(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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* 항바이러스 활성
* 화합물 세포독성
HepG2-2.2.15 세포를 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 평판 배양하였다. 16 내지 24 시간 후에, 이중 실험으
로, HepG2-2.2.15 세포의 융합성 단층을 세척하고, 배지를 테스트 펩티드 - 10 ㎍/ml를 함유하는 완전 배지로
교체하였다. 라미부딘 (3TC)을 양성 대조군으로서 사용하고, 배지 단독을 음성 대조군 (바이러스 대조군)으로
서 세포에 첨가하였다. 3일 후에, 배지를 펩티드를 함유하는 새로운 배지로 교체하였다. 펩티드의 초기 투여
6일 후에, 세포 배양 상청액을 수집하여, 프로나아제 및 DNA 분해 효소로 처리한 다음에, 실시간 정량적 TaqMan
PCR 검정에 사용하였다. 증폭된 HBV DNA에 하이브리다이즈하는 소광된 (quenched) 형광 프로브 분자의 엑소핵
산 분해 (exonucleolytic degradation)로부터 발생된 형광 시그널 증가를 모니터링함으로써, PCR로 증폭된 HBV
DNA를 실시간으로 검출하였다. 각각의 PCR 증폭에 관해서는, 정제된 HBV DNA의 희석물을 사용하여, 표준곡선을
동시에 형성시켰다. 항바이러스 활성을 HBV DNA 레벨 (% 바이러스 대조군) 감소량으로부터 계산하였다. 그 다
음에, 신규 염료 흡수 (uptake) 검정을 이용하여 세포 생존율을 계산하였으며, 이는 독성 (% 세포 대조군)을 계
산하는데 사용된다.
HBV 실험 결과: 펩티드 1은 바이러스 대조 감염에 비해 HBV 복제를 71.8% 저해하였다. 펩티드 2는 바이러스 대
조 감염에 비해 HBV 복제를 62.3% 저해하였다. 펩티드 배합물 (0.95 몰 펩티드 1 및 1.05 몰 펩티드 2)은 바이
러스 대조 감염에 비해 HBV 복제를 86.7% 저해하였고, 펩티드 배합물 (0.50 몰 펩티드 1 및 1.50 몰 펩티드 2)
은 HBV 복제를 83.2% 저해하였다. 또한, 본 발명의 펩티드는 이들 인간 간 세포에서 세포 생존성에 어떠한 유의
적인 저해 효과도 나타내지 않았다.
실시예 3:
HCMV 실험 검정 시스템
MRC-5 세포 (인간 태아 폐 섬유아세포)를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection
(ATCC CCL-171; Rockville, Maryland))으로부터 입수하고, 10% 소 태아 혈청 (FBS), 0.1 mM 비필수 아미노산,
1.0 mM 피루브산나트륨, 2.0 mM L-글루타민, 100 units/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 이
글 (Eagle) BSS를 함유하는 이글 최소 필수 배지(EMEM)에서 성장시켰다. 세포를 주당 2회 1:2로 분할하였다.
HCMV 균주 AD169를 ATCC (ATCC VR-538)로부터 입수하였다. 2% FBS를 함유하는 MRC-5 성장 배지에서 최소 감염
다중도로 80% 융합성 MRC-5 세포를 감염시킴으로써, 바이러스 스톡을 준비하였다. 90% 내지 95%의 바이러스 세
포 변성 효과 (CPE)가 관찰될 때까지 (10 내지 13일), 단층을 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 그 다음에, 배지
를 세포로부터 수집하여, 세포 파편을 제거하도록 저 속도로 원심분리하고, 1 ml 용적으로 등분하여, 스톡 바이
러스로서 -80℃로 보관하였다.
MRC-5 세포를 MRC-5 성장 배지를 사용하여, 24 웰 플레이트에서 75,000 세포/웰로 시딩하였다. 플레이트를 37
℃, 5% CO2에서 하룻밤 동안 배양하였다. 그 다음날, 배지를 제거하고, HCMV의 100개의 플라크 형성 단위
(pfu)를 웰에 추가하였다. 바이러스를 37℃, 5% CO2에서 1 시간 동안 세포에 흡착시켰다. 펩티드를 0.5% 메틸
셀룰로스를 함유하는 애세이 배지에서 10 ㎍/ml로 희석하였다. 배양 시간 후에, 바이러스 접종원을 흡인하지
않고서, 각 펩티드 용액 1 ml를 웰에 가하였다. 플레이트를 플라크 형성을 위해 7 내지 10일간 배양하였다.
간시클로비르를 양성 대조군으로서 사용하였다. 배양물을 현미경으로 관찰하여, 독성을 확인하였다. 배지를
웰로부터 흡인하고, 세포를 고정시켜, 크리스탈 바이올렛을 함유하는 20% 메탄올을 사용하여 염색한 다음에, 현
미경 검사에 의해 플라크 계수를 행하였다. 세포독성 시험에 관해서는, MRC-5 세포를 성장 배지를 사용하여 96
웰 플레이트에서 2,500 세포/웰로 시딩하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 동안 배양하였다. 그 다
음날, 펩티드를 가해, 이중으로 테스트하였다. 6일간의 배양 시간 후에, 세포 생존율을 셀타이터 (CellTiter)
96 솔루션 (Solution) (Promega)를 사용하여 측정하였다. 플레이트를 37℃에서 추가로 4 시간 동안
배양하였다. 접착 플레이트 시일러를 리드 대신에 사용하고, 시일링된 플레이트를 수회 전도시켜, 가용성 포르
마잔 생성물을 혼합하고, 몰레큘러 디바이스 Vmax 플레이트 리더를 사용하여, 플레이트를 490/560 nm에서 분광
광도법으로 리딩하였다.
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공개특허 10-2010-0063715