E - Coordinación de la Investigación Científica - Universidad ...

Expresión del péptido cecropina A-1 de Drosophila melanogaster en células endoteliales de bovinola cual se le agregaron 200 g de lisozima(10 l de un stock 20 mg/ml); se mezcló yse incubó 5 min a temperatura ambientey 45 s a 100 °C. Después se centrifugó a14,000 rpm durante 10 min y posteriormentese eliminó la pastilla. Se agregaron10 µl de CTAB al 10% al sobrenadante,se mezcló bien y se centrifugó a14,000 rpm durante 5 min. Se eliminó elsobrenadante y se resuspendió la pastillaen 300 µl de NaCl 1.2 M. Se adicionaron600 µl de etanol absoluto (previamenteenfriado a -20°C) y se mezcló. Se centrifugóa 14,000 rpm, durante 10 min y seeliminó el sobrenadante. El DNA se lavócon etanol al 70% y se dejó secar. Finalmente,la pastilla se resuspendió en50 µl de TE (10 mM Tris-HCl y 1 mMEDTA). Posteriormente, la integridad delas construcciones de CecA-1 nativa ymutantes puntuales se verificó por secuenciaciónrealizada en el Cinvestav,Campus Gto.Subclonación del gen nativo y de lasmutantes de CecA-1 en pcDNA 3El plásmido pTrcHis2 con el gennativo y las mutantes de CecA-1, así comoel plásmido pcDNA 3 se sometierona doble digestión enzimática con BamHI y Hind III a 37°C por 2 h. El plásmidopcDNA 3 linearizado y los genes de CecA-1nativos y mutantes digeridos se incubaroncon la enzima ligasa a 37°C por2 h. Con esta mezcla de ligación setransformó la cepa de E. coli DH5α y seprocedió a recuperar el plásmido, comose describió en párrafos anteriores.Resultados y DiscusiónClonación del gen CecA-1 nativo en elplásmido pTrcHis2ALa construcción denominadapEBH1(4.650 Kpb) fue identificada porsecuenciación de una de las dos clonas(carriles 1 y 2 de la Figura 1). Estas clonasmostraron un retraso en la movilidadelectroforética en un gel de agarosa al0.8%, respecto al pTrcHis2A (4.4 Kpb),causada por la inserción del gen CecA-1de D. melanogaster (250 pb). La secuenciaobtenida de la construcción del carril1 correspondió en un 100% a la del gennativo CecA-1, sin intrones. El análisis dela secuencia de aa, empleando el programaDNAstar, correspondió a CecA-1de D. melanogaster (Cuadro 1).Generación de mutaciones puntuales enel gen de CecA-1 de D. melanogasterCon el objetivo de realizar tantoun análisis de restricción como de secuenciacióndel gen CecA-1, se seleccionarontres clonas independientes decada una de las cinco mutaciones generadas.El análisis de restricción se llevó acabo con Eco RI. Dado que el DNA ais-Tabla 1. Oligonucleótidos para generar las mutaciones puntuales en el gen CecA-1 de Drosophila melanogaster.Nativa 5’GGAAGCTGGGTGGCTGAAGAAAA3´ 5´TTTTCTTCAGCCACCCAGCTTCC3´W por D 5´GGAAGCTGGGGATCTGAAGAAAA3´ 5´TTTTCTTCAGATCCCCAGCTTCC3´W por F 5´GGAAGCTGGGTTCCTGAAGAAAA3´ 5´TTTTCTTCAGGAACCCAGCTTCC3´W por G 5´GGAAGCTGGGGGGCTGAAGAAAA3´ 5´TTTTCTTCAGCCCCCCAGCTTCC3´W por K 5´GGAAGCTGGGAAGCTGAAGAAAA3´ 5´TTTTCTTCAGCTTCCCAGCTTCC3´W por L 5´GGAAGCTGGGCTGCTGAAGAAAA3´ 5´TTTTCTTCAGCAGCCCAGCTTCC3´No. Especial 2008 Ciencia Nicolaita [19]