix
Verhältnis von 3:2 mit 81 % deutlich niedriger lag als bei einem Verhältnis von 2:2 (97
%) (siehe Tab. 3.1.7-1).
Es besteht hier ein Zusammenhang zwischen dem Wasser/Hydromatrix-Verhältnis in
der Probe (Feuchtigkeitsgrad) und der Extrahierbarkeit von Cypermethrin (vgl. Kap.
3.1.4.7.3). In Tab. 3.1.7-2 werden die nach der SFE-Methode (Anlage 1) und der
DFG-S-19-Methode ermittelten Gehalte mit den Angaben der Organisatoren des
Ringversuches verglichen.
Tab. 3.1.7-2: Gegenüberstellung der ermittelten Gehalte der SFE-Methode und
der DFG S19 mit den Ergebnisangaben der Organisatoren
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138

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
SFE-Methode DFG S19
(modifiziert)
Angaben der Organisatoren
Mittelwert Mittelwert Median kleinster höchster
(„korrigiert*“) („korrigiert*“) aller 85 angegebener angegebener
Teilnehmer
Gehalte in ppm
Wert Wert
Diazinon 0,39 (0,41) 0,37 (0,44) 0,312 0,170 0,460
Chlorpyrifos 0,74 (0,80) 0,72 (0,82) 0,681 0,370 0,942
Procymidon 0,75 (0,74) 0,76 (0,78) 0,644 0,315 0,993
Σ-Endosulfan 0,47 (0,47) 0,48 (0,51) 0,391 0,195 0,650
Cypermethrin 0,29 (0,36) 0,34 (0,37) 0,330 0,042 0,695
SFE-Bestimmungsmethode: Anlage 1
Probe: tiefgefroren zerkleinerte Paprika, 3g Probe + 2g Hydromatrix
Bestimmung: mittels GC/MSD
* bei Berücksichtigung der Wiederfindungen
3.1.7.1.2 Proficiency Test II
Eine dotierte Probe Apfel sollte auf folgende Stoffe untersucht werden:
Acephat, Benalaxyl, Binapacryl, Bromophos-Ethyl, Captafol, Carbendazim,
Carbofuran, Chlorthalonil, Chlorpyrifos, Chlorpyrifos-Methyl, Cyfluthrin,
Cypermethrin, DDT, Deltamethrin, Diazinon, Dicofol, Dioxathion, Disulfoton,
Endosulfan, Endrin, Fenarimol, Fenchlorphos, Fenvalerat, Heptachlor, Imazalil,
Iprodion, Lambda-Cyhalothrin, Mecarbam, Metalaxyl, Methamidophos,
Methidathion, Permethrin, Pirimiphos-Methyl, Procymidon, Propiconazol,
Propoxur, Propyzamid, TEPP, Thiabendazol, Triazophos und Vinclozolin.
Für die Bestimmung wurden die in Anlage 1 und Anlage 2 aufgeführten Methoden
verwendet. Auch hier wurden für die positiven Stoffe Wiederfindungsversuche
durchgeführt (siehe Tab. 3.1.7-3) und zur Herstellung der Kalibrierlösungen Extrakte
der Blindprobe mit Standards versetzt (Eichung auf Matrix).
Folgende Substanzen wurden identifiziert: Diazinon, p,p-Dichlorbenzophenon,
Thiabendazol, Methidathion, Iprodion und Carbendazim. Tab. 3.1.7-3 zeigt die
ermittelten Wiederfindungen (Carbendazim siehe Kap. 3.1.5.3.2.5).
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139

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.1.7-3: Wiederfindungen von Wirkstoffen aus Paprika.
Diazinon p,p´-Dichlorbenzophenon*
Methidathion Iprodion
Wiederfindung in %
Ansatz 1 94 92 90 87
Ansatz 2 93 89 88 86
Ansatz 3 100 93 89 87
Ansatz 4 104 94 88 87
Ansatz 5 98 94 87 87
Mittelwert 98 92
88 87
SFE-Bestimmungsmethoden: Anlage 1
Probe: tiefgefroren zerkleinerte Paprika 3g Probe + 2g Hydromatrix, Zusatz: 2µg/3g (0,267 ppm)
Bestimmung: mittels GC/MSD
*Abbauprodukt von Dicofol
In Tab. 3.1.7-4 werden die nach den SFE-Methoden (Anlage 1 und 2) ermittelten
Gehalte mit den Angaben der Organisatoren des Ringversuches verglichen.
Tab. 3.1.7-4: Vergleich der mittels SFE-Methode ermittelten Gehalte mit den
Angaben der Organisatoren
Wirkstoff Ansatz 1 Ansatz 2 Mittelwert
Spiking
level
140
Mittelwert
aller
Teilnehmer
mg/kg mg/kg mg/kg
Carbendazim 0,58 0,74 0,66 0,653 0,507
Diazinon
0,211 0,214 0,21 0,243 0,197
p,p´-Dichlorbenzophenon* 0,331 0,345 0,34 0,373 keine Angabe
Methidathion 0,232 0,237 0,23 0,253 0,246
Iprodion 1,20 1,25 1,22 1,38 1,222
Thiabendazol 1,00 0,943 0,97 1,11 0,825
SFE-Bestimmungsmethoden: Anlage 1 und Anlage 2
Probe: tiefgefroren zerkleinerte Paprika 3g Probe + 2g Hydromatrix
Bestimmung: mittels GC/MSD
*Abbauprodukt von Dicofol
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Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.2 EINSATZ DER SFE IN DER ANALYTIK VON BEDARFSGEGENSTÄNDEN
3.2.1 Einleitung
Zu den Bedarfsgegenstände im Sinne des LMBG werden unter anderem gezählt:
• „Gegenstände, die dazu bestimmt sind, bei dem Herstellen, Behandeln, Inverkehrbringen
oder dem Verzehr von Lebensmitteln verwendet zu werden und dabei
mit den Lebensmitteln in Berührung zu kommen oder auf diese einzuwirken“
(Lebensmittelbedarfsgegenstände) wie z.B. Lebensmittelverpackungen, Geschirr,
• „Spielwaren und Scherzartikel“,
• „Gegenstände, die dazu bestimmt sind, nicht nur vorübergehend mit dem
menschlichen Körper in Berührung zu kommen...“, wie Kleidung, Bettwäsche.
In Bedarfsgegenständen können Stoffe enthalten sein, die, bei einem Kontakt, ggf.
auf Lebensmittel oder Menschen übergehen (migrieren) können.
Nach §31 LMBG ist es verboten:
„...Gegenstände als Bedarfsgegenstände... so zu verwenden oder für solche
Verwendungszwecke in den Verkehr zu bringen, daß von ihnen Stoffe auf
Lebensmittel oder deren Oberfläche übergehen, ausgenommen gesundheitlich,
geruchlich und geschmacklich unbedenkliche Anteile, die technisch unvermeidbar
sind“.
In der Bedarfsgegenständeverordnung werden deshalb u.a. umfangreiche Positivlisten
von Stoffen aufgeführt, die die Zusammensetzung und Migration von
Lebensmittelbedarfsgegenständen regeln. Aufgabe der Lebensmittelüberwachung ist
es, die Einhaltung der Vorschriften hinsichtlich der Zusammensetzung der
Bedarfsgegenstände und des Migrationsverhaltens der Inhaltsstoffe zu überwachen.
Auf den ersten Blick erscheinen viele Bedarfsgegenstände gut für Extraktionen mit
überkritischem Kohlendioxid geeignet zu sein. Sie enthalten meist wenig oder kein
Wasser oder Fett, Inhaltsstoffe, die bei der SFE im allgemeinen Probleme bereiten
können (vgl. Kap. 2.3.3). Allerdings bereitet bei vielen Bedarfsgegenständen, z.B. bei
Kunststoffen, die Zerkleinerung Schwierigkeiten. Da bei der SFE nur wenig Probenmaterial
zur Extraktion eingesetzt werden kann, ist hier auf eine besonders gute
Homogenität zu achten. Dies ist aber nicht immer einfach, da z.B. bei der
Zerkleinerung von Kunststoffen viel Wärme entsteht und Verluste an Inhaltsstoffen
auftreten können. Darüber hinaus ist es bekanntermaßen meist nicht möglich, die
z.B. bei Kunststoffen eingebetteten Inhaltsstoffe durch Dotierungen im Labor zu
simulieren. Daher ist bei reellen Proben eine Abschätzung der Extraktionsausbeuten
von Inhaltsstoffen sehr schwer.
Im folgenden werden einige Anwendungen vorgestellt, bei denen die SFE zur
Extraktion von Inhaltsstoffen in Bedarfsgegenständen erfolgreich eingesetzt werden
kann.
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141

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.2.2 Di-Isopropyl-Naphthalin in Papier
3.2.2.1 Einführung
Di-Isopropyl-Naphthalin (DIPN) wird als Isomerengemisch u.a. bei der Herstellung
von Durchschreibepapieren und Thermopapieren als Farblösungsmittel und Farbträger
verwendet. Die allgemeine Strukturformel der DIPN-Isomere ist in Abb. 3.2.2-1
dargestellt [117].
Abb. 3.2.2-1: Strukturformel von Di-Isopropyl-Naphthalin
Di-Isopropyl-Naphthalin
(Isomerengemisch)
Da beim Recycling von Altpapier alle Prozesse in wäßrigen Medien ablaufen, wird
DIPN wegen seiner stark lipophilen Eigenschaften nur schwer abgetrennt und gelangt
somit in Recyclingpapiere und Recyclingkartonagen. Aus Sicht der Lebensmittelüberwachung
ist es interessant DIPN zu analysieren, da Verpackungsmaterialien
oft zu einem großen Anteil aus Altpapier hergestellt werden. Kommen
diese Papiere in Kontakt mit Lebensmitteln, so kann es durch Migrationen, zu einer
Kontamination kommen [118].
3.2.2.2 Bestimmungsverfahren
Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Methode zur Bestimmung von DIPN-Rückständen
in Papier entwickelt. Nach einer Extraktion mit überkritischem Kohlendioxid
wurde das DIPN Isomerengemisch mittels GC/MSD gemessen. Erzielte Ergebnisse
wurden mit denen eines naßchemischen Verfahrens verglichen.
3.2.2.2.1 naßchemisches Verfahren
Im Rahmen einer Praktikantenarbeit am CVUA Stuttgart wurde ein Verfahren zur
Bestimmung von DIPN in Papieren und Lebensmitteln ausgearbeitet, bei dem das
Isomerengemisch mit Hilfe einer Wasserdampfdestillation nach Clevenger aus dem
Papier in eine Isooctan-Vorlage getrieben wird [115]. Die Messung erfolgt fluorimetrisch
nach flüssigkeitschromatographischer Auftrennung. Die einzelnen DIPN-
Isomere konnten flüssigkeitschromatographisch nicht aufgetrennt werden und
wurden daher als Summe erfaßt.
3.2.2.2.2 Extraktion mittels SFE
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, Sitz Fellbach
142

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Es wurden Extraktionen mit beiden zur Verfügung stehenden Extraktoren durchgeführt.
Die zu extrahierenden Papierproben wurden in kleine Streifen geschnitten und in die
Extraktionshülsen gefüllt (meist 0,8 bis 1,2 g) und extrahiert.
Extraktion mit HP-7680T:
Zur Ermittlung der Wiederfindungsrate wurde ein zuvor mit Ether extrahiertes
Filterpapier verwendet. Je 1 g Filterpapier wurde in drei Extraktionshülsen gefüllt und
mit jeweils 5 µg DIPN in acetonischer Lösung versetzt. Vor der Extraktion wurde die
Hülse für ca. 1 min offen stehen gelassen, damit das Lösungsmittel verdampfen
konnte. Die Extraktion erfolgte nach den unten aufgeführten Bedingungen und die
Bestimmung wurde mittels GC-MSD durchgeführt. Dabei wurde eine mittlere
Wiederfindung von 98% (n=3) ermittelt.
SFE-Parameter für HP 7680T:
• Extraktionsdruck: 329 bar, Temperatur: 55°C
• Dichte: 0,89 g/ml
• statische Extraktion: 2 min
• dynamische Extraktion: 25 min
• CO2-Fluß: 1,8 ml/min
• Fallenmaterial: ODS, 5°C während der Extraktion
• Elutions-Lösungsmittel: Acetonitril
Extraktion mit ISCO SFX 3560:
Bei Extraktionsversuchen mit dem ISCO Gerät wurde zunächst zum Auffangen der
Extrakte Acetonitril/Aceton 1:4 bei einer Temperatur von 10°C vorgelegt. Es wurde
jedoch beobachtet, daß es mit steigender Extraktionszeit zu Verlusten an DIPN durch
Verflüchtigung kam. Daraufhin wurde das unpolare Isooctan als Vorlagelösungsmittel
verwendet und die Temperatur wurde während der Extraktion bei 0°C gehalten. Zur
Überprüfung ob unter diesen Bedingungen Verluste auftreten, wurden vier
Vorlagegläschen in denen Isooctan vorgelegt wurde mit je 10 µg DIPN versetzt und
für 5, 10, 20, 30 min eine Extraktion simuliert. Selbst nach 30minütiger
„Extraktionszeit“ waren praktisch keine Verluste festzustellen.
SFE-Parameter für ISCO SFX 3560:
• Extraktionsdruck: 330 bar, Temperatur: 55°C
• Dichte: 0,89 g/ml
• statische Extraktion: 2 min
• dynamische Extraktion: 25 min
• CO2-Fluß: 1,8 ml/min
• Lösungsmittel in der Vorlage: 10 ml Isooctan
• Temperatur der Vorlage: 0°C
3.2.2.2.3 Bestimmung mittels GC/MSD
Die nach der SFE erhaltenen Extrakte wurden direkt ohne jegliche Nachreinigung
mittels GC/MSD gemessen. In Abb. 3.2.2-2 sind die SIM-Chromatogramme (m/z 155
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143

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
und 197) einer DIPN-Standardlösung dargestellt. Es wird ersichtlich, daß das
Isomerengemisch durch die Gaschromatographie zu einer Vielzahl von Peaks
aufgetrennt wird, die man im wesentlichen in zwei Hauptgruppen unterteilen kann.
Gruppe 1: Retentionszeit-Fenster 17 -17,60 min (leichterflüchtigere Isomere)
Gruppe 2: Retentionszeit-Fenster 17,60-18,30 min (schwererflüchtigere Isomere).
Abb. 3.2.2-2: SIM-Chromatogramme von DIPN-Standardlösung (m/z 155, 197)
Abundance
80000
75000
70000
65000
60000
55000
50000
45000
40000
35000
30000
25000
20000
15000
10000
5000
Ion 155.00 (154.70 to 155.70): 5101002.D
17.82
0
Time-->
17.00 17.10 17.20 17.30 17.40 17.50 17.60 17.70 17.80 17.90 18.00 18.10
Abundance
220000
200000
180000
160000
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
Ion 197.00 (196.70 to 197.70): 5101002.D
17.83
0
Time-->
17.00 17.10 17.20 17.30 17.40 17.50 17.60 17.70 17.80 17.90 18.00
Anmerkung: Die Unterschiede im Peakmuster der beiden SIM-Chromatogramme sind auf die
Unterschiede in den Massenspektren der einzelnen DIPN Isomere zurückzuführen
(Fragmentierungsunterschiede).
Abb. 3.2.2-3: SIM-Chromatogramme von DIPN aus Papierextrakt (m/z 155, 197)
Abundance
180000
170000
160000
150000
140000
130000
120000
110000
100000
90000
80000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
Gr. 1
Gr. 1
Gr. 2
m/z 155
Ion 155.00 (154.70 to 155.70): 5501006.D
Gr. 2
17.83
Abundance
500000
450000
400000
350000
300000
250000
200000
150000
100000
m/z 155 m/z 197
0
Time-->
17.00 17.10 17.20 17.30 17.40 17.50 17.60 17.70 17.80 17.90 18.00
50000
Gr. 1
Gr. 1
Gr. 2
m/z 197
Ion 197.00 (196.70 to 197.70): 5501006.D
Gr. 2
17.83
0
Time-->
17.00 17.10 17.20 17.30 17.40 17.50 17.60 17.70 17.80 17.90 18.00 18.10
Anmerkung: Die Unterschiede im Peakmuster der beiden SIM-Chromatogramme sind auf die
Unterschiede in den Massenspektren der einzelnen DIPN Isomere zurückzuführen
(Fragmentierungsunterschiede).
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144

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.2.2-1: Verhältnisse der Peakflächen der Gruppe 2 zu Gruppe 1
bei 2 SIM-Massen (m/z 155, 197)
m/z Standardlösung Papierextrakt
Gruppe 1 Gruppe 2 Verhältnis Gruppe 1 Gruppe 2 Verhältnis
Fläche Gr. 1/Gr. 2 Fläche Gr. 1/Gr. 2
155 3560 7240 0,49 5850 14120 0,41
197
7570 18990 0,40 12410 36860 0,34
Bei ersten Extraktionsversuchen von Papierproben wurde festgestellt, daß es
Unterschiede in den Peakmustern zwischen dem aus Proben extrahierten DIPNisomerengemisch
und dem verwendetem Standard gab (vgl. Abb. 3.2.2-2 und Abb.
3.2.2-3). Die Isomeren der ersten Gruppe waren im Verhältnis zu denen der Gruppe
2 in den Probenextrakten schwächer vertreten als im Standard (siehe Tab. 3.2.2-1).
Es lag demnach eine Diskriminierung der leichterflüchtigeren Isomeren in den Proben
vor.
Durch einen Vergleich der Peakmuster eines Extraktes aus einem Wiederfindungsversuch
und dem Standard konnte ausgeschlossen werden, daß diese
Diskriminierung während der Extraktion auftritt. Wenn man davon ausgeht, daß im
verwendeten DIPN-Standard die Isomerenverteilung in etwa mit der des industriell
verwendeten DIPN übereinstimmt, dann müßte diese Diskriminierung im Zeitraum
von der ersten Verwendung des DIPN bis zur Analyse erfolgt sein. Dies ließe sich
durch die leichtere Verflüchtigung der leichterflüchtigen Isomere der Gruppe 1 erklären.
Abb. 3.2.2-4: Massenspektrum von zwei unterschiedlichen DIPN-Isomeren
Abundance
130000
120000
110000
100000
90000
80000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
m/z-->
Abundance
220000
200000
180000
160000
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
m/z-->
128
129
120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220
128
129
Scan 1772 (17.231 min): 5101002.D
Peak aus Gruppe 1
141
Scan 1846 (17.832 min): 5101002.D
141
152
152
155
155
165
Peak aus Gruppe 2
165
120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220
Zur Ermittlung der Gehalte wurden die Peaks der jeweiligen Gruppe als Summe
integriert. Bedingt durch die oben beschriebene Diskriminierung werden in Proben für
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197
197
212
212
145

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
die Isomere der Gruppe 1 niedrigere Ergebnisse erzielt als für die Gruppe 2. Die
Unterschiede zwischen den Ergebnissen aus Gruppe 1 und Gruppe 2 lagen
zwischen 4 und 30 % (meist im Bereich zwischen 15 und 20%). Daher wurde hier
stets der Mittelwert aus den beiden Werten als Ergebnis angegeben.
Da es, wie beschrieben, zwischen Standard und Proben Unterschiede im DIPN-
Peakmuster gibt (vgl. Abb. 3.2.2-2 und Abb. 3.2.2-3) und da die einzelnen Isomere
etwas unterschiedliche Massenspektren aufweisen (siehe Abb. 3.2.2-4 und Tab.
3.2.2-1), ergeben sich bei der Bestimmung Unterschiede in den Ergebnissen bei
Verwendung unterschiedlicher Quantifizierungsmassen. Um diesen Fehler möglichst
klein zu halten, wurden mehr als 15 Massen, die zusammen etwa 80% der
Gesamtfläche des DIPN-Signals im SCAN-Modus ausmachen, zur Quantifizierung
herangezogen. Eine Quantifizierung anhand der im SCAN-Modus erhaltenen
Gesamtionenstrom-Chromatogramme wurde nicht durchgeführt, um zu vermeiden,
daß durch Interferenzen koeluierender Verbindungen das Ergebnis verfälscht wird.
3.2.2.3 Extraktion von Proben aus dem Handel
Verschiedene Proben wurden mit den SFE-Methoden sowie naßchemisch untersucht
und die dabei erzielten Ergebnisse verglichen. Bei diesen Proben handelte es sich
um Papierverpackungen, die dazu verwendet werden offene Lebensmittel vor der
Abgabe an den Verbraucher zu verpacken. Diese Verpackungen waren z.T. mit einer
Kunststoffolie beschichtet. In Tab. 3.2.2-2 werden die Ergebnisse dieser
Untersuchungen zusammengestellt.
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146

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.2.2-2: Zusammenstellung der Ergebnisse der Untersuchung von Papieren
und Kunststoffolien
Ermittelte Gehalte in ppm
Proben-
Nr.
11146
11211
Papierart
Destillation HP- ISCO-
HPLC Extraktor Extraktor
GC-MSD GC-MSD
Butterbrotpapier 0,24 0,73 -
Packpapier für Backwaren 1,18 0,68 -
147
Anmerkungen
11212 beschichtetes Papier zur
Verpackung von
Lebensmitteln
34,2 22,0 Σ=90* *4x extrahiert
11459 Papiertüte für Brot 22,9 22,1 22,4
11460
11883
11884
12170
12368
12591
12813
Papiertüte für Backwaren 1,53 - 5,2
Pappschachtel für fritierte
Backwaren
0,22 2,8 0,85
Papiertüte für Backwaren 0,40 2,0 -
Butterbrotpapier 0,05 0,16 -
Frühstücksbeutel 0,07 0,27 -
Frühstücksbeutel
aus Papier und Folie
2,32 0,48/2,65 - mit Folie
Karton für Torten 4,6 7,6 -
13049 Einwickelpapier für Wurst mit
PE-Folie beschichtet
2,72 3,4/26 2,0/9,8 mit Folie
13050 Einwickelpapier für Käse mit
PE-Folie Beschichtet
6,52 4,7/28,6 3,9/11,9 mit Folie
Bei der Extraktion einiger wachshaltiger Proben mit dem Extraktor HP 7680T ist es
zu Verstopfungen in der Festphasenfalle und in der Leitung, die von der Festphasenfalle
zu dem Auffanggläschen führt, gekommen. Bei Extraktionen mit dem
ISCO SFX 3560 traten diese Schwierigkeiten dagegen nicht auf.
Bei der Interpretation der Ergebnisse aus der Tab. 3.2.2-2 ist zu beachten, daß das
DIPN innerhalb verschiedener Papierschichten sehr unterschiedlich verteilt ist. Die
große Streuung der Ergebnisse ist in erster Linie sicherlich auf diese Inhomogenitäten
(z.B. Klebeflächen, bedruckte Flächen) zurückzuführen.
Bei mehreren Papieren wurde eine Doppelextraktion durchgeführt. Bei fast allen
Papieren war im Extrakt der zweiten Extraktion DIPN nur noch in Spuren vorhanden.
Die 1. Extraktion scheint daher nahezu vollständig zu sein. Bei einem Papier
allerdings (Nr. 11211, siehe Tab. 3.2.2-2), das einseitig mit einer glänzenden Schicht
beschichtet war, war trotz mehrerer Extraktionen weiterhin DIPN nachweisbar.
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Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.2.2-3: Ergebnisse der Mehrfachextraktion eines beschichteten Papiers
Papier Nr.
11211
dynamische Extraktionszeit (min)
5 10 15 25
1. Extraktion 63 % 69 % 73 % 75 %
2. Extraktion 19 % 13 % 13 % 13 %
3. Extraktion 8 % 8 % 8 % 6 %
4. Extraktion 6 % 6 % 6 % 6 %
5. Extraktion 4 % 4 % n.d. n.d.
Summe als
100 % gesetzt
100 % 100 % 100 % 100 %
Summe 83 ppm 86 ppm 86 ppm 90 ppm
Interessant ist, daß es zu einer Anreicherung von DIPN in den mit den Papieren in
Kontakt stehenden Beschichtungsfolien kommt (siehe Tab. 3.2.2-2). Da mit Folien
beschichtete Papiere zur Verpackung von fettreichen Lebensmitteln (z.B. Käse,
Wurst) vorgesehen sind, ist dieser Befund im Hinblick auf mögliche Migrationen für
die Lebensmittelüberwachung von Bedeutung.
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148

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.2.3 PCP (Pentachlorphenol) aus Holz und Textilien
3.2.3.1 Einführung
Pentachlorphenol wurde in der Vergangenheit häufig wegen seiner fungiziden
Eigenschaften als Holzschutzmittel eingesetzt. Daneben wurde und wird es als
Konservierungsstoff in der Papier- und Zellstoffindustrie, in der Textilindustrie, zur
Konservierung von Leder, bei der Herstellung von Farben, Klebern und Leimen etc.
eingesetzt.
Aufgrund seiner Toxizität wurde PCP nach und nach durch andere Stoffe ersetzt.
Zwischenzeitlich ist seine Verwendung in vielen Bereichen verboten. In Deutschland
ist es nach der Chemikalienverbots-Verordnung verboten Mittel in den Verkehr zu
bringen, die PCP in einer Menge von über 0,1 % enthalten. Es sind Höchstmengen
für PCP festgesetzt, deren Einhaltung im Rahmen der amtlichen Lebensmittelüberwachung
zu überprüfen sind (z.B. in Leder, Holz).
3.2.3.2 Bestimmung von PCP
3.2.3.2.1 naßchemisches Verfahren
Nach dem derzeit im CVUA Stuttgart verwendeten Verfahren wird Phentachlorphenol
mit Isooctan aus dem zerkleinerten Probenmaterial (Holz, Textilien) isoliert und nach
Silylierung mittels GC-MSD bestimmt.
Dazu werden 5 g Probe mit 200 ml Isooctan versetzt und 2 h lang unter Rückflußkühlung
auf der Heizplatte oder im Wasserbad extrahiert. Der abgekühlte Extrakt wird
filtriert und auf etwa 2-5 ml eingeengt. Anschließend wird der Extrakt in einen 25 ml
Meßkolben überführt, mit Interner Standard-Lösung (HCB) versetzt und mit Isooctan
zur Marke aufgefüllt.
Bei positiven Befunden wird die Bestimmung wiederholt und die Kalibrierung erfolgt
nach dem Standardadditionsverfahren.
3.2.3.2.2 SFE-Methode
3.2.3.2.2.1 Probenaufarbeitung
PCP ist eine recht saure Verbindung (pKs=5,8). Die Abspaltung des Protons aus der
Phenolgruppe wird durch die elektronenanziehende Wirkung der 5 Chloratome im
Ring erleichtert. Daher wurden zur Extraktion des PCP saure Bedingungen
eingestellt (vgl. Kap. 3.1.4.7.2).
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149

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Abb. 3.2.3-1: Strukturformel von PCP
Cl
Cl
Cl
Cl Cl
O
Pentachlorphenol
Je nach Größe und Dichte des Ausgangsmaterials werden 0,5 bis 2 g Probe in ein
Becherglas eingewogen. Die Probenmatrix wird mit ca. 150 bis 200 µl 2%iger
Schwefelsäure versetzt und mit Wasser befeuchtet. Die befeuchtete und angesäuerte
Probe wird mit einem Adsorbens (Hydromatrix) vermengt und in die
Extraktionshülsen überführt.
3.2.3.2.2.2 Extraktion mit ISCO SFX 3560
Die Extraktion wurde ausgehend von den bisherigen Erfahrungen bei folgenden
Bedingungen durchgeführt:
Extraktor ISCO SFX 3560
• Extraktionsdruck CO2-Druck 330 bar
• Extraktionstemperatur 55 °C
• Restriktortemperatur 55 °C
• Flußrate (Restrikor) 1,8 ml/min
• Statische Extraktionszeit 2,5 min
• Dynamische Extraktionszeit 25 min
• Vorlage im Auffanggefäß 5 ml Aceton-Acetonitril-Gemisch (2:1)
• Temperatur der Vorlage 10 °C.
Der Extrakt wird im Stickstoff-Strom vorsichtig auf etwa 1 ml eingeengt.
3.2.3.2.2.3 Derivatisierung mit PFB-Br
Die Derivatisierung erfolgt im Vorlagegefäß. Dazu wird der eingeengte Extrakt mit
200 µl 25% iger Kaliumcarbonat-Lösung (Katalysator) und 200 µl 15 %iger PFB-Br-
Lösung in Acetonitril versetzt. Das verschlossene Gefäß wird 3 h im Heizblock auf 65
°C erwärmt. Anschließend wird die organische Phase im Stickstoffstrom entfernt und
die Derivate in 1 ml Isooctan, das den Internen Standard enthält (PCB IUPAC Nr.
101), aufgenommen. Noch vorhandenes Wasser wird mit Na2SO4 (wasserfrei)
gebunden.
Die organische Phase wird in ein GC-Vial überführt und zur GC-MSD-Bestimmung
eingesetzt.
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H
150

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.2.3.2.3 Wiederfindungen und Untersuchung PCP-haltiger Seide
Zur Ermittlung der Wiederfindungsrate wurde eine PCP-freie Probe insgesamt 3 mal
mit 10 µg PCP dotiert und wie oben beschrieben aufgearbeitet. Die Wiederfindungsraten
lagen zwischen 95 und 97 %.
Das Extraktionsverhalten von gealterten PCP-Rückständen könnte jedoch anders sein
als das von dotierten. Für weitere Untersuchungen (siehe Tab. 3.2.3-1) wurde deshalb
ein Seidenpulver verwendet, das gealterte PCP-Rückstände enthielt. Diese Probe
wurde im Rahmen eines Ringversuches zur Verfügung gestellt.
Tab. 3.2.3-1: Untersuchungsergebnisse der PCP-haltigen Seidenprobe
PCP-Gehalt (angegebener Gehalt)
30 mg/kg
naßchemisch ermittelter Gehalt
mit der SFE-Methode ermittelter Gehalt
Wiederfindung bei der SFE, Aufstockung mit 15 µg PCP
3.2.3.2.4 Optimierung der Extraktion
5 mg/kg
28 mg/kg
99 %
Folgende Parameter wurden variiert um zu überprüfen, ob die Extraktion von PCP
noch verbessert werden kann:
- höhere Flußrate,
- höhere Extraktionstemperatur,
- längere statische Extraktionszeit,
- höherer Extraktionsdruck,
- Durchführung einer zweiten Extraktion.
Die Untersuchungen wurden mit einer Holzprobe durchgeführt, bei der nach der
naßchemischen Methode ein PCP-Gehalt von 5,2 mg/kg ermittelt wurde.
Tab. 3.2.3-2 zeigt die bei Anwendung verschiedener Extraktionsbedingungen
ermittelten PCP-Gehalte.
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151

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.2.3-2: Ermittelte PCP-Ergebnisse in einer zerkleinerten Holzprobe bei
Variation der Extraktionsbedingungen
Extraktionsbedingungen ermittelter PCP-Gehalt (mg/kg)
1. Extraktion 2. Extraktion
naßchemische Methode 4,9 5,6 5,0 n.n. n.d.
SFE-Methode (wie 3.2.2.3.2.2) 4,1 4,0 0,7
SFE, Fluß 2,5 ml/min 4,1 0,81
SFE, Extraktionstemperatur 65 °C 4,1 4,0 0,65
SFE, statische Extraktionszeit 5 min 4,1 4,0 0,64
SFE, Extraktionsdruck 500 bar 4,6 4,6 0,4
SFE, Extraktionsdruck 660 bar 4,6 4,5
0,64
Wie die Ergebnisse zeigen, führt eine Erhöhung des Extraktionsdruckes von 330 auf
500 bar zu einer deutlichen Erhöhung der PCP-Ausbeuten. Eine weitere Erhöhung
des Druckes auf 660 bar brachte keine Vorteile mehr.
Um zu überprüfen, ob die Extraktionszeit noch verkürzt werden kann, wurde ein
weiterer Versuch durchgeführt, bei den die dynamische Extraktionszeit zwischen 10
und 35 min variiert wurde. Tab. 3.2.3-3 zeigt die Ergebnisse dieses Versuchs.
Tab. 3.2.3-3: PCP-Ergebnisse einer Holzprobe bei Variation der Extraktionszeit
Extraktionsbedingungen
ermittelter PCP-Gehalt (mg/kg)
1. Extraktion 2. Extraktion
naßchemische Methode 4,9 5,6 5,0 n.n.
SFE-Methode (wie 3.2.2.3.2.2) 4,1 4,0 0,7
SFE*, dyn. Extraktionszeit 10 min 3,1 3,2 0,45
SFE*, dyn. Extraktionszeit 15 min 3,5 3,6 0,21
SFE*, dyn. Extraktionszeit 20 min 4,0 4,3 0,17
SFE*, dyn. Extraktionszeit 25 min 4,6 0,15
SFE*, dyn. Extraktionszeit 30 min 4,6
SFE*, dyn. Extraktionszeit 35 min
* Extraktionsdruck 500 bar
4,6
Nach diesen Untersuchungen sind die optimierten Extraktionsbedingungen:
Extraktor ISCO SFX 3560
• Extraktionsdruck CO2-Druck 500 bar
• Extraktionstemperatur 55 °C
• Restriktortemperatur 55 °C
• Flußrate (Restrikor) 1,8 ml/min
• Statische Extraktionszeit 2,5 min
• Dynamische Extraktionszeit 25 min
• Vorlage im Auffanggefäß 5 ml Aceton-Acetonitril-Gemisch (2:1)
• Temperatur der Vorlage 10 °C.
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152

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.2.3.3 Untersuchung von Planproben
Mit der optimierten Extraktionsmethode wurden einige Planproben auf ihren Gehalt
an PCP untersucht. Die Ergebnisse im Vergleich zur herkömmlichen Analysenmethode
sind in Tab. 3.2.3-3 dargestellt.
Tab. 3.2.3-3: PCP-Gehalte in Planproben, Extraktion mit SFE im Vergleich zum
naßchemischen Verfahren
Gehalt an PCP (mg/kg)
Proben-Nr. SFE-Methode Mittelwert naßchemisches
SFE-Methode Verfahren
4191 4,6; 4,7; 4,5 4,6 4,9; 5,6; 5,0; n.n.
6280 12,7; 15,3; 15,8 14,6 2,2; 0,6; 0,7; 0,8
5057 0,22; 0,23 0,23 n.n.
Seidenpulver 30,0; 32,2; 30,7 30,9 5,0
3.2.3.4 Fazit
Wie Tab. 3.2.3-3 zeigt, werden mit der SFE-Extraktion zum Teil erheblich höhere
Gehalte an PCP festgestellt als nach einer Extraktion mit Isooctan. Ausschlaggebend
für diese deutlich verbesserte Extraktion dürften sein:
• Zurückdrängung der Dissoziation des PCP durch Einstellung des pH-Wertes und
• die Zugabe von Wasser als Modifier bei der SFE-Extraktion, wodurch
Wechselwirkungen zwischen dem PCP und Bestandteilen der Holzmatrix reduziert
werden.
Vorteile der SFE-Extraktion sind der geringere Lösungsmittelverbrauch, der geringere
Zeit- und Arbeitsaufwand und die damit verbundenen geringeren Kosten [116].
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153

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.2.4 Extraktion von Antioxidantien aus Kunststoff
3.2.4.1 Einführung
Die einzelnen Kunststoffe weisen unterschiedlich günstige physikalische und
chemische Eigenschaften auf. Sie haben in der Regel für sich allein nicht die
hinsichtlich Verarbeitung, Gebrauch und Stabilität benötigten Eigenschaften, sondern
sind oft spröde, lichtempfindlich, wärmeunbeständig, hydrolyseanfällig, gas- oder
wasserdampfdurchlässig. Durch Zugabe weiterer Stoffe, sog. Additiven und
Verarbeitungshilfsstoffen, werden die gewünschten eigenschaften eingestellt.
Typische Zusatz- und Hilfsstoffe sind: Weichmacher, Stabilisatoren, Gleitmittel,
Füllstoffe, Antistatika u.a..
Wärme, energiereiche Lichtstrahlung (UV), Luftsauerstoff sowie Feuchtigkeit
schädigen polymere Werkstoffe derart, daß ein Kettenabbau stattfindet, wodurch sich
die mechanischen Eigenschaften der Kunststoffe verschlechtern. Ein Zusatz von
Stabilisatoren (Antioxidantien und UV-Stabilisatoren) erhöht die Lebensdauer von
Kunststoffen.
Antioxidantien werden zum Schutz gegen thermische Alterungserscheinungen sowie
gegen Oxidationen eingesetzt. Beispiele für diese Additive sind sterisch gehinderte
Phenole, Thioether und Organophosphite [128].
3.2.4.2 Bestimmung von Antioxidantien
3.2.4.2.1 naßchemisches Verfahren
Die Antioxidatien werden aus Polyolefinen isoliert und mit HPLC-DAD oder
densitometrisch bestimmt.
Dazu werden 5 g zerkleinertes Kunststoffmaterial mit 75 ml Toluol versetzt unter
Rückflußkühlung erwärmt. Dabei löst sich das Polyolefin auf. Zur Fällung des
Polymer gibt man in die noch heiße Lösung ca. 150 ml Ethanol. Die abgekühlte
Lösung wird über ein Faltenfilter filtriert und der Niederschlag mit Ethanol
gewaschen. Das Filtrat wird am Rotationsverdampfer auf ca. 5 ml eingeengt, dabei
fällt noch etwas Polymer aus. Nach erneutem Filtrieren, Nachwaschen und Einengen
wird der Extrakt mit Ethanol auf 10 ml aufgefüllt und zur HPLC oder Densitometrie
eingesetzt.
3.2.4.2.2 SFE-Methode
3.2.4.2.2.1 Probeneinbringung in die SFE-Hülse
Der zerkleinerte Kunststoff wird direkt in eine Extraktionshülse eingewogen.
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154

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
3.2.4.2.2.2 Extraktion mit ISCO SFX 3560
Die Extraktion wurde bei folgenden Bedingungen durchgeführt:
Extraktor ISCO SFX 3560
• Extraktionsdruck CO2-Druck 440 bar
• Extraktionstemperatur 120 °C
• Restriktortemperatur 50 °C
• Flußrate (Restrikor) 1,5 ml/min
• Statische Extraktionszeit 5 min
• Dynamische Extraktionszeit 30 min
• Vorlage im Auffanggefäß 5 ml Acetonitril
• Temperatur der Vorlage 10 °C.
Die Bestimmung der Antioxidantien erfolgt direkt aus dem erhaltenen Extrakt mittels
HPLC-DAD.
3.2.4.2.3 Untersuchung von Proben mit bekannter Rezeptur
Da durch Dotierung von Kunststoffen im Labor die natürlichen Verhältnisse von
Proben praktisch nicht simulierbar sind, machen Wiederfindungsversuche meist
wenig Sinn. Zur Entwicklung und Validierung von Methoden sollte deshalb Probenmaterial
zur Verfügung stehen dessen Rezeptur bekannt ist. Antioxidantien werden
jedoch dazu eingesetzt, Oxidationen am Polymer zu verhindern, sie werden dabei
selbst oxidiert und damit verbraucht. Dies bedeutet, daß die in der Rezeptur
angegebene Menge an Antioxidantien im Endprodukt bereits nicht mehr vorhanden
zu sein braucht.
Zur Bewertung der SFE-Methode wurden 6 Proben mit bekanntem Gehalt an drei
Antioxidantien untersucht. Die Ergebnisse werden mit denen der bisher gebräuchlichen
naßchemischen Methode verglichen.
3.2.4.2.3.1 untersuchte Antioxidantien
In Tab. 3.2.4-1 sind die Antioxidantien aufgeführt, die in den zur Verfügung
stehenden Proben mit bekannter Rezeptur verwendet wurden.
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155

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.2.4-1: untersuchte Antioxidantien
Abkürzung Chemische Bezeichnung Summen-
A1
A2
A3
Tetrakis (methylen(3,5-di-tert.butyl-4-hydroxycinamat)-methan
n-Octadecyl-ß-(4’-hydroxy-3,5 ditert.-butylphenyl)-propionat
Tris-(2,4-di-tert.-butylphenyl)phosphit
formel
C73H100O1
Im folgenden werden die Abkürzungen A1, A2 und A3 verwendet.
3.2.4.2.3.2 Probenmaterial
2
156
Molekular Handels-
gewicht bezeichnung
1168 Irganox 1010
C35H56O4 530 Irganox 1076
C42H63O3P 647 Irgafos 168
In Tab. 3.2.5-2 sind die zur Verfügung gestandenen Proben und deren Rezepturangaben
bezüglich A1, A2 und A3 aufgeführt.
Tab. 3.2.4-2: untersuchtes Probenmaterial
Bezeichnung Abkürzung Gehalt an Antioxidanz (mg/100g)
nach Rezeptur
A1 A2 A3
Schale, klein Probe 1 36 - 72
Schale, groß Probe 2 4,5 - 14
Polybatch PAO 1490
Probe 3 65 - 180
Daplen Str. 150 RC Probe 4 16 18 35
Attane SC 4103 Probe 5 - 63 120
Amaco PP 100-GA02 Probe 6 30 - 112
3.2.4.2.3.3 Untersuchungsergebnisse
Die zur Verfügung gestandenen Proben 1-6 mit bekanntem Gehalt an Antioxidantien
wurden mittels SFE extrahiert und z.T. auch mit der naßchemischen Methode aufgearbeitet.
In der folgenden Tab. 3.2.3-3 werden die erzielten Untersuchungsergebnisse
aufgeführt.
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Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Tab. 3.2.4-3: Untersuchungsergebnisse
Probe Gehalt an A1 Gehalt an A2 Gehalt an A3
(mg/100g)
(mg/100g)
(mg/100g)
SFE naßchem. SFE naßchem. SFE naßchem.
Probe 1 12,7 12,4 - - 34,4 23
Probe 2 1,55 - - - 5,4 -
Probe 3 22,5 n.d. - n.d. 88,5 n.d.
Probe 4 7,85 n.d. 6,75 n.d. 12 n.d.
Probe 5 - n.d. 20,9 n.d. 59,5 n.d.
Probe 6 14,8 n.d. - n.d. 58,1 n.d.
Anmerkung: n.d.: nicht durchgeführt
3.2.4.2.3.4 Variation der SFE-Parameter
Folgende Parameter wurden variiert um zu überprüfen, ob die Extraktion von
Antioxidantien noch verbessert werden kann:
- höhere Flußrate,
- höhere Restriktortemperatur,
- höherer Extraktionsdruck.
Die restlichen Parameter der Extraktionsmethode wurden gleich belassen.
Die Untersuchungen wurden mit Probe Nr. 4 durchgeführt.
Die folgende Tab. 3.2.3-4 zeigt die Ergebnisse bei verschiedenen Extraktionsbedingungen.
Tab. 3.2.4-4: SFE-Ergebnisse bei Variation der Extraktionsbedingungen, Probe 4
ermittelter Antioxidantien-Gehalt
Extraktionsbedingungen
(mg/100g)
A1 A2
SFE-Methode (wie 3.2.5.3.2.2) 15,0 8,9
SFE, Fluß 2,5 ml/min 14,6 10,0
SFE, Restriktortemperatur 60 °C 15,1 11,1
SFE, Extraktionsdruck 550 bar
18,4 11,0
Die Bestimmung von A3 bereitete aufgrund von Zersetzungen Probleme. Eine
Quantifizierung wurde deshalb nicht vorgenommen.
Aus Tab. 3.2.4-4 wird ersichtlich daß durch Erhöhung des Extraktionsdruckes auf 550
bar die Extraktionsausbeuten von A1 am deutlichsten gesteigert werden können,
während A2 schon bei milderen Bedingungen gut extrahiert werden kann.
3.2.4.2.4 Fazit
Aus den erzielten Ergebnissen der oben beschriebenen, zur Orientierung dienenden
Untersuchungen, können folgende Folgerungen gezogen werden. Die SFE ist für die
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157

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Extraktion von Antioxidantien aus Kunststoffen prinzipiell gut geeignet. Die
Verwendung hoher Drucke begünstigt die Extraktion. Da mit dem Gerät der Fa. HP
Drucke bis maximal 350 bar erreichbar sind, scheint der Extraktor der Fa. ISCO für
diesen Aufgabenbereich geeigneter zu sein.
Bezüglich Extraktion und Probenzerkleinerung sind noch weitere Untersuchungen
erforderlich.
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Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
4. SCHLUßFOLGERUNGEN
4.1 BEWERTUNG DER SFE ALS EXTRAKTIONSVERFAHREN
Die bisherigen Untersuchungen und Ergebnisse haben gezeigt, daß die SFE ein
Extraktionsverfahren ist, das für verschiedene Aufgaben im Bereich der Lebensmittelüberwachung
erfolgreich eingesetzt werden kann.
Pestizidrückstandsanalytik:
Im Bereich der Pestizidrückstandsanalytik hat sich die SFE als eine sehr gute
Alternative zu vielen gängigen naßchemischen Extraktionsmethoden erwiesen.
Vorteilhaft bei der SFE sind neben dem geringeren Lösungsmittelverbrauch, der
geringere Arbeitsaufwand und der hohe Probendurchsatz. Dadurch sind SFE-
Methoden in der Regel wesentlich kostengünstiger als entsprechende naßchemische
Verfahren.
Mit der hier vorgestellten SFE-Multimethode werden bei einem geringen
Arbeitsaufwand Ergebnisse erzielt, die mit denen herkömmlicher Multimethoden
vergleichbar sind. Vorteilhaft bei der SFE-Methode ist vor allem die Tatsache, daß
die SFE-Extrakte in der Regel so rein sind, daß ein aufwendiges Clean-up entfällt.
Für zahlreiche Pestizide wurden Wiederfindungsversuche durchgeführt und bei
niedrigen Schwankungen gute Wiederfindungen erzielt.
Physikalische begründet sind die Limitationen der SFE bei der Extraktion polarer
Analyten. Hier ist die SFE nur bedingt einsetzbar. (z.B. zur Extraktion von sauren
oder basischen Verbindungen nach einer pH-Wert Einstellung). Diese Problematik
stellt sich allerdings auch bei vergleichbaren naßchemischen Verfahren.
Als besonders interessant hat sich die Kombination SFE-Extraktion und GC/MSD-
Bestimmung erwiesen. Bei bestimmten Applikationen (saure und basische Pestizide
und thermolabile Verbindungen wie N-Methylcarbamate und Organozinn-Pestizide)
bietet sich darüber hinaus die LC-MSD als Bestimmungsverfahren an.
Bedarfsgegenständeanalytik
Die durchgeführten Untersuchungen (z.B. PCP aus Holz, Di-Isopropyl-Naphthalin aus
Papier, Antioxidantien aus Kunststoff) haben gezeigt, daß die SFE prinzipiell vielfältig
im Bereich der Bedarfsgegenständeanalytik eingesetzt werden kann.
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159

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
4.2 BEWERTUNG DER VERWENDETEN EXTRAKTIONSGERÄTE
SFE-7680T der Fa. Hewlett-Packard:
Das Gerät ist vom Funktionsprinzip her variabel und bietet dem Anwender gute
Möglichkeiten, Extraktionsmethoden zu entwickeln und zu optimieren. Die Handhabung
ist sehr einfach und komfortabel. Druck- und Temperaturbereiche scheinen
ausreichend für Anwendungen in der Pestizidanalytik. Das Gerät bietet zudem einen
Clean-up-Schritt, der der Extraktion nachgeschaltet ist (fraktionierte Elution aus der
Festphasenfalle).
Das Geräte weist jedoch auch einige Mängel auf:
Bei den relativ häufig auftretenden Undichtigkeiten, wird die Sequenz abgebrochen,
Kühlung der Falle und Heizung der Extraktionskammer werden dabei allerdings nicht
abgeschaltet. Dadurch wird unnötig Kühl-CO2
verbraucht. Die nachfolgenden Proben
in der Sequenz verbleiben u.U. für längere Zeit bei Raumtemperatur und werden
dadurch meist unbrauchbar. Besser wäre es, wenn nach einer gewissen Zeit die
fehlerhafte, undichte Probe übersprungen und die Sequenz fortgeführt würde.
Die Kühlung ist vom Prinzip her umständlich (häufiger Wechsel der Gasflasche
nötig), laut und relativ teuer.
Das Volumen der Extraktionshülse ist auf 7 ml begrenzt, wodurch auch die
einsetzbare Probenmenge limitiert wird. Zwar reicht die Einwaage für viele Anwendungen
aus, bei einigen Anwendungen wäre jedoch eine größere Probenmenge
günstiger.
SFX 3560 der Fa. ISCO:
Bei dem Gerät der Fa. ISCO werden die Extrakte nicht an einer Festphasenfalle
aufgefangen sondern in eine Lösungsmittelvorlage eingeleitet.
Vorteilhaft gegenüber dem Gerät der Fa. HP ist die Tatsache, daß bei diesem Gerät
wesentlich höhere Drucke eingesetzt werden können. Höhere Drucke in Kombination
mit höheren Temperaturen sind z.B. im Bereich der Bedarfsgegenständeanalytik
erforderlich.
Darüber hinaus bietet sich die Möglichkeit durch eine zweite Förderpumpe dem
überkritischen Kohlendioxid andere Lösungsmittel in beliebigem Verhältnis
zuzumischen oder auch Extraktionen mit einem herkömmlichen Lösungsmittel
durchzuführen (Accelerated Solvent Extraktion).
Die Kapazität der Extraktionshülsen ist mit 10 ml größer als bei dem HP-Gerät, so
daß größere Probenmengen eingesetzt werden können.
Bei dem Gerät der Fa. ISCO traten insgesamt weniger Undichtigkeiten auf als beim
Gerät der Fa. HP. Dies ist darauf zurückzuführen, daß die Extraktionshülsen sich
während der Extraktion in einer unter Druck stehenden Extraktionskammer befinden
(Druckausgleich). Dafür sind mehrmals Probleme mechanischer Art aufgetreten, die
jedoch problemlos repariert werden konnten.
Nachteilig bei diesem Gerät ist, daß Unregelmäßigkeiten im Fluß zu Verlusten von
Analyten in der Falle durch Verflüchtigung führen können. Im Vergleich zu dem
Extraktor der Fa. HP ist die Bedienung etwas unbequemer.
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160

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
4.3 ALLGEMEINE ANALYTISCHE ERKENNTNISSE
Matrixeffekte
Bei der Optimierung der gaschromatographischen Bestimmung von Pestiziden wurde
festgestellt, daß Matrixbestandteile im Probenextrakt einen großen Einfluß auf die
Bestimmung verschiedener Substanzen haben. Diese Matrixbestandteile wirken bei
der Gaschromatographie „schützend“ auf Pestizide, indem sie aktive Stellen im
Injektionssystem besetzen. Dadurch werden Wechselwirkungen der Pestizide mit
den Oberflächen des Injektionssystems verringert. Eine Bestimmung von Pestiziden
unter Verwendung von Kalibrierlösungen in reinem Lösungsmittel führt für einige
Verbindungen zu falschen, überhöhten Werten. Um dies zu verhindern, ist die
Erstellung von „Eichungen auf Matrix“ unerläßlich.
Zerkleinerung (Homogenität)
Aufgrund der geringen Probenmenge die für SFE-Extraktionen eingesetzt wird, ist
eine gute Homogenität der zerkleinerten Proben erforderlich. Nur so können
Ergebnisse erzielt werden, die für die Gesamtprobe repräsentativ sind.
Bei Obst- und Gemüseproben ist dies durch eine Zerkleinerung in gefrorenem
Zustand möglich.
Im Bereich der Bedarfsgegenstände ist ebenfalls eine Feinzerkleinerung der Proben
erforderlich, die jedoch erfahrungsgemäß größere Schwierigkeiten bereitet.
4.4 AUSBLICK
Ein verstärkter Einsatz der SFE in Pestizidrückstandslaboratorien würde viele
Vorteile mit sich bringen. Mit Hilfe der SFE kann nicht nur der Probendurchsatz
erheblich gesteigert werden, sondern auch durch die Automatisierung der
Probenaufarbeitung die Vergleichbarkeit innerhalb der Laboratorien verbessert
werden.
Die Entwicklung von weiteren matrixbezogenen Multimethoden wäre vorteilhaft. Hierbei
werden Stoffe, die in den jeweiligen Matrizes zu erwarten sind, gezielt erfaßt und zudem
ggf. Eigenheiten der betreffenden Matrizes (z.B. pH-Wert, Wasser-, Fettgehalt)
berücksichtigt.
Für Pestizide, die sich zwar mittels SFE gut extrahieren lassen, jedoch Probleme bei
der Gaschromatographie bereiten, wäre der Einsatz der LC/MSD als Bestimmungsverfahren
sehr interessant (z.B. Uronsäurederivate).
Für die Erfassung von polareren Verbindungen ist der Einsatz der beschleunigten
Lösungsmittelextraktion (ASE), die ebenfalls ein automatisiertes Extraktionsverfahren
ist, denkbar.
Im Bereich der Bedarfsgegenständeanalytik wurden zwar bisher nur wenige
Applikationen entwickelt. Es ist zu erwarten, daß die SFE für viele weitere
Applikationen erfolgreich eingesetzt werden könnte. In diesem Zusammenhang ist zu
erwähnen, daß das Verfahren auch für die Analytik von migrierten Stoffen in
Lebensmitteln geeignet ist.
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161

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
Die Problematik der Zerkleinerung von verschiedenen Bedarfsgegenständen konnte,
mangels apparativer Ausstattung, nicht näher verfolgt werden. Ein ausreichender
Zerkleinerungsgrad der Proben ist sowohl unter dem Aspekt der Homogenität als
auch der Extrahierbarkeit als günstig zu bewerten.
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162

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
5. ABKÜRZUNGEN
2,4-D : 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-essigsäure
2,4-DB : 2,4-Dichlorphenoxybuttersäure
2,4-DP : 2,4-Dichlorphenoxypropionsäure
2,4,5-T : 2-(2,4,5-Trichlorphenoxy)-essigsäure
2,4,5-TP : 2,4,5-Trichlorphenoxypropionsäure
a : Wasseraktivität
w
AAS : Atom-Adsorptions-Spektroskopie
API : atmospheric pressure interface
BBA : Biologische Bundesanstalt
BBU : (1-(2-Benzimidazoyl)-3-n-Butylharnstoff)
BG : Bestimmungsgrenze
BMG : Bundesministerium für Gesundheit
CH : Cyclohexan
CID : collision induced dissociation
CO2 : Kohlendioxid
CVUA : Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt
DAD : Dioden-Array-Detektor
DCIP : Dichlorisopropanol
DDE : 1,1-Dichlor-2,2-bis(4-chlorphenyl)ethylen
DDT : 1,1,1-Trichlo-2,2-bis(4-chlorphenyl)ethan
DFG : Deutsche Forschungsgemeinschaft
DINP : Di-Isopropyl-Naphthalin
DMF : Dimethylformamid
EA : Ethylacetat
EC : electron capture
ECD : Elektroneneinfangdetektor
EDTA : Ethylen-diamin-tetra-essigsäure
EPC : electronic pressure control
FP : flammenphotometrisch
GC : Gaschromatographie
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163

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
GPC : Gelpermeationschromatographie
h : Stunde
HCB : Hexachlorbenzol
HEX : Hexan
HM : Höchstmenge
HMZ : Halbwertszeit
HP : Hewlett-Packard
HPLC : high pressure liquid chromatography
Hymx : Hydromatrix
ICP : induktiv gekoppeltes Plasma
ISTD : interner Standard
IUPAC : International Union of Pure and Applied Chemistry
IO : Isooctan
KAS : Kaltaufgabesystem
LC : liquid chromatography
LMBG : Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz
M : Molekulargewicht
MCPA : 2-(4-Chlor-2-methylphenoxy) essigsäure
MCPB : 2-(4-Chlor-2-methylphenoxy) buttersäure
MCPP : 2-(4-Chlor-2-methylphenoxy) propionsäure
MS : Massenspektrometrie
MSD : massenselektiver Detektor
m/z : Masse/Ladung
n.d. : nicht durchgeführt
NG : Nachweisgrenze
NMC : M-Methyl-Carbamate
NP : Stickstoff-Phosphor
ODS : Octadecylsilan
P : Druck
PAK : polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe
Pc : kritischer Druck
PCB : polychlorierte Biphenyle
PCP : Pentachlorphenol
PE : Polyethylen
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164

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
PFB : Pentafluorbenzyl
PFB-Br : Pentafluorbenzylbromid
Po/w : Verteilungskoeffizient n-Octanol/Wasser
pKb : Basenkonstante
ppm : parts per million
pKs : Säurekonstante
PVC : Polyvinylchlorid
RHmV : Rückstands-Höchstmengenverordnung
RP : reversed phase
RT : Raumtemperatur
SCAN : scanning modus, Aufzeichnung aller Massen
s : Sekunde
Sdp. : Siedepunkt
SFC : supercritical fluid chromatography
SFE : supercritical fluid extraction
SIM : selected ion monitoring
STB : (3-Butyl-2,4-Dioxo[1,2-a]-s-Triazinobenzimidazol)
T : Temperatur
t0,5 : Halbwertszeit
TBME : tert.-Butyl-Metyl-Ether
Tc : kritische Temperatur
TCE : 2,2,2-Trichlorethanol
TEPP : Tetraethylpyrophosphat
TIC : Totalionenstrom-Chromatogramm, total ion chromatogram
UV : Ultraviolett
VO : Verordnung
XSE : Accelerated Solvent Extraction
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165

Extraktion von Lebensmitteln und Bedarfsgegenständen mit Hilfe von überkritischem CO2
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