manejo de insectos plagas05-10 - projeto pirada

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proteasa del tipo tripsina (Sirvas, 1999), podrían representar una fuente más económica de obtención de dichas enzimas, y su uso como suplemento en dietas microencapsuladas para post-larvas de camarón, fue considerado en el presente trabajo. Metodología Preparación de las dietas Se usó una dieta comercial (Fripak CD2) como base para la preparación de las dietas suplementadas. La composición de CD2 fue: proteína 52 %, lípidos 12 %, ácidos grasos insaturados 2 %, cenizas 20 %, fibra 1 %, y agua 13 %. Se trituraron 5 g de CD2, se agregó 50 mL de agua destilada, y se mezcló. Se agregó 6 g de hemoglobina, y se mezcló con un mezclador eléctrico. Se centrifugó a 2000 rpm por 5 minutos para extraer el sobrenadante conteniendo los constituyentes de la dieta, y se almacenó a 4ºC toda la noche. Microencapsulación Las dietas se micro-encapsularon modificando el método de Jones (1984) (Número de Patentes Británicas: 79437454 y 2103568). En un vaso de 50 mL se colocaron 25 mL de ciclohexano con lecitina al 2 % (P/V), y se agitó a 3000 rpm por 2 min. Por otra parte, en un vaso de 10 mL se mezclaron 2.5 mL de dieta con 21 % (P/V) de la correspondiente cepa bacteriana liofilizada (Sirvas, 1999), y se mezcló con una bagueta de vidrio. Luego se agregó la dieta al ciclohexano (en agitación), durante 1 minuto. Después de 2 a 3 minutos, se agregó una mezcla de 10 mL de ciclohexano con 0.2 mL de bicloruro succinílico, durante 1 minuto. Luego de aproximadamente 8 minutos, se detuvo el agitador, y se verificó la formación y el tamaño de las micro-cápsulas, bajo el microscopio. Se eliminó el solvente, y las microcápsulas se lavaron 2 veces en 50 mL de ciclohexano. Se realizó un último lavado en etanol, y las cápsulas se dejaron secar en una campana extractora por 1 hora. La composición de las dietas micro-encapsuladas fue la siguiente: Dieta CD2: Dieta artificial comercial Frippak CD2. Dieta D2: 5 g CD2 + 5 g Hb + 50 mL H O 2 Dieta XL1: 5 g CD2 + 6 g Hb + 50 mL H O + 1 % XL1 2 Dieta 635: 5 g CD2 + 6 g Hb + 50 mL H O + 1 % 635 2 Dieta 7: 5 g CD2 + 6 g Hb + 50 mL H O + 1 % 7 2 235
Donde: Hb = hemoglobina, XL1 = cepa E.coli XL1BluepUC19, 635 = cepa E. coli XL1p635 (conteniendo el gen para proteasa el tipo tripsina), y 7 = cepa E. coli XLp1 (conteniendo el gen para lipasa). La estabilidad de las micro-cápsulas en agua de mar a 28ºC, fue monitoreada, durante 5.5 h. Preparación de los bioensayos Se distribuyeron post-larvas de Fenneropenaeus indicus al estadio de PL1, en 15 recipientes conteniendo 5 L de agua de mar, a una densidad poblacional de 20 animales por recipiente. El agua fue pasada a través de filtros con tamaños decrecientes de 20 a 5 µm, y colada a través de una columna de fraccionamiento. Los bioensayos tuvieron una duración de 15 días. El agua tenía un pH de 8.0 – 8.3, una salinidad de 3,3 % y una temperatura de 28ºC (+/- 1ºC). Se emplearon piedras aireadoras para la oxigenar los recipientes y se realizaron cambios de agua cada 2 días (100 %). Las post-larvas fueron alimentadas con 3 porciones iguales a las 9:00, 13:00 y alas 18:00 h. La tasa de alimentación fue del 15 % de la biomasa. La cantidad de alimento requerido para los 3 recipientes réplica, fue rehidratada en 6 mL de agua destilada estéril, agregando 2 mL de esta solución a cada uno de los 3 recipientes, usando una jeringa de 2 mL. Se midió la longitud total (desde la punta del rostrum hasta la punta del telson) de 15 PLs al asar por cada tratamiento, cada 2 días. Se registró la supervivencia de los PLs cada 2 días. Resultados y Discusión Micro-cápsulas El tamaño promedio de las micro-cápsulas fue: Dieta CD2 = 41.1 µm, dieta D2 = 148.0 µm, dieta XL1 = 218.0 µm, dieta XL1p635 = 218.0 µm, y dieta XL1p7 = 218.0 µm. La figura 1 muestra las micro-cápsulas antes y durante la digestión por parte de la cepa XL1p635. El 53 % de las micro-cápsulas es digerido por la bacteria en agua de mar a 28ºC después de 2.5 h, y el 75 % después de 5.5 h. Desarrollo de las post-larvas Las post-larvas aceptaron las 5 dietas ofrecidas, aunque aquellas alimentadas con las micro-cápsulas más grandes (dietas D2, XL1, 635 y 7) tomaron más tiempo manejando su alimento antes de poder ingerirlo, que aquellas alimentadas con microcápsulas más pequeñas (dieta CD2). 236
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