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En la FIGURA 12, se muestran los cultivos puros obtenidos en todas las cepas de Bacillus, con lo cual se asegura que todos los individuos del mismo, tengan la misma composición genética, para obtener una efectiva identificación. Esta etapa es esencial para tener mayor seguridad en la identificación de los microorganismos. 4.2 Cuantificación del ADN genómico Las cepas puras se inocularon en medio CST, desde el cual se extrajo el ADN genómico. En el CUADRO 6 se observan las concentraciones de ADN genómico aislado y medido por espectrofotometría, midiendo la absorbancia a 260nm y utilizando la razón de absorbancias 260nm/280nm para verificar la calidad y pureza del ADN extraído. CUADRO 6 Cuantificación del ADN genómico extraído de Bacillus. Muestra Concentración (ng/µl) 260nm/280nm 1g 55,9 2,02 20 76,9 2,04 22 8 2,22 67 - - 87 59 1,75 92 98,1 1,7 95 - - 97 - - 33
De la medición obtenida en el equipo NANODROP 2000, se puede apreciar cuantificación de ADN genómico extraído en las muestras de las cepas 1g; 20; 22; 87 y 92, mientras que en las muestras 67; 95 y 97, el equipo no logró obtener una medición, lo cual pudo deberse al límite de detección que el equipo posee, el cual va de los 2- 15.000ng/µl. Debido a los anillos aromáticos que poseen las bases nitrogenadas del ADN, éste tiene por absorbancia máxima 260nm, mientras que en las proteínas la absorbancia es medida a 280nm, por ende la determinación de la pureza y calidad del ADN, se determinó utilizando la razón de ambas absorbancias (260nm/280nm), con valores que deben estar por sobre 1,7, como sucede con las cepas 1g; 20; 22; 87 y 92. 4.3 Amplificación del gen ARNr 16S por medio de PCR El gen 16S fue amplificado por PCR a partir de ADN obtenido desde células vegetativas de cepas del género Bacillus. Para ello se utilizaron partidores universales UN y EB descritos por BARRY et al., (1990). Producto de la amplificación se obtuvo un fragmento de 1.500 pb, correspondiente al tamaño del gen ANRr 16S. Varias investigaciones han revelado que la secuencia del gen ARNr 16S presenta regiones conservadas y entre ellas se encuentran regiones que son variables, que han sido útiles para la diferenciación de género y especie en bacterias (JENSEN et al., 1993). En la FIGURA 13 se observa la separación en el gel de agarosa de los productos de la amplificación del gen de ADNr 16S de cada cepa, los que en todos los casos, al ser comparados con el estándar de ADN, corresponden a los 1.500 pb aproximadamente, descritos en la literatura por BARRY et al., (1990). Este producto PCR se obtuvo en todas las cepas en estudio, aún en las que no se había obtenido cuantificación de concentración de ADN genómico en el equipo NANODROP 2000, dando cuenta que no es necesario grandes cantidades de ADN para realizar la amplificación. La especificidad de la reacción fue determinada al no observar productos de amplificación inespecífica en el control negativo. 34
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