Universidad Austral de Chile - Tesis Electrónicas UACh ...

En la FIGURA 15 se aprecian colonias de E. coli conteniendo al vector sin inserto
(colonias azules) y conteniendo el vector e inserto (colonias blancas). Esta coloración
es debido a que el inserto ubicado en el sitio de múltiple clonamiento del vector,
interrumpió la secuencia de parte del gen lacZ que codifica la proteína β-galactosidasa,
originando una enzima no funcional.
De esta manera, se seleccionan sólo las colonias que poseen el plasmidio e inserto,
que en este caso corresponden a aquellas colonias blancas, que no son capaces de
metabolizar el compuesto cromogénico X-Gal por parte de la enzima β-galactosidasa.
Este proceso de selección es denominado α-complementación (VOET y VOET, 2007).
Las tres colonias (clones) elegidos por placa, fueron cultivadas en medio líquido LB
suplementado con ampicilina para extraer el ADN plasmidial recombinante, el cual fue
digerido, en cada caso, con enzima de restricción EcoRI, para verificar la inserción de
los productos de PCR. Los productos de digestión fueron analizados en un gel de
agarosa al 1,5%, para finalmente seleccionar un clon plasmidial conteniendo el gen
16S por cepa de Bacillus.
En la FIGURA, 16 se puede apreciar los productos de la digestión de los clones
plasmidiales 92 y 20, donde se puede ver el plasmidio pGEM-T Easy sin inserto a las
altura de 3.000pb y los fragmentos de ADN correspondiente al inserto, que en este
caso son dos, ya que el gen 16S de Bacillus posee un sitio para la enzima EcoRI. Los
clones plasmidiales seleccionados fueron 923 y 201.
En las figuras del ANEXO 3 se aprecia el mismo análisis de restricción, donde los
clones plasmidiales seleccionados fueron 1g3, 221, 673, 871, 973 y 951.
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