La phospholipase D, une voie de signalisation lipidique impliquée ...

III.2.8.1 Extraction de l’ARN total, à l’aide du Kit d’extraction Tri Reagent :.................................... 99
III.2.8.2 Transcription inverse (RT) :............................................................................................ 100
III.2.8.3 Réaction en chaîne de la polymérase (PCR) : ..................................................................... 100
III.2.8.4 Electrophorèse sur gel d’agarose : .................................................................................... 101
III.2.9 Immunofluorescence : ........................................................................................................... 102
III.2.9.1 La myogénine : ............................................................................................................. 102
III.2.9.2 Marquage de l’actine : ................................................................................................... 102
III.2.9.3 Immunofluorescence des PLD :....................................................................................... 103
III.2.10 Isolement des LDL : séparation par ultracentrifugation séquentielle :....................................... 103
III.2.11 Mesure de la perméabilité des cellules endothéliales grâce aux systèmes Transwell : ..................... 108
III.2.12 Test de prolifération des lymphocytes : .................................................................................. 109
III.2.13 Caractérisation des microdomaines chez les lymphocytes : ........................................................ 111
IV. RESULTATS ET DISCUSSION :............................................................................................. 113
IV.1 RESULTATS :........................................................................................................................... 113
IV.1.1 Rôle des céramides dans la différenciation des cellules L6 induite par l’AVP : ....Erreur ! Signet non
défini.
IV.1.1.1 Cinétique de la production des céramides au cours de la différenciation des L6C5 induite par
l’AVP :..................................................................................................................................... 113
IV.1.1.2 Rôle des céramides dans la différenciation des L6C5 :......................................................... 114
IV.1.1.2.1 Effet des céramides sur l’expression et l’accumulation nucléaire de la
myogénine :........................................................................................................................ 114
a) Effet des céramides sur l’expression de la myogénine : ....................................... 114
b) Effet des céramides sur l’accumulation nucléaire de la myogénine :........................ 116
IV.1.1.2.2 Effet des céramides sur la fusion des cellules musculaires induite par l’AVP :119
IV.1.1.2.3 Effet des céramides sur l’expression de la créatine kinase :............................. 120
IV.1.1.3 Implication de la PLD dans les effets des céramides sur la différenciation des cellules L6 induite
par l’AVP : ............................................................................................................................... 121
IV.1.1.3.1 Au niveau de l’activité :.................................................................................... 121
IV.1.1.3.2 Au niveau de l’expression des ARNm de PLD : .............................................. 122
IV1.1.4 Effets des céramides sur la formation PLD dépendante des fibres de stress au cours de la
stimulation myogénique :............................................................................................................. 124
IV.1.2 Rôle de la phospholipase D dans la perméabilité endothéliale : ............. Erreur ! Signet non défini.
IV.1.2.1 Caractérisation de la PLD dans la lignée HUV-EC-C : ...................................................... 127
IV.1.2.2 Localisation des phospholipases D1 et D2 dans les cellules endothéliales :............................. 128
IV.1.2.3 Effets des LDL natives et oxydées sur l’activité PLD :...................................................... 129
IV.1.2.4 Effets de différents agonistes de la PLD et des LDL modifiées ou non sur la réorganisation du
cytosquelette :............................................................................................................................ 131
IV.1.2.5 La réorganisation du cytosquelette induite par les LDL est-elle PLD dépendante ?................ 133
IV1.2.6 Effets des LDL natives ou oxydées sur la localisation des PLD endogènes :........................... 134
IV1.2.7 Effets des LDL natives et oxydées sur la perméabilité des cellules endothéliales :.................... 136
IV1.2.8 Passage des LDL marquées à travers la monocouche de cellules endothéliales......................... 138
IV1.2.9 Recherche d’une éventuelle modification des LDL dans nos conditions expérimentales : 139
IV1.2.9.1 Pureté des préparations et mobilité électrophorétique des LDL natives et
oxydées : ............................................................................................................................ 139
IV1.2.9.2 Quantification de l’oxydation de la partie lipidique des LDL : dosage des
TBARS : ............................................................................................................................ 140
IV1.2.9.3 Dosage de la vitamine E : .................................................................................. 141
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