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Los componentes de la mezcla de digestión fueron las siguientes: 2µl buffer 10X, 0,5µl de la enzima EcoRI, ADN purificado y agua en cantidades suficientes para completar 20µl. La digestión se realizó a 37ºC por 3h y los productos de éstas se observaron en un gel de agarosa. 3.3.8 Extracción de ADN plasmidial, para secuenciación. Una vez identificados los clones de E. coli conteniendo los plasmidios recombinantes, se procedió a realizar una extracción de ADN plasmidial para su posterior secuenciación, utilizando el kit “E.Z.N.A miniprep para plasmidio” de Omega Bio-TeK. Primeramente una colonia de E. coli recombinante se inoculó en 10-15mL de caldo LB/ampicilina (50ug/mL), se incubó a 37ºC con agitación orbital (150rpm) por 16h y se centrifugó a 5.000 x g por 10min a temperatura ambiente. Se descartó el sobrenadante y el sedimento bacteriano se resuspendió en 500µL de solución I RNasa con agitación en vortex. Es vital resuspender completamente el sedimento bacteriano para obtener un buen rendimiento de ADN. Luego las células en suspensión se trasfirieron a un tubo de 2mL y se agregaron 500µL de la solución II, mezclando por inversión del tubo hasta obtener un lisado claro y se incubó por 5min a temperatura ambiente. Enseguida, se agregaron 700µL de la solución III, mezclando rápidamente por inversión del tubo hasta obtener un lisado blanco. Luego, se centrifugó a temperatura ambiente a 10.000 x g por 10min y el sobrenadante se aspiró cuidadosamente, cuidando de no tomar el sedimento. El sobrenadante obtenido se agregó a una columna HiBind miniprep ensamblada en un tubo colector de 2mL y se centrifugó a 10.000 x g por 1min, se descartó el filtrado obtenido y se lavó el ADN unido a la columna con 500µL de buffer HB. Se centrifugó a 10.000 x g por 1min, eliminando el sobrenadante y agregando luego 750µL de buffer de lavado diluido previamente con etanol. Nuevamente se centrifugó a 10.000 x g por 1min y se descartó el sobrenadante. Posteriormente, la columna se centrifugó seca a 10.000 x g por 1min, este paso es crítico para remover el etanol de la columna. Finalmente la columna fue puesta en un tubo microcentrífuga limpio de 1,5mL y se agregaron 80µL de agua desionizada estéril para eluir el ADN unido a la matriz de la columna. Se centrifugó a 10.000 x g por 1min, obteniéndose así al alrededor del 75- 27
80% de ADN plasmidial recombinante unido a la matriz, el cual se cuantificó en NANODROP 2000 para su posterior secuenciación. FIGURA 9 Protocolo de extracción de ADN plasmidial. FUENTE: Elaboración propia. 3.3.9 Lectura y análisis de secuencias. El ADN plasmidial recombinante, conteniendo el gen 16S, fue enviado a secuenciar a la empresa Macrogen (http://www.macrogen.com). Las secuencias obtenidas se compararon con las secuencias de ADNr 16S que se encuentran en la base de datos del GenBank mediante el software BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) del NCBI (National center for Biotechnology Information). La alineación de las secuencias se realizó mediante el software Clustal W de la EBI (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). ClustalW es un programa para la alineación de secuencias de ADN o proteínas. Produce alineaciones de secuencias múltiples biológicamente significativas de secuencias divergentes. Calcula el mejor 28
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