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Para la ligación, se mezclaron en un tubo eppendorf las cantidades y volúmenes como se indica el CUADRO 5 en el siguiente orden: Agua estéril, buffer de ligación rápida 2X, plasmidio pGEMT- Easy, ADN ligasa T4 y el inserto. CUADRO 5 Componentes para la ligación del producto de PCR en el plasmidio pGEMT-Easy. Componentes Volumen (ul) Buffer rápida ligación 2x 5,0 Vector pGEM-T (50ng) 1,0 DNA ligasa T4 1,0 Inserto 2,5 Agua 2,5 FUENTE: Elaboración propia. La mezcla de ligación fue incubada a 4ºC durante toda una noche. 3.3.6.2 Transformación de E. coli competentes con el ADN plasmidial conteniendo el gen 16S de Bacillus. Este es un método realizado para incorporar ADN plasmidial recombinante en células de E. coli competentes. Primero se descongelaron las células competentes en hielo (almacenadas a -80ºC). Se transfirieron 100µL de células bacterianas a tubos de 1,5mL pre-enfriados en hielo y se añadió a las células bacterianas todo el volumen de la mezcla de ligación (vector/inserto) y se incubaron por 30min en hielo, agitando suavemente cada 5min. Posteriormente los tubos con la mezcla se incubaron en un baño de agua a 42ºC 1min 15s, este tiempo es crítico para la eficiencia de la transformación. Inmediatamente se incubó en hielo durante 2min. Después se trasfirió la mezcla de E. coli y ADN 25
plasmidial a un tubo de 15ml con 1mL de medio LB y se incubó a 37ºC en agitador orbital (200rpm) por 1h. Posteriormente, el cultivo de bacterias, se centrifugó a 3000rpm por 5min y se retiraron 900µL de sobrenadante y se resuspendieron las bacterias con 100µl de sobrante que quedó. Enseguida se sembró todo el volumen en placas de agar LB/ampicilina (50µg/mL), conteniendo además 20mg/mL de X-gal e IPTG 0,84M). Las placas sembradas fueron cultivadas a 37ºC durante 16h aproximadamente para la obtención de colonias recombinantes. 3.3.6.3 Extracción del ADN plasmidial por el Método de Ebullición. Para determinar la presencia de los plasmidios recombinantes en las colonias de E. coli, se procedió a realizar una extracción de ADN plasmidial por medio del método de ebullición para su posterior análisis. Para ello se sembró una colonia de E. coli recombinante (colonias blancas) en un tubo de 15mL conteniendo 4mL de medio LB fresco, con el antibiótico ampicilina y se incubó durante 16h a 37ºC. Posteriormente se colectaron 1,2mL de bacterias en un tubo microcentrífuga de 1,5mL y se centrifugó durante 3min a máxima velocidad. El sedimento bacteriano obtenido, se resuspendió en 110µL de solución STET (Solución STET que contiene: Sacarosa 8%; Tris-HCl 50mM pH 8,0; EDTA 50mM; Triton X-100 5%) y se mezcló en vortex por 2min. Enseguida la mezcla se incubó en baño maría por 1min y se centrifugó el lisado bacteriano a temperatura ambiente a 12.000 x g por 10min. El ADN plasmidial contenido en el sobrenadante se precipitó con 100µL de isopropanol (equivalente a la cantidad de sobrenadante que se obtiene) y luego se mezcló en vortex por algunos segundos, para luego ser centrifugado a temperatura ambiente a máxima velocidad durante 15min. El ADN precipitado se lavó con 0,5mL de etanol frío 70% (-20ºC) por la pared contraria al precipitado (lentamente) y se dejó reposar por 3min. Finalmente, el ADN plasmidial precipitado, se dejó secar a temperatura ambiente y se disolvió en 20µL de agua, agregando 0,7µL RNAasa a 2ng/mL. 3.3.7 Análisis de restricción de ADN plasmidial purificado. Para determinar la presencia del 16S insertado en los plasmidios purificados se realizó una digestión con la enzima de restricción EcoRI, la cual libera el fragmento de ADN insertado en el plasmidio. 26
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