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2.3.1 Caracterización bacteriana utilizando el gen ribosomal 16S En la década de 1980, como lo señala CLARRIDGE (2004), un nuevo estándar para identificación de bacterias comenzó a desarrollarse en los laboratorios de Woese y de otros investigadores, demostrando que las relaciones filogenéticas de las bacterias y de todas las formas de vida, se pueden determinar mediante la comparación de una parte estable del código genético. La parte del ADN más utilizado para propósitos taxonómicos en bacterias es el gen ARNr 16S, siendo indiscutible que la información contenida en este gen, ha jugado un papel fundamental en la microbiología. El gen ARNr 16S es una secuencia de aproximadamente 1.500 nucleótidos, contiene regiones altamente conservadas, que permiten establecer la relación taxonómica profunda entre familias, clases y filos, así como regiones variables que posibilitan discriminar entre especies dentro del mismo género (TORTORI, 2003). Estas características permitieron utilizar el gen como marcador filogenético y herramienta de identificación (MAC-FADDIN, 2003). El análisis del los genes de ARNr, con el uso de las bases de datos de referencia de alta calidad, proporciona un método eficaz para la identificación de microorganismos (HARMSEN y KARCH, 2004). 2.3.2 Operones ribosómicos. Todas las bacterias contienen genes codificantes para diferentes ARNs ribosomales. Estos genes que codifican los ARN ribosomales están organizados en operones. En eubacterias, cada operón ribosómico (rrn) incluye genes para los ARNr: 23S (rrl), 16S (rrs) y 5S (rrf), separados por regiones espaciadoras o intergénicas (IG) y contiene además genes para uno o más ARN de transferencia (BARRY et al., 1991). El producto de la transcripción del operón a partir de dos promotores P1 y P2, situados en la región anterior a rrs, es procesado por la enzima ARNasa III, la que mediante cortes en sitios específicos da origen a las tres clases de ARNr, el o los ARNt y las dos regiones IG (GÜRTLER y STANISICH, 1996). A continuación en la FIGURA 3, se representa esquemáticamente la organización de un operón ribosómico. 13
FIGURA 3 Representación esquemática de un operón ribosómico (rrn). A) Genes estructurales de los tres tipos de ARNr (rrs, rrl y rrf), los promotores P1 y P2, y las regiones intergénicas (IG). B) Amplificación del gen rrs (ADNr 16S). Se indica la posición de los iniciadores I1 (directo), I2 e I3 (reversos) utilizados para la amplificación (y posterior secuenciación) del gen completo (I1-I3; amplicón de 1.500pb, aproximadamente) o de un fragmento menor (11-I2; 500pb correspondientes al extremo 59 del gen) C) Visualización de ambos fragmentos por electroforesis en gel de agarosa. FUENTE: RODICIO y MENDOZA (2004). 14
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