La phospholipase D, une voie de signalisation lipidique impliquée ...

N° d’ordre 2006-ISAL-0003 année 2006
THESE
Présentée
DEVANT L’INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON
Pour obtenir
LE GRADE DE DOCTEUR
Formation doctorale: Biochimie
Ecole Doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé
Par
Saida MEBAREK AZZAM
La phospholipase D, une voie de signalisation lipidique
impliquée dans de multiples fonctions cellulaires :
morphologie, prolifération, différenciation.
Soutenue le 16 janvier 2006
Jury de thèse : M. le Pr. M. LAGARDE (Président)
M. le Dr. G. MOUCHIROUD (rapporteur)
M. le Dr. G. NEMOZ (Directeur de thèse)
Mme. le Dr. A. F. PRIGENT
M. le Dr. A. ZACHOWSKI (rapporteur)
Cette thèse a été préparée au Laboratoire de Physiopathologie des Lipides et des Membranes de l’INSA
(INSERM UMR585)

Novembre 2003
INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON
Directeur : STORCK A.
Professeurs :
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5

RESUME
La phospholipase D (PLD), qui hydrolyse la phosphatidylcholine des membranes
cellulaires et donne naissance à un médiateur phospholipidique, l’acide phosphatidique, joue
un rôle central dans diverses fonctions cellulaires. Nous avons choisi d’étudier son
implication dans plusieurs fonctions présentant un intérêt particulier en physiopathologie : la
différenciation myogénique des myoblastes squelettiques, l’établissement des jonctions
intercellulaires qui commandent la perméabilité de l’endothélium, et la prolifération des
lymphocytes.
Nous avons tout d’abord mis en évidence l’implication des céramides dans la
différenciation des myoblastes de rat L6. Ces cellules sont capables de se différencier in vitro
en myotubes polynucléés exprimant divers marqueurs du tissu musculaire, en présence de
vasopressine. Cette hormone induit une régulation biphasique des taux cellulaires de
céramides, avec une décroissance dans les premières heures, suivie d’une augmentation
jusqu’au 8 e jour, attribuable à l’activation de la voie de biosynthèse de novo. Les céramides
ainsi formés ont un effet régulateur négatif sur la différenciation, au moins en partie à cause
du contrôle négatif qu’ils exercent sur l’expression de l’isoforme PLD1, dont nous avions
démontré le caractère indispensable à la myogénèse. Nous avons de plus observé que les
céramides inhibent la réorganisation PLD1-dépendante du cytosquelette d’actine, une des
premières étapes du processus myogénique. La régulation de la PLD par les céramides semble
constituer une cible pharmacologique intéressante pour des actions visant à favoriser la
régénération musculaire dans diverses situations pathologiques.
Par ailleurs, nous avons montré que la PLD intervient dans le contrôle de la
perméabilité paracellulaire d’une monocouche de cellules endothéliales HUV-EC-C aux
macromolécules, grâce à ses effets sur le cytosquelette d’actine. Les lipoprotéines de faible
densité (LDL), natives ou oxydées, mises en contact avec la monocouche, sont capables de
stimuler l’activité PLD des cellules et la perméabilité aux macromolécules. Elles provoquent
en parallèle un remodelage PLD-dépendant du cytosquelette avec la formation de fibres de
stress, et un changement de morphologie cellulaire. Les LDL stimulent donc leur propre
passage transendothélial, via leur capacité à réguler la PLD. Un défaut de régulation de la
PLD pourrait contribuer à une accumulation subendothéliale anormale des LDL, et, étant
donné le rôle proathérogène de ces molécules, à l’accélération du processus athéroscléreux.
Des travaux antérieurs avaient établi la présence de l’isoforme PLD1 au niveau des
radeaux lipidiques membranaires de lymphocytes périphériques humains, et suggéré un lien
entre la délocalisation de l’enzyme, son activation, et une inhibition de la réponse aux
mitogènes. Nous avons confirmé que la perturbation des radeaux, par des agents agissant
spécifiquement sur les lipides de ce compartiment, est associée à une activation de la PLD et à
une inhibition de la prolifération lymphocytaire. Par des expériences de surexpression, nous
avons montré que l’isoforme PLD1, mais pas l’isoforme PLD2, est spécifiquement
responsable d’un contrôle négatif de l’activation lymphocytaire. La mise en évidence de la
régulation de PLD1 par inclusion / exclusion du compartiment radeaux lipidiques, et la
démonstration de son implication dans le contrôle de la réponse lymphocytaire, devraient
permettre de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans diverses
pathologies de l’immunité.
6

AVANT-PROPOS
Le travail présenté dans ce mémoire a fait l’objet de publications parues et soumises. Ces
résultats ont également été présentés par communications affichées lors de congrès
scientifiques. En voici les références :
Publications scientifiques :
Komati H, Naro F, Mebarek S, De Arcangelis V, Adamo S, Lagarde M, Prigent AF and
Nemoz G (2005) Phospholipase D is involved in myogenic differentiation through
remodeling of actin cytoskeleton. Mol Biol Cell 16:1232-44.
Diaz O*, Mebarek S*, Benzaria A, Dubois M, Lagarde M, Nemoz G and Prigent AF
(2005) Disruption of lipid rafts stimulates phospholipase D activity in human
lymphocytes: implication in the regulation of immune function; Journal of Immunology
sous presse.
* Ces deux auteurs ont contribué également à ce travail.
Mebarek S, Komati H, Naro F, Zeiller C., Alvisi M., Lagarde M, Prigent AF and Nemoz
G (2005) Inhibition of de novo ceramide synthesis up-regulates phospholipase D and
enhances myogenic differentiation of L6 cells; soumis à Exp Cell Res.
Communications affichées:
20-25 Septembre 2005 :
Inhibition of lymphocyte response through activation of phospholipase D by raft
disrupting agents.
Mebarek S, Diaz O, Benzaria A, Dubois M, Lagarde M, Nemoz G and Prigent AF: 46th
International Conference on the Bioscience of Lipids (ICBL), Ajaccio, Corsica
Juin 2004 :
Rôle de la phospholipase D dans la perméabilité endothéliale.
Mebarek S, Komati H, Zeiller C, Lagarde M, Nemoz G, Prigent AF : 1er congrès de la
Nouvelle Société Française d’Athérosclérose (NSFA), Biarritz.
Avril 2004 :
Rôle de la phospholipase D dans le contrôle de la perméabilité endothéliale.
Mebarek S, Komati H, Zeiller C, Lagarde M, Nemoz G, Prigent AF : 21ème congrès du
Groupe de Réflexion sur la Recherche Cardiovasculaire (GRRC) à La Baule.
7

Avril 2004 :
Rôle de la phospholipase D dans le contrôle de la perméabilité endothéliale.
Mebarek S, Komati H, Zeiller C, Lagarde M, Nemoz G, Prigent AF : 8 ème journée
scientifique à Lyon 1 : Ecole Doctorale Interdisciplinaire Science Santé (EDISS).
Octobre 2004 :
Rôle de la phospholipase D dans la perméabilité endothéliale.
Mebarek S, Komati H, Zeiller C, Lagarde M, Nemoz G, Prigent AF: 15ème Rencontres
Régionales de la Recherche (RRR) à Lyon.
Septembre 2004 :
PLD et contrôle de la perméabilité endothéliale aux LDL.
Mebarek S, Komati H, Zeiller C, Lagarde M, Nemoz G, Prigent AF. 5ème journée
scientifique : Institut Multidisciplinaire de Biochimie des Lipides (IMBL).
Octobre 2003 :
Rôle de la phospholipase D et de son produit, l’acide phosphatidique dans la
différenciation du muscle squelettique.
Komati H, Naro F, Mebarek S, Lagarde M, Prigent AF, Nemoz G : 14 ème Rencontres
Régionales de la Recherche (RRR) à saint-Etienne.
8

TABLE DES MATIERES
TABLE DES FIGURES ET TABLEAUX ........................................................................................ 13
ABREVIATIONS ................................................................................................................................ 16
I. INTRODUCTION : ......................................................................................................................... 18
II.RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES : ............................................................................................ 21
II.1 PHOSPHOLIPASE D : ...................................................................................................................... 21
II.1.1 : Caractéristiques enzymatiques des phospholipases D ; identification et clonage des gènes de PLD
eucaryotes :...................................................................................................................................... 22
II.1.2 Structure primaire des PLD : .................................................................................................... 25
II.1.3 Régulation des PLD : .............................................................................................................. 28
II.1.3.1 Régulation par des protéines kinases : ................................................................................. 28
II.1.3.1.1) Les protéines kinase C : ...................................................................................... 29
II.1.3.1.2) Les tyrosines kinases :......................................................................................... 30
II. 1.3.2 Régulation par des petites protéines G monomériques :.......................................................... 30
II.1.3.2.1 Le facteur d’ADP ribosylation (ARF) :................................................................ 31
II.1.3.2.2 Les protéines G de la famille Rho :...................................................................... 32
II.1.3.3 Régulation de la PLD par le PIP2 (phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate) : ............................ 33
II.1.3.4 Régulation de la PLD par le calcium :................................................................................. 33
II.1.3.5 Régulation de la PLD par les lipoprotéines de basse densité (LDL) : ....................................... 34
II.1.3.6 Régulation par des facteurs inhibiteurs de la PLD: ............................................................... 36
II.1.3.6.1 Les protéines du cytosquelette : ........................................................................... 36
II.1.3.6.2 Les céramides :..................................................................................................... 36
a) Voies de synthèse des céramides : .......................................................................... 36
b) Effet des céramides sur la PLD : ................................................................................. 39
II.1.4 Localisation des PLD : ............................................................................................................ 40
II.1.4.1 Localisation tissulaire :..................................................................................................... 40
II.1.4.2 Localisation subcellulaire : ................................................................................................ 41
II.1.5 Rôle physiologique de la PLD et de ses produits :......................................................................... 42
II.1.5.1 Rôle de la PLD dans la différenciation cellulaire : ................................................................ 42
II.1.5.2 La PLD dans la régulation de la sécrétion et du trafic vésiculaire : ......................................... 44
II.1.5.3 Rôle de la PLD dans le remaniement du cytosquelette : ......................................................... 45
II.1.5.4 Rôle de la PLD dans la prolifération, la survie et la mort cellulaires : ...................................... 46
II.2 LA MYOGENESE :...................................................................................................................... 48
II.2.1 Les principales étapes de la différenciation des cellules musculaires : .............................................. 48
II.2.1.1 Durant le développement embryonnaire : ............................................................................. 48
II.2.1.2 La différenciation : de la prolifération à la fusion des myoblastes :.......................................... 49
II.2.1.3 La maturation : ............................................................................................................... 52
II.2.2 Les facteurs régulateurs de la myogénèse :................................................................................... 54
II.2.2.1 Les protéines de type hélice-boucle-hélice basique. (bHLH) : ................................................... 54
II.2.2.2 Les facteurs de transcription à boîte MADS : ...................................................................... 56
II.2.2.2.1 Facteurs de transcription SRF : ............................................................................ 56
II.2.2.2.2 Facteurs de transcription MEF2 : ......................................................................... 57
9

II.2.3 Hétérogénéité myoblastique : existence de plusieurs lignées myogéniques :........................................ 58
II.2.4 Les modulateurs de la différenciation myogénique :...................................................................... 59
II.3 L’ENDOTHELIUM : ................................................................................................................... 62
II.3.1 Structure de la paroi vasculaire : (figure 12) ................................................................................ 62
II.3.1.1 L’intima et l’endothélium vasculaire : ................................................................................. 62
II.3.1.2 La média : ....................................................................................................................... 62
II.3.1.3 L’ adventice :................................................................................................................... 63
II.3.2 Endothélium : origine, structure et rôle :..................................................................................... 63
II.3.2.1 Origine et structure :......................................................................................................... 63
II.3.2.2 Rôle de l’endothélium :...................................................................................................... 64
II.3.3. Rôle de barrière et perméabilité sélective :.................................................................................. 64
II.3.3.1 La voie paracelluaire et les jonctions intercellulaires : ........................................................... 65
II.3.3.1.1 Les jonctions serrées, étanches :........................................................................... 66
II.3.3.1.2 Les jonctions adhérentes : .................................................................................... 70
II.3.3.2 Régulation de la perméabilité via la réorganisation du cytosquelette : ...................................... 72
II.3.3.3 La voie transcellulaire :..................................................................................................... 74
II.3.3.3.1 structure des cavéoles :......................................................................................... 74
II.3.3.3.2 rôles des cavéoles :............................................................................................... 76
II.3.4 Dysfonctionnement endothélial : ............................................................................................... 77
II.4 L’ACTIVATION LYMPHOCYTAIRE : ROLE DE LA PLD : ....................................................................... 79
II.4.1 Généralités : Le système immunitaire de l’homme est composé de milliards de lymphocytes : ............... 79
II.4.2 Activation lymphocytaire :........................................................................................................ 82
II.4.2.1 Transmission du signal : .................................................................................................... 82
II.4.2.2 PLD et activation lymphocytaire :...................................................................................... 85
III. MATERIELS ET METHODES.................................................................................................. 87
III-1 MATERIELS :............................................................................................................................... 87
III-1-1 Appareils :............................................................................................................................ 87
III-1-2 Réactifs :.............................................................................................................................. 88
III.2 METHODES :................................................................................................................................ 89
III.2.1 Culture et traitements des cellules :........................................................................................... 89
III.2.1.1 Culture des cellules L6C5 : ............................................................................................... 89
III.2.1.2 Culture des cellules HUV-EC-C :...................................................................................... 89
III.2.1.3 Culture des PBMC et des Jurkat :..................................................................................... 90
III.2.2 Transfections transitoires :...................................................................................................... 90
III.2.3 Dosage de l’activité de la PLD : .............................................................................................. 91
III.2.4 Dosage protéique des échantillons, selon la méthode de Bradford : ................................................ 92
III.2.5 Analyse par Western blotting : ................................................................................................ 92
III.2.5.1 Préparation des échantillons :........................................................................................... 92
III.2.5.2 Electrophorèse et transfert : ............................................................................................. 93
III.2.5.3 Conditions spécifiques à chaque protéine détectée : .............................................................. 94
III.2.6 Dosage de l’activité créatine kinase dans les cellules L6C5 :......................................................... 95
III.2.7 Analyse des céramides :........................................................................................................... 96
III.2.7.1 Extraction des lipides cellulaires : ..................................................................................... 96
III.2.7.2 Dosage des céramides et des DAG : ................................................................................... 97
III.2.7.3 Quantification des produits phosphorylés : ......................................................................... 98
III.2.8 RT-PCR : ............................................................................................................................. 99
10

III.2.8.1 Extraction de l’ARN total, à l’aide du Kit d’extraction Tri Reagent :.................................... 99
III.2.8.2 Transcription inverse (RT) :............................................................................................ 100
III.2.8.3 Réaction en chaîne de la polymérase (PCR) : ..................................................................... 100
III.2.8.4 Electrophorèse sur gel d’agarose : .................................................................................... 101
III.2.9 Immunofluorescence : ........................................................................................................... 102
III.2.9.1 La myogénine : ............................................................................................................. 102
III.2.9.2 Marquage de l’actine : ................................................................................................... 102
III.2.9.3 Immunofluorescence des PLD :....................................................................................... 103
III.2.10 Isolement des LDL : séparation par ultracentrifugation séquentielle :....................................... 103
III.2.11 Mesure de la perméabilité des cellules endothéliales grâce aux systèmes Transwell : ..................... 108
III.2.12 Test de prolifération des lymphocytes : .................................................................................. 109
III.2.13 Caractérisation des microdomaines chez les lymphocytes : ........................................................ 111
IV. RESULTATS ET DISCUSSION :............................................................................................. 113
IV.1 RESULTATS :........................................................................................................................... 113
IV.1.1 Rôle des céramides dans la différenciation des cellules L6 induite par l’AVP : ....Erreur ! Signet non
défini.
IV.1.1.1 Cinétique de la production des céramides au cours de la différenciation des L6C5 induite par
l’AVP :..................................................................................................................................... 113
IV.1.1.2 Rôle des céramides dans la différenciation des L6C5 :......................................................... 114
IV.1.1.2.1 Effet des céramides sur l’expression et l’accumulation nucléaire de la
myogénine :........................................................................................................................ 114
a) Effet des céramides sur l’expression de la myogénine : ....................................... 114
b) Effet des céramides sur l’accumulation nucléaire de la myogénine :........................ 116
IV.1.1.2.2 Effet des céramides sur la fusion des cellules musculaires induite par l’AVP :119
IV.1.1.2.3 Effet des céramides sur l’expression de la créatine kinase :............................. 120
IV.1.1.3 Implication de la PLD dans les effets des céramides sur la différenciation des cellules L6 induite
par l’AVP : ............................................................................................................................... 121
IV.1.1.3.1 Au niveau de l’activité :.................................................................................... 121
IV.1.1.3.2 Au niveau de l’expression des ARNm de PLD : .............................................. 122
IV1.1.4 Effets des céramides sur la formation PLD dépendante des fibres de stress au cours de la
stimulation myogénique :............................................................................................................. 124
IV.1.2 Rôle de la phospholipase D dans la perméabilité endothéliale : ............. Erreur ! Signet non défini.
IV.1.2.1 Caractérisation de la PLD dans la lignée HUV-EC-C : ...................................................... 127
IV.1.2.2 Localisation des phospholipases D1 et D2 dans les cellules endothéliales :............................. 128
IV.1.2.3 Effets des LDL natives et oxydées sur l’activité PLD :...................................................... 129
IV.1.2.4 Effets de différents agonistes de la PLD et des LDL modifiées ou non sur la réorganisation du
cytosquelette :............................................................................................................................ 131
IV.1.2.5 La réorganisation du cytosquelette induite par les LDL est-elle PLD dépendante ?................ 133
IV1.2.6 Effets des LDL natives ou oxydées sur la localisation des PLD endogènes :........................... 134
IV1.2.7 Effets des LDL natives et oxydées sur la perméabilité des cellules endothéliales :.................... 136
IV1.2.8 Passage des LDL marquées à travers la monocouche de cellules endothéliales......................... 138
IV1.2.9 Recherche d’une éventuelle modification des LDL dans nos conditions expérimentales : 139
IV1.2.9.1 Pureté des préparations et mobilité électrophorétique des LDL natives et
oxydées : ............................................................................................................................ 139
IV1.2.9.2 Quantification de l’oxydation de la partie lipidique des LDL : dosage des
TBARS : ............................................................................................................................ 140
IV1.2.9.3 Dosage de la vitamine E : .................................................................................. 141
11

IV1.2.9.4 Effet du plasma sur la réorganisation du cytosquelette : ................................... 142
IV.1.3 Rôle de la phospholipase D dans la prolifération lymphocytaire : ................................................ 144
IV1.3.1 Effet de la désorganisation des radeaux sur la phospholipase D et sur la prolifération des
lymphocytes :............................................................................................................................. 144
IV1.3.1.1 Effet de la désorganisation des radeaux sur l’activité de la phospholipase D : . 144
IV1.3.1.2 Effet de la SMase sur la localisation de la PLD1 : ............................................ 146
IV1.3.1.3 Effet de la désorganisation des radeaux sur la réponse lympho-proliférative : . 147
IV1.3.2 Rôle de la phospholipase D dans la prolifération des lymphocytes T de la lignée Jurkat : 148
IV1.3.2.1 Caractérisation de la phospholipase D dans les cellules Jurkat :........................................ 148
IV1.3.2.2 Effet de la surexpression de la PLD1 sur la prolifération spontanée des cellules Jurkat : .. 149
a) Vérification de l’efficacité de la transfection :................................................................................ 149
b) Effet de la surexpression transitoire de la PLD1 sur la prolifération des Jurkat :........................... 151
IV1.3.2.3 Effet de la surexpression de la PLD1 sur l’expression de l’interleukine-2 :...... 152
IV1.3.2.4 Localisation, par rapport aux microdomaines, de la PLD1 surexprimée dans les
Jurkat :................................................................................................................................ 154
a) Caractérisation des microdomaines : .................................................................... 154
b) Localisation de la protéine PLD2 endogène hors des microdomaines :.................... 155
c) Localisation de la PLD1 surexprimée hors des microdomaines :.............................. 156
IV.2 DISCUSSION :............................................................................................................................. 160
V. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES :................................................................................... 169
VI REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES................................................................................... 174
12

TABLE DES FIGURES ET TABLEAUX
Figure 1 : Caractéristiques des différentes formes de PLD PIP2 sensibles.............. 22
Figure 2 : Schéma de réaction de la PLD................................................................. 23
Figure 3 : Domaines conservés CRI à CRIV dans différentes protéines apparentées à
la PLD humaine (hPLD1a, hPLD2) Cockcroft, 2001.......................................... 23
Figure 4 : Domaines principaux de PLD1 et PLD2 (Rizzo et Romero, 2002). .......... 25
Figure 5 : Structure d’une LDL, d’après Cooper et al., 2000..................................... 35
Figure 6 : Métabolisme des sphingolipides d’après Hannun et Luberto, 2000.......... 37
Figure 7 : Représentation schématique d’un somite au stade épithélial (A) et à un
stade plus avancé (B)........................................................................................ 49
Figure 8 : Les principales étapes de la différenciation morphologique des cellules
musculaires. ...................................................................................................... 51
Figure 9 : Structure du muscle squelettique : schéma représentant les niveaux
d’organisation du muscle squelettique depuis l’ensemble du muscle dans
l’organisme jusqu’au sarcomère individuel. ....................................................... 53
Figure 10 : structure des protéines de type hélice-boucle-hélice basique. .............. 54
Figure 11 : Séquence d’expression des facteurs myogéniques au cours de la
myogénèse........................................................................................................ 56
Figure 12 : Structure de base d'un vaisseau sanguin............................................... 62
Figure 13 : cellules endothéliales de la veine du cordon ombilical à environ 75% de
confluence. ........................................................................................................ 63
Figure 14 : Deux voies de transport sont à la base de la fonction de barrière
endothéliale : les voies transcellulaire et paracellulaire (Tsukita et al., 2001). .. 65
Figure 15 : Schéma des différents complexes moléculaires situés
au niveau des jonctions interendothéliales ........................................................ 66
Figure 16 : Représentation de deux cellules unies solidement par les jonctions
serrées. ............................................................................................................. 67
Figure 17 : Mode d’action des protéines Rho/Rac/cdc42 dans la réorganisation du
cytosquelette (Takai et al., 2001). ..................................................................... 73
Figure 18 : Structure de la cellule endothéliale......................................................... 74
Figure 19 : représentation des différents constituants des cavéoles (Razani et al.,
2002). ................................................................................................................ 75
Figure 20 : Formation de la plaque athéroscléreuse : .............................................. 78
Figure 21 : Structure du récepteur des cellules T (TCR) : ........................................ 80
Figure 22 : Lymphocytes, vus en microscopie électronique à balayage................... 81
Figure 23 : Résumé schématique des signaux d’activation intracellulaire des
lymphocytes T CD4+ (Goldsby et al., 2000)...................................................... 84
Figure 24 : quantification des céramides et des DAG séparés par chromatographie
sur couche mince après révélation au Phosphorimager Storm. ........................ 99
Figure 25 : schéma représentatif des différents composants du plasma humain après
électrophorèse horizontale sur gel d’agarose...................................................105
Figure 26 : réaction du MDA avec le TBA pour former un chromophore de couleur
rose. .................................................................................................................106
Figure 27 : Profil HPLC des tocophérols présents dans les LDL natives.................108
Figure 28 : Vérification de la monocouche de cellules endothéliales.......................108
13

Figure 29 : schéma d’un système Transwell et réaction colorimétrique de la
peroxydase.......................................................................................................109
Figure 30 : Test de prolifération :.............................................................................110
Figure 31: protocole simplifié de préparation des microdomaines membranaires. ..111
Figure 32 : Variation du taux de céramides en fonction de la durée de traitement par
l’AVP.................................................................................................................114
Figure 33 : Effet des céramides sur l’expression de la myogénine..........................115
Figure 34 : Effet des céramides sur l’accumulation nucléaire de la myogénine induite
par l’AVP. .........................................................................................................116
Figure 35 : effet de la surexpression des constructions pCMV5-GFP-RE et pCMV5-
GFP-SMase-RE sur l’accumulation nucléaire de la myogénine induite par l’AVP
10 -7 M. ...............................................................................................................118
Figure 36 : Effet de la fumonisine B1 sur la fusion des cellules L6 traitées par l’AVP :
.........................................................................................................................119
Figure 37 : Effet des céramides sur l’activité d’un marqueur de la différenciation
terminale : la créatine kinase............................................................................120
Figure 38 : Effet des céramides sur l’activité de la PLD. .........................................122
Figure 39 : Effet des céramides sur l’expression des PLD évaluée par RT-PCR : ..123
Figure 40 : Effet du C6- céramide sur la formation des fibres de stress dans les
cellules L6. .......................................................................................................126
Figure 41 : Expériences de RT-PCR : l’utilisation d’amorces spécifiques de PLD1 et
PLD2 permet de détecter la présence de transcrits PLD1 et PLD2 dans les
cellules endothéliales. ......................................................................................127
Figure 42 : Détection de PLD1 et PLD2 chez les cellules endothéliales. ................128
Figure 43 : Mise en évidence de la localisation subcellulaire de PLD1 et PLD2 par
immunofluorescence. .......................................................................................128
Figure 44 : Expression des protéines de fusion PLD-GFP dans les cellules HUV-EC-
C :.....................................................................................................................129
Figure 45 : Effet des LDL natives et oxydées sur l’activité de la PLD......................131
Figure 46 : Effets de différents agonistes et les LDL modifiées ou non sur la
réorganisation du cytosquelette........................................................................133
Figure 47 : La réorganisation du cytosquelette induite par les agonsites de PLD et
LDL natives ou oxydées est-elle PLD dépendante ?.......................................134
Figure 48 : Mise en évidence de la localisation subcellulaire de PLD1 (A) et PLD2 (B)
par immunofluorescence. .................................................................................136
Figure 49 : Mesure de la perméabilité de la monocouche de cellules endothéliales à
la peroxydase de raifort (HRP). ........................................................................137
Figure 50 : Passage des LDL marquées à travers la monocouche de cellules
endothéliales ....................................................................................................138
Figure 51 : Mobilité électrophorétique des LDL natives et oxydées........................140
Figure 52 : Quantification de l’oxydation de la partie lipidique des LDL au contact des
HUV-EC-C, pour des temps variables..............................................................141
Figure 53 : Dosage de l’α-tocophérol dans les LDL au contact des HUV-EC-C, à des
temps variables. ...............................................................................................142
Figure 54 : Effet du plasma sur la réorganisation du cytosquelette. ........................143
Figure 55 : Effet de la désorganisation des radeaux sur l’activité de la phospholipase
D des PBMC :...................................................................................................145
Figure 56 : Délocalisation de la protéine PLD1 par la sphingomyélinase. ...............146
Figure 57 : inhibition de la prolifération des PBMC par le MBCD, la filipine et la
bSMase. ...........................................................................................................147
14

Figure 58 : Détection des ARNm de PLD dans les Jurkat par RT-PCR. .................148
Figure 59 : Détection de PLD1 et PLD2 chez les cellules Jurkat, par Western blotting.
.........................................................................................................................149
Figure 60 : Expression des protéines de fusion PLD-GFP dans les cellules Jurkat 150
Figure 61 : Vérification de la transfection par RT-PCR............................................150
Figure 62 : Activité PLD des cellules Jurkat transfectées par les plasmides pEGFP,
pEGFP-PLD1 et pEGFP-PLD2.........................................................................151
Figure 63 : Prolifération spontanée des cellules Jurkat transfectées par les plasmides
pEGFP, pEGFP-PLD1, pEGFP-PLD2. .............................................................152
Figure 64 : Effet du TPA et de l’ ionomycine sur l’expression de l’IL-2. ...................153
Figure 65 : Effet de la surexpression de la PLD1 sur l’expression de l’IL-2.............154
Figure 66 : Distribution du ganglioside GM1 dans les différentes fractions du gradient
de saccharose préparé à partir des cellules Jurkat. .........................................155
Figure 67 : Détection de PLD2 dans les différentes fractions d’un gradient de
saccharose préparé à partir de cellules Jurkat. ................................................156
Figure 68 : Expression de la protéine de fusion GFP-PLD1 dans les cellules Jurkat :
.........................................................................................................................156
Figure 69 : Détection par Dot blot des protéines GFP et GFP-PLD1 dans les
surnageants post-nucléaires (SNP) des cellules transfectées par pEGFP et
pEGFP-PLD1 respectivement. .........................................................................157
Figure 70 : Distribution du ganglioside GM1 dans les différentes fractions des
gradients de saccharose préparés à partir de cellules transfectées par pEGFP
(A) et par pEGFP-PLD1(B)...............................................................................158
Figure 71 : Détection de PLD1 dans les différentes fractions de cellules transfectées
par pEGFP-PLD1. ............................................................................................159
15

ABREVIATIONS
ADP : adénosine diphosphate
ADNc : acide désoxyribonucléique complémentaire
AMPc : adénosine monophosphate 3’, 5’ cyclique
ARF : facteur d'ADP-ribosylation
ARN : acide ribonucléique
AVP : arginine 8 -vasopressine
bHLH: basic helix-loop-helix
BHT : butyl-hydroxy-toluène
BET : bromure d’éthidium
BSA : albumine sérique bovine
CCM : chromatographie sur couche mince
CK: créatine kinase
CMH : complexe majeur d’histocompatibilité
ConA : concanavaline A
CPA: cellule présentatrice de l’antigène.
DAG : diacylglycérol
DAPI : Di Aminido Phenyl Indol
DHA : acide docosahexaénoïque
DIF : fraction insoluble aux détergents
DMSO : dimethylsulfoxide
DPPC : dipalmitoylphosphatidylcholine
DRM : Detergent Resistant Membranes
ECL : enhanced chemiluminescence
EDTA : acide éthylènediamine tétraacétique
EGF : facteur de croissance de l’épiderme
EGTA : acide éthylèneglycol tétraacétique
FGF: fibroblast growth factor
GDP : guanosine diphosphate
GFP : protéine fluorescente verte
GPI : glycosylphosphatidylinositol
GTP : guanosine triphosphate
GTPγS : guanosine 5'-O-3-thiotriphosphate
HDL: Lipoproteine de haute densité
HEPES : acide N-(2-hydroxyéthylpipérazine)N’-(2-éthanesulfonique).
HPLC : chromatographie liquide haute performance
HRP: peroxydase du raifort
IGF : insulin-like growth factor
IL-2: Interleukine-2
ITAM: Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif
JAM: Junctional adhesion molecule
LDL: lipoprotéines de basse densité
LDL-N: lipoprotéines de basse densité natives
LDL-ox: lipoprotéines de basse densité oxydées
16

LPA : acide lysophosphatidique
MADS: MCM1-Agamous-Deficiens-SRF
MAP Kinase: Mitogen Activated Protein Kinase
MBCD: méthyl-bétacyclodextrine
MDA: dialdéhyde malonique
MEF2: myocyte enhancer factor 2
MHC: Complexe majeur d’histocompatibilité
MRF : myogenic regulator factor
NO: monoxyde d’azote
PA : acide phosphatidique
PAGE : électrophorèse en gel de polyacrylamide
PBMC : cellules mononucléées de sang périphérique humain
PBS : tampon phosphate salin
PBu : phosphatidylbutanol
PC : phosphatidylcholine
PCR : polymerase chain reaction
PDE : phosphodiestérase
PDMP : phenyl-2-décanoylamino-3-morpholino-1-propanol
PE : posphatidyléthanolamine
PHA : phytohémaglutinine
PI : phosphatidylinositol
PIP2 : phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate
PIP3 : phosphatidylinositol 1,4,5-trisphosphate
PKC : protéine kinase C
PL : phospholipide
PLA2 : phospholipase A2
PLC: phospholipase C
PLD : phospholipase D
PMSF : phenylmethylsulfonyl fluoride
PS: phosphatidylsérine
PTK : protéine tyrosine kinase.
SDS : dodécylsulfate de sodium
SFLS : stress fiber like structures
Si RNA : small interfering ribonucleic acid
SMAC: Supra Molecular Activation Complexes
SMase: sphingomyélinase
SRF : serum response factor
S1P: sphingosine-1 phosphate
SVF : sérum de veau foetal
TBARS: thiobarbituric acid reactive substances
TBS-T : tampon tris salin + tween
TCR : récepteur des lymphocytes T
TEMED : N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine 1,2-bis(dimethylamino)ethane
TGF-β: β transforming growth factor β
TPA : 12-O-tétradécanoylphorbol-13-accétate
Tween : monolaurate de polyéthylène-sorbitane
VLDL : Lipoproteines de très basse densité
ZO : Zonula Occludens.
17

I. INTRODUCTION :
Les phospholipases D (PLD) sont des enzymes aux caractéristiques singulières. Elles
possèdent une activité de remodelage des membranes : en modifiant la tête polaire d’un
phospholipide leur activité conduit à la formation d’un nouveau phospholipide, l'acide
phosphatidique, au sein de la membrane. Outre ses propriétés physicochimiques particulières,
ce composé a un rôle très important dans la signalisation cellulaire, par lui-même ou par les
effets de ses métabolites bio-actifs. Les phospholipases D constituent un système complexe.
Chez les mammifères, deux gènes distincts PLD1 et PLD2 ont été décrits (Frohman et al.,
1999), chaque gène donnant naissance à plusieurs variants d’épissage (Hammond et al.,
1997). La régulation des PLD met en jeu une multitude de facteurs. Les deux isoformes de
PLD nécessitent du phosphatidylinositol 4,5-diphosphate comme cofacteur pour leur activité,
mais sont régulées différemment. La PLD1 caractérisée par une activité basale faible est
activée synergiquement par les petites protéines G des familles Rho et ARF, et par les PKC
conventionnelles. La PLD2 au contraire a une activité basale élevée, et sa sensibilité à des
protéines activatrices est moins marquée (Exton, 2002). Divers facteurs protéiques, comme
certaines protéines du cytosquelette, ou lipidiques, comme les céramides ou certains acides
gras, modulent aussi l'activité des PLD. La position centrale de ce système enzymatique dans
la transduction du signal, la multiplicité des régulations croisées qui l'affectent, se traduisent
par son implication dans de nombreux processus physiologiques majeurs, comme la
prolifération, la différenciation, le trafic vésiculaire, la migration, la sécrétion, la phagocytose.
Ce mémoire porte sur l’étude des rôles physiologiques de la PLD au cours de certaines étapes
de la vie cellulaire comme la prolifération, la différenciation, et l'établissement des jonctions
intercellulaires, qui commandent la perméabilité paracellulaire. Ces questions ont été
abordées à l'aide de différents modèles cellulaires : la différenciation a été étudiée chez une
lignée myoblastique ; des lignées de cellules endothéliales ont servi à l'étude de la
perméabilité paracellulaire ; l'étude de la prolifération a été réalisée chez les lymphocytes
circulants et à l'aide d'une lignée de cellules T.
Notre équipe étudie depuis plusieurs années la différenciation myogénique de myoblastes
squelettiques de rat L6 en culture. Au cours du processus myogénique, les myoblastes,
cellules précurseurs, cessent de proliférer et fusionnent pour se différencier en myotubes
polynucléés, exprimant les protéines spécifiques du tissu musculaire, notamment les
constituants du système contractile. La myogénèse intervient au cours de la vie embryonnaire,
18

mais aussi lors de la réparation des blessures du tissu musculaire déjà constitué, et dans la
régénération du muscle dystrophique, chez les patients atteints de myopathies (Perry and
Rudnick, 2000). La compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu présente donc un
intérêt majeur en physiopathologie. Nous avons montré que la PLD, et plus spécifiquement
l'isoforme PLD1, est nécessaire à la différenciation myogénique des myoblastes L6 induite
par l’arg 8 -vasopressine (AVP), ou par l'ester de phorbol TPA. La PLD1 intervient dans ce
processus en provoquant la formation de fibres d’actine, primordiale dans la myogénèse
(Komati et al., 2004, 2005). Les céramides sont des sphingolipides dont le rôle de seconds
messagers fait l'objet d'un intérêt croissant. Leur implication est démontrée dans des réponses
physiologiques comme l'apoptose, l'arrêt du cycle cellulaire, la différenciation. Bien que le
rôle des céramides dans la physiopathologie musculaire soit bien établi, peu de choses sont
connues en ce qui concerne leur implication dans la signalisation des cellules myogéniques en
général, et dans leur différenciation en particulier. Nous avons abordé cette question dans le
modèle des cellules L6. Nous montrons dans le présent travail que les céramides jouent un
rôle important dans la différenciation myogénique induite par l’AVP, via la régulation de la
PLD.
L’équipe a par ailleurs travaillé sur les interactions lymphocytes-endothélium dans le
contexte de l’athérosclérose. Elle a notamment montré que le contact de cellules endothéliales
avec les lymphocytes stimule une cascade intercellulaire de signalisation aboutissant à la
production de prostacycline antiagrégante et vasorelaxante (Mehri-Soussi et al., 2003). Le
contrôle de la perméabilité vasculaire est primordial pour la prévention de l’athérosclérose,
puisque l'accroissement de la perméabilité est une étape initiale du développement de cette
pathologie. Ce contrôle est assuré par l’établissement et le maintien de jonctions
interendothéliales. Deux types de jonctions cellulaires sont principalement présentes au
niveau de l’endothélium : les jonctions serrées et les jonctions adhérentes. Reliées au
cytosquelette d’actine qui assure la charpente cellulaire, elles permettent le maintien de
l’intégrité de la monocouche endothéliale qui peut ainsi assurer son rôle de barrière sélective.
La PLD joue un rôle important dans le contrôle du cytosquelette en participant notamment à
la formation de fibres de stress (Cross et al., 1996). L’apparition de ces fibres induit un
changement de la morphologie des cellules et une désorganisation des jonctions
intercellulaires, qui est susceptible d'influer sur la perméabilité paracellulaire aux
macromolécules. Etant donné le rôle crucial de l'accumulation subendothéliale de
macromolécules proathérogènes, en particulier de lipoprotéines de basse densité (LDL), dans
l’initiation de l’athérosclérose, nous avons entrepris une étude du rôle potentiel de la PLD sur
19

la perméabilité de l’endothélium vasculaire aux LDL natives ou modifiées par oxydation.
Nos observations permettent de conclure à un rôle de la PLD dans le contrôle du passage
transendothélial des LDL.
Un autre thème étudié au sein de notre équipe concerne le rôle de la PLD dans l'activation
lymphocytaire. L’observation initiale qui a conduit l’équipe à s’intéresser à la PLD dans ce
modèle est que les taux d'AMPc intracellulaire, un des systèmes majeurs de contrôle négatif
de la réponse lymphocytaire, sont sous la dépendance d'une phosphodiestérase de type 4,
régulée par l'acide phosphatidique. Les études ultérieures ont montré que la PLD n'est pas
mobilisée lors de la stimulation mitogénique des lymphocytes dans les conditions normales,
mais que sous l'effet d'un enrichissement des cellules en acide docosahexaènoïque (DHA), un
acide gras de la série n-3 constituant majeur des huiles marines, la PLD devient sensible à
l'activation par les mitogènes (Bechoua et al., 1998). Par ailleurs, le DHA inhibe la réponse
proliférative lymphocytaire in vitro (Joulain et al., 1995), et il montre des propriétés
immunomodulatrices lorsqu'il est apporté comme supplément nutritionnel à des sujets âgés
(Bechoua et al., 2003). L'hypothèse a donc été faite que l'activation de la voie PLD participe
à l'effet négatif du DHA sur la prolifération lymphocytaire. Une étude plus approfondie des
mécanismes impliqués a par la suite montré que dans les lymphocytes périphériques humains,
PLD1 est localisée préférentiellement dans les radeaux lipidiques membranaires, alors que
PLD2 en est exclue. L’enrichissement des lymphocytes en DHA modifie significativement la
composition lipidique de ces microdomaines et provoque une relocalisation de PLD1 hors des
radeaux, corrélée à une activation de l’enzyme (Diaz et al., 2002). Dans le présent travail,
nous avons confirmé que la perturbation des radeaux lipidiques par des agents spécifiquement
actifs sur les lipides de ce compartiment est associée à une activation de PLD et à une
inhibition de la lymphoprolifération. Nous avons donc évalué, par des expériences de
surexpression, les effets des PLD sur l'activation lymphocytaire et avons pu observer que
PLD1, spécifiquement, est responsable d'un contrôle négatif de cette réponse.
La première partie de ce mémoire est consacrée aux rappels bibliographiques et comporte
quatre chapitres : le premier retrace les principales caractéristiques de la PLD, sa structure, sa
régulation et ses différentes fonctions physiologiques. Dans les chapitres suivants, nous
évoquons la myogénèse, la fonction de la barrière endothéliale et l’activation lymphocytaire.
Le reste du mémoire concerne notre travail personnel et s'articule en trois parties. La première
partie traite des méthodes d'étude utilisées. La deuxième partie est consacrée aux résultats
expérimentaux et à la discussion des résultats obtenus. Ce mémoire se termine par une
conclusion générale et par l’exposé des perspectives qui découlent de notre travail.
20

II.RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES :
II.1 Phospholipase D :
La phospholipase D (PLD) est une enzyme membranaire qui fait partie de la superfamille
des phosphohydrolases incluant la phosphatidylsérine synthase, la cardiolipine synthase, la
tyrosyl-DNA phosphodiestérase, deux endonucléases bactériennes, la toxine murine de
Yersinia pestis et deux enveloppes protéiques de poxvirus (Exton, 2002). La PLD hydrolyse la
liaison phosphodiester distale des glycérophospholipides, ce qui produit l’acide
phosphatidique (PA), lipide considéré comme second messager (English, 1996). Elle a le plus
souvent comme substrat la phosphatidylcholine (PC), phospholipide majoritaire des
membranes mais elle hydrolyse aussi la phosphatidyléthanolamine (PE) et le
phosphatidylinositol (PI) dans certains organismes ou tissus. Des activités PLD ont été
détectées dans des organismes simples et complexes, des virus et bactéries jusqu’à la levure,
les plantes et les animaux. C’est dans les plantes (feuilles de chou) que la PLD a été
découverte pour la première fois (Hanahan et Chaikoff, 1947). Longtemps considérée comme
absente du règne animal, ce n’est qu’en 1973 que la première activité PLD de mammifère a
été identifiée dans les extraits membranaires de cerveau de rat (Saito et Kanfer, 1973).
Depuis, de nombreux travaux ont été consacrés à l’étude de la PLD dans les cellules de
mammifères : identification, isolement et purification de cette enzyme. Les groupes de Pai et
de Billah ont montré que l’activation cellulaire via des récepteurs membranaires faisait
intervenir une phospholipase D, l’impliquant dans la transduction des signaux (Pai et al.,
1988 ; Billah et al., 1989).
On distingue deux grandes familles de PLD chez les mammifères selon leur sensibilité au
phosphatidylinositol 4,5-diphosphate (PIP2) : les PLD PIP2 sensibles (nécessitant la présence
de PIP2) et les PLD PIP2 insensibles (ne nécessitant pas la présence de PIP2). Chez les PLD
PIP2 sensibles (figure 1), deux isoformes de PLD issues de deux gènes différents comportant
50% d’homologie ont été caractérisées à ce jour : PLD1 et PLD2. Les PLD PIP2 insensibles
ne sont pas stimulables par les protéines activatrices de PLD1 et PLD2 mais par des acides
gras comme l’acide oléique (Frohman et al., 1999) et sont également appelées des PLD
oléate-dépendantes. Ces différentes formes sont impliquées dans d’importantes fonctions
cellulaires comme la mitose, l’organisation du cytosquelette et le trafic vésiculaire (Liscovitch
et al., 2000).
21

Figure 1 : Caractéristiques des différentes formes de PLD PIP2 sensibles (Foster et Xu,
2003).
II.1.1 : Caractéristiques enzymatiques des phospholipases D ; identification et
clonage des gènes de PLD eucaryotes :
La PLD hydrolyse les phospholipides et principalement la phosphatidylcholine (PC) en
présence d'eau pour générer un messager primaire, l'acide phosphatidique (PA) et des
messagers secondaires tels que le diacylglycérol (DAG) et l’acide lysophosphatidique (LPA)
(figure 2). Cette enzyme catalyse aussi une réaction de transphosphatidylation, qui permet en
présence d’alcool primaire de former du phosphatidylalcool aux dépens du PA. En effet, les
alcools primaires à chaîne courte tels que le butanol-1 sont de meilleurs accepteurs
nucléophiles que l’eau. Par contre, les alcools secondaires ne permettent pas la réalisation
d’une transphosphatidylation par les PLD végétales et animales (Danin et al., 1993).
Cette réaction de transphosphatidylation est spécifique de la PLD et permet ainsi de
quantifier son activité dans les cellules. En général, les méthodes de mesure de l’activité PLD
se basent sur le dosage des produits dans le milieu réactionnel après marquage de son substrat
par des molécules radioactives ou fluorescentes.
22

23
Figure 2 : Schéma de réaction de la
PLD. En présence d’eau, la PLD
hydrolyse la PC libérant du PA et de
la choline. En présence d’alcool
primaire, la PLD forme du
phosphatidylalcool (Liscovitch et al.,
2000).
Les phospholipases D ont été purifiées et clonées à partir de bactéries, de levures, de plantes
et de tissus de mammifères (Morris et al., 1996). La connaissance des séquences de la PLD de
différents règnes a permis de les comparer, de mettre en évidence des régions et des motifs
très conservés ainsi que d’identifier des domaines (figure 3). Tous les gènes eucaryotes de
PLD clonés à ce jour possèdent un centre catalytique très conservé, entouré de régions N et C
terminales de séquences plus variables (Jenkis et Frohman, 2005).
Figure 3 : Domaines conservés CRI à CRIV dans différentes protéines apparentées à la
PLD humaine (hPLD1a, hPLD2) Cockcroft, 2001.

Les travaux de Hammond et al., 1995 ont conduit au premier clonage de la PLD1 humaine
isolée à partir d’une banque d’ADNc de cellules HeLa. Le produit du gène cloné révèle une
protéine de 1074 acides aminés et d’une masse moléculaire de 120 kDa. Plus tard, ces mêmes
auteurs ont montré la coexistence de deux variants de PLD1 (Hammond et al., 1997).
La PLD1 a été renommée PLD1a après l’identification d’un variant issu de l’épissage
alternatif de l’exon 8, appelé PLD1b. Ce variant comporte une délétion de 38 acides aminés
(résidus 585 à 624). Les deux formes de PLD1 présentent des propriétés catalytiques et
régulatrices identiques. Elles présentent une activité PC-spécifique (hydrolyse et
transphosphatidylation) et ont une activité basale faible, elles peuvent être activées en
présence de PIP2. Leurs activités peuvent de plus augmenter en présence de protéines G
monomériques de la famille ARF (ADP ribosylation factor) et Rho (Ras Homology family
protein), d’où son appellation de PLD ARF- ou Rho- dépendante, ou par plusieurs membres
de la famille des PKC. Chez le rat, deux variants de PLD1 ont également été identifiés (Park
et al., 1997). Il a été rapporté que rPLD1b est moins sensible à RhoA que rPLD1a (Katayama
et al., 1998).
Le clonage chez l’homme du gène d’une nouvelle isoforme de PLD, hPLD2, a montré qu’il
codait une protéine de 933 acides aminés et d’une masse moléculaire théorique de 110 kDa
(Lopez et al., 1998). Les PLD2 de différents mammifères (homme, souris, rat) présentent 50%
d’homologie avec les PLD1. La région boucle de 116 acides aminés présente au milieu de la
séquence de hPLD1 (résidus 505-620) n’existe pas dans hPLD2 (figure 4). PLD1 et PLD2
diffèrent également au niveau de leurs parties N et C terminales.
Deux variants ont été séquencés : hPLD2a et hPLD2b qui proviennent d’un épissage alternatif
conduisant à la délétion de 11 acides aminés au niveau de la partie C terminale. Un troisième
variant hPLD2c a également été séquencé (Steed et al., 1998). Il s’agit d’une forme tronquée
qui ne comprend que les 335 premiers acides aminés de la séquence hPLD2a (∆336-932).
Cette isoforme est inactive car elle ne contient pas le site catalytique. Comme la PLD1, la
PLD2 a pour substrat majeur la phosphatidylcholine et est dépendante du PIP2. Cependant, la
PLD2 est régulée différemment : contrairement à la PLD1, PLD2 a une activité basale élevée
in vitro, mais qui est peu ou pas stimulée par les protéines activatrices de PLD1. La sensibilité
de PLD2 à ARF est variable dans différentes espèces. En effet, alors qu’ARF n’a aucun effet
sur la PLD2 murine in vitro (Colley et al., 1997a), il a été montré que la PLD2 humaine est
activée par cette protéine G, mais à un degré bien moindre que la PLD1 (1.5 fois pour la
PLD2 contre 100 fois pour la PLD1).
24

II.1.2 Structure primaire des PLD :
L’analyse des séquences peptidiques de la PLD a permis de mettre en évidence quatre motifs
(CRI à CRIV) conservés entre les diverses isoformes et entre espèces.
CRI
CRI
Figure 4 : Domaines principaux de PLD1 et PLD2 (Rizzo et Romero, 2002).
Les boîtes représentent les séquences très conservées dans les PLD de mammifères (CRI,
HKD, CRIII et domaines PH et PX) ou la région spécifique de la PLD1 (boucle ou loop).
Les régions conservées CRII et CRIV : les domaines HKD :
Les régions CRII (résidus 463 à 487) et CRIV (résidus 894 à 919) contiennent chacune deux
motifs chargés invariables HxKxxxxD/E, appelés HKD ou encore triades catalytiques (figure
4). Ce motif est conservé dans toutes les espèces (Sung et al., 1997). Ces domaines
caractérisés par la présence des résidus histidine (H), lysine (K) et aspartate (D) sont
nécessaires à l’activité catalytique de l’enzyme (Hammond et al., 1995). La mutagénèse
dirigée a permis de montrer que ces acides aminés sont indispensables à la catalyse de
l’enzyme. Sung et al., (1997), ont montré que des cellules COS-7, transfectées par hPLD1
dont la lysine 898 du motif HKD a été mutée ne conservent pas leur activité PLD. Ces auteurs
ont montré que la mutation unique de chacun des acides aminés H, K ou D dans un seul de
ces motifs (CRII ou IV) abolit totalement l’activité catalytique de l’enzyme, et donc que les
deux motifs ne fonctionnent pas indépendamment. Pour les enzymes de cette superfamille qui
ne comprennent qu’une seule triade HKD, une dimérisation a été observée après cristallisation
25
PIP2/membrane
Interaction
CRIII
CRIII

(Stuckey et Dixon, 1999). En ce qui concerne le mécanisme catalytique, des résultats récents
ont permis d’imaginer un modèle faisant intervenir les résidus histidyl des deux triades HKD
(McDermott et al., 2004). Une histidine servirait de nucléophile et l’autre servirait à protonner
l’oxygène du groupement partant (Iwasaki et al., 1999). Très tôt, la formation d’un
intermédiaire phosphatidylenzyme a été mise en évidence lors de la réaction catalysée par la
PLD (Yang et al., 1967). Un mécanisme réactionnel de type ping pong a été identifié (Sung et
al., 1997). La structure cristalline de la PLD de Streptomyces species a pu être observée par
Leiros et ses collaborateurs en 2000, et confirme les observations précédentes concernant le
site catalytique.
Les régions CRI et CRIII :
La région CRI (résidus 362 à 422) très conservée est spécifique des PLD. Elle n’a pas encore
de fonctions clairement identifiées : certains de ses acides aminés semblent être
indispensables au fonctionnement de l’enzyme (Sung et al., 1999b).
Le motif IYIENQFF ou la région CRIII : le rôle exact de cette région reste inconnu.
Cependant, des mutations au niveau de ce motif montrent que cette région occupe également
une position critique dans l’activation de la PLD (Sung et al., 1997). Etant donné la présence
de résidus aromatiques au sein du motif, on peut penser qu’il interagit avec la tête polaire de
la phosphatidylcholine pour faciliter la catalyse ou pour limiter la spécificité de la PLD aux
phospholipides portant la choline.
Domaine d’homologie à PHOX ou domaine PX, domaine PH-like, et domaine
polybasique ou domaine de liaison au PIP2 :
Un autre domaine significativement conservé, le domaine d’homologie à PHOX ou domaine
PX a été mis en évidence chez les PLD1 et PLD2 de mammifères (figure 4), et la PLD1 de
levure dans la partie N terminale de leur séquence. Ce domaine permet l’interaction avec de
nombreuses protéines comme les protéines kinases et les protéines présentant un domaine
SH3 (src homology) (Ponting et Kerr, 1996). Ces domaines sont également des modules
spécifiques impliqués dans les interactions protéines-lipides (Ellson et al., 2001). En effet, ils
peuvent fixer PI3P, PI(3,4)P2, PI(4,5)P2, PI(3,5)P2, PI(3,4,5)P3 (Xu et al., 2001). Ils
possèdent un acide aminé basique en position centrale (lysine en position 53) qui lie plus
26

particulièrement le PI3P (Ellson et al., 2002). Du et al. ont montré en 2003 que le domaine PX
de PLD1 peut lier le PI5P et cibler la protéine vers des vésicules d’endocytose.
Les régions N terminales de PLD1 et PLD2 contiennent un domaine d’homologie à la
pleckstrine ou domaine PH (Steed et al., 1998). Ce domaine a été impliqué dans un premier
temps dans l’interaction de la PLD avec les membranes et avec les inositides diphosphorylés
ayant leurs phosphates en position vicinale comme le phosphatidylinositol 4,5 diphosphate
(PIP2) et le phosphatidylinositol 3,4 diphosphate (Hodgkin et al., 2000). Afin de vérifier cette
hypothèse, des expériences de délétion dans la séquence de PLD1 ont été réalisées. La
délétion des 325 premiers acides aminés de la partie N terminale (comprenant le domaine PH)
ne modifie pas l’activité PLD mesurée in vitro sur des vésicules artificielles contenant le
PIP2. Ceci suggère la présence d’un autre domaine de liaison au PIP2 responsable de
l’activation de l’enzyme par ce phosphoinositide (Sciorra et al., 1999). Le domaine PH
interviendrait plutôt dans la localisation subcellulaire de l’enzyme. En effet, Brown et al. en
1998 ont montré que la PLD1b sauvage exprimée dans les cellules COS-1 et RBL-2H3 est
localisée au niveau des endosomes et des lysosomes. La PLD1b délétée de son domaine PH
est diffuse dans la cellule (Hodgkin et al., 2000).
Un domaine de liaison au PIP2 situé entre les deux domaines HKD a été identifié : il s’agit du
domaine polybasique (figure 4). Ce domaine impliquerait majoritairement une région riche en
résidus basiques et hydrophobes : il serait indispensable à l’activité enzymatique des PLD de
levures et de mammifères (Sciorra et al., 1999).
La séquence boucle :
C’est une séquence de 116 acides aminés présente au centre de la protéine PLD1 entre le
domaine II et III. Elle est absente dans la PLD2 des mammifères (Hammond et al., 1995).
Cette région paraît jouer un rôle important sur le niveau de l’activité basale de l’enzyme. En
effet, la PLD1 délétée de cette région possède une activité basale très élevée. L’activité basale
de la PLD2 qui ne possède pas la région boucle est constitutivement importante. L’insertion
de cette région dans la PLD2 provoque une diminution de son activité basale, ce qui confirme
le rôle négatif de la séquence boucle dans la régulation de la PLD (Sung et al., 1999b).
27

Les régions amino et carboxy-terminales :
La région amino-terminale est la moins conservée entre les PLD des différentes espèces. La
région tolère la fusion avec des protéines étiquettes (par exemple, protéines fluorescentes)
sans qu’il y ait modification de l’activité enzymatique (Hammond et al., 1995). Dans cette
partie N terminale de la PLD1 se trouve une zone qui serait impliquée dans la régulation par
la PKC (Xie et al., 1998). En effet, des mutants de PLD1 délétés de leur partie N terminale
perdent leur sensibilité aux esters de phorbol, puissants activateurs des PKC. Entre les PLD2
des mammifères, des similarités de séquence existent au niveau des 80 premiers acides
aminés. Cette région participe à la forte activité basale de la PLD2 (Sung et al., 1999a). La
délétion des 308 premiers acides aminés conduit à une enzyme de faible activité basale qui
devient sensible à l’activation par ARF.
La région carboxy-terminale est relativement bien conservée entre les PLD (Xie et al., 2000 ;
Liu et al., 2001). Cette région est nécessaire à l’activité enzymatique. En effet, la délétion de
99 acides aminés de cette région supprime l’activité de la PLD (Sung et al., 1999a et b).
Contrairement à la région amino-terminale, cette région est réfractaire à la présence de
protéines étiquettes qui peuvent altérer l’activité enzymatique. Cette région est impliquée dans
l’interaction de la PLD1 avec les petites protéines G de la famille Rho (Yamazaki et al.,
1999).
II.1.3 Régulation des PLD :
La régulation de la PLD dépend de plusieurs facteurs comme la nature de la cellule,
l’isoforme considérée, et la voie de signalisation activée par le stimulus (les protéines G, les
PKC…). Elle est très complexe et met en jeux de nombreux activateurs et inhibiteurs. Cette
régulation très fine serait associée d’une part à la réponse sélective des PLD à leurs différents
agonistes et d’autre part à leur implication dans différentes fonctions physiologiques in vivo.
II.1.3.1 Régulation par des protéines kinases :
Les protéines kinases provoquent des modifications de protéines cibles impliquées dans la
transduction des signaux, en induisant un changement de leur conformation. La majorité des
28

modifications observées consiste en de multiples phosphorylations sur des résidus tyrosines
ou sérines et thréonines.
Ces phosphorylations sont effectuées par des kinases groupées en deux classes. La première
classe est formée par des enzymes qui phosphorylent les protéines sur les résidus
sérines/thréonines. Elles incluent notamment les protéines kinases C (PKC). La deuxième
classe est formée d’enzymes qui phosphorylent les résidus tyrosines, appelées tyrosines
kinases.
II.1.3.1.1) Les protéines kinase C :
La famille des PKC peut être divisée en trois sous-familles :
les isoformes classiques ou conventionnelles (PKCα, β et γ) caractérisées par leur
capacité à être stimulées par le calcium, le diacylglycérol (DAG) et la
phosphatidylsérine (PS).
les PKC nouvelles (δ, ε, η, θ) indépendantes du calcium mais activables par le DAG et
la PS.
les PKC atypiques (ξ, λ, τ) qui ne sont stimulées ni par les DAG, ni par le calcium.
Elles ne sont appelées PKC que parce qu’elles possèdent un domaine de liaison aux
lipides acides (souvent la PS).
L’activation de la PLD par la PKC a été démontrée sur plusieurs types cellulaires par des
approches différentes : utilisation d’esters de phorbols activateurs de la PKC (Lopez et al.,
1995); utilisation d’inhibiteurs de PKC (Davis et al., 1989); altération de l’expression des
isoformes de PKC par l’utilisation d’oligonucléotides antisens (Balboa et al., 1994).
La régulation négative des PKC par traitement prolongé des cellules avec des esters de
phorbol a pour effet de bloquer l’activation de la PLD par divers agonistes (Exton, 1997). Il
faut noter que dans certaines situations, la diminution de l’activité PKC ne conduit qu’à une
diminution partielle ou nulle de la stimulation de la PLD, ce qui indique la présence de
mécanismes non dépendants de la PKC. Classiquement, il est considéré que la PLD1 est
sensible à l’activation par les protéines kinases C (Hammond et al., 1995 et 1997) alors que
PLD2 ne l’est pas (Kodaki et Yamashita, 1997). Cependant, plusieurs études récentes ont
montré une activation de PLD2 par les PKC, quoique plus faible que celle observée pour
PLD1 (Han et al., 2002). Deux isoformes de PKC, les isoformes α et β, activent directement
29

la PLD1. Les cellules MDCK transfectées par des ADNc antisens de PKCα ont une activité
PLD diminuée (Balboa et al., 1994). Par contre, des fibroblastes qui surexpriment les PKCα et
PKCβ ont une activité PLD basale augmentée et leur réponse à des stimulus tels que
l’endothéline, la thrombine et le PDGF (Eldar et al., 1993) est plus élevée que dans les
cellules témoins. Il est connu que l’activation de la PKC par des agonistes induit leur
translocation vers la membrane. Il a été montré que le domaine régulateur de la PKC est
capable à lui seul de stimuler la PLD en l’absence de phosphorylation (Singer et al., 1996). Il
semblerait que la PLD1 interagisse directement avec la PKC via son domaine N terminal (Xie
et al., 1998) mais indépendamment des domaines PH et PX (Sung et al., 1999a).
II.1.3.1.2) Les tyrosines kinases :
De nombreux travaux basés sur l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques des tyrosines kinases
mais aussi des tyrosines phosphatases ont fourni des preuves d’une régulation de la PLD par
un mécanisme de tyrosine phosphorylation / déphosphorylation (Min et al., 1998).
La PLD est stimulée dans différents types cellulaires via des récepteurs à activité tyrosine
kinase ou via des récepteurs qui recrutent des tyrosines kinases solubles. Le rôle des tyrosines
kinases sur la PLD a été montré par l’utilisation de pervanadate qui augmente le niveau de
tyrosine phosphorylation en inhibant les tyrosines phosphatases (Bourgoin et Grinstein, 1992)
et par l’utilisation d’inhibiteurs des tyrosines kinases comme la génistéine, l’herbimycine, la
tyrphostine (revue Natarajan et al., 1996). La génistéine par exemple inhibe la PLD dans
divers types cellulaires incluant les cellules U937, les cellules RBL-2H3 ou les fibroblastes
Swiss 3T3 (Dubyak et al., 1993 ; Kumada et al., 1993 ; Briscoe et al., 1995). Différents
récepteurs ayant une activité tyrosine kinase intrinsèque comme le récepteur à l’EGF activent
la PLD. D’autres voies d’activation de cette enzyme mettent en jeu des tyrosines kinases
cytosoliques. Il a en effet été montré que la tyrosine kinase v-src est capable d’activer la PLD
via l’oncogène p21ras (Jiang et al., 1994).
II. 1.3.2 Régulation par des petites protéines G monomériques :
Un grand nombre d’agonistes sont connus comme activateurs de la PLD, et parmi ceux-ci
plusieurs agissent par des récepteurs couplés à des protéines G hétérotrimériques Gq ou Gi.
30

Cependant, l’activation de PLD ferait intervenir, en aval, des protéines G monomériques. La
guanosine 5’-O-(3-thiotriphosphate) (GTPγS) stimule l’activité PLD dans de nombreux
systèmes acellulaires ou des cellules perméabilisées. Cette stimulation implique des protéines
G monomériques de la superfamille des protéines Ras qui possèdent un motif consensus de
liaison au GTP. Parmi celles-ci, les protéines des familles ARF et Rho sont impliquées dans la
transduction de signaux qui activent la PLD (Exton, 1999).
II.1.3.2.1 Le facteur d’ADP ribosylation (ARF) :
Les protéines ARF ont été les premières identifiées comme activatrices des PLD sensibles au
GTPγS dans le cytosol de cerveau de bœuf (Brown et al., 1993) et dans les cellules HL60
(Cockcroft et al., 1994). L’ARF est connu comme un facteur participant à la ribosylation de la
protéine Gsα induite par la toxine cholérique (Lopez et al., 1995). C’est le domaine NH2terminal
de ARF qui serait impliqué dans l’activation de la PLD (Zhang et al., 1995).
L’activation de cellules HL60 par le peptide synthétique N-formyl-met-leu-phe (fMLP) induit
une augmentation de la quantité d’ARF associée à la membrane et une stimulation de la PLD
(Houle et al., 1995). Ces résultats indiquent donc que la stimulation de la PLD par cet
agoniste serait médiée par une translocation d’ARF à la membrane. L’implication de ARF
dans la régulation de la PLD a également été montrée à l’aide d’inhibiteurs de ce facteur. La
bréfeldine A est une toxine fongique inhibitrice de l’échange GDP/GTP au niveau des
protéines ARF, qui empêche donc leur activation (Donaldson et al., 1992). Dans les cellules
HEK et les cellules d’astrocytome 1321N1, stimulées via le récepteur M3-muscarinique,
l’utilisation de concentrations élevées de bréfeldine A diminue l’activation de la PLD et
détruit l’appareil de Golgi (Rumenapp et al., 1995 ; Mitchell et al., 1998). Un autre facteur
cytosolique, le facteur d’échange du GTP des protéines ARF, le facteur ARNO de 50Kda
(ARF nucléotide site opener) est également requis pour l’activation de la PLD via ARF. Les
données existantes suggèrent que les poly-phosphoinositides permettent le recrutement
d’ARNO au niveau de la membrane où il active ARF, qui lui-même active la PLD (Chardin et
al., 1996). Les isoformes de PLD qui répondent à ARF sont les hPLD1 a et b (Hammond et
al., 1995 et 1997), les rPLD1a et b (Park et al., 1997 ; Min et al., 1998) et plus faiblement la
hPLD2 (Lopez et al., 1998). L’activation de la PLD par ARF a été observée dans la
membrane plasmique (Provost et al., 1996), le noyau (Banno et al., 1997), l’appareil de Golgi
(Whatmore et al., 1996), et le cytosol. La présence de la PLD ARF-dépendante dans ces
différents compartiments suggère son implication dans le trafic vésiculaire au niveau du
31

Golgi, dans la fusion des vésicules et des endosomes, et dans l’assemblage des membranes
nucléaires (Moss et Vaughan, 1995).
II.1.3.2.2 Les protéines G de la famille Rho :
La famille des protéines Rho est divisée en trois groupes principaux : Rho, Rac et Cdc42-like
(Bishop et Hall, 2000). Elle régule beaucoup d’activités cellulaires, et en particulier celles
impliquant l’actine du cytosquelette. Le groupe de Bowman (1993) a été le premier à mettre
en évidence une régulation de la PLD par les protéines de la famille Rho. Ces auteurs ont
montré que l’effet activateur du GTPγS sur la PLD dans des membranes de neutrophiles est
inhibé par RhoGDI, une protéine qui empêche la dissociation du GDP des protéines Rho et
bloque ainsi leur activation. Enfin, des études dans les cellules Sf9 indiquent que RhoA
interagit directement avec la PLD et que d’autres membres de la famille des protéines Rho,
tels que Rac et Cdc42 sont aussi actifs (Hammond et al., 1997). De plus, une combinaison des
trois protéines n’active pas plus la PLD qu’une protéine seule, ce qui suggère qu’elles
interagissent avec la PLD sur le même site. Il a été confirmé par la technique de double
hybride que Rho interagit directement avec la PLD1. Le domaine d’interaction de la PLD1
avec RhoA se situe du côté C terminal de la protéine (Cai et Exton, 2001). De plus, une
combinaison de RhoA et ARF résulte en une activation synergique de la PLD (Hammond et
al., 1997 ; Singer et al., 1996 ; Kwak et al., 1995). Cela suggère la présence de sites fixateurs
séparés mais interagissant entre eux pour l’activation de la PLD. Beaucoup de toxines
bactériennes qui inactivent les protéines Rho ont été utilisées pour montrer leur implication
dans l’activation de la PLD in vivo. Ainsi, l’exoenzyme C3 de Clostridium botulinum qui
ADP-ribosyle RhoA bloque l’activation de la PLD induite par le lysoPA dans les fibroblastes
de rat (Malcom et al., 1996). De la même manière, la toxine B issue de Clostridium difficile
qui glucosyle et inactive les protéines Rho, bloque l’activation de la PLD induite par la
stimulation de récepteurs muscariniques dans des cellules embryonnaires de rein (Schmidt et
al., 1995). RhoA peut également réguler la synthèse de PIP2 par son effet sur la PI-4-P 5-
Kinase (Chong et al., 1994) et les changements d’activité PLD peuvent en partie être dus à
des variations des taux de PIP2 (Schmidt et al., 1996).
32

II.1.3.3 Régulation de la PLD par le PIP2 (phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate) :
Le PIP2 est par lui-même un second messager impliqué dans plusieurs fonctions incluant le
trafic vésiculaire, l’exocytose, la formation des adhésions focales et la régulation du
cytosquelette d’actine (Hinchliffe et al., 1998).
Brown et al. (1993) ont été les premiers à suggérer que la PLD pouvait être stimulée par le
PIP2 et beaucoup d’autres études ont confirmé cet effet. En fait, on considère que le PIP2 est
un cofacteur nécessaire à la stimulation de la PLD par la PKC et les petites protéines G, ARF
et RhoA (Brown et al., 1993).
Dans les cellules U937 perméabilisées, l’activation de la PLD induite par le GTPγS est
potentialisée par MgATP, qui maintient les taux de PIP2 et PIP élevés (Pertile et al., 1995).
De plus, lorsque les taux de PIP2 et PIP sont diminués par des inhibiteurs de PI-4-Kinase, on
note une diminution de l’activation de la PLD par le GTPγS. Une inhibition similaire de la
PLD est observée avec la néomycine, qui se lie aux phosphoinositides (Liscovitch et al.,
1994). Toutes ces expériences sont donc en faveur d’une dépendance de l’activité PLD vis-àvis
du PIP2.
Des études réalisées en système acellulaire ont montré que les deux isoformes clonées de
PLD (PLD1 et PLD2) nécessitent du PIP2 pour être actives (Hammond et al., 1997) bien
qu’elles ne soient pas régulées par les mêmes facteurs protéiques (PKC, protéines ARF,
protéines Rho). Le PIP2 en s’associant à la PLD au niveau du domaine PH favoriserait le
rapprochement de l’enzyme de son substrat in vivo (Yokozeki et al., 1996) et pourrait ainsi
augmenter son efficacité catalytique. Les travaux de Yokozeki et al. montrent que dans des
vésicules artificielles contenant PC/PE, la présence de PIP2 est nécessaire à l’activation de la
PLD qui se lie aux vésicules. Cette liaison est inhibée en présence du domaine PH de la
Kinase du récepteur β adrénergique (βARK) liant spécifiquement le PIP2 (Yokoseki et al.,
1996).
II.1.3.4 Régulation de la PLD par le calcium :
Les premières études in vitro réalisées sur la PLD purifiée à partir du cerveau de rat ont
montré que le calcium stimule l’activité enzymatique dans ce tissu (Taki et Kanfer, 1979).
Cette observation a été confirmée par les expériences réalisées sur des PLD de cellules HL-60
(Anthes et al., 1989) ou de poumon de porc (Okamura et Yamashita, 1994). Les PLD clonées
33

chez les mammifères n’ont aucun domaine connu permettant leur association directe au
calcium (Liscovitch et al., 2000). Le calcium pourrait activer la PLD indirectement par
l’intermédiaire d’autres protéines comme la calmoduline qui interagirait avec ARF
(Takahashi et al., 1996), ou comme les isoformes de PKC dépendantes du calcium ou les
tyrosines kinases (Earp et al., 1995 ; Yu et al., 1996 ; Ito et al., 1997). De plus, les
concentrations de calcium requises pour la stimulation sont très variables selon le tissu étudié
et l’activité PLD peut être inhibée par de fortes concentrations de calcium (Geny et al., 1993).
Dans certains modèles cellulaires comme les hépatocytes (Bocckino et al., 1987), les cellules
endothéliales (Martin, 1988) ou les cellules MDCK (Huang et al., 1992), il existe une activité
PLD indépendante du calcium. L’implication du calcium dans l’activation de la PLD des
cellules intactes a pu être montrée grâce à l’utilisation de différentes molécules :
- d’une part, grâce à deux ionophores de calcium qui
permettent l’augmentation de la concentration du calcium intracellulaire : l’ionomycine et
l’A23187. Ces deux composés sont capables de stimuler la PLD de plusieurs types cellulaires
comme les neutrophiles (Agwu et al., 1989), les cellules HL-60 (Billah et al., 1989) et les
plaquettes (Huang et al., 1991).
- d’autre part, grâce à des chélateurs d’ions calcium qui
l’empêchent d’agir sur ses différentes cibles. L’EGTA (chélateur du calcium extracellulaire)
et/ou le BAPTA (chélateur du calcium intracellulaire) bloquent l’activation de la PLD par
différents agonistes, dans plusieurs types cellulaires comme les cellules HL-60 et les
neutrophiles humains stimulés par le fMLP (Kessels et al., 1991), les cellules de
l’endothélium vasculaire humain stimulées par l’α-thrombine (Garcia et al., 1992). Ces études
suggèrent que la PLD peut être activée soit par la libération de calcium du réticulum
endoplasmique, soit par un apport de calcium extracellulaire, soit par les deux mécanismes,
selon le type cellulaire et l’isoforme de PLD considérés.
II.1.3.5 Régulation de la PLD par les lipoprotéines de basse densité (LDL) :
Les lipoprotéines de basse densité ou LDL sont des particules dédiées principalement au
transport du cholestérol dans la circulation sanguine. En effet, 70% du cholestérol transporté
dans le sang est contenu dans les LDL. De forme sphérique comme les autres lipoprotéines,
les LDL ont un diamètre moyen de 22 nm. Elles contiennent environ 25% de protéines pour
75% de lipides. La fraction protéique est constituée à plus de 95% par l’apoB100 synthétisée
34

au niveau du foie et provenant du catabolisme des VLDL. La fraction lipidique est constituée
principalement de phospholipides, de cholestérol, d’esters de cholestérol et de triglycérides
qui se répartissent sur deux zones : le noyau et la surface (figure 5). En plus des lipides, les
LDL transportent aussi des antioxydants lipophiles. L’antioxydant majeur est l’α-tocophérol
avec environ 6 molécules par LDL. D’autres antioxydants sont aussi présents comme le γ
tocophérol, des caroténoides, de la crypthoxanthine et de l’ubiquinol-10 (Esterbauer et al.,
1992 ; Ramos et al., 1995 ; Mertens et al., 2001).
Figure 5 : Structure d’une LDL, d’après Cooper et al., 2000.
Il est classiquement connu que les lipoprotéines sont oxydées au niveau des plaques
d’athérome après migration des LDL dans l’intima de la paroi artérielle : ce sont des
molécules proathérogènes et ce d’autant plus qu’elles sont oxydées. Les LDL oxydées
activent la PLD dans des cellules musculaires lisses de lapin alors que les LDL natives ou
acétylées ne l’activent pas (Natarajan et al., 1995). Cette activation de la PLD au niveau des
lésions athérosclérotiques permettrait de générer de l’acide phosphatidique puis de l’acide
lysophosphatique. Ces seconds messagers seraient impliqués dans l’augmentation de la
prolifération des cellules musculaires lisses. De même, dans les macrophages péritonéaux de
souris, les LDL oxydées activent la PLD (Gomez-Munoz et al., 2000). Plus le degré
d’oxydation des LDL est important, plus l’activation de la PLD augmente.
35

II.1.3.6 Régulation par des facteurs inhibiteurs de la PLD:
Les inhibiteurs cellulaires des PLD n’ont commencé à être isolés qu’après le clonage des
enzymes et pour certains d’entre eux grâce aux connaissances et aux outils qu’a procuré le
clonage des PLD.
II.1.3.6.1 Les protéines du cytosquelette :
La fodrine fut le premier inhibiteur de la PLD à avoir été caractérisé (Lukowski et al., 1996 ;
1998). Elle inhibe spécifiquement la PLD activée par ARF dans les cellules HL-60
perméablisées (Lukowski et al., 1996) en diminuant les taux de PIP et PIP2 membranaires
(Lukowski et al., 1998). La synaptojanine, une polyphosphoinositide 5-phosphatase de 150
kDa inhibe l’activation par ARF, Rho et Cdc42 des PLD dépendantes des phosphoinositides.
Son activité inhibitrice de la PLD se fait via l’hydrolyse du cofacteur PIP2 (Chung et al.,
1997). La gelsoline, protéine de 90 kDa liant l’actine, régulée par le calcium et les
phosphoinositides, inhibe l’activation de la PLD par la bradykinine dans les fibroblastes
NIH3T3 (Banno et al., 1999). Les protéines AP3 d’assemblage de la clathrine des synapses
(clathrin assembly protein 3) jouant un rôle important dans l’endocytose rapide et dans le
relargage de vésicules synaptiques (Lee et al., 2000) inhibent la PLD1 par interaction directe
(Lee et al., 1997). Les amphiphysines I et II, hétérodimères s’associant avec le manteau de
clathrine (Lee et al., 2000) inhibent la PLD. Dans le muscle cardiaque, l’α-actinine interagit
de façon réversible avec une région située dans les 185 premiers acides aminés de la PLD2
(Park et al., 2000). Elle n’inhibe la PLD2 qu’en présence de ARF. La β-actine régule
négativement la PLD1 et la PLD2 par interaction directe (Lee et al., 2001).
Les synucléines α et β, membres d’une classe de protéines de faibles masses moléculaires qui
inhibent les sérines/thréonines phosphatases et les protéines kinases dépendantes de la
calmoduline inhibent de façon sélective la PLD2 (Jenco et al., 1998).
II.1.3.6.2 Les céramides :
a) Voies de synthèse des céramides :
Les céramides, lipides appartenant au groupe des sphingolipides, sont impliqués dans la
régulation de diverses réponses cellulaires comme la prolifération, la différenciation et
l’apoptose (Perry et Hannun, 1998). La formation des céramides résulte principalement de
36

l’hydrolyse du pool de sphingomyélines par diverses sphingomyélinases, ou de la
biosynthèse de novo sous l’action d’une synthase (figure 6). Les céramides peuvent également
être générés par l’hydrolyse du pool de glycosphingolipides sous l’action d’hydrolases (ou
cérébrosidases).
Voie de synthèse de novo
Myriocine
Voie de la sphingomyélinase
Figure 6 : Métabolisme des sphingolipides d’après Hannun et Luberto, 2000. Les
inhibiteurs que nous avons utilisés lors de cette étude, et leurs cibles enzymatiques sont
mentionnés.
37
Fumonisine B1
désipramine
PDMP

La voie de biosynthèse de novo :
Elle est initiée à la surface du réticulum endoplasmique par une réaction de condensation de la
sérine avec du plamitoyl-CoA pour former la 3-cétosphinganine, réduite en
dihydrosphingosine. La céramide synthase (dihydrocéramide synthase ou sphinganine N-acyltransférase)
catalyse l’acylation de la dihydrosphingosine en dihydrocéramide. La mise en
évidence de l’activation de la synthèse de novo des céramides a été facilitée par l’utilisation
d’un inhibiteur spécifique de la céramide synthase, la fumonisine B1 (Merrill et al., 1996).
Les céramides, formés sous l’action d’une désaturase (dihydrocéramide réductase),
s’accumulent sur la face cytosolique du réticulum endoplasmique (Merrill et Wang, 1992 ;
Michel et Van Echten-Deckert, 1997) et servent de précurseur pour la synthèse de
sphingolipides complexes, comme les sphingomyélines et divers glycosphingolipides qui sont
dirigés vers différents compartiments subcellulaires.
La voie des sphingomyélinases :
La voie catabolique de formation des céramides implique l’action de sphingomyélinases,
phospholipases C spécifiques des sphingomyélines, qui hydrolysent la liaison phosphodiester
pour libérer les céramides et de la phosphorylcholine. Différentes isoformes de
sphingomyélinases ont été identifiées et se distinguent essentiellement par leur pH optimal
d’activité : elles portent le nom de sphingomyélinases acides, neutres / alcalines. Une fois
générés, les céramides peuvent transitoirement s’accumuler ou être convertis en d’autres
métabolites sous l’action de différentes enzymes : la céramidase coupe la liaison amide,
libérant un acide gras et de la sphingosine. Trois isoformes pH-dépendantes de céramidases
ont été identifiées : une céramidase acide, localisée dans les lysosomes (Sugita et al., 1972),
une céramidase neutre membranaire (Slife et al., 1989) localisée dans les cavéoles (Romiti et
al., 2001) et une forme neutre alcaline (El Bawab et al., 1999) localisée dans la mitochondrie
(El Bawab et al., 2000). Dans la plupart des cas, la sphingosine est métabolisée en
sphingosine 1-phosphate par une sphingosine kinase (Spiegel et al., 1996).
Dans certaines conditions, les deux voies de synthèse participent d’une manière additive à la
production des céramides et ceci dans le même type cellulaire et en réponse au même
stimulus. Il semblerait que la cinétique, l’amplitude de la réponse et même la composition en
38

espèces moléculaires des céramides formés par la synthèse de novo et la voie des
sphingomyélinases soient différentes (Kroesen et al., 2001). L’action du céramide semble être
compartimentalisée et il existe différents pools de céramides associés à des réponses
physiologiques spécifiques.
b) Effet des céramides sur la PLD :
La PLD a été décrite comme une cible des céramides. En effet, quelques études ont montré
que des céramides exogènes à courte chaîne (acétyle : C2-céramide, hexanoyle : C6céramide),
capables de traverser la membrane plasmique, inhibent la PLD de certains types
cellulaires, tels que les fibroblastes (Jones et Murray, 1995), les basophiles leucémiques
RBL2H3 (Nakamura et al., 1996), les neutrophiles (Nakamura et al., 1994). Dans les cellules
HL-60, les céramides à courtes chaînes inhibent la PLD1 GTPγS-dépendante associée à la
membrane plasmique, alors que le dihydrocéramide, analogue biologiquement inactif, n’a pas
d’effet (Venable et al., 1996). En système acellulaire, les céramides inhibent également
l’activité de la PLD2 recombinante (Singh et al., 2001). Les céramides à courtes chaînes (C2
céramide ou C6 céramide) inhibent l’activité PLD stimulée par la sphingosine-1 phosphate, le
LPA ou la thrombine dans les fibroblastes (Gomez-Munoz et al., 1994 et 1995).
De plus, d’autres études ont montré que l’expression de la PLD est très diminuée au cours de
l’apoptose induite par les céramides (Yoshimura et al., 1997). Ainsi, le traitement des cellules
gliales C6 de rat par des céramides exogènes conduit à l’apoptose et à une diminution de
l’activité PLD GTPγS-dépendante, accompagnée d’une diminution de l’expression des
ARNm de la PLD1 alors que celle des ARNm de la PLD2 reste inchangée (Yoshimura et al.,
1997). Dans des fibroblastes de rat, le C2-céramide et le C6-céramide inhibent les effets
mitogéniques de PA, LPA et sphingosine-1 phosphate. Par contre, le rôle des céramides
endogènes sur l’activité PLD reste hypothétique, puisqu’à ce jour seul l’effet inhibiteur des
céramides exogènes a été largement décrit. Les céramides pourraient agir sur la PLD de façon
indirecte via des protéines impliquées dans sa régulation. En effet, de nombreux travaux ont
montré que les céramides inhibent la translocation du cytosol à la membrane des PKCα, β1,
β2 et des protéines ARF et Rho (Venable et al., 1996 ; Singh et al., 2001). Dans les cellules
Jurkat, Signorelli et al. en 2001 ont montré que des céramides générés sur le feuillet externe
de la membrane plasmique par traitement avec de la sphingomyélinase bactérienne sont
capables de réverser la translocation de la PKC à la membrane. Dans les cellules
39

endothéliales, il est possible que les céramides générés au niveau de la membrane
plasmique/caveolae modulent l’activité PLD via une PKC. Par ailleurs, la nature hydrophobe
du céramide est un élément majeur dans la détermination de ses cibles potentielles. En effet, il
est vraisemblable que l’action du céramide soit localisée au niveau des membranes où il a été
formé, puisqu’à l’heure actuelle, aucune protéine de liaison au céramide, permettant son
transport d’un compartiment à l’autre n’a été décrite. Il est donc vraisemblable que selon la
voie/le site de formation du céramide, il agira ou non sur l’une ou l’autre des isoformes de
PLD, et sur ses protéines régulatrices.
II.1.4 Localisation des PLD :
Etant donné que les PLD ont des fonctions variées, il est possible que leurs localisations
subcellulaires et tissulaires expliquent leurs rôles physiologiques respectifs.
II.1.4.1 Localisation tissulaire :
La connaissance des séquences des ADNc de chaque isoforme de PLD a permis de déterminer
l’expression de leurs messagers dans les tissus par l’utilisation de sondes radioactives
spécifiques de hPLD1 et hPLD2. Les isoformes issues du gène PLD1 ont une expression
restreinte à certains tissus comme la moelle épinière, le cerveau, le cœur, le placenta, la rate et
le pancréas. Leur expression est particulièrement faible dans les poumons, le thymus, la
trachée, les ganglions lymphatiques et les leucocytes (Steed et al., 1998). Les transcrits de
PLD1 ne sont pas détectables dans le muscle adulte de rat (Katayama et al., 1998). La PLD1b
semble majoritairement exprimée et le niveau relatif de la PLD1a varie selon les tissus (Steed
et al., 1998; Katayama et al., 1998; Millar et al., 1999). L’expression de PLD2 semble
beaucoup moins restreinte. La hPLD2 est fortement exprimée dans le placenta, le thymus, la
prostate, les ovaires, la thyroide, la trachée et la moelle épinière. Les mPLD2 et rPLD2 ont
une répartition tissulaire semblable à celle de la hPLD2 (Colley et al., 1997b ; Kodaki et
Yamashita, 1997), à l’exception du thymus et de la rate où cette enzyme est beaucoup plus
abondante chez l’homme que chez les rongeurs. Des trois isoformes de la PLD2, PLD2a est la
plus largement exprimée quel que soit le tissu étudié.
40

II.1.4.2 Localisation subcellulaire :
Des expériences de fractionnement subcellulaire et des études de caractérisation ont démontré
la présence d’une activité phospholipasique D dans les différents compartiments des
membranes cellulaires y compris l’enveloppe nucléaire, le réticulum endoplasmique,
l’appareil de Golgi, la membrane plasmique et les vésicules de transport et de sécrétion
cellulaire. Des fractionnements subcellulaires du foie de rat (Provost et al., 1996) montrent
que l’activité PLD est la plus forte au niveau de la membrane plasmique bien qu’une activité
significative soit également retrouvée au niveau du noyau et de l’appareil de Golgi.
Dans les noyaux de cellules MDCK, une activité PLD stimulée de façon synergique par
l’ATP et le GTPγS a été retrouvée (Balboa et al., 1995). La protéine Rho, présente au niveau
du noyau pourrait être impliquée dans cette activation de la PLD et dans l’augmentation de
PA et de DAG détectée. En 1995, Ktistakis et al. ont montré l’existence d’une activité PLD
dépendante d’ARF plus importante dans les fractions cellulaires contenant des membranes
enrichies en appareil de Golgi que dans les fractions enrichies en réticulum endoplasmique ou
en membrane plasmique. Cependant, des études réalisées en transfectant des fibroblastes
d’embryons de rat avec de la hPLD1 recombinante n’ont pas montré de localisation au niveau
de l’appareil de Golgi mais dans le réticulum endoplasmique et les endosomes (Colley et al.,
1997a). Des constructions de PLD1a et b recombinantes couplées à la protéine fluorescente
GFP exprimées dans les cellules COS-1 et RBL-2H3 ne montrent pas de localisation dans le
Golgi. Dans les cellules RBL-2H3, la PLD1b est retrouvée dans les granules de sécrétion et
les lysosomes (Brown et al., 1998). Dans les mitochondries, une activité « PLD-like » a été
rapportée, elle serait sensible au calcium mais ne catalyserait pas de réaction de
transphosphatidylation (Madesh et al., 1997).
Une des fonctions proposées pour les PLD de mammifères est de médier le remaniement du
cytosquelette induit par différents agonistes. Dans les cellules U937 perméabilisées et activées
par du GTPγS, la PLD1 a été localisée dans des fractions insolubles contenant les éléments du
cytosquelette. Cette activité PLD associée au cytosquelette est réduite par l’exotoxine C3 de
C. botulinum qui inactive spécifiquement RhoA (Iyer et Kusner, 1999). De plus, la présence
de la PLD au niveau du cytosquelette est associée à une cotranslocation de ARF et RhoA.
Cette phospholipase D dépendante de RhoA est impliquée dans la formation de fibres de
stress induite par le lysoPA (Ha et al., 1994 ; Cross et al., 1996). Dans les fibroblastes, il a été
montré que la PLD2 se localise préférentiellement au niveau de la membrane plasmique des
41

cellules quiescentes (Colley et al., 1997b). Les cavéoles sont riches en activité PLD et sont
impliquées dans le trafic vésiculaire probablement via cette enzyme. En effet, dans différentes
cellules épithéliales (kératinocytes, cellules de colon et cellules de cancer du sein), les
membranes riches en cavéoles présentent une activité PLD (Czarny et al., 1999). Sur des
kératinocytes humains HaCaT, des travaux récents ont montré que la PLD2 est la forme
prédominante dans les cavéoles (Czarny et al., 2000). Une localisation de la PLD1 au niveau
des microdomaines a été aussi rapportée dans les cellules COS-7, les myoblastes, les
lymphocytes (Kim et al., 2000 ; Meacci et al., 2000 ; Diaz et al., 2002).
Une des PLD au moins est présente dans chaque compartiment membranaire. La répartition
de chaque isoforme semble être dépendante du type cellulaire étudié et de l’état d’activation
de la cellule. De plus, la diversité des mécanismes de régulation de chaque isoforme pourrait
également correspondre à leur répartition dans les différents compartiments cellulaires et
tissulaires.
II.1.5 Rôle physiologique de la PLD et de ses produits :
La PLD peut théoriquement exercer ses effets biologiques par différents mécanismes :
l’action directe d’hydrolyse des phospholipides (PC, PE, PI) induit des modifications dans les
propriétés physico-chimiques des membranes en altérant leur composition. L’action de la
phospholipase D sur son substrat majeur la PC aboutit à la production de l’acide
phosphatidique et de la choline : l’acide phosphatidique, le plus simple des
glycérophospholipides est considéré comme un second messager intracellulaire et peut être
métabolisé en deux autres seconds messagers importants : le diacylglycérol (DAG) dû à
l’action d’une phosphatidate phosphohydrolase (Jamal et al., 1991) et l’acide
lysophosphatidique (LPA) dû à l’action d’une phospholipase A2 spécifique de l’acide
phosphatidique (Thomson et Clark, 1995).
II.1.5.1 Rôle de la PLD dans la différenciation cellulaire :
La différenciation de divers types cellulaires est accompagnée d’une augmentation de
l’activité et/ou de l’expression des PLD suggérant l’implication de cette enzyme dans ce
processus. L’activation de la PLD par l’ester de phorbol TPA est suffisante pour déclencher
42

une différenciation complète des cellules L6C5. De même, la surexpression de l’isoforme
PLD1b favorise l’engagement des cellules dans la myogénèse (Komati et al., 2005).
L’arg 8 vasopressine (AVP), une hormone neurohypophysaire qui est un puissant inducteur de
la différenciation myogénique (Nervi et al., 1995), déclenche précocément l’activation des
voies de la PIP2-PLC et de la PLD dans les myoblastes. La réponse myogénique peut
intervenir pour des concentrations nanomolaires d’AVP, auxquelles seule la PLD, et non la
PLC, est activée, ce qui suggère l’implication prépondérante de la voie PLD, et donc de son
produit le PA, dans ce processus (Naro et al., 1997). Dans les cellules myéloïdes humaines
HL60, l’activité basale de la PLD est faible mais elle peut-être rapidement augmentée au
cours du processus de différenciation induit par des composés comme le dibutyryl-AMPc ou
l’acide rétinoïque « all-trans » (Nakashima et al., 1996 ; El Marjou et al., 2000). L’activation
de la PLD par le GTPγS est également augmentée, suggérant que les facteurs activateurs de la
PLD ou que la PLD elle-même puissent être régulés durant la différenciation.
Le groupe de Nakashima a rapporté que l’expression des différentes isoformes de PKC
(PKCα et β) activatrices de la PLD augmente progressivement au cours de ce processus.
L’expression des PKC βI et βII est respectivement de 3 et 9 fois plus élevée après 1 jour de
différenciation par l’acide rétinoïque (Nakashima et al., 1996). De même durant ce processus,
l’expression des petites protéines G, ARF, Rac et Cdc42 est augmentée dans le cytosol de
cellules HL60 différenciées par rapport à celui des cellules non différenciées. L’augmentation
de l’activité PLD observée au cours du processus de la différenciation est due au niveau
d’expression de ces régulateurs mais aussi à une augmentation de l’expression des ARNm des
PLD1 et PLD2.
Le groupe de Yoshimura a montré en 1996 que la différenciation de cellules neuronales est
accompagnée d’une augmentation des ARNm de la PLD1. La différenciation par le dibutyryl-
AMPc des cellules PC12 de rat en neurites provoque une augmentation des ARNm de la
rPLD1b tandis que ceux de la rPLD1a et de la rPLD2 restent inchangés. La différenciation de
ces cellules par le NGF conduit à une augmentation des deux variants rPLD1a et b sans
modifier la rPLD2. Komati et al., (2005), montrent que les deux isoformes de la PLD sont
exprimées dans les myoblates au niveau des ARNm et des protéines et que l’expression de la
PLD1 mais pas celle de PLD2 est down-régulée au cours de la différenciation myogénique.
Les deux isoformes de PLD jouent des rôles distincts. La PLD1 pourrait être requise pour le
déclenchement du processus myogénique et disparaîtrait lorsque les cellules sont engagées.
La PLD2 pourrait jouer plutôt un rôle de maintenance des fonctions cellulaires de base.
43

L’implication de la PLD dans la différenciation et dans la régulation des fonctions cellulaires
est complexe et fait intervenir des modifications transcriptionnelles des PLD elles-mêmes et
de leurs nombreux régulateurs, mais aussi leurs modifications post-transcriptionnelles dont
beaucoup restent à identifier.
II.1.5.2 La PLD dans la régulation de la sécrétion et du trafic vésiculaire :
L’addition de PA exogène, ou la génération de ce lipide par une PLD exogène d’origine
bactérienne, stimule les fonctions sécrétoires physiologiques dans différents types cellulaires
comme la sécrétion d’aldostérone par les cellules glomérulaires surrénales (Bollag et al.,
1990) et la sécrétion d’insuline par les îlots du pancréas (Metz et Dunlop, 1990). Selon les
données de la littérature, c’est par la production du PA que la PLD est impliquée dans
l’exocytose : le PA est un phospholipide régulateur de la dynamique membranaire. Le rôle du
PA dans l’exocytose est lié à sa capacité à réguler la PI(4)P5-kinase (Jenkins et al., 1994), une
des enzymes nécessaires à la synthèse du PIP2. Ce phospholipide est essentiel au trafic
membranaire, à l’exocytose et à la régulation du cytosquelette (De Camilli et al., 1996). Rho
et PKC, régulateurs de la PLD, sont impliqués dans l’exocytose des cellules RBL
perméablisées (Hammond et al., 1997). L’adjonction de Rho et Rac mutants présentant une
activité constitutivement élevée sur ces cellules augmente la sécrétion (Price et al., 1995).
L’ensemble de ces données souligne l’importance de la PLD, de son produit PA, de son
cofacteur PIP2 et de plusieurs de ses activateurs ARF, Rho et PKC dans la stimulation de la
sécrétion, du trafic vésiculaire et de la formation de vésicules. Le phénomène de fusion
membranaire s’accompagne de changements dans la composition en phospholipides des
membranes. La stimulation de l’activité PLD provoque une redistribution des phospholipides
membranaires avec un remplacement de la PC par du PA qui est un lipide fusogène. Le PA
est un lipide moins encombrant que la PC et plus riche en charges négatives.
Des cations divalents comme le calcium peuvent lier les phospholipides anioniques adjacents,
ce qui résulte en leur regroupement et incurve la membrane lipidique vers l’intérieur (Powell
et Hui, 1996).
Un des mécanismes moléculaires importants dans la formation des vésicules est la
participation et/ou la modification du cytosquelette d’actine. Il y a un réarrangement du réseau
d’actine mettant en jeu de très nombreuses protéines contrôlant l’élongation des filaments,
44

leur organisation et leur stabilité. Nombre de ces protéines possèdent des sites d’interaction
avec les phospholipides membranaires.
II.1.5.3 Rôle de la PLD dans le remaniement du cytosquelette :
Les PLD de mammifères jouent un rôle dans le remaniement du cytosquelette induit par
différents agonistes. Plusieurs équipes ont pu établir un lien entre l’acide phosphatidique et la
polymérisation de l’actine, dans différents types cellulaires dont les fibroblastes Rat-1, Swiss
3T3 et IIC9 (Ridley et al., 1992; Van der Bend et al., 1992; Ha and Exton, 1993; Ha et al.,
1994), les cellules endothéliales de l’aorte de porc (PAEC) (Cross et al., 1996), les
neutrophiles (Siddiqui and English, 1997) et les monocytes (Zhou et al., 1995). Ha et Exton
en 1994 ont montré que le changement morphologique des fibroblastes IIC9 d’une forme
semi-circulaire à une forme allongée peut être induit par l’α-thrombine et s’accompagne de la
formation de fibres de stress. Sur ces mêmes cellules, l’ajout de PA exogène ou d’une PLD
bactérienne, produit les mêmes effets que ceux obtenus par la stimulation avec l’α-thrombine
alors que d’autres phospholipides, le PMA, le DAG, et la PLC bactérienne ne permettent pas
de reproduire ces effets.
Le PA produit par la PLD peut être métabolisé en LPA sous l’action d’une phospholipase A2
spécifique (Thomson et Clark, 1995). Ce dernier phospholipide intervient dans l’organisation
du cytosquelette d’actine (Moolenaar, 1995). Ha et al. (1994) ont montré que le LPA entraîne
une augmentation de la polymérisation de l’actine et une hausse très rapide des taux de PA
endogène due à l’activation de la PLD. Le LPA stimulerait la PLD via une protéine G sensible
à la toxine pertussique. La stimulation des récepteurs au LPA active la PLD ainsi que la
formation de fibres de tension dans les cellules endothéliales de l’aorte chez le porc (Cross et
al., 1996). Le même effet est observé quand on ajoute du PA exogène aux cellules. En
présence de butanol-1, la PLD stimulée par le LPA catalyse une réaction de
transphosphatidylation qui permet la formation de phosphatidylbutanol aux dépens du PA et
il en résulte une inhibition de la formation des fibres de stress. Porcelli et al. en 2002 ont
montré que la sphingosine-1-phosphate (S1P) induit la formation des fibres de stress dans les
cellules épithéliales humaines et que la PLD serait un des composants de la voie de
signalisation en aval du récepteur de la S1P. Dans les cellules U937, la PLD1 est associée à
une fraction insoluble à l’octylglucoside correspondant vraisemblablement au cytosquelette :
cette PLD1 est activée par RhoA et ARF (Iyer et Kusner, 1999). L’exoenzyme C3 qui inactive
45

les protéines Rho inhibe la formation des fibres de stress stimulées par le LPA ou le PA dans
les fibroblastes. Ceci montre l’importance du PA comme second messager dans la régulation
du cytosquelette via les protéines Rho. Dans les fibroblastes 3T3 activés (Ridley, 1999), les
protéines Rho sont responsables de la formation de fibres de stress. Dans les fibroblastes,
l’AVP peut induire une formation Rho-dépendante des fibres de stress via la médiation des
protéines Gα12 (Gohla at al., 1999). Nous avons montré en 2005 que la PLD intervient dans la
réponse myogénique via une réorganisation du cytosquelette. Les inducteurs de
différenciation AVP et TPA provoquent une formation de « Stress Fiber Like Structures »
(SFLS) concomitante avec l’activation de la PLD et PLD-dépendante. La PLD1 est
transloquée au niveau des fibres d’actine. A l’aide d’une sonde fluorescente intracellulaire
liant spécifiquement le PA, nous avons montré que ce messager participe activement au
processus de mise en place des SFLS. En effet, il est sélectivement accumulé au niveau des
SFLS naissantes. De nombreux auteurs ont montré que les deux isoformes PLD1 et PLD2 ont
des fonctions différentes dans un même type cellulaire. Dans les mastocytes, la PLD2, et non
la PLD1, est impliquée dans la formation des «ruffles» au niveau de l’actine corticale après la
stimulation antigénique (O’Luanaigh et al., 2002). La surexpression de la PLD2 provoque
l’apparition de filopodes dans les cellules fibroblastiques (Colley et al., 1997b). Au contraire
la PLD1, et non la PLD2, participe à la formation des fibres de stress dans les fibroblastes
(Kam and Exton, 2001). Cette différence dans les rôles physiologiques des deux isoformes de
PLD peut être attribuée au fait qu’elles ont des localisations subcellulaires distinctes (Colley
et al., 1997b; Diaz et al., 2002).
II.1.5.4 Rôle de la PLD dans la prolifération, la survie et la mort cellulaires :
Le PA est un second messager de toute première importance impliqué dans le contrôle de la
prolifération. La PLD responsable de sa synthèse est connue pour être activée par de
nombreux mitogènes, de nombreux facteurs de croissance dont les récepteurs possèdent une
activité tyrosine kinase intrinsèque comme celui de l’EGF (Zhang et Aktar, 1998), ou sont
couplés à une protéine G. L’effet de la PLD sur la prolifération semble s’exercer via le PA
mais aussi le LPA. L’addition de PA ou de LPA exogène à des cellules de carcinome (Van
Corven et al., 1989), à des fibroblastes ou des cellules mésangiales (Knauss et al., 1990)
stimule la synthèse d’ADN. Dans de nombreux modèles cellulaires, l’inhibition de la PLD par
des alcools primaires provoque l’arrêt de la prolifération (Kötter et al., 2000). Il est important
de noter que la PLD et ses métabolites (PA, LPA, DAG) ne représentent qu’une des voies de
46

signalisation permettant la prolifération cellulaire. L’activation de la PLD est très souvent
parallèle à l’activation de la PLC provoquant la stimulation de PKC et la mobilisation du
calcium intracellulaire, activateurs directs de la PLD et de la prolifération (Boarder, 1994).
La réponse mitogènique ne dépend pas toujours de l’activation de la PLD et inversement
l’activation de la PLD n’est pas systématiquement associée à la prolifération cellulaire.
L’activation de la PLD dans les lymphocytes est connue pour induire des signaux
antiprolifératifs (Gilbert et al., 1998). Diaz et al., (2002) ont montré que l’activation de la
PLD produite par l’enrichissement en DHA des membranes de PBMCs inhibe fortement la
réponse lymphoproliférative aux mitogènes. L’exclusion des protéines kinases Lck et de la
PLD1 des microdomaines après enrichissement des cellules en DHA est probablement l’un
des facteurs responsables de l’inhibition de la transduction du signal mitogénique et donc de
l’effet antiprolifératif de cet acide gras. Certains activateurs de la voie SMase/céramide
inducteurs d’apoptose tels que le TNFα ou la daunorubicine sont susceptibles d’activer à la
fois cette voie pro-apoptotique et la voie du DAG via l’activation de la PLD ou de la PLC
(Avila et al., 1993 ; Bettaieb et al., 1999). Il est donc possible qu’en présence de stimuli
extracellulaires, il y ait activation de ces deux voies de signalisation parallèles, dont les effets
sont opposés. Ainsi en fonction du rapport DAG/céramide, la réponse cellulaire pourrait être
orientée soit vers un signal apoptotique soit vers un signal de prolifération. La PLD en
générant du PA aboutit à la production de DAG, antagoniste du céramide et peut donc jouer
un rôle protecteur vis-à-vis de l’apoptose. Plusieurs études ont montré que les céramides
exogènes conduisent à une inhibition de l’activité et de l’expression de la PLD (Nakashima et
Nozawa, 1999) et inversement que le PA régule certaines étapes de la voie des céramides. Ces
systèmes sont donc reliés par diverses régulations croisées.
47

II.2 LA MYOGENESE :
Le muscle squelettique humain a été très tôt considéré comme un système modèle pour le
développement de thérapie cellulaire. La formation du muscle squelettique au cours de
l’embryogénèse passe par une série d’étapes qui démarre par l’engagement de précurseurs
totipotents d’origine mésodermique vers le lignage musculaire pour donner des myoblastes
(étape de détermination). Les myoblastes prolifèrent jusqu’à ce qu’ils reçoivent les signaux
induisant leur différenciation. A ce stade, ils sortent du cycle cellulaire, fusionnent et se
différencient en myotubes. Au cours d’une dernière étape dite de maturation, les myotubes
acquièrent des propriétés contractiles caractéristiques de la fibre musculaire. La myogénèse
intervient aussi dans le muscle adulte. Quand le muscle est intact, les fibres musculaires
différenciées sont post-mitotiques et les cellules souches de remplacement appelées cellules
satellites sont quiescentes. En cas de lésions traumatiques ou pathologiques, les cellules
satellites sont activées, prolifèrent puis se différencient pour reformer les fibres lésées.
II.2.1 Les principales étapes de la différenciation des cellules musculaires :
II.2.1.1 Durant le développement embryonnaire :
Chez les vertébrés supérieurs, les muscles squelettiques dérivent pour la plupart des somites.
Ces derniers sont des structures sphériques issues de segmentation du mésoderme paraxial
suivant un axe antéro-postérieur, de part et d’autre du tube neural (Chevalier et al., 1977).
Ce sont des structures épithéliales qui subissent rapidement une différenciation
morphologique après leur formation : le somite se subdivise pour donner le sclérotome (la
partie ventrale) et le dermomyotome (la partie dorsale) (figure 7). Le sclérotome est à
l’origine des cellules du cartilage, des os, des vertèbres et des côtes. Le dermomyotome va
donner le derme et le muscle squelettique. Les somites de la partie dorsale sont divisés en
deux parties : latérale et médiane. Dans la partie médiane, les cellules donnent le myotome à
l’origine de la musculature axiale. Dans la moitié latérale, les cellules migrent vers leur
localisation finale où ils forment la musculature des membres et de l’abdomen. (Brand-Saberi
et Christ, 1999).
48

Figure 7 : Représentation schématique d’un somite au stade épithélial (A) et à un stade
plus avancé (B). Le somite épithélial (A) se subdivise pour donner le sclérotome (à l’origine
du cartilage, des vertèbres, des côtes et des os) et le dermomyotome (B) à l’origine des
muscles squelettiques et du derme. TN : tube neural, NC : notochorde (Picard et al., 2003).
Les cellules somitiques évoluent en cellules fusiformes de la lignée myogénique, appelées
myoblastes présomptifs ou prémyoblastes via un processus de détermination. La
détermination du phénotype myogénique est dirigée par une hiérarchie de divers gènes
régulateurs codant pour des protéines qui sont des facteurs transcriptionnels spécifiques du
muscle squelettique.
II.2.1.2 La différenciation : de la prolifération à la fusion des myoblastes :
L’étude du développement des cellules myogéniques in vitro a grandement contribué à
modéliser les étapes précoces de l’ontogenèse des cellules musculaires. Les cultures
cellulaires montrent que les premières cellules reconnaissables de cette filiation sont les
49

myoblastes présomptifs ou prémyoblastes. Ceux-ci prolifèrent activement, poursuivant au
moins un cycle de division cellulaire, et présentent une motilité plutôt active comparée à celle
d’autres types cellulaires en culture (Yaffe, 1971). Leur fonction est d’assurer l’extension et la
mise en place de la lignée myogénique sur les sites destinés à la formation des muscles.
Lorsqu’ils sont arrivés au sein des masses pré-musculaires, ils vont arrêter leur prolifération et
quitter irréversiblement le cycle cellulaire, ils prennent alors le nom de myoblastes postmitotiques
(figure 8). Même après que le cycle de division a cessé, la migration des
myoblastes en culture continue, cette phase aboutissant à l’alignement des myoblastes en
chaînons de cellules bipolaires accolées par leurs extrémités (Nameroff et Munar, 1976).
Grâce à des mécanismes de reconnaissance cellulaire faisant intervenir des molécules
d’adhésion membranaires, les myoblastes fusionnent (figure 8). Les cellules s’engagent dans
une voie de différenciation au cours de laquelle les cellules subissent des modifications
importantes de leur forme, de leurs propriétés fonctionnelles, et de l’expression de leurs
constituants protéiques. Le programme de différenciation est marqué par la sortie des
myoblastes du cycle de réplication et se restreint aux cellules arrêtées en phase G0 ou G1.
(Okazaki et Holtzer, 1966 ; Bischoff et Holtzer, 1969). Ainsi, les cellules bloquées avec du
colcémide ne présentent pas de signes de différenciation en phase S, G2 et M (Dienstman et
Holtzer, 1977). La fusion des myoblastes donne naissance à des cellules allongées appelées
myotubes polynucléés (Cossu et al., 1996) exprimant diverses protéines spécifiques du muscle
comme l’actine-alpha sarcomérique, les chaînes lourdes et légères de la myosine
sarcomérique, la tropomyosine, la troponine, et les récepteurs nicotiniques à l’acétylcholine,
des enzymes cytoplasmiques nécessaires à l’énergétique de la cellule musculaire comme la
myokinase et la créatine kinase. La plupart des ces protéines sont codées par des familles
multigéniques et sont présentes sous différentes isoformes exprimées à différentes périodes du
développement (Buckingham et al., 1985). La synthèse de ces protéines devient détectable
quand les myoblastes commencent à fusionner 12 h après les avoir placés dans un milieu de
culture qui diminue la vitesse de prolifération et induit la différenciation.
50

Figure 8 : Les principales étapes de la différenciation morphologique des cellules
musculaires.
De nombreux changements membranaires et intracellulaires surviennent pendant la période de
fusion qui touchent aussi bien la constitution protéique et lipidique que l’organisation des
structures membranaires et du cytoplasme. A partir de la période de fusion, le processus de
différenciation semble s’accélérer et la vitesse de transcription des gènes codant pour les
protéines spécifiques du muscle augmente (Devlin et Emerson, 1978). Ces évènements
membranaires s’accompagnent également de changements importants au niveau du
cytosquelette. Cette réorganisation du cytosquelette durant la fusion est en accord avec le fait
que des agents comme la cytochalasine qui affecte les microfilaments bloquent également la
fusion. L’actine est la protéine la plus abondante représentant, en moyenne 5% des protéines
totales. On connaît au moins six gènes codant pour différentes isoformes d’actine chez les
vertébrés (Vandekerkhove et Weber, 1978), à savoir les deux isoformes non musculaires β et
γ, et 4 isoformes exprimées différentiellement dans les muscles: la forme α-squelettique, la
forme α-cardiaque, la forme α-vasculaire et la forme α-entérique. Les myoblastes en
prolifération expriment dans leur cytoplasme les isoformes ubiquitaires β et γ, alors que,
51

quand le programme de différenciation se poursuit, l’expression de ces deux isoformes est
réduite tandis que l’expression de l’isoforme α-squelettique est activée.
II.2.1.3 La maturation :
Les myotubes organisent progressivement leur appareil myofibrillaire et leur cytosquelette de
façon à constituer une cytoarchitecture ordonnée et adaptée aux exigences de la fonction de
contraction. Les myofibrilles représentent environ 2/3 de la masse sèche de la cellule
musculaire, et en constituent l’unité fonctionnelle. Ce sont de longs cylindres, pouvant
atteindre plusieurs centimètres, de un à deux µm de diamètre. Elles présentent une structure
périodique extrêmement régulière apparaissant sous la forme d’une alternance de bandes
transversales sombres et claires. Chaque myofibrille est constituée d’un empilement d’unités
contractiles : les sarcomères (figure 9). Chaque sarcomère comprend un assemblage miniature
de filaments parallèles et partiellement chevauchants, arrangés de façon précise. A fort
grossissement, une série de bandes claires (bandes I) et foncées (bandes A) peuvent être
observée dans chaque sarcomère : une ligne dense au centre de chaque bande claire sépare un
sarcomère du suivant : la ligne Z, (ou disque Z), qui est formée par l’organisation des
filaments d’alpha-actinine reliant les extrémités des filaments fins de chaque sarcomère entre
elles et avec les extrémités des filaments fins du sarcomère adjacent. Les filaments minces,
composés d’actine et de protéines associées sont attachés aux disques Z, aux deux extrémités
du sarcomère. Ils s’étendent vers l’intérieur en direction du milieu du sarcomère, où ils se
chevauchent avec les filaments épais, qui sont des polymères d’isoformes de myosines II
spécifiques du muscle. Quand cette région de chevauchement est examinée en coupe
transversale en microscopie électronique, on voit que les filaments de myosine sont arrangés
en un réseau hexagonal, avec les filaments d’actine placés régulièrement entre eux. D’autres
protéines accessoires maintiennent l’architecture de la myofibrille et lui procurent son
élasticité : la titine et la nébuline qui forment un réseau de fibres associées avec les filaments
d’actine et de myosine. Les molécules de titine, en forme de ficelle, s’étendent depuis les
filaments épais jusqu’aux disques Z. Elles agiraient comme des ressorts pour maintenir les
filaments épais de myosine centrés dans le sarcomère. La nébuline est associée avec les
filaments fins d’actine et elle pourrait donc agir comme une règle moléculaire pour contrôler
l’assemblage de l’actine et la longueur des filaments d’actine pendant le développement du
muscle. Les myofibrilles sont liées l’une à l’autre, côte à côte, par un système de filaments
52

intermédiaires de desmine et l’arrangement entier est ensuite ancré dans la membrane
plasmique du muscle par diverses protéines comme la dystrophine, protéine allongée et
flexible liant l’actine.
Figure 9 : Structure du muscle squelettique : schéma représentant les niveaux
d’organisation du muscle squelettique depuis l’ensemble du muscle dans l’organisme
jusqu’au sarcomère individuel.
53

II.2.2 Les facteurs régulateurs de la myogénèse :
De nombreux facteurs de transcription impliqués dans l’induction de la myogénèse ont été
identifiés (Perry et Rudnick, 2000).
II.2.2.1 Les protéines de type hélice-boucle-hélice basique. (bHLH) :
Ces facteurs appartiennent à la famille MRF (myogenine regulatory factor) et sont au nombre
de quatre : MyoD (myogenic determination), Myf5 (myogenic factor 5), myogénine, MRF-4
(myogenine regulatory factor 4). Ce sont des facteurs de transcription spécifiques du muscle
squelettique.
Figure 10 : Structure des protéines de type hélice-boucle-hélice basique.
La conversion de plusieurs types cellulaires non musculaires en cellules musculaires
squelettiques peut être ainsi provoquée par l’expression forcée des facteurs myogéniques
bHLH soit in vitro (Choi et al., 1990), soit in vivo (Miner et al., 1992). Ceci laisse à penser
que ces facteurs bHLH jouent un rôle important dans l’initiation et le maintien du phénotype
différencié (Rudnicki et Jaenisch, 1995). Ces régulateurs activent la transcription de gènes de
différenciation musculaire en se fixant sous forme d’hétérodimères (figure 10) sur des
séquences spécifiques CANNTG, appelées boîtes E, présentes dans les promoteurs de ces
gènes (Sabourin et Rudnicki, 2000). Les ARNm de ces protéines régulatrices apparaissent
54

dans les myoblastes embryonnaires et fœtaux. Au cours de l’embryogenèse de la souris, les
quatre facteurs myogéniques sont exprimés selon une séquence spatio-temporelle spécifique
(Currie et Ingham, 1998) (figure 11). L’expression séquentielle de ces facteurs au cours de la
différenciation musculaire in vitro et in vivo et les phénotypes distincts obtenus chez la souris
par invalidation génique de chacun d’entre eux, ou en combinaison, montrent que les
différents facteurs myogéniques exercent des fonctions différentes quoique partiellement
redondantes, sur la détermination et la différenciation musculaire (Arnold et Winter, 1998).
Chez les mammifères, Myf5 est le premier exprimé. Chez le poulet, l’ordre d’apparition entre
Myf5 et MyoD ne semble pas clair (Wigmore et Evans, 2002). Une absence complète de
muscle est constatée chez les souris portant la double mutation MyoD (-/-) et Myf-5 (-/-). Les
deux facteurs seraient indispensables à la formation et la survie des myoblastes. MyoD et
Myf-5 sont qualifiés de gènes de détermination myogénique et participent à la régulation du
cycle cellulaire. MyoD et Myf-5 sont les seuls MRF à être exprimés dans les cellules en
prolifération mais à des phases différentes du cycle cellulaire. L’induction de la
différenciation à la fin de la phase G1 apparaît dépendante de l’accumulation de MyoD audelà
d’une valeur seuil, supposant un mécanisme de régulation du niveau d’expression de la
protéine MyoD à cette période précise du cycle (Kitzmann et al., 1999). L’activation de la
myogénine et de MRF4 est importante pour la différenciation terminale et dépend de
l’expression de MyoD ou Myf-5 (Rudnicki et al., 1993). La séquence d’apparition des
facteurs myogéniques est un indicateur de l’état cellulaire au cours de son évolution jusqu’à la
fusion avec une autre cellule musculaire. Au cours de la myogenèse, la différenciation
terminale est marquée par l’expression de la myogénine. Tous les myoblastes synthétisant la
myogénine en culture sont en cours de différenciation. Ils sont aptes à la fusion et à la
synthèse des protéines structurales musculaires (Yoshida et al., 1998).
55

Figure 11 : Séquence d’expression des facteurs myogéniques au cours de la myogénèse.
II.2.2.2 Les facteurs de transcription à boîte MADS :
Les facteurs de transcription à boîte MADS (MCM1, Agamous, Deficiens et Serum response
factor SRF) constituent une famille de protéines incluant les facteurs de transcription
métazoaires SRF et MEF2 ( myocyte enhancer factor 2) qui jouent un rôle clé dans le contrôle
de divers processus biologiques. Chez les vertébrés, le facteur de transcription SRF contrôle
l’expression des gènes précoces dans de nombreux tissus, et des gènes exprimés
spécifiquement dans les muscles. Pour leur part, les facteurs MEF2 ont été impliqués dans la
régulation de l’expression des gènes musculaires, la différenciation des cellules du muscle
squelettique. La boîte MADS est un motif structurellement très conservé de 56 acides aminés
présent dans le domaine de liaison à l’ADN des membres de cette famille (Huang et al.,
2000), qui possèdent également des spécificités de liaisons à l’ADN très similaires.
II.2.2.2.1 Facteurs de transcription SRF :
SRF (serum response factor), d’une masse moléculaire de 67 kDa, est un facteur
transcriptionnel ubiquitaire qui permet la régulation de nombreux gènes impliqués dans la
prolifération cellulaire et dans la différenciation musculaire. SRF semble assurer son rôle à
travers sa fixation en homodimère sur une séquence d’ADN de 10pb (CC(A/T)6GG) nommé
boîte CArG située dans la séquence régulatrice de plusieurs gènes spécifiques des muscles.
56

L’invalidation complète du gène SRF entraîne une léthalité précoce des embryons de souris
dès 6,5 jours de développement et révèle un rôle essentiel de SRF dans la formation du
mésoderme (Arsenian et al.,1998). L’invalidation conditionnelle du gène SRF (utilisant le
système Cre/loxP) permet d’inactiver de façon ciblée le gène SRF dans le temps et l’espace.
L’invalidation de SRF ciblée uniquement dans les muscles squelettiques donne des souris
mutantes normales à la naissance, mais qui présentent dès trois jours une hypotrophie qui
s’accentue au cours du temps. Ces souris montrent également une forte mortalité post-natale,
elles développent toutes une scoliose, signe de leur faiblesse musculaire. Chez l’adulte, une
altération importante de l’architecture musculaire est observée. L’examen des fibres par
microscopie électronique montre une désorganisation générale de l’ultrastructure des
sarcomères. Des marqueurs clés de la myogénèse fœtale : myoD, myogénine, et MRF4 sont
réprimés chez les mutants. L’ensemble de ces caractéristiques évoque un retard de maturation.
Ces résultats montrent que SRF est indispensable pour le maintien du programme
myogénique et la maturation des fibres musculaires squelettiques post-mitotiques.
II.2.2.2.2 Facteurs de transcription MEF2 :
Les membres de la famille de facteurs de transcription MEF2 ont été initialement identifiés
par leur activité de liaison à une séquence d’ADN très conservée, présente dans la région
régulatrice d’une majorité des gènes spécifiques des muscles (Black et al., 1998). Ces facteurs
MEF2 jouent un rôle important dans l’activation transcriptionnelle de plusieurs gènes des
muscles squelettiques. Chez les vertébrés, il existe quatre gènes mef2 : mef2a, mef2b, mef2c,
mef2d. Les protéines MEF2 peuvent former entre elles des homo et des hétérodimères : cette
capacité de dimérisation des protéines MEF2 requiert un domaine de 29 acides aminés situé
immédiatement en carboxy-terminal de la boîte MADS et appelé domaine MEF-2. La boîte
MADS et le domaine MEF2 sont nécessaires et suffisants pour permettre une liaison de haute
affinité à la séquence consensus (T/C)TA(A/T)4TA(G/A). Des sites de liaison pour les
protéines MEF2 ont été identifiés dans les promoteurs de plusieurs gènes des muscles
squelettiques comme ceux de la créatine kinase musculaire et de la chaîne légère de la
myosine chez le rat (Gossett et al., 1989). L’expression des quatre gènes mef2 est détectée
dans les cellules musculaires squelettiques et lisses de façon concomitante à l’activation de
leur programme de différenciation. Les membres de la famille MEF2 comme les autres
protéines à boîtes MADS coopèrent avec d’autres facteurs de transcription pour contrôler le
57

programme d’expression génique propre à un tissu. Dans le muscle squelettique, il s’agit des
membres de la famille des facteurs myogéniques de type hélice-boucle-hélice (bHLH).
Contrairement aux facteurs myogéniques, les protéines de la famille MEF sont incapables
d’activer le programme de différenciation musculaire. Cependant, elles peuvent coopérer avec
les facteurs myogéniques pour activer de façon synergique des promoteurs des gènes
musculaires squelettiques et pour induire la myogenèse (Molkentin et al., 1995). Plusieurs
études ont démontré que cette coopération est due à une interaction physique directe entre la
boîte MADS des protéines MEF2 et le domaine de liaison à l’ADN des facteurs myogéniques
bHLH. De plus, le site de liaison à l’ADN d’un seul des deux facteurs est requis. Ces résultats
suggèrent que les facteurs MEF2 peuvent moduler la transcription des gènes musculaires
selon deux mécanismes différents : par liaison directe à leur propre site sur le promoteur, ou
encore en étant recrutés par un membre de la famille myogénique lui-même lié à la boîte E sur
le promoteur.
II.2.3 Hétérogénéité myoblastique : existence de plusieurs lignées myogéniques :
Nous avons jusqu’à présent décrit les séquences myogéniques et les caractéristiques
myoblastiques comme des éléments homogènes dans leur expression. Toutefois, si l’on
explore ces phénomènes dans le détail, il apparaît que certaines différences dans les résultats
expérimentaux peuvent être attribuées à l’existence d’une hétérogénéité myoblastique. Il
semble que l’on puisse distinguer plusieurs lignées myogéniques intervenant à différentes
périodes du développement et que la colonisation des sites myogéniques par les précurseurs se
fasse en plusieurs vagues successives. Trois catégories de myoblastes sont distinguées : les
myoblastes embryonnaires, fœtaux et adultes. Leur apparition est séquentielle au cours du
développement. Les myoblastes adultes ou cellules satellites sont des cellules quiescentes
présentes sous la membrane basale des fibres musculaires déjà constituées. Elles interviennent
dans la croissance pré et post natale du muscle ainsi que dans la régénération. Des expériences
réalisées avec des myoblastes en culture primaire ont montré que les mécanismes généraux de
différenciation in vivo peuvent être reproduits in vitro. Les cultures de myoblastes
représentent donc un bon modèle pour l’étude des différentes étapes de la myogénèse. Des
cultures primaires de myoblastes fœtaux ont été mises au point (Hembree et al., 1991 chez le
porc ; Picard et al., 1998 chez le bovin). L’étude des mécanismes qui régulent le processus
myogénique chez les mammifères est effectuée dans une large mesure sur des lignées
58

cellulaires immortalisées, essentiellement d’origine murine. Pour notre étude, nous avons
utilisé la lignée L6 qui dérive de cultures de myoblastes issus de la patte postérieure de rat
nouveau-né, et stabilisés par traitement avec un carcinogène chimique (Yaffe et al., 1977). Le
sous-clonage et la caractérisation de la lignée L6 ont été rapportés par Teti et al. (1993). Les
cellules du clone C5 (L6C5) constituent un bon modèle pour l’étude de la myogénèse
puisqu’elles ont une forte capacité de différenciation dans des milieux de cultures contenant
1% de serum, ou des milieux dépourvus de serum additionnés de différents inducteurs
myogéniques. (Nervi et al., 1995; Minotti et al., 1998). Ces cellules fusionnent en formant des
fibres musculaires striées, même si lors de la multiplication des passages en culture la
tendance à la fusion diminue et rend nécessaire le reclonage périodique de la lignée.
II.2.4 Les modulateurs de la différenciation myogénique :
Les myoblastes sont soumis à l’influence de divers facteurs environnementaux, comme les
signaux provenant de la matrice extracellulaire ou les hormones et facteurs de croissance, qui
sont, ou non, favorables à la sortie du cycle de réplication et à une différenciation
subséquente. Certains signaux activateurs de différenciation proviennent de facteurs de
croissance et hormones comme les IGFs (insulin-like growth factors) (Quinn et al., 1993),
l’hormone thyroidienne T3 (Carnac et al., 1992), l’acide rétinoïque (Halevy et Lerman, 1993).
Des études in vitro montrent que l’hormone thyroïdienne et l’acide rétinoïque associés à leurs
récepteurs nucléaires accélèrent la différenciation musculaire en activant l’expression des
gènes MyoD alors qu’au contraire, une concentration élevée en sérum/facteurs de croissance
prolonge la phase de prolifération des myoblastes en culture.
Le FGF est un puissant inhibiteur du processus myogénique. De nombreuses études utilisant
des cultures primaires ou des lignées de cellules myogéniques ont plus particulièrement
montré que la phase de prolifération est prolongée par les formes acide aFGF et basique bFGF
du facteur de croissance fibroblastique (Gospodarowicz et al., 1976). Ce facteur agit au
niveau des gènes spécifiques du muscle en régulant négativement les protéines myogéniques
bHLH. Le FGF induit la phosphorylation de la thréonine 114 située dans le domaine basique
de la myogénine, lui faisant perdre ainsi la capacité de se lier à l’ADN (Olson, 1993).
Le TGFβ, inducteur du phénotype transformé dans les cellules fibroblastiques, inhibe la
différenciation des cellules myogéniques en empêchant l’expression des marqueurs
59

principaux de différenciation (créatine kinase, myogénine, récepteur de l’acétylcholine…), et
stimule en parallèle la prolifération.
Les IGFs appartiennent à une famille de petits peptides caractérisés par une structure très
proche de celle de la pro-insuline humaine. Les plus importants sont IGF-I, IGF-II et
l’insuline. Des premières études ont montré que l’insuline stimule la différenciation des
cellules musculaires d’embryon de poulet à des concentrations de l’ordre du µM. Ensuite, il a
été montré que les taux physiologiques d’IGFs stimulent la différenciation au niveau
morphologique (fusion) et au niveau biochimique (activité créatine kinase) (Florini et al.,
1991), soit sur des lignées (myoblastes de rat L6), soit sur des cellules primaires d’embryon
de poulet, soit sur des cellules satellites de rat (Ewton et al., 1994). Des études impliquent
aussi les IGFs dans les phénomènes de régénération du muscle squelettique in vivo (Musaro et
al., 1999). La liaison de l’IGF-I sur son récepteur tyrosine-kinase conduit à la stimulation
transitoire de la voie des MAP-kinases qui est principalement impliquée dans la mitogénèse,et
à une stimulation prolongée de PI3-Kinase qui par l’intermédiaire de l’activation de la kinase
Akt stimule la différenciation myogénique. Cette double action des IGFs correspond au fait
qu’ils activent, dans un premier temps, la prolifération cellulaire, puis stimulent la phase
ultérieure de différenciation.
La vasopressine (AVP) est une hormone nonapeptidique, produite par l’hypothalamus et
secrétée par la neurohypophyse. Elle est connue pour sa fonction antidiurétique, ainsi que son
effet vasoconstricteur. Elle est aussi capable d’agir sur les cellules hépatiques en stimulant la
glycogénolyse, et d’agir comme neurotransmetteur dans le système sympathique (Hanley et
al., 1984). Elle peut se lier à deux types de récepteurs à sept domaines transmembranaires, V1
et V2. Les récepteurs V1, localisés sur les hépatocytes, les cellules musculaires lisses des
vaisseaux, et sur les cellules neuronales, agissent en activant diverses phospholipases (PLA2,
PLD, PLC), qui produisent des seconds messagers capables de moduler divers types de
canaux calciques (Michell et al., 1979). Localisés dans les canaux collecteurs des tubules
rénaux, les récepteurs de type V2 sont responsables de l’action anti-diurétique de l’AVP, via
l’activation d’une adénylate cyclase qui conduit à la production d’AMPc comme second
messager. Les deux types de récepteurs peuvent être exprimés simultanément dans le même
tissu, si l’on considère les diverses fonctions régulées par l’AVP (Valloton, 1991). Le calcium
libéré, à la suite de l’activation du récepteur V1, induit la translocation de la forme
cytosolique inactive de la PKC sur la face interne de la membrane plasmique, où elle est
activée par les DAG libérés par la PLC, et où elle peut agir sur les substrats importants pour
divers processus cellulaires. L’action de l’AVP sur le tissu musculaire squelettique n’est pas
60

encore bien clarifiée, même si les études antérieures, soit in vitro, soit in vivo, sur les cellules
musculaires, ont suggéré son implication dans le métabolisme glucidique. En outre, il a été
mis en évidence la présence de récepteurs V1 dans la lignée myogénique de rat L6 (Wakelam
et al., 1987), et la réponse à l’AVP a été caractérisée, au niveau de la transduction du signal,
dans diverses lignées myogéniques (L6, L5, RD), une lignée de cellules satellites de souris
(C2C12), et des cultures primaires de poulet (Teti et al., 1993). La stimulation par l’AVP, à
des concentrations comprises entre 10 -9 et 10 -6 M, induit, de manière dose-dépendante, la
production d’inositol-phosphates en quelques secondes, et est suivie d’un pic transitoire de
calcium libéré à partir du réticulum endoplasmique. Les signaux induits par l’AVP dans les
lignées étudiées sont hétérogènes et indépendants du stade de différenciation des cultures,
mais corrélés à leur potentiel myogénique (Teti et al., 1993). En ce qui concerne le rôle de
l’AVP dans l’induction de la différenciation des cellules musculaires squelettiques, il a été
démontré que les myoblastes L6C5 cultivés dans un milieu contenant 5% de sérum en
présence d’AVP ont un pourcentage de fusion augmentée, après 3-4 jours de traitement, et
une formation de myotubes plus grands qu’en l’absence d’hormone. De plus, l’AVP est
capable d’induire la différenciation des myoblastes en l’absence d’autres facteurs, en milieu
défini, et agit en synergie avec l’IGF-I pour augmenter l’expression du phénotype différencié
(Minotti et al., 1998). Le mécanisme de transduction du signal AVP-dépendant co-implique
les phospholipases C et D (Naro et al., 1997), la réponse cellulaire consiste en une
augmentation rapide de l’expression du co-régulateur myogénique des MRFs, MEF2,
nécessaire pour l’activation transcriptionnelle de la myogénine (Scicchitano et al., 2002),
suivie d’une augmentation de l’expression des MRFs myogénine et Myf5 (Nervi et al., 1995),
et ensuite, des marqueurs terminaux comme la myosine et les diverses formes de récepteurs
de l’acétylcholine. Tous les résultats impliquant l’AVP dans l’induction de la différenciation
ayant été obtenus en culture, le rôle physiologique de l’AVP dans la myogénèse in vivo reste à
démontrer. Certaines constatations expérimentales montrent la présence de fortes
concentrations d’AVP dans le muscle fœtal humain, qui décroissent seulement après la
naissance (Smith et al., 1992).
Ce sont les niveaux relatifs d’expression des divers facteurs de transcription, sous l’influence
d’un équilibre environnemental en facteurs de signalisation, qui modulent finement le
comportement de la cellule en développement.
61

II.3 L’ENDOTHELIUM :
II.3.1 Structure de la paroi vasculaire : (figure 12)
Les vaisseaux forment un réseau dense de transport du sang dans toutes les régions de
l’organisme. Ils comprennent des artères, des artérioles, des capillaires, des veines et des
veinules. Les parois des vaisseaux sanguins, sauf celles des capillaires, sont formées de trois
couches appelées tuniques qui entourent la lumière centrale : les tuniques intime (intima),
moyenne (média), externe (adventice).
Figure 12 : Structure de base d'un vaisseau sanguin.
II.3.1.1 L’intima et l’endothélium vasculaire :
C’est la couche interne de la paroi artérielle : elle est principalement constituée par une
couche monocellulaire de cellules endothéliales qui reposent sur une membrane basale,
séparée de la limitante élastique interne par un espace virtuellement acellulaire : la zone sousendothéliale.
La limitante élastique interne est une couche bien individualisée (épaisseur 40-
80 nm) de fibres élastiques (élastine) qui sépare l’intima de la média.
II.3.1.2 La média :
Elle constitue l’épaisse couche du milieu. Elle est composée de cellules musculaires lisses et
d’un réseau de collagène, d’élastine, et de mucopolysaccharides. Les cellules musculaires
62

lisses de la média ont un double rôle, contractile et sécrétoire. Elles remodèlent en
permanence les vaisseaux en proliférant et en produisant de la matrice extracellulaire. Ce
processus physiologique normal est appelé remodelage vasculaire. Il reflète la capacité d’une
artère à modifier durablement son calibre en réponse à certaines situations.
II.3.1.3 L’ adventice :
C’est la couche la plus externe qui soutient et protège les vaisseaux sanguins : elle contient
des fibroblastes, des cellules adipeuses et des fibres de collagènes. Elle est parcourue par des
petits vaisseaux appelés vasa vasorum qui nourrissent les tissus externes des gros vaisseaux.
II.3.2 Endothélium : origine, structure et rôle :
II.3.2.1 Origine et structure :
L’endothélium est un tissu de type épithélial qui se différencie des autres épithéliums car il
dérive du mésoderme embryonnaire, la plupart des autres dérivant de l’ectoderme ou de
l’endoderme. Les cellules endothéliales (figure 13) sont des cellules plates et polarisées
possédant deux domaines membranaires, apical et basolatéral dont la composition en lipides
et en protéines est différente, la face baso-latérale étant fixée sur une lame basale constituée
de collagène. Elles mesurent 0.3-0.5µm d’épaisseur et 100µm de long et de large. Selon la
taille des vaisseaux, la morphologie est très différente. Dans les gros vaisseaux, tels que les
artères et les veines, elles ont une forme prismatique comme la plupart des cellules
épithéliales. Dans les capillaires les plus petits, elles forment un petit tube à l’intérieur duquel
le sang circule.
Figure 13 : Cellules endothéliales de la veine du cordon ombilical à environ
75% de confluence.
63

II.3.2.2 Rôle de l’endothélium :
Autrefois, l’endothélium était considéré comme une barrière non thrombogénique
relativement inerte. Ce n’est qu’en 1966 que Florey affirme que l’endothélium est beaucoup
plus qu’une « feuille de cellophane nucléé ». Plus tard, la mise en route de cultures de cellules
endothéliales in vitro a permis de mettre en évidence la fonction endothéliale. L’endothélium
est bien plus qu’une simple barrière entre le sang et la paroi vasculaire. C’est en fait un
véritable organe qui sécrète de nombreuses substances vasoactives régissant le tonus et la
croissance vasculaires. La découverte par Furchgott et Zawadzki, il y a 25 ans, du rôle
obligatoire de l’endothélium dans la relaxation vasculaire a non seulement révolutionné la
physiologie cardiovasculaire mais aussi a stimulé la compréhension de l’évolution du
développement des maladies cardiovasculaires : la dysfonctionnement des cellules
endothéliales joue un rôle important dans l’initiation et la progression de ces maladies.
L’endothélium occupant une position anatomique stratégique dans la paroi vasculaire assure
trois fonctions principales :
L’endothélium est une couche thromborésistante : il maintient la fluidité du sang au
contact de la paroi, au travers de diverses activités qui le situent au coeur de toutes les
étapes de l’hémostase (coagulation, fibrinolyse).
L’endothélium est un régulateur de la vasomotricité artérielle par la sécrétion de
substances vasoconstrictrices ou vasodilatatrices (comme l’endothéline ou le
monoxyde d’azote) qui agissent sur le muscle de la média sous jacente.
L’endothélium est une barrière de perméabilité qui filtre et contrôle la pénétration de
composants sanguins (molécules, mais aussi cellules) destinés à nourrir les parties
internes de l’artère et à en assurer la défense.
II.3.3. Rôle de barrière et perméabilité sélective :
L’endothélium forme une véritable barrière continue entre les éléments circulants du sang et
les structures musculaires du sous endothélium, ce qui lui permet de jouer un rôle important
dans le contrôle de l’échange de substances entre le sang et les tissus. Les jonctions
intercellulaires sont à la base de la fonction de barrière attribuée aux cellules endothéliales,
notamment la voie paracellulaire (Majno et Palade, 1961) : celle-ci dépend du phénomène de
diffusion et de l’espace existant entre les cellules. Une autre voie permet le transport de
macromolécules et de solutés du pôle apical au pôle basolatéral de la cellule (figure 14) : il
64

s’agit de la voie transcellulaire, mettant en jeu des récepteurs particuliers et la formation de
vésicules (Predescu et Palade, 1993).
Jonction
serrée
Membrane
apicale
Membrane
baso-latérale
Voie
paracellulaire
Figure 14 : Deux voies de transport sont à la base de la fonction de barrière endothéliale :
les voies transcellulaire et paracellulaire (Tsukita et al., 2001).
II.3.3.1 La voie paracelluaire et les jonctions intercellulaires :
Les cellules endothéliales sont fortement liées entre elles, ce qui leur permet de maintenir leur
intégrité. L’augmentation de la perméabilité endothéliale en réponse à des médiateurs
inflammatoires comme la thrombine et l’histamine est accompagnée de la désorganisation des
jonctions interendothéliales et de l’arrondissement de cellules, réversibles, indiquant que la
principale voie de transport impliquée est une diffusion à travers l’espace intercellulaire.
Les structures jonctionnelles présentes dans la zone de recouvrement entre deux cellules
endothéliales sont apparentées à celles localisées aux contacts intercellulaires épithéliaux.
Elles ont été classées sur la base de leurs caractéristiques morphologiques et fonctionnelles en
quatre types :
Les jonctions étanches, appelées également jonctions serrées ou zonula occludens
(Anderson et al., 1993).
Les jonctions adhérentes ou zonula adherens (Rubin, 1992).
Les complexus adherens (Schmelz et Franke, 1993).
Les jonctions de communication (Beyer, 1993).
65
Voie
transcellulaire

L’organisation moléculaire des jonctions intercellulaires (figure 15) a été en partie élucidée
dans les années 90.
Tight
Junction
Adherens
Junction
Occludin
II.3.3.1.1 les jonctions serrées, étanches :
66
Selon Lampugnani et Dejana, 1997
Figure 15 : Schéma des différents
complexes moléculaires situés au
niveau des jonctions
interendothéliales : présence de
protéines transmembranaires
(jonctions serrées, adhérentes), de
partenaires cytoplasmiques. Les
connexions avec les éléments du
cytosquelette sont aussi représentées.
Ces jonctions ont deux fonctions : d’une part, elles assurent le contrôle des échanges entre le
sang et les tissus, d’autre part, elles forment une barrière au sein de la membrane plasmique,
en séparant les domaines apicaux et baso-latéraux. La formation des jonctions étanches est
corrélée à un changement de l’état physiologique de la cellule. La complexité de ce réseau
varie de façon considérable parmi les différents types d’endothélium. Les jonctions étanches
existent surtout entre les cellules endothéliales formant la structure spéciale des vaisseaux
capillaires du cerveau (barrière hémato-meningée) et du placenta (barrière placentaire). C’est
dans les capillaires du cerveau que les jonctions serrées sont les plus développées, aboutissant
ainsi à une étanchéité totale des contacts intercellulaires, le transfert ne s’effectuant que par la
voie transcellulaire. A l’inverse, les jonctions serrées sont peu développées dans les capillaires
et quasiment absentes dans les veinules post-capillaires où la perméabilité est maximale
(Simionescu et Simionescu, 1991).

Figure 16 : Représentation de deux cellules unies solidement par les jonctions serrées.
Décrites pour la première fois par Farquhar et Palade en 1963, ces jonctions apparaissent en
microscopie électronique comme des portions de membranes anastomosées et continues
(figure 16). Autrefois, certains pensaient que cela représentait une fusion de la bicouche
lipidique des cellules adjacentes (Kachar et Reese, 1982). Il est maintenant admis que ces
contacts sont établis par des composants protéiques membranaires et cytoplasmiques
essentiels au maintien de l’adhérence cellule-cellule et au contrôle de la prolifération et de la
polarité cellulaire (Furuse et al., 1996).
Différentes protéines forment les jonctions serrées :
a) L’occludine (60-65 kDa) :
67

Elle a été identifiée pour la première fois chez le poulet
(Furuse et al., 1993) et ensuite chez les mammifères (Ando-
Akatsuka et al., 1996). C’est une protéine à quatre passages
transmembranaires avec un long domaine cytoplasmique C
terminal et un court domaine cytoplasmique N terminal.
Elle s’exprime en forte proportion et se distribue de façon continue aux jonctions des cellules
endothéliales des capillaires cérébraux. Dans les autres tissus, son expression est beaucoup
plus faible et sa distribution aux contacts cellules-cellules est discontinue (Hirase et al., 1997)
En 1998, Kevil et al. ont montré que l’occludine joue un rôle important au niveau de la
barrière endothéliale, car la transfection d’un oligonucléotide antisens de l’occludine
provoque un accroissement de la perméabilité. De plus, le clivage de l’occludine par une
cystéine protéase, entraînant sa dégradation, augmente la perméabilité paracellulaire au
mannitol (Wan et al., 1999). La prolactine, les acides gras insaturés diminuent partiellement la
perméabilité de la barrière formée par les jonctions serrées en augmentant l’expression de
l’occludine dans les cellules endothéliales et épithéliales (Antonetti et al., 2002). La
localisation cellulaire ainsi que la fonction de l’occludine peuvent être régulées par un
mécanisme post-traductionnel au moyen de phosphorylations. Ceci contribuerait à la
perméabilité des jonctions serrées. De multiples voies de signalisation interviennent pour
phosphoryler l’occludine. En plus de la phosphorylation, l’occludine peut aussi être régulée
par ubiquitination (Traweger et al., 2002).
L’occludine est une protéine clé des jonctions serrées dont le niveau d’expression et les
régulations post-traductionnelles dictent les propriétés de la barrière endothéliale.
b) La claudine (22-24 kDa) :
Plus récemment deux autres protéines transmembranaires, les
claudines 1 et 2, ont été identifiées comme composants des
jonctions serrées (Furuse et al., 1998) . La claudine fait partie
d’une famille de vingt membres dont plusieurs peuvent être
présents dans une même jonction (Morita et al., 1999a). Ce sont
des protéines intégrales avec quatre domaines transmembranaires, deux boucles
extracellulaires et des extrémités N et C terminales cytoplasmiques. Certaines claudines sont
exprimées spécifiquement dans certains types de cellules : les claudines 1, 5 et 15 sont toutes
68

exprimées dans les cellules endothéliales et la claudine 5 est spécifiquement exprimée dans
les cellules endothéliales et épithéliales du plexus choroïde (Morita el al., 1999a). Cette
protéine pourrait jouer un rôle spécifique dans l’organisation des jonctions serrées :
l’expression ectopique des claudines dans les fibroblastes confère aux cellules une fonction
d’adhésion indépendante du calcium (Kubota et al., 1999). La surexpression de la claudine 5
dans les fibroblastes réorganise les jonctions serrées de façon similaire à celles des cellules
endothéliales (Morita et al., 1999b).
c) Les JAMS (junctionnal adhesion molecule 36-40 kDa) :
Les molécules d’adhésion jonctionnelle sont des protéines à un domaine
transmembranaire et deux motifs immunoglobuline dans la partie
extracellulaire. Elles sont trouvées dans les jonctions serrées des
cellules épithéliales et endothéliales (Martin-Padura et al., 1998). Ces
protéines appartenant à la superfamille des immunoglobulines
pourraient être impliquées dans la régulation et la formation des
jonctions serrées. La surexpression des JAM dans les cellules
endothéliales réduit la perméabilité paracellulaire au dextran 40kDa (Martin-Padura et al.,
1998) . JAM interagit avec quelques protéines de jonctions serrées comme la Zonula
Occludens de type 1, AF-6 et ASIP, bien que les rôles fonctionnels de ces interactions n’aient
pas encore été élucidés (Ebnet et al., 2000 ; 2001).
d)La Zonula Occludens (210-220 kDa)
Il existe d’autres protéines qui sont cytoplasmiques et qui sont colocalisées avec l’occludine,
la claudine, les JAM, formant un complexe jonctionnel sous-membranaire, notamment les
Zonula Occludens. Deux types ont été identifiés : ZO-1, ZO-2. La ZO-2 est exclusivement
trouvée au niveau des jonctions serrées des cellules épithéliales et endothéliales tandis que la
ZO1 a une distribution plus large et beaucoup moins spécifique (Gumbiner et al., 1991). Les
cellules endothéliales expriment spécifiquement une isoforme de la ZO-1 appelée ZO-1α
(issue d’un épissage alternatif, entraînant la délétion de 80 acides aminés). Balda et Anderson
(1993) suggèrent que cette isoforme pourrait contribuer à une plus grande dynamique des
jonctions. Cette large famille de molécules semble être impliquée dans la fonction
d’organisation des zones spécifiques de la surface cellulaire. Elles peuvent jouer un rôle dans
69

l‘ancrage des protéines des jonctions serrées avec le cytosquelette. L’association de la ZO
avec le complexe jonctionnel se fait notamment par l’occludine au niveau de son extrémité C
terminale (Wong et Gumbiner, 1997). Ce complexe est nécessaire mais pas suffisant pour
localiser l’occludine au niveau des jonctions serrées (Furuse et al., 1994). D’autres facteurs
sont requis pour localiser correctement cette protéine. La ZO1 met en liaison l’occludine avec
l’actine via son interaction avec la spectrine (Itoh et al., 1991). Elle lie aussi directement
l’actine via son extrémité C terminale (Fanning et al., 1998) Les cytokines comme le TNFα,
l’interféron-γ, l’interleukine-1β, augmentent la perméabilité de la barrière endothéliale en
désorganisant les jonctions serrées, ce qui se traduit par un marquage discontinu de la ZO-1 et
l’occludine à la périphérie des cellules endothéliales et épithéliales (Bolton et al., 1998 ;
Harhaj et al., 2002).
II.3.3.1.2 Les jonctions adhérentes :
Les jonctions adhérentes, un des types de jonctions
d’ancrage, relient les cellules entre elles par des
interactions homotypiques, ainsi qu’à la matrice
extracellulaire par l’intermédiaire du cytosquelette. Ce
sont des sites de connexions avec le réseau des
filaments d’actine. Les jonctions adhérentes forment
une ceinture (zonula) d’adhérence à la périphérie de la
cellule (Farquhar et Palade, 1963). On peut définir
trois éléments dans ces structures : des protéines de
liaison transmembranaires, formées par des membres
de la famille des cadhérines, des protéines de la plaque
sous-membranaire, dont les caténines, et des fibres
d’actine, associées en câbles.
Les cadhérines sont une famille de plus de quinze protéines à un seul domaine
transmembranaire dont la partie extracellulaire développe une activité adhérente homotypique
et dépendante du calcium. La VE-cadhérine constitue un marqueur des cellules endothéliales
car elle s’exprime pendant les étapes très précoces du développement vasculaire, sur les
angioblastes (Dejana, 1996). La E-cadhérine épithéliale est la mieux connue et est aussi
exprimée dans l’endothélium. En outre, la N-cadhérine assure le contact entre les cellules
endothéliales et les cellules musculaires lisses ou les péricytes. La N-cadhérine contrairement
70

à la VE-cadhérine n’est pas localisée aux jonctions mais elle est répartie sur l’ensemble de la
surface cellulaire (Navarro et al. 1998).
La VE-cadhérine a également la capacité d’assembler les différents constituants de la jonction
adhérente aux contacts cellules-cellules et sa présence diminue la perméabilité d’une
monocouche cellulaire (Lampugnani et al., 1995). Les domaines intracellulaires de ces
protéines interagissent avec des filaments d’actine organisés en câble, par l’intermédiaire de
protéines adaptatrices appelées caténines, spécifiquement la β-caténine, la plakoglobine (γcaténine)
et la protéine p120, un substrat des tyrosines kinases (Shibamato et al., 1995). Ces
protéines appartiennent à la famille Armadillo du nom de la protéine princeps de la drosophile
(Miller et Moon, 1996). Contrairement à la protéine p120, la β-caténine et la plakoglobine
peuvent se lier à l’α-caténine (homologue de la vinculine) qui s’associe à son tour au
cytosquelette d’actine permettant ainsi la stabilisation du complexe (Aberle et al., 1996). La
protéine p120 ne se liant pas à l’α-caténine et à l’actine, son association avec la cadhérine
conduit à une organisation plus mobile et plus dynamique de la jonction (jonction immature).
En dehors de son interaction avec le cytosquelette d’actine, la VE-cadhérine s’associe aux
filaments de vimentine présents dans le cytoplasme par l’intermédiaire de la plakoglobine et
de la desmoplakine dans des structures appelées complexus adherens ou syndesmos. En
l’absence de desmosomes dans l’endothélium, ce sont ces deux structures les jonctions
adhérentes et les complexus adhérens qui forment les unités d’ancrage intercellulaire. Ces
dernières structures très polymorphes sont pourvues de zones d’interruption et de
ramifications et semblent être moins continues que les jonctions adhérentes (Schmelz et
Franke, 1993). La formation des complexus adherens qui s’effectue après celle des jonctions
adhérentes pourrait former un degré d’organisation jonctionnelle supérieur. Ces jonctions
doivent s’assembler et se dissocier partiellement ou complètement au cours du développement
et au cours de divers processus physiologiques. Dans l’endothélium, la VE-cadhérine limite la
migration cellulaire et participe au contact d’inhibition au cours de la croissance cellulaire
(Caveda et al., 1996). Cet effet nécessite la formation du complexe VE-cadhérine et caténine.
Ce complexe est très dynamique et sa composition change rapidement en fonction de l’état
fonctionnel de la cellule. La VE-cadhérine, la β-caténine et la p120 sont le siège de
phosphorylations-déphosphorylations sur des résidus tyrosines, le taux de phosphorylation
étant inversement corrélé au degré de confluence. Quand les cellules sont confluentes, les
jonctions se stabilisent : les VE-cadhérines sont alors déphosphorylées au niveau de leurs
résidus tyrosines.
71

En plus des protéines des jonctions serrées et adhérentes, il existe d’autres molécules
d’adhésion vasculaire comme les sélectines, les intégrines et certains membres de la famille
des immunoglobulines.
II.3.3.2 Régulation de la perméabilité via la réorganisation du cytosquelette :
La perméabilité des jonctions peut être régulée directement via la modification des protéines
de jonctions ou indirectement à travers les modifications du cytosquelette (figure18). Celui-ci
est une structure tridimensionnelle complexe issue de l’assemblage, à différents niveaux, de
biopolymères filamenteux interconnectés. Il en existe trois classes : les filaments d’actine ou
microfilaments (encore appelés actine-F), les microtubules et les filaments intermédiaires. Ce
réseau de biopolymères présente les caractéristiques d’une charpente tridimensionnelle
permettant à la cellule de se déformer, d’adapter sa forme en fonction des forces mécaniques
venues de l’environnement tridimensionnel qui caractérisent les conditions in vivo. En effet,
les cellules endothéliales tapissant les vaisseaux sanguins subissent des efforts d’étirement, de
compression et de cisaillement au passage du flux sanguin. La réorganisation des
microfilaments d’actine est essentielle pour changer la forme des cellules endothéliales
(Phillips et al., 1989). L’inhibition de la polymérisation de l’actine par la cytochalasine D
augmente la perméabilité paracellulaire et désorganise les jonctions serrées (Madara et al.,
1986). La thrombine ou le peroxyde d’hydrogène augmentent la perméabilité des cellules
endothéliales en provoquant une redistribution de l’actine dans la cellule, avec une disparition
de l’actine corticale et la formation de fibres de stress. (Garcia et al., 1986 ; Lum et al., 1992 ).
Quelques protéines qui régulent la polymérisation de l’actine du cytosquelette ont été
impliquées dans la régulation des jonctions serrées. Ceci inclut les GTPases Rho et Rac 1,
ainsi que la p160 ROCK/Rho kinase, un effecteur de Rho qui est une serine/thréonine kinase
impliquée dans l’organisation de l’actine et la morphologie cellulaire (Hirase et al., 2001).
Trois rôles distincts dans le réarrangement de l’actine ont été attribués à trois membres de la
famille Rho : Cdc42, Rac1, RhoA. Cdc42 est responsable de la nucléation de filaments
d’actine et de la formation de faisceaux parallèles à la périphérie cellulaire : les filopodes
(Nobes et Hall, 1995). Rac1 est responsable de la formation de réseaux d’actine corticale
correspondant aux lamellipodes (Ridley et al., 1992). RhoA est responsable de la formation
des contacts focaux suivie par la formation de faisceaux contractiles, les fibres de stress
(Ridley et Hall, 1992) (figure 17).
72

Figure 17 : Mode d’action des protéines Rho/Rac/cdc42 dans la réorganisation du
cytosquelette (Takai et al., 2001).
L’inactivation de Rho par la toxine C3 de Clostridium botulinum désorganise l’actine-F
apicale, augmente la perméabilité paracellulaire au dextran, et diminue l’immunomarquage de
la ZO-1 à la périphérie des cellules épithéliales T84 (Nusrat et al., 1995). La phosphorylation
des chaînes légères de la myosine peut aussi réguler la rétraction de cellules et induire une
augmentation de la perméabilité des jonctions serrées. La stimulation par l’acide
lysophosphatidique ou l’histamine des cellules ECV 304 augmente la perméabilité et la
phosphorylation des chaînes légères de myosine. (Hirase et al., 2001). Les effets de l’acide
lysophosphatidique et de l’histamine sont bloqués par l’expression de mutants dominants
négatifs de RhoA ou par un inhibiteur pharmacologique de p160 ROCK/ Rho kinase,
suggérant que rhoA module la phosphorylation des chaînes légères de la myosine. Une
rétraction passive des cellules peut se faire indépendamment de la phosphorylation des
chaînes légères de la myosine : ceci peut être régulé par la phosphorylation des protéines liant
l’actine comme la vinculine et la taline, importante pour le maintien des contacts cellulecellule
et cellule-matrice. Ces protéines sont phosphorylées par des protéines kinases C
(Werth et al., 1983) et des tyrosines kinases (Glenney, 1992). L’activation de la protéine
kinase C par des esters de phorbol cause la réorganisation de l’actine et de la vinculine dans
les fibroblastes (Schliwa et al., 1984) et l’interruption des complexes jonctionnels dans les
cellules épithéliales (Ben-Zé’ev, 1986). La PKC phosphoryle aussi la caldesmone et la
73

vimentine, deux autres protéines du cytosquelette qui sont importantes pour le changement de
la forme cellulaire (Stasek et al., 1992).
occludine
Structure de la cellule endo théliale
VE Cadhérine
Caténine
Filaments
d’
actine
jonctionnels
Membrane Mbrne
Basale
Fibres de Stress stress
glycocalix
Figure 18 : Structure de la cellule endothéliale
II.3.3.3 La voie transcellulaire :
74
β 1 intégrine s
Réseau
cortical
Plaques
d'attachement
Le transport vésiculaire transcellulaire pourrait contribuer aussi significativement à
l’augmentation de perméabilité totale de l’endothélium. Ceci se fait grâce à la capture de
macromolécules extracellulaires via les cavéoles ou vésicules plasmalemmales (Palade et
Bruns, 1968) qui sont des invaginations sphériques de la membrane plasmique identifiées
pour la première fois au microscope électronique dans les années 50, par Palade en 1953 et
Yamada en 1955.
L’existence des cavéoles a été initialement observée dans les cellules endothéliales, les
adipocytes et les cellules musculaires lisses mais on les trouve dans presque toutes les
cellules, hormis les lymphocytes.
II.3.3.3.1 structure des cavéoles :
Cependant, la structure des microdomaines cavéolaires est source de controverse : certains les
assimilent uniquement à des puits tandis que d’autres les ont détectés sous forme de vésicules
cytoplasmiques qui peuvent traverser les couches cellulaires ou fusionner avec les
compartiments impliqués dans l’endocytose (Tran et al., 1987 ; Severs, 1988 ; Keller et al.,

1992). Cette diversité morphologique est un argument puissant pour mettre en avant le
caractère dynamique de ces structures.
La purification des cavéoles couplée à l’immunocytochimie a montré qu’elles sont enrichies
en glycolipides tels que la sphingomyéline et en protéines ancrées à la membrane par un lien
glycosylphosphatidylinositol (GPI) telles que le récepteur de l’acide folique et la phosphatase
alcaline placentaire. De plus, les cavéoles possèdent un taux élevé de cholestérol, qui a été
mis en évidence grâce à son affinité pour la filipine (Simionescu et al., 1983).
Figure 19 : représentation des différents constituants des cavéoles (Razani et al., 2002).
L’association particulière de lipides dans les cavéoles permet à la membrane d’adopter
localement une structure ordonnée L0 (liquide ordonnée) par opposition au reste de la
membrane plasmique qui adopte une structure moins organisée Lβ soluble dans les détergents
non ioniques. La recherche sur les cavéoles a été dynamisée dans les années quatre-vingt-dix
grâce à la découverte d’un marqueur moléculaire, la cavéoline (Rothberg et al., 1992). La
cavéoline, protéine transmembranaire de 21 kDa a une structure en épingle à cheveux.
Différentes isoformes de cavéoline existent : les cavéoline-1 et cavéolines-2 sont exprimées
de façon ubiquitaire, généralement co-exprimées et capables de former des hétéro-oligomères
tandis que la cavéoline-3 est exprimée spécifiquement dans le muscle (Way et Parton, 1995 ;
Scherer et al., 1996). Les cavéoles présentent des caractéristiques très similaires aux radeaux
lipidiques et de ce fait sont parfois présentées comme des radeaux spécialisés. Il apparaît en
fait que les cavéoles ne sont pas présentes dans les cellules dépourvues de cavéolines telles
que les lymphocytes, qui possèdent cependant des radeaux.
75
caveolae
Cavéoline
Phospholipides
Sphingolipides
Cholestérol

II.3.3.3.2 rôles des cavéoles :
Dans les années cinquante, il a été proposé que dans les cellules endothéliales, les cavéoles
sont responsables du passage de solutés de la lumière du vaisseau vers les tissus voisins par
transcytose (Mellman et al., 1996). Depuis de nouveaux rôles leur ont été attribués :
intervention dans le transport intracellulaire du cholestérol (Smart et al., 1996) et dans
l’activation de voies de transduction du signal (Stahlhut et al., 2000). Les cavéoles sont des
compartiments membranaires enrichis en nombreuses molécules de signalisation et leur
intégrité structurale est essentielle pour plusieurs processus de signalisation. Diverses
molécules impliquées dans la signalisation cellulaire co-purifient avec les cavéoles isolées
grâce à leur insolubilité dans le triton X100 à 4°C et à leur très faible densité en gradient de
flottaison : des récepteurs couplés aux protéines G, le récepteur à l’insuline, des récepteurs
aux lipoprotéines de basse densité, des molécules impliquées dans la régulation du calcium
cytosolique, la NO synthase, et divers intermédiaires dans la voie des tyrosines kinases et des
MAP-kinases. Certaines protéines telles que les protéines G hétérotrimériques, les protéines
ras, src et eNOS (endothelial nitric oxyde synthase) se lient directement à la cavéoline et cette
liaison les inactive. Il est possible qu’un des rôles des cavéoles soit d’inhiber par séquestration
dans l’organite toute une série de molécules impliquées dans la signalisation (Wells et al.,
2001).
L’endocytose via les cavéoles diffère de celle qui fait intervenir d’autres structures comme les
puits à clathrine, car elle implique des complexes moléculaires distincts. Dans la plupart des
cellules, à l’état basal, les cavéoles seraient des organites très peu dynamiques qui ne sont pas
endocytés de manière constitutive (Thomsen et al., 2002). Schnitzer et al en 1994 ont montré
qu’en perturbant les cavéoles par l’utilisation d’agents liant le cholestérol comme la filipine, Il
est possible de réduire la transcytose de l’albumine et de l’insuline sans affecter la voie
dépendant de la clathrine. Une fonction des cavéoles serait de permettre le transfert spécifique
de molécules dans l’espace sous-endothélial et la perméabilité vasculaire pourrait être régulée
par les cavéoles / cavéolines. Cette perméabilité sélective est contrôlée par la taille des
vésicules cavéolaires mais aussi par la présence de récepteurs spécifiques à leur niveau
(récepteurs à l’insuline, récepteurs aux LDL).
Les cavéolines jouent un rôle important dans l’organisation et les interactions entre protéines
qui permettent la cohésion de la barrière endothéliale. Les cavéoles sont des structures
permettant une compartimentalisation à la fois de molécules de signalisation, de protéines
associées aux jonctions intercellulaires et des protéines du cytosquelette. Chez des souris
76

déficientes en cavéoline-1, Schubert et al. en 2001 ont montré à l‘aide de la microscopie
électronique que les jonctions interendothéliales sont désorganisées ainsi que l’adhésion des
cellules endothéliales à la membrane sous jacente. La cavéoline-1 peut aussi interagir avec
des intégrines (Wary et al., 1998). Les cavéoles sont des structures relativement stables à
cause de leurs interactions avec le cytosquelette. Par la technique du double hybride, la
filamine, protéine de liaison à l’actine a été identifiée comme liant la cavéoline-1 au niveau de
son extrémité N terminale cytoplasmique. (Stahlut et Van Deurs, 2000). La réorganisation du
cytosquelette d’actine cause une redistribution des cavéoles : en effet, la cytokalasine
favorisant la dépolymérisation de l’actine augmente la mobilité de la cavéoline-1 dans la
membrane (Thomsen et al., 2002).
II.3.4 Dysfonctionnement endothélial :
Les phénomènes initiaux de l’athérosclérose dépendent d’anomalies de l’endothélium. La
première fonction touchée est la capacité de l’endothélium à induire une vasodilatation,
essentiellement liée à une diminution de la production du NO endothélial. Les autres
fonctions endothéliales de perméabilité et d’adhésivité sont ensuite affectées. L’endothélium
devient anormalement perméable aux éléments figurés du sang, en particulier aux monocytes,
et à des macromolécules comme les LDL (figure 20). Les cellules endothéliales peuvent
modifier les LDL lors de leur passage transendothélial et ainsi produire des LDL oxydées qui
sont cytotoxiques. L’atteinte endothéliale est suivie d’une perméabilité accrue et d’une
libération de facteurs chimiotactiques qui attirent les monocytes, lesquels vont ensuite se
différencier en macrophages dans la paroi vasculaire. Les LDL oxydées sont captées par les
macrophages par une voie métabolique dite voie scavenger, ne possédant pas de rétrocontrôle
négatif. Il s’ensuit une charge excessive en lipides des macrophages qui se transforment en
cellules spumeuses, premier stade de formation de la plaque athéromateuse. Les macrophages
présents sur le site de la lésion, avec le concours des cellules endothéliales, produisent des
cytokines et des molécules qui entretiennent l’état inflammatoire au niveau de la lésion. Une
fois que la réaction inflammatoire est amorcée, elle a tendance à s’amplifier d’elle-même. La
conséquence la plus grave de cette inflammation est qu’elle facilite la rupture de plaque en
favorisant la dégradation de la matrice extracellulaire par les enzymes protéolytiques,
l’induction de l’apoptose des cellules musculaires lisses et le début d’un processus
thrombotique par production de facteurs tissulaires.
77

Pénétration des LDL
Oxydation des LDL : activation endothéliale
Activation endothéliale et monocytaire
Pénétration des monocytes
Formation des cellules spumeuses
Migration des CML
Sécrétion de collagène, fibres élastiques
et PG
Accumulation de TC, Lip., CML
et cell spum
Figure 20 : Formation de la plaque athéroscléreuse :
Vue générale et détail des étapes (CS : cellules spumeuses ; CML : cellules musculaires
lisses ; LDL : Low Density Lipoprotein ; LDLox : LDL oxydée ; Lip. : lipides ; PG :
protéoglycanne ; TC : tissu conjonctif) (Cohen , 1997).
78
Paroi
vasculaire
LDL
Thrombus
Lumière
vasculaire
monocyte
Endothélium
Formation des noyaux lipidiques
Ulcérations
Activation plaquettaire et
thrombose

II.4 L’activation lymphocytaire : rôle de la PLD :
II.4.1 Généralités : Le système immunitaire de l’homme est composé de milliards
de lymphocytes :
Parmi les leucocytes responsables de l’immunité, les lymphocytes ont un rôle
particulièrement important. Ils sont présents en grand nombre dans le sang, la lymphe et dans
les tissus lymphoïdes spécialisés comme le thymus, les ganglions lymphatiques, la rate et
l’appendice. Bien que les lymphocytes aient été depuis longtemps reconnus comme un
composant cellulaire principal du sang, ce n’est qu’à la fin des années 50 que l’importance de
leur rôle dans l’immunité fut établie. Il existe deux grands types de réponses immunitaires : la
réponse immunitaire de type humoral impliquant la production d’anticorps, et la réponse à
médiation cellulaire. Au cours des années 60, il fut démontré que les deux principaux types de
réponses immunitaires avaient lieu par l’intermédiaire de différentes classes de lymphocytes :
Les lymphocytes B, chez les mammifères, se développent dans la moelle osseuse
adulte ou dans le foie fœtal. Ils reconnaissent l’antigène grâce à un récepteur
spécifique (BCR), se divisent, et se différencient en plasmocytes sécrétant des
anticorps.
les lymphocytes T, dérivent des cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse. Les
lymphocytes T immatures migrent ensuite vers le thymus pour subir un processus de
maturation où ils vont acquérir certaines molécules de surface spécifiques. Ils
migreront par la suite dans les organes lymphatiques et ils circuleront sans cesse dans
le sang et dans tout l’organisme. On distingue deux populations majeures de cellules T
fonctionnellement différentes :
Les lymphocytes T auxiliaires (ou helper, Th), ils expriment à leur surface le marqueur CD4
et reconnaissent les antigènes liés aux molécules du CMH de classe II. Lorsqu’elles sont
activées, ces cellules secrètent différentes cytokines qui agissent sur d’autres cellules du
système immunitaire. Les lymphocytes T auxiliaires sont classés en fonction des cytokines
qu’ils sécrètent : les Th1 sécrètent des cytokines pro-inflammatoirs et activent principalement
certaines cellules T et les macrophages, les Th2 activent essentiellement les cellules B et les
réponses immunitaires qui dépendent des anticorps.
79

Les lymphocytes T cytotoxiques (Tc), Ils expriment à leur surface le marqueur CD8. Ils
reconnaissent les antigènes liés aux molécules du CMH de classe I. Lorsqu’elles sont activées,
ces cellules se différencient en cellules effectrices qui peuvent détruire des cellules du soi
altérées. Contrairement aux cellules Th, la plupart des Tc secrètent peu de cytokines.
Les lymphocytes T expriment à leur surface le TCR (T Cell Receptor) composé de
deux chaînes polypeptidiques hétérodimériques α et β (90-95% des lymphocytes T), plus
rarement γ et δ (5-10% des lymphocytes T), liées de manière covalente par des ponts
disulfures. Ces chaînes sont composées de régions variables et de régions constantes. Les
parties variables se situent vers l’extrémité N-terminale et sont responsables de la
reconnaissance de l’antigène par le CMH. Le TCR est associé à un complexe multi-protéique
appelé CD3 composé des chaînes polypeptidiques δ, γ, ε, ξ et η qui s’associent pour former
trois dimères : un hétérodimère γε, un hétérodimère δε et un homodimère ζζ. L’hétérodimère
ζη ne se trouve que dans 10% des CD3. Ces protéines possèdent une partie intracellulaire
comportant un ou plusieurs ITAMs (Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif)
(Figure 21).
Figure 21 : Structure du récepteur des cellules T (TCR) :
Le TCR est composé de deux chaînes peptidiques α et β liées de manière covalente. Le TCR
est associé à un complexe multiprotéique appelé CD3.
80

En réponse à un antigène, les lymphocytes grossissent considérablement, se divisent
rapidement et sécrètent un grand nombre de protéines contribuant à l’élimination de
l’organisme envahisseur ou des substances étrangères.
Figure 22 : Lymphocytes, vus en microscopie électronique à balayage.
Les lymphocytes apparaissent hétérogènes par leur taille (6 à 10µ de diamètre) et leur
morphologie. Ce sont des cellules à noyaux volumineux, ovoïdes ou arrondis, leur
cytoplasme est peu abondant et pauvre en granulations.
Les communications inter-cellulaires se font soit par contact direct grâce à des molécules
d’adhérence soit par la sécrétion de cytokines dans le milieu interstitiel. Les cytokines sont
des molécules de signalisation entre lymphocytes, phagocytes et d’autres cellules de
l’organisme durant la réponse immunitaire. Toutes sont des polypeptides, glycosylés ou non.
On distingue différentes catégories de cytokines : celles produites par les lymphocytes sont
souvent appelés les lymphokines. Les principaux groupes de cytokines sont les interférons
(IFN), les interleukines (IL) et les facteurs stimulant les colonies (CSF).
Les interférons sont produits très précocement lors de l’infection et représentent la première
ligne de résistance vis-à-vis de nombreux virus. Les CSF contrôlent la division et la
prolifération des cellules souches et des précurseurs hématopoïétiques. Les interleukines sont
un vaste groupe de cytokines (IL-1 à IL-15) produites principalement par les cellules T, bien
que certaines puissent être produites par des phagocytes mononuclées ou par d’autres cellules.
Elles ont de multiples fonctions et la plupart contrôlent la différenciation et la prolifération
81

cellulaire. Chaque interleukine agit sélectivement sur les cellules qui expriment son récepteur
spécifique. L’activation et la prolifération lymphocytaires peuvent être étudiées in vitro en
cultivant les lymphocytes en présence d’un mitogène. Les substances ayant ces propriétés sont
par exemple des lectines. Ce sont des protéines qui se lient spécifiquement à des
polysaccharides. La plupart sont des dérivés de végétaux ou de bactéries. Certaines sont
capables d’activer les lymphocytes par agrégation des récepteurs TCR ou BCR, et de
déclencher leur prolifération. La stimulation des lymphocytes in vitro par des mitogènes est
censée reproduire la stimulation par des antigènes spécifiques. La phytohémagglutinine
(PHA) et la Concanavaline A (ConA) stimulent les cellules T humaines et murines.
L’utilisation de ces substances in vitro a permis de montrer que l’activation des cellules T et B
conduit à la production de cytokines et à l’expression de récepteurs de cytokines.
II.4.2 Activation lymphocytaire :
II.4.2.1 Transmission du signal :
L’activation lymphocytaire T débute par la formation d’une structure complexe entre le
lymphocyte T et la cellule présentatrice de l’antigène (CPA), la synapse immune (figure 23).
Elle est formée par la redistribution spatiale des molécules de surface impliquées dans
l’activation lymphocytaire, qui s’organisent en SMACs (Supra Molecular Activation
Complexes) sous l’effet mobilisateur du cytosquelette. La synapse a pour effet de stabiliser
l’interaction T-CPA pendant plusieurs heures, durée indispensable pour une activation
optimale.
Au cours du processus d’activation lymphocytaire, il existe des réponses précoces se
produisant en quelques minutes ou quelques heures après l’initiation de la transduction du
signal, alors que d’autres réponses peuvent se produire des jours après la stimulation.
L’engagement du TCR avec son ligand induit l’activation des tyrosines kinases (PTK)
cytoplasmiques de la famille Src : Lck ou Fyn (Kane et al., 2000). Ces protéines présentent
toutes un domaine catalytique homologue appelé SH1 (Src Homology domain 1) contenant un
site d’autophosphorylation sur un résidu tyrosine. Les portions intracellulaires des molécules
CD3, les ITAMs servent de substrat aux PTK. La phosphorylation des domaines ITAMs de
CD3 va permettre le recrutement des kinases ZAP-70 qui font partie de la famille Syk (figure
23). Celles-ci peuvent en effet s’ancrer via leurs domaines SH2 (pour Src Homology domain
2) aux tyrosines phosphorylées des domaines ITAMs de CD3, ce qui les rendraient
82

accessibles aux kinases Src qui les activeraient par phosphorylation. Les kinases vont ensuite
phosphoryler un groupe de protéines adaptatrices membranaires dont LAT, SPL-76, SIT ou
PAG. Ces molécules qui ne possèdent pas d’activité enzymatique ont par contre la
particularité de posséder des domaines modulaires d’interaction avec de nombreuses protéines
comme les domaines SH2, SH3 ou PH (Pleckstrin Homology domain). Elles permettent ainsi
le recrutement d’autres protéines à la membrane et favorisent leurs interactions. Ces
adaptateurs membranaires sont donc à l’origine de la formation de complexes permettant la
transduction du signal. Parmi ces adaptateurs, la protéine LAT « Linker Activation of T
cells » est particulièrement bien étudiée et ses mécanismes d’action peuvent être considérés
comme un modèle de la transduction du signal (Leo et al., 2002). Il a été montré que LAT
pouvait recruter des protéines cytosoliques comme la PLCγ, les kinases Itk, PI3K et des
adaptateurs cytosoliques comme Grb2, Gads, ou SLP76. Ces différentes protéines vont agir en
synergie pour activer les voies de transduction en aval comme la voie du Ca 2+ et la voie Ras /
MAPK kinase.
La PLCγ a un rôle crucial dans l’amplification du signal. Sa phosphorylation sur des résidus
tyrosine est indispensable à son activation. Sous forme active, la PLCγ scinde le PIP2
(phosphatidylinositol biphosphate membranaire) en deux parties : l’IP3 (inositol triphosphate)
et le DAG (diacylglycérol). L’IP3 en interagissant avec son récepteur sur le réticulum
endoplasmique induit la libération massive d’ions calciques (Ca 2+ ). L’augmentation du
calcium intracellulaire active la calmoduline qui, à son tour, active d’autres protéines et
enzymes, jusqu'à l’activation du facteur de transcription NFAT (Janeway et al., 2001). Le rôle
essentiel des DAG est d’activer les protéines kinases C (PKC).
Plusieurs travaux ont montré une hausse rapide du taux intracellulaire d’acide phosphatidique
au cours de l’activation lymphocytaire (Pelassy et al., 1991 ; Bismuth et al., 1988 et Marcoz et
al., 1993). Cette hausse de PA serait due à l’activation séquentielle de la PLCγ et de la DAG
kinase ; en effet la préincubation des cellules mononucléées avec un inhibiteur de la DAG
kinase, R59022 inhibe fortement la production de PA induite par la ConA (Zakaroff-Girard et
al., 1999).
L’activation lymphocytaire induit une cascade complexe d’événements qui se traduisent par
des réponses telles que l’activation de gènes, et enfin, par la prolifération. Les cellules T
progressent dans le cycle cellulaire et entrent en phase S, caractérisée par une synthèse
d’ADN et la réplication des chromosomes. Ce stade nécessite une interaction directe ou
indirecte avec les cellules accessoires (monocytes, macrophages) qui produisent
l’interleukine-1 (IL-1). L’IL-1 induit la production d’IL-2 par les lymphocytes. La réplication
83

des cellules T fait suite à l’interaction de l’IL-2 avec son récepteur. Il semble que les divisions
successives ne nécessitent pas une réexposition aux mitogènes, mais plutôt la présence d’IL-2.
Figure 23 : Résumé schématique des signaux d’activation intracellulaire des lymphocytes T
CD4+ (Goldsby et al., 2000).
84

II.4.2.2 PLD et activation lymphocytaire :
Il est généralement admis que les leucocytes humains n’expriment que peu ou pas de PLD
(Meier et al., 1999). Des résultats variables et parfois contradictoires ont été rapportés quant à
l'expression des ARNm et des protéines de PLD dans différentes lignées lymphoïdes
cancéreuses. Ainsi, les cellules leucémiques myéloïdes humaines HL60 n’expriment que
PLD1, les cellules leucémiques lymphocytaires de souris L1210 n’expriment que PLD2, alors
qu'aucune des deux isoformes n’est présente dans les cellules cancéreuses de thymus de souris
EL4 (Kim et al., 1999; Gibbs et Meier, 2000). Bien que certains auteurs n'aient détecté que les
ARNm de PLD2 dans les cellules Jurkat, d'autres travaux ont montré que l'activation de PLD
par la chimiokine RANTES (Regulated on Activation Normal T cell Expressed and Secreted)
dans ces mêmes cellules nécessitait la présence des petites protéines G ARF et RhoA,
suggérant fortement la présence de PLD1 (Bacon et al., 1998; Gibbs et Meier, 2000). De plus,
ces cellules contiennent une activité PLD dépendante de l'oléate, qui est augmentée lors de
l'apoptose induite par l'actinomycine D (Kasai et al., 1998). Diaz et al. en 2002 ont caractérisé
les isoformes de PLD exprimées dans les PBMC (peripheral blood mononuclear cells, cellules
mononucléées du sang périphérique) ainsi que leur mode de régulation. Les PBMC expriment
les deux isoformes de PLD, PLD1 et PLD2, aussi bien au niveau des ARNm que des
protéines, mais sont dépourvues de PLD oléate sensible. La stimulation mitogénique des
PBMC n’induit pas d’activation de la PLD dans les conditions normales, mais si les cellules
ont été préalablement enrichies en DHA (Bechoua et al., 1998) ou en 12-HETE (Meskini et
al., 1995), la PLD devient activable par les mitogènes. L’activité PLD révélée lors de la
stimulation mitogénique après enrichissement en DHA s’est avérée indépendante des PKC,
mais dépendante des petites protéines G ARF, suggérant une implication de PLD1
principalement. Diaz et al. ont montré la présence de la PLD1 dans les radeaux lipidiques des
lymphocytes. Ces structures constituent des plates-formes concentrant à des endroits
particuliers de la membrane plasmique les composants nécessaires à la transduction du signal
mitogénique (Janes et al., 2000 ; Langlet et al., 2000). Xavier et al. en 1998 ont montré que
l’intégrité des radeaux est nécessaire à la transmission correcte des signaux d’activation
mitogénique. Lors de la liaison du récepteur à l’antigène des cellules T, une cascade de
signalisation cellulaire est activée via la famille des tyrosines kinases Src présentes dans les
radeaux lipidiques. Ceci permet le recrutement dans les radeaux des protéines kinases de la
famille Syk puis l'activation de la PLCγ et de la cascade des MAP kinases, alors que des
85

phosphatases, comme le CD45, sont exclues des radeaux lipidiques (Janes et al., 2000;
Langlet et al., 2000). La plupart des travaux portant sur le rôle des radeaux lipidiques dans
l'activation lymphocytaire ont été réalisés sur des thymocytes, des lignées cellulaires d’origine
murine (Montixi et al., 1998; Ilangumaran et al., 1999), des cellules humaines Jurkat (Stulnig
et al., 1998; Xavier et al., 1998) et des lymphocytes de sang périphérique humain
(Ilangumaran et Hoessli, 1998 ; Diaz et al., 2002).
Dans les lymphocytes B, l’activation de la PLD a été associée à une inhibition de la réponse
proliférative (Gilbert et al., 1998). La modification de la composition des membranes des
lymphocytes par enrichissement en DHA ou en 12-HETE, qui permet l’activation de la PLD
par les mitogènes, s’accompagne d’une inhibition de la réponse proliférative (Meskini et al.,
1995 ; Joulain et al., 1995 ; Gilbert et al., 1998). Dans le présent travail, nous montrons que la
perturbation des radeaux par déplétion en cholestérol des membranes cellulaires ou hydrolyse
partielle de leur contenu en sphingomyéline, est capable, tout comme l’enrichissement en
DHA, d’inhiber la prolifération lymphocytaire induite par les mitogènes, et que ceci
s’accompagne d’une activation de la PLD. La PLD pourrait donc jouer un rôle important dans
la modulation du signal mitogénique dans les lymphocytes.
86

III. MATERIELS ET METHODES
III-1 Matériels :
III-1-1 Appareils :
Appareil d’électrophorèse: BIORAD Mini Protean II TM
Appareil d’électrotransfert: HOEFER SCIENTIFIC INSTRUMENTS Semi-Phor TM
Appareil d’Hybri-dot Manifold BETHESDA
Bain à ultrasons BIOBLOCK Scientific Vibra-Cell 75034
Balance de précision: METTLER type B6
Balance: METTLER PC 2000
Centrifugeuse basse vitesse: JOUAN GR 4.11
Centrifugeuse de paillasse: SIGMA 113 et HERAEUS Biofuge Fresco
Centrifugeuse haute vitesse: ALC 4239R (rotors A 15-C et A 18-C)
Collecteur de fraction: LKB BROMMA 2112 Redirac
Evaporateur rotatif: Rotavapor BÜCHI RE 111 couplé à un bain marie BÜCHI 461
Générateur de tension et de courant: BIORAD Power-Pac 300
Lecteur spectrophotométrique de plaques multipuits: BIOTEK INSTRUMENTS, Inc. Power
Wave X
Microscope à fluorescence ZEISS Axiovert 200
Pompe péristaltique: LKB BROMMA 2232 Microperpex S
Potter Verre-Teflon: BIOBLOCK SCIENTIFIC
Réfractomètre portable: POLYLABO Brix 103 et 104
Sonde à ultrasons BRANSON Sonifier Cell-disruptor B15
Spectrophotomètre: UVIKON 936
Thermocycleur MWG-BIOTECH Primus 25/96
Unités de filtration Centricon Plus-20, membranes de type NMWL (seuil de coupure
10000KD): MILIPORE
Ultracentrifugeuse: KONTRON INSTRUMENTS Centrikon T-1190 (rotor KONTRON TST
41.14)
87

Caméra CCD ImageMaster VDS-CL AMERSHAM BIOTECH couplée au logiciel de
traitement d’image ImageQuant AMERSHAM BIOTECH
III-1-2 Réactifs :
Acide phosphatidique (1-arachidonyl, 2-stearoyl) et phosphatidylbutanol : proviennent de
TEBU.
Anticorps monoclonal anti-tubiline α : provient de SIGMA.
Anticorps polyclonaux anti-PLD1 et anti-PLD2 : ont été généreusement fournis par le Dr
Sylvain Bourgoin (université Laval, Québec, Canada).
Anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à la peroxydase de raifort et kit ECL :
proviennent de AMERSHAM PHARMACIA BIOTECK.
Anticorps secondaire anti-IgG de lapin couplé à la peroxydase de raifort : provient de
BIORAD.
Bleu de trypan : provient de SIGMA.
Butylhydroxytoluène : provient de SIGMA.
C6- et C8- céramides : proviennent de Biomol Research Laboratories.
Cocktail d’inhibiteur de protéases (Inhibitor cocktail), saccharose et sous-unité B de la toxine
cholérique couplée à la peroxydase : viennent de SIGMA.
Concanavaline A, Ficoll histopaque, albumine sérine humaine (HSA) delipidée : proviennent
de SIGMA.
Fumonisine B1 : provient de Alexis Biochemical.
Fugene : provient de ROCHE.
Milieu RPMI 1640 (HEPES 25mM, bicarbonate 2g/l) : provient de GIBCO.
Myriocine, AVP : proviennent de SIGMA.
Scintillant liquide Pico Fluor 15 : provient de PACKARD.
Sérum de vœu fœtal, pénicilline, streptomycine et L-Glutamine : proviennent de GIBCO.
Taq polymérase et kit MTT de prolifération : proviennent de Roche Applied Science.
Transcriptase inverse M-MLV : vient de PROMEGA.
Tri Reagent : provient de SIGMA.
Triton X-100 : provient de Merck.
88

III.2 Méthodes :
III.2.1 Culture et traitements des cellules :
Les cellules sont cultivées sous une atmosphère humide à 37°C avec 5% de CO2 et 95% d’air
dans un incubateur Stéricult.
III.2.1.1 Culture des cellules L6C5 :
Les cellules utilisées sont des cellules myogéniques de rat de type L6, clone 5 (L6C5)
possédant une capacité de différenciation significative. Elles sont ensemencées à raison de 1
million de cellules / flacon de 75 cm². Elles forment un tapis cellulaire monocouche qui
devient jointif à confluence. Ces cellules sont mises en culture dans un milieu nutritif liquide
DMEM de base riche en glucose (4500 mg/L) supplémenté avec 200 mM de L-glutamine, 20
mM de tampon HEPES, 100 µg/mL de streptomycine, de 100U/mL de penicilline, ce qui
donne un milieu incomplet, auquel on ajoute 10% du sérum de veau fœtal décomplémenté
(SVF) afin d’obtenir un milieu complet.
Lorsque les cellules deviennent confluentes, le milieu est aspiré, les cellules sont lavées deux
fois au tampon PBS (sans Ca ++ , sans Mg ++ ) puis incubée avec 2mL de trypsine/EDTA
pendant 2 minutes à 37°C. Le détachement des cellules est ensuite suivi au microscope à
contraste de phase puis la trypsine est inactivée par addition de 2mL de milieu de culture
contenant 10% de sérum. Les cellules sont récupérées, centrifugées 10 minutes à 1000g et
reprises dans 15mL de milieu complet et réensemencées.
III.2.1.2 Culture des cellules HUV-EC-C :
Elles forment également un tapis cellulaire monocouche qui devient jointif à confluence. Leur
durée de vie est d’environ 50 à 60 passages. Le milieu nutritif Ham’s F12K contient 2mM de
L-Glutamine ainsi que 1,5 g/L de bicarbonate de sodium. Il est supplémenté avec 100 µg/mL
de streptomycine, 100 U/mL de pénicilline, 10% de sérum de veau fœtal non décomplémenté,
et du facteur de croissance des cellules endothéliales ECGF (Endothelial Cell Growth Factor)
à 1/100. Les cellules sont ensemencées à raison de 15000 cellules/cm 2 sur une surface
gélatinée et sont passées tous les 7 jours environ.
89

III.2.1.3 Culture des PBMC et des Jurkat :
Préparation des PBMC : isolement des cellules
Les cellules mononucléées sont isolées à partir de sang veineux prélevé sur anticoagulant
citrate-phosphate-dextran (Etablisement de transfusion sanguine de Lyon). La préparation des
cellules est réalisée à température ambiante. Le plasma, riche en plaquettes, est éliminé par
centrifugation à 120g pendant 20min (surnageant). Le culot de cellules est remis en
suspension dans une solution de NaCl 0,9 % EDTA 1mM en présence de dextran 1% final.
Après sédimentation pendant 30min à 37°C, les hématies sont éliminées dans le culot, et le
surnageant leucocytaire est séparé sur un gradient de Ficoll Histopaque (d=1,077) par
centrifugation à 600g pendant 20min. Ceci permet la séparation des neutrophiles et des
cellules mononucléées. Ces dernières sont collectées à l'interface du gradient, puis lavées trois
fois par centrifugation à 400g durant 10min, dans du RPMI 1640 contenant de l'HEPES
25mM et du bicarbonate 2g/L. Le culot final de lymphocytes et monocytes (cellules
mononucléées ou PBMC) est resuspendu dans 10mL de RPMI et les cellules sont comptées
sur lame de Thoma. Les cellules sont resuspendues à la concentration de 2.10 7 cellules/mL
dans du RPMI 1640.
Culture des cellules Jurkat :
Ces cellules sont mises en culture en suspension dans un milieu nutritif liquide RPMI 1640
supplémenté avec 10% de serum de veau fœtal, glutamine 2mM, penicilline-streptomycine
50µg/mL et 20mM de tampon HEPES. Elles sont passées toute les 48h environ.
III.2.2 Transfections transitoires :
La méthode de transfection utilisée est basée sur la formation d’un complexe entre l'ADN
plasmidique et des liposomes cationiques, permettant l'entrée du plasmide à l'intérieur de la
cellule. Le réactif utilisé pour cette méthode est le FuGENE 6 (ROCHE Molecular
Biochemicals). 6 µL de réactif FuGENE 6 sont dilués dans 100µL de milieu incomplet (sans
SVF) et laissés à température ambiante 5 min. Le FuGENE dilué est ensuite ajouté sur 4 µg
de plasmides placés au fond d'un tube eppendorf. L’ensemble FuGENE/ADN est incubé 15
minutes à température ambiante en tapotant de temps à autre. Ensuite, le mélange de 100 µL
90

Fugène/ADN est déposé sur les cellules en suspension dans 1 mL de milieu complet (10% de
SVF). Les cellules sont ensuite ensemencées dans des boîtes de culture de 35 mm et laissées
48h à 37°C.
III.2.3 Dosage de l’activité de la PLD :
La propriété de transphosphatidylation de la PLD permet de réaliser une mesure sensible et
hautement spécifique de son activité enzymatique (Morris et al., 1997). En présence d'un
alcool primaire à chaîne courte comme le butan-1-ol, la PLD catalyse une réaction de transfert
du groupe phosphatidyl sur le butanol pour produire de la choline et du phosphatidylbutanol
au dépens du PA. Le phosphatidylbutanol formé est un marqueur sensible et sélectif de
l'activité PLD dans les cellules intactes (Randall et al., 1990).
Les cellules cultivées en présence de 10% de SVF, sont lavées avec du PBS et incubées
pendant 2h, dans un milieu dépourvu de SVF, en présence de 2µCi/mL de [ 3 H]-acide
palmitique. Les incubations sont stoppées par élimination rapide du milieu, lavage des
cellules avec du PBS froid et addition de 0,5 mL de HCL 0,1 N dans du PBS. Les cellules
grattées sont transférées dans des tubes de verre. Avant l'extraction lipidique selon la
technique de Bligh et Dyer (1959), de l'acide dipalmitoyl phosphatidique marqué au [ 14 C]
(144mCi/mmole) utilisé comme standard interne et du phosphatidylbutanol (PBu) (1µg) ainsi
que de l’acide phosphatidique (PA) (1µg), utilisés comme entraîneurs, sont rajoutés dans
chaque tube. Les lipides sont extraits dans un mélange de solvants (méthanol/chloroforme 2/1
v/v) contenant 50 µM de buthylhydroxytoluène (BHT) utilisé comme antioxydant. Les tubes
sont vortexés durant 30 secondes. Après 30 minutes à température ambiante, un mélange de
PBS / chloroforme (1/1 v/v) est ajouté et les tubes sont vortexés pendant une minute. Les
phases organique et aqueuse sont séparées par centrifugation de 5 minutes à 2500 rpm. La
phase organique est prélevée et évaporée à sec sous azote. Les résidus secs sont repris par un
mélange chloroforme/méthanol (2/1 v/v) et déposés sur plaque de silice. Le PBu et l'acide
phosphatidique sont séparés des autres phospholipides par CCM bidimensionnelle. Le premier
système de solvant est un mélange chloroforme/méthanol/ammoniaque aqueux 28%
(65/35/5.5 v/v/v). Après séchage des plaques sous atmosphère réduite pendant 2h, un mélange
de PBu/PA standards est déposé. La seconde migration s'effectue dans un mélange acétate
d'éthyle/isooctane/acide acétique (90/50/20 v/v/v). Les plaques sont séchées et colorées au
91

leu de Coomassie à 0,03% dans une solution de NaCl 0,9% /méthanol 20% pendant 20 min,
puis lavées par une solution de NaCl 0,9% /méthanol 20% pendant 10min. Chacun des spots
d'intérêt est gratté puis sa radioactivité est mesurée par comptage en scintillation liquide dans
un compteur Packard 1900TR. La quantité de PBu formé dans l'essai est exprimée en
pourcentage de la radioactivité liée aux phospholipides totaux, et corrigée par le rendement de
récupération de l’acide phosphatidique.
III.2.4 Dosage protéique des échantillons, selon la méthode de Bradford :
Pour connaître la quantité de protéines à déposer sur un gel de polyacrylamide, un dosage
protéique des échantillons est nécessaire. Le dosage est réalisé selon la méthode de Bradford
adaptée par Pierce (1977) à l’aide d’un kit Bio-Rad protein assay. Le principe repose sur la
fixation non covalente à la protéine du bleu de Coomassie brillant G250, qui déplace son
maximum d’absorption de 465nm à 595nm. Un aliquot des échantillons à doser est prélevé et
complété à 50µL avec du tampon : on ajoute 200µL de la solution BioRad protein assay
diluée cinq fois dans de l’eau. La densité optique est lue à 595nm en microplaque de 96 puits
à l’aide d’un lecteur spectrophotométrique de plaques multipuits (Powerwave X, BIOTEK
INSTRUMENTS). La quantité de protéines est déterminée par comparaison avec une gamme
étalon d’albumine sérique bovine (0 à 10µg) réalisée dans les mêmes conditions que les
échantillons.
III.2.5 Analyse par Western blotting :
Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en milieu dénaturant (SDS-PAGE) :
En présence de DTT, SDS, d’urée et de chaleur, les protéines sont dénaturées et chargées
négativement. Leur migration au travers d’un gel de polyacrylamide permet leur séparation en
fonction de leur taille.
III.2.5.1 Préparation des échantillons :
Les cellules récoltées dans du PBS sont centrifugées à 1000g pendant 10 min. Le culot
cellulaire est homogénéisé dans un tampon 20 mM Tris-HCl PH 7,6, 100 mM NaCl, 1%
Triton X-100 contenant un mélange d'inhibiteurs de protéases (Inhibitor Cocktail, Sigma
92

P2714) dilué à ¼ pour la PLD et un tampon d’homogénéisation (20 mM Tris-HCl PH 7,6)
contenant un mélange d'inhibiteurs de protéases (Inhibitor Cocktail, Sigma P2714) dilué à ¼
pour la myogénine. Les cellules sont lysées et homogénéisées au potter de Dounce par 40
allers et retours. Le dosage des protéines (par la méthode de Bradford) est réalisé sur un
aliquot de chaque échantillon. Un autre aliquot de chaque fraction est alors dilué dans le
tampon de Laëmmli. Pour la PLD, on ajoute de l’urée 4M et de l’EDTA 2,5mM.
L’ensemble des échantillons (PLD et myogénine) est soniqué dans un bain à ultrasons jusqu’à
dissolution totale des échantillons. Ceux-ci sont portés à 100°C pendant 1minute pour la PLD
et 5 minutes pour la myogénine puis déposés sur le gel.
III.2.5.2 Electrophorèse et transfert :
Préparation des gels :
Les dépôts sont réalisés sur des minigels de polyacrylamide dont la concentration dépend de
la taille des protéines à séparer, contenant du SDS 0,1%, pré-coulés dans un appareil
d’électrophorèse BioRad. Pour les électrophorèses destinées à la mise en évidence de la PLD,
les gels sont préparés à 8% de polyacrylamide en présence d'urée 4M. On réalise le gel de
séparation en mélangeant 6,9mL d’eau, 4ml d’acrylamide à 30%, 3,8 mL de Tris 1,5 M
pH8,8 ; et 150µL de SDS 10%. Il faut rajouter le TEMED (9µL) et le persulfate d’ammonium
10% (150µL) à la dernière minute, la polymérisation ne commençant qu’à cet instant. On
coule le gel après avoir vortexé. Le gel est recouvert d’isobutanol pour assurer une surface
plane. Après polymérisation, l’isobutanol est éliminé en renversant le dispositif sur du papier
absorbant. Pour le gel de concentration, on mélange 2,1mL d’eau, 500µL d’acrylamide à
30%, 380µL de Tris 1M pH 6,8, 30µl de SDS 10%, 30µL de persulfate d’ammonium 10% et
3 µL de TEMED. Le gel de concentration est coulé au dessus du gel de séparation et lorsqu’il
est polymérisé, l’ensemble est placé dans la cuve de migration du système. La migration
électrophorétique se déroule à 120 volt et est suivie grâce au dépôt de marqueurs de masses
moléculaires précolorés dans un puit de référence.
Electrotransfert :
Les protéines séparées par migration sur gel sont transférées sur une membrane ImmobilonP
Millipore dans un appareil de transfert semi-sec Semi-Phor (Holffer Scientific Instruments)
afin d’être révélées par des anticorps adéquats. Le transfert se fait dans un système de
sandwich imbibé de tampon de transfert (25 mM de Tris/HCl pH 8,3, 0,19M de glycine, 20%
93

de méthanol) par un courant électrique de 40mA pendant une heure trente. Les marqueurs de
masses moléculaires qui sont également transférés peuvent servir de contrôle.
Traitement des membranes :
A l’issue du transfert, la membrane est rincée dans un tampon salin TBS-T (Tris HCl 20mM,
NaCl 137mM pH 7,6 ; tween 20 à 0,1%). Les sites de liaisons non spécifiques de la
membrane sont saturés par le tampon de saturation adéquat : un bain de TBS-T /BSA 5 % s’il
s’agit de la myogénine ou de TBS-T/lait 10% s’il s’agit de la phospholipase D, durant 2h à
température ambiante. Après avoir rincé la membrane avec du TBS-T, elle est incubée sous
agitation à 4°C pendant la nuit avec l’anticorps primaire dilué à la concentration voulue. La
membrane est lavée soigneusement avec du TBS-T et incubée avec un anticorps secondaire
anti IgG couplé à la peroxydase pendant 1h à température ambiante. La membrane est à
nouveau lavée abondamment. La membrane est séchée rapidement sur du papier absorbant,
incubée avec la solution de détection pour chimioluminescence du Kit ECL fourni par la
société Amersham Pharmacia pendant 1 minute puis enveloppée dans un film transparent.
La révélation des protéines immunodétectées par l’anticorps se fait grâce à la peroxydase qui
catalyse une réaction de chimioluminescence en présence d’eau oxygénée et de luminol.
Les membranes sont révélées sur film d’autoradiographie ou à l’aide de la caméra
photosensible (Image Master VDS-CL).
III.2.5.3 Conditions spécifiques à chaque protéine détectée :
- PLD1 et PLD2 (~120 KDa et ~90 KDa respectivement) :
Le gel est à 8% de polyacrylamide, 0,1% de SDS et 4M d’urée. Les deux isoformes de PLD
sont détectées grâce à un anticorps anti-PLD1 ou anti-PLD2 (dilution 1/2000). L’anticorps
anti-PLD1 est dirigé contre quatre peptides correspondant aux résidus 1-16, 144-162, 967-
981, et 1027-1040, tandis que l’anticorps anti-PLD2 est dirigé contre une séquence d’acides
aminés située en N-terminal, correspondant aux résidus 13-33. L’anticorps secondaire antilapin
est ensuite utilisé (dilution 1/5000).
- Myogénine (~36 KDa) :
Le gel est à 15 %. L’anticorps monoclonal anti-myogénine est dilué à 1/50 dans du TBS-
T/BSA 0,01 % et l’anticorps secondaire anti-IgG de souris est dilué au 1/10000.
94

-Standardisation des signaux par rapport à la tubuline :
Afin de standardiser les signaux ECL par rapport aux quantités de protéines déposées sur les
gels, les membranes sont décapées des complexes anticorps primaires et secondaires puis
révélées avec l’anticorps anti-tubuline. Les membranes sont incubées pendant 30 minutes à
50°C dans une solution de décapage (0,7 % de β mercaptoéthanol, 10% de SDS, 62,5mM
Tris-HCL pH 6,8). Au terme de l’incubation, les membranes sont rincées trois fois dans du
tampon TBS-T, puis un nouveau cycle de révélation avec l’anticorps anti-tubuline est réalisé
après saturation de la membrane.
III.2.6 Dosage de l’activité créatine kinase dans les cellules L6C5 :
Ce dosage est effectué d’après les conditions de réactions optimales déterminées par Szasz et
al., en 1976.
Principe : Les réactions enzymatiques impliquées dans le dosage sont les suivantes :
CK
Créatine phosphate + ADP Créatine + ATP
Hexokinase
ATP + Glucose ADP + G-6-P
G-6-PDH
G-6-P +NAD + 6-phosphogluconate +NADH + H +
La créatine kinase catalyse la réaction entre la créatine phosphate et l’adénosine diphosphate
(ADP), formant la créatine et l’adénosine triphosphate (ATP). L’ATP formé est utilisé pour
phosphoryler le glucose, produisant le glucose-6-phosphate (G-6-P) en présence d’hexokinase
(HK). Ensuite, le G-6-P est oxydé en 6-phosphogluconate (6-PG) en présence de nicotinamide
adénine dinucléotide (NAD). Cette réaction est catalysée par la glucose-6-phosphate
déshydrogénase (G-6-PDH). Au cours de cette oxydation, une quantité équimolaire de NAD
est réduite en NADH augmentant ainsi l’absorbance à 340nm. La vitesse de variation de
l’absorbance est directement proportionnelle à l’activité CK.
95

Mode opératoire :
Six jours après le début de traitement, les cellules sont lavées au PBS, puis décollées par
incubation dans du PBS contenant 1mM d’EDTA pendant 15 minutes à 37°C, et récupérées
grâce à une centrifugation de 10 minutes à 2500 g. Les culots sont repris par 300 µL de
tampon Tris 20mM, EDTA 1mM, pH 6,7, puis soniqués 5 secondes à 4°C afin d’obtenir une
suspension homogène, puis centrifugés 15 minutes à 14000g.
Les surnageants sont récupérés et utilisés pour le dosage qui se fait sur une micro-plaque de
96 puits. Ce dernier se fait sur 50 µL d’échantillon par puits en présence de 100 µL de milieu
réactionnel (CK 47-10 Sigma) contenant 30 mM de créatine phosphate, 2 mM de NAD,
20mM de N-acétyl-L-cystéine (pour activer la CK), 3000U/L d’hexokinase de levure,
2000U/L de glucose-6-phosphate déshydrogénase, 10 mM d’ions magnésium, 20 mM de Dglucose,
10µM d’ADP et 2 mM d’EDTA.
On suit la formation de NADH, pour cela la quantification se fait pendant 15 minutes à 30°C
par mesure de la vitesse de variation de l’absorption à 340 nm. L’appareil utilisé est un lecteur
de plaque Powerwave-X (BIO-TEK INSTRUMENTS).
III.2.7 Analyse des céramides :
III.2.7.1 Extraction des lipides cellulaires :
Les lipides totaux sont extraits des cellules, selon la méthode de Bligh et Dyer (1959). Les
cellules grattées et mises en suspension dans 2mL de PBS, sont lysées par 18µL de HCl 4N et
transférées dans des tubes de verre bouchés à vis. Les lipides sont extraits dans un mélange de
solvants (méthanol / chloroforme 2 :1 – v / v) contenant 50 µM de BHT utilisé comme
antioxydant. Les tubes sont vortexés durant 30 secondes. Après 30 minutes à température
ambiante, un mélange de NaCl 0,15 M / chloroforme 1: 1 – v / v est ajouté et les tubes sont
vortexés pendant 1 minute. Les phases aqueuse et organique sont séparées par centrifugation
de 10 minutes à 1500 tr / min. La phase organique est prélevée, transférée dans un ballon et
évaporée sous vide. Les lipides sont repris dans un mélange éther / methanol (9 : 1 – v / v) et
évaporés à sec sous azote. Les échantillons peuvent être conservés à -20°C jusqu’à analyse.
96

III.2.7.2 Dosage des céramides et des DAG :
Principe :
La technique est adaptée de la méthode utilisée par Preiss et al., 1986 initialement décrite par
Schneider et Kennedy, 1973. Le principe est d’utiliser une DAG Kinase d ‘Escherichia coli
qui catalyse la phosphorylation des céramides et des DAG en présence d’ATP (γ 33 P) selon les
réactions :
Céramide + ATP Céramide 1-phosphate + ADP
DAG + ATP Ac.Phosphatidique (PA) + ADP
La quantité de céramides et de DAG présente dans chaque échantillon est déterminée par
comparaison à une gamme étalon de céramides ou de DAG traités dans les mêmes conditions
que les échantillons. A chaque extrait lipidique sec sont ajoutés 20µL d’une solution de
détergents contenant de la cardiolipine à 5 mM, du DETAPAC 1mM et 7,5% de n-octyl β-D-
Glucopyranoside. La cardiolipine stimule l’activité de la DAG kinase. Après une minute de
sonication douce (bain de sonication) et 15 minutes de repos à température ambiante, sont
ajoutés 50µL d’un tampon de réaction contenant de l’imidazole 100mM à pH 6,6, du NaCl
100mM, du MgCl2 25mM, de l’EGTA 2 mM, puis 20µL d’une solution aqueuse avec 4,5 µg
de DAG Kinase (Sn 1,2-Diacylglycérol Kinase d’ E.coli), contenant du DTT 10 mM.
La réaction est initiée par addition de 10µl d’une solution d’ATP à 10mM tamponnée à pH
6,6 avec de l’imidazole 100mM, du DETAPAC 1mM et contenant 10% de (γ 33 P) ATP, puis
incubée pendant une heure à température ambiante. La réaction de phosphorylation est
stoppée par addition de 1 mL du mélange de solvants chloroforme / méthanol / acide
chlorhydrique 1N (100 :100 :1-v /v /v) auquel on ajoute 170 µL d’un tampon à pH 7,4 (NaCl
135 mM, CaCl2 15 mM, MgCl2 25mM, EGTA 2mM) et 30µL d’EDTA 100 mM. Après
agitation et 15 min de repos, une centrifugation de 5 min à 10000 rpm permet de séparer les
phases organique et aqueuse. La phase organique contenant les lipides phosphorylés est
récupérée et évaporée sous azote.
97

III.2.7.3 Quantification des produits phosphorylés :
Les extraits secs ainsi obtenus (gamme étalon des céramides et extraits lipidiques des cellules
L6C5), sont repris dans un mélange Ether/ Méthanol (9 : 1 - v : v), puis déposés sur gel de
silice. Les plaques sont développées dans un mélange de solvants : chloroforme / méthanol /
acide acétique (65 : 15 : 5 - v/ v/ v), révélées par analyse au Phosphorimager Storm afin de
localiser les céramides et les DAG phosphorylés et marqués au P 33 . Les zones de silice
contenant les lipides marqués au P 33 sont grattées. La radioactivité des différents échantillons
est comptée dans un mélange de 200 µL de méthanol, 200 µL d’eau et 10 mL de scintillant
Pico Fluor 15. Il est aussi possible de quantifier la radioactivité par analyse des images
digitales obtenues au Phosphorimager, à l’aide du logiciel Image Quant. Les deux méthodes
donnant des résultats extrêmement similaires, nous avons utilisé la technique d’analyse
d’image après la phase de mise au point. A partir de la radioactivité présente dans les
échantillons et de celle des gammes étalons de céramides, la concentration de céramides et de
DAG est calculée et rapportée en pourcentage par rapport à notre contrôle (cellules
maintenues 24h en présence de BSA 1%, non traitées).
0,1 0,25 0.05 0
Gamme étalon des
céramides (µg)
SVF BSA 3h 2J 3J 4J 5J 6J
10% 1%
traitement à l’AVP
Extraits lipidiques
98
Acide
CERAMIDE-Phosphate

volum
1800000
1600000
1400000
1200000
1000000
800000
600000
400000
200000
0
gamme étalon des céramides
y = 6E+06x + 34661
R 2 = 0,9971
0 0,1 0,2 0,3
quantité de céramides en µg
Figure 24 : quantification des céramides et des DAG séparés par chromatographie sur
couche mince après révélation au Phosphorimager Storm.
III.2.8 RT-PCR :
III.2.8.1 Extraction de l’ARN total, à l’aide du Kit d’extraction Tri Reagent :
Les cellules sont récupérées dans du PBS-EDTA et culottées à 1000 rpm à 4°C. Chaque culot
est mis en suspension dans 1 mL de Tri Reagent : les cellules sont homogénéisées par passage
dans une seringue. Chaque culot est incubé 5 min à température ambiante afin que les
complexes nucléoprotéiques se dissocient complètement. A chaque essai, 0,2mL de
chloroforme sont ajoutés. Après agitation, on laisse 15 min à température ambiante. Après
une centrifugation à 12000g pendant 15 minutes à 4°C, il apparaît une phase organique rouge
contenant les protéines, une interphase contenant l’ADN, et une phase aqueuse incolore
contenant l’ARN. Celle-ci est récupérée et agitée avec 0,5 mL d’isopropanol. Après
incubation pendant 5 minutes à température ambiante, les échantillons sont centrifugés à
12000g pendant 15 minutes. L’ARN précipité forme un culot au fond du tube. Le surnageant
est éliminé et le culot est lavé par un mL d’éthanol à 75% et centrifugé à 7500g pendant 5
minutes à 4°C. Après élimination du surnageant, le culot est séché à l’air et dissous dans de
l’eau stérile. La quantification des ARNs totaux s’effectue dans des cuves en quartz. La
densité optique est lue à 260nm et à 280nm. Le rapport DO260/DO280 fournit une estimation
de la pureté des acides nucléiques. Ce rapport doit être situé entre 1.8 et 2. Les ARNs sont
ensuite conservés à -80°C.
99

III.2.8.2 Transcription inverse (RT) :
A partir de l’ARN, l’ADN complémentaire est transcrit à l’aide de la transcriptase inverse M-
MLV (PROMEGA). La réaction se fait dans un thermocycleur MWG dans un volume final de
20µL avec une unité de transcriptase inverse (1U/µL), 0,5 unités de l’inhibiteur de RNase
(Roche 1U/µL), 0,5 mM de mélange de désoxynucléotides triphophates (dNTP), 3,5µM
d’oligo(dT) qui sert d’amorce et de 5µg de chaque ARN total préparé servant de matrice.
Dans le milieu de réaction est ajouté un tampon concentré dix fois (concentration finale Tris-
HCL pH 8,3, 40mM KCl, 8mM MgCl2, 1mM DTT.)
Avant l’ajout de l’enzyme, l’ARN en présence des amorces d’oligo(dT) est porté à 70°C
pendant 10 minutes pour le dénaturer. Les tubes sont ensuite placés dans la glace. Le tampon,
l’enzyme, l’inhibiteur de RNase sont alors ajoutés. Ce mélange réactionnel est incubé 15
minutes à 25°C pour l’hybridation de l’amorce d’oligo(dT), puis 50 minutes à 45°C pour
permettre la synthèse d’ADNc et enfin 15 minutes à 70°C pour dénaturer les complexes
ARN/ADNc. L’ADNc simple brin synthétisé, conservé à 4°C est maintenant prêt pour
l’amplification enzymatique par PCR (Polymerase Chain Reaction).
III.2.8.3 Réaction en chaîne de la polymérase (PCR) :
Les ADNc correspondant à PLD1, PLD2, IL2 ou β-actine sont ensuite amplifiés grâce à des
amorces spécifiques : les amorces spécifiques pour l'amplification des transcrits de PLD1, ont
été préparées sur la base des séquences publiées afin de pouvoir discriminer les isoformes
PLD1a et PLD1b. Les amorces sens et antisens utilisées pour les cellules endothéliales et les
Jurkat (hPLD1a et hPLD1b) sont respectivement 5’-
GGGATCCGTGTGAAGCGGGTCACTTCAGGACCG-3’ et
GGGAATTCTCTGGTTTCCCCATGCAGCTCTCCCAC-3’.
5’-
Celles des cellules musculaires de rat (rPLD1a et rPLD1b) sont 5’-
AGGACAGTCTCTGGGCTCTC
respectivement.
-3’ et 5’- TGCCTTTCCGTGAACCACAG -3’
Les amorces spécifiques pour l'amplification des transcrits de PLD2, ont été préparées sur la
base de la séquence publiée. Les amorces sens et antisens pour les cellules endothéliales et les
cellules Jurkat (hPLD2) sont: 5’-GGGAATTCGACGGCGACCCCTGAGAGCCTCTTC-3’
et 5’-GGGAATTCACGGTATTTCTTCTTGGTTGTCCAGG-3’, respectivement.
100

Celles utilisées pour les cellules musculaires de rat (rPLD2) sont : 5’-
TGAACAGGGGCAGTGTTTCC
respectivement.
-3’ et 5’- AGGTCTGGCCAGGTATTTGC -3’
Les transcrits de l’IL2 ont été amplifiés en utilisant les amorces sens et antisens 5’-
CACTAAGTCTTGCACTTGTCAC-3’
respectivement
et 5’-CCTTCTTGGGCATGTAAAACT-3’
Les transcrits de la β-actine ont été amplifiés en utilisant les amorces sens et antisens 5’-
TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGT-3’
GGTGCACGATG –3’ respectivement.
et 5’-CCTAGAAGCATTTGC
Les réactions de PCR ont été effectuées dans un volume final de 50µL : on incube 5 µL du
milieu de réaction de la transcription inverse contenant l’ADNc servant de matrice en
présence de 200µM dNTP, 0,4 µM de chaque amorce spécifique (voir description ci-dessus)
et 0,05U/µL d’ADN polymérase Taq (Roche), dans un milieu tamponné Tris- HCl 10mM pH
8,3, 50mM KCl, 1,5M MgCl2. Les conditions d’amplification programmées sur le
thermocycleur sont les suivantes : le mélange réactionnel est préalablement soumis à un
chauffage à 94°C pendant 3 minutes pour inactiver la RT. Ensuite, les cycles suivants sont
appliqués.
dénaturation hybridation élongation nombre de cycles
r PLD1 94°C 45 secondes 54°C 45 secondes 72°C 45 secondes 30
r PLD2 94°C 45 secondes 56°C 45 secondes 72°C 30 secondes 30
h PLD1 94°C 45 secondes 60°C 45 secondes 72°C 45 secondes 30
h PLD2 94°C 45 secondes 56°C 45 secondes 72°C 45 secondes 30
IL-2 92°C 60 secondes 52°C 75 secondes 72°C 90 secondes 30
actine 94°C 45 secondes 65°C 45secondes 72°C 30 secondes 30
Finalement, les échantillons sont chauffés 10 minutes à 72°C et conservés à 4°C.
III.2.8.4 Electrophorèse sur gel d’agarose :
Les différents fragments d’ADN issus de l’amplification par PCR sont séparés par migration
électrophorétique à travers un gel d’agarose à 2 % contenant du bromure d’éthidium : celuici
se fixe à l’ADN et lui confère une fluorescence rose sous UV. 2 g d’agarose sont dispersés
dans 100mL de tampon TBE (Tris-HCl 10,9g/L, acide borique 5,5g/L, EDTA 0,93g/L pH8).
La suspension est portée à ébullition afin de dissoudre l’agarose. Puis elle est refroidie avant
d’ajouter 10µL de bromure d’éthidium à 10mg/mL. La solution est coulée dans la cuve de
101

migration horizontale. Le gel polymérise (l’agarose se solidifie à 40°C). Les échantillons
préparés dans une solution de dépôt (0,05% de bleu de bromophénol, 0.05% de xylène cyanol,
6% de glycérol) sont déposés dans les puits du gel d’agarose. La migration électrophorétique
se fait dans le tampon TBE de la cathode vers l’anode sous tension constante (100 volts) en
présence d’un marqueur de taille permettant d’évaluer la taille des fragments. Le gel est
ensuite révélé et photographié sous ultra violet à l’aide d’une caméra CDD (Image Master
VDS-CL, AMERSHAM BIOTECH).
III.2.9 Immunofluorescence :
III.2.9.1 La myogénine :
Vingt-quatres heures après culture des cellules en présence ou en absence des agonistes
appropriés, les cellules sont lavées dans du PBS et sont fixées par du formaldéhyde à 3,7%
dans du PBS à température ambiante pendant 20 minutes. Les aldéhydes sont d’excellents
fixateurs mais ils ne permettent pas souvent de perméabiliser suffisamment la membrane aux
macromolécules. La perméabilisation doit donc être achevée par un traitement avec un
détergent. Après trois rinçages au PBS afin d’éliminer le fixateur, elles sont ensuite incubées
pendant 15 min avec 0,1% de triton dilué dans du PBS à température ambiante. Après lavage,
les cellules sont mises en présence d’une solution de blocage constituée du tampon PBS
auquel est ajouté de l’albumine sérique bovine à 1% pendant 20 minutes à température
ambiante. Ensuite, on incube les cellules avec l’anticorps primaire anti-myogénine
monoclonal pendant la nuit à température ambiante. Enfin, les cellules sont lavées avec du
PBS et mises en présence d’un anticorps secondaire, couplé à la rhodamine ou à la
fluorescéine, dilué à 1:200 dans une solution de PBS.
III.2.9.2 Marquage de l’actine :
Les cellules sont fixées et perméabilisées comme pour la myogénine. Les cellules sont ensuite
incubées en présence de phalloïdine couplée à la rhodamine. La phalloïdine est une toxine qui
marque spécifiquement l’actine F dans les cellules et qui nous permet de détecter le
cytosquelette d’actine.
102

III.2.9.3 Immunofluorescence des PLD :
Les cellules sont fixées par du formaldéhyde à 3,7% pendant 30 minutes. Elles sont ensuite
traitées pendant 10 min avec du NH4Cl puis par de la BSA à 0,1% pendant 20 minutes. Les
anticorps polyclonaux anti-PLD1 ou anti-PLD2 dilués à 1:1000 dans du PBS contenant 0,05%
de saponine, 0,1% de BSA sont ensuite ajoutés pour la nuit à 4°C. Après avoir lavé au PBS,
on ajoute l’anticorps secondaire anti-lapin couplé à l’Alexa-Fluor (Molecular Probes) dilué à
1:1000 pendant 1 heure.
III.2.10 Isolement des LDL : séparation par ultracentrifugation séquentielle :
Les lipoprotéines de basse densité (LDL) sont préparées à partir de sang veineux issu de
donneurs sains.
Préparation du plasma :
Au laboratoire, en conditions stériles, le sang est centrifugé à 200g pendant 17 minutes à
température ambiante. Le surnageant obtenu correspond au plasma riche en plaquettes. Il est
prélevé puis aussitôt centrifugé à 900g pendant 12 min. Le second surnageant qui correspond
au plasma pauvre en plaquettes est supplémenté en EDTA (1 mM final). Il sera utilisé pour la
séparation des LDL par ultracentrifugation séquentielle.
Séparation par ultracentrifugation séquentielle :
La séparation des lipoprotéines est basée sur leur différence de densité et donc de leur
flottaison dans le plasma ou elles se trouvent. La densité du plasma est augmentée par ajout de
KBr afin de faire flotter les lipoprotéines d’intérêt. Le plasma pauvre en plaquette (PPP) est
centrifugé à 200000 g (45000 rpm, rotor Kontron tft 5080) pendant 20h à 4°C. Les VLDL et
les chylomicrons qui flottent en surface sont éliminés. Puis le plasma, ajusté à la densité de
1,063g/ml est centrifugé une nouvelle fois à 200000g pendant 20h à 4°C. L’anneau orangé,
constitué des LDL qui flottent est alors récupéré et dialysé dans un tampon phosphate riche en
EDTA 1mM pour éliminer l’excès du KBr tout en protégeant les LDL d’une éventuelle
oxydation. Les LDL sont ensuite conservées à 4°C sous azote jusqu’à utilisation (7jours
maximum). La concentration de LDL est déterminée par dosage protéique selon la méthode
de Bradford adaptée par Pierce (1977).
103

Modification in vitro des LDL :
L’oxydation des LDL in vitro est effectuée selon la méthode décrite par Liao et al., 1995.
Les LDL récupérées après centrifugation sont séparées en deux fractions. La première fraction
est utilisée pour préparer des LDL oxydées (LDL-OX). Deux étapes de dialyse sont réalisées.
La première est effectuée dans un tampon PBS (NaCl 137mM, KCl 2,7mM, KH2PO4
1,72mM, Na2HPO4 20 Mm) à 4°C pendant 24 heures pour éliminer l’EDTA présent dans
l’échantillon. Les LDL sont ensuite incubées à 37°C pendant une heure en présence d’ions
cuivriques (10µM). La réaction d’oxydation est arrêtée en ajoutant de l’EDTA 270µM dans le
bain de dialyse. La dernière étape de dialyse est réalisée dans du PBS à 4°C en conditions
antioxydantes (EDTA, 270µM final), afin d’éliminer les traces d’ions cuivriques. La
deuxième fraction de LDL est dialysée en conditions antioxydantes afin de préparer les LDL
natives (LDL-N). Cette dialyse est réalisée à 4°C pendant 24 heures dans du PBS contenant
de l’EDTA.
Préparation des LDL marquées :
Un phospholipide traceur a été utilisé, le 3 H-DPPC (Dipalmitoyl Phosphatidyl 3 H-Choline
84ci/mmol Amersham). Celui-ci, dissous dans du toluène, est séché sous azote et redissous
dans de l’éthanol. On l’incube en présence de LDL pendant 2h à 37°C sans agiter.
L’ensemble est ajusté à une densité de 1,063g/mL en ajoutant du KBr solide dans le tube. Les
tubes fermés sous azote sont ultracentrifugés pour isoler les LDL marquées et éliminer le reste
les phospholipides marqués non-incorporés pendant 5h à 4°C à 400000g. Les anneaux
orangés de LDL sont récupérés à l’aide d’une seringue. Ensuite, une étape de dialyse dans du
tampon PBS est effectuée à 4°C toute la nuit pour éliminer le KBr en excès.
Caractérisation des LDL :
Electrophorèse sur gel d’agarose :
Elle permet l’analyse qualitative des différentes classes de lipoprotéines. La charge électrique
des lipoprotéines varie avec la teneur en protéines : les plus riches, les HDL, migrent le plus
loin ; les plus pauvres, les chylomicrons, le moins loin. L’électrophorèse sur gel d’agarose du
plasma sanguin met en évidence 5 bandes. Au niveau du dépôt on retrouve, si l’échantillon en
contient les chylomicrons. La deuxième bande, la plus intense représente les LDL, appelées βlipoprotéines.
Les α-lipoprotéines, les plus éloignées du dépôt, représentent les HDL. Enfin,
entre les deux bandes, on trouve une bande faiblement colorée de VLDL.
104

C’est une méthode qui nous permet d’une part de vérifier la pureté des fractions des LDL
isolées du plasma ainsi que leur degré d’oxydation. En effet lors du processus d’oxydation des
LDL, les hydroperoxydes lipidiques générés sont décomposés en aldéhydes qui réagissent
avec les résidus amino-acides (lysine, arginine et histidine) de l’apoB 100 pour former des
liaisons covalentes stables. Il en résulte une augmentation de la charge négative des particules
d’où une augmentation de la mobilité électrophorétique (Esterbauer, 1987).
ANODE
CATHODE
Albumine
α-lipoprotéines (HDL)
préβ-lipoprotéines (VLDL)
β-lipoprotéines (LDL)
Chylomicrons (dépôt)
Figure 25 : schéma représentatif des différents composants du plasma humain après
électrophorèse horizontale sur gel d’agarose.
Les échantillons sont déposés sur le gel d’agarose à la cathode. L’électrophorèse est réalisée
dans un tampon Tris-HCl pendant 30 minutes à 120volts. Le gel est plongé 5min dans une
solution colorante (bleu de Coomassie à 0,03% dans une solution de Nacl 0,9% ; MeOH 20%)
pendant 30 min.
Quantification de l’oxydation de la partie lipidique des LDL : Dosage des TBARS :
Principe :
La peroxydation lipidique est mesurée dans les préparations de LDL en dosant des produits
qui en sont issus : les TBARS (Thiobarbituric Acid Reactives Substances).
105

Les substances réagissant avec de l’acide thiobarbiturique sont des aldéhydes issus de la
décomposition des peroxydes lipidiques formés au cours de l’oxydation des LDL.
In vivo, ces aldéhydes sont principalement représentés par le dialdéhyde malonique (MDA)
qui est un béta-dialdéhyde tricarboné formé au cours de la coupure des acides gras
polyinsaturés possédant au moins trois doubles liaisons (acide arachidonique, acide
éicosapentaénoïque, acide docosapentaénoïque, acide gamma-linolénique). Le MDA étant un
composé hydrophile, la plupart diffuse hors de la particule LDL dans la phase aqueuse
contrairement aux aldéhydes lipophiles qui restent liés aux LDL.
Le dosage du MDA est basé sur la réaction d’une molécule du MDA avec deux molécules
d’acide thiobarbiturique (TBA) en milieu acide et à chaud, selon un mécanisme d’addition
nucléophile : il se forme un chromophore de couleur rose.
Figure 26 : réaction du MDA avec le TBA pour former un chromophore de couleur rose.
Les TBARS sont dosés selon une variation de la méthode décrite par Steinbrecher
(Steinbrecher et al.,1984).
Mode opératoire :
La suspension de lipoprotéines LDL (50µL) est placée dans un tube en verre. On y ajoute
1mL d’acide trichloroacétique 20% (w/v dans H2O) et 1mL d’acide thiobarbiturique à 0,75%
106

(w/v dans HCL 0,1N). Le complexe MDA-TBA se forme par chauffage dans un bain de sable
à 100°C pendant 30 minutes. La réaction est stoppée en plaçant les tubes dans la glace
pendant 10 minutes. Les essais sont centrifugés pendant 10 minutes à 3000 rpm afin
d’éliminer les impuretés. Puis les surnageants (200µL) sont transférés dans une plaque de 96
puits. Une gamme étalon est réalisée en faisant réagir avec le TBA dans les mêmes conditions
expérimentales que les essais des quantités connues d’un précurseur du MDA : le
1,1,3,3’tétramétoxypropane (TMP) dont l’hydrolyse complète aboutit à la formation d’une
molécule de MDA et quatre molécules de méthanol. La mesure est effectuée à 550nm à l’aide
d’un lecteur spectrophotométrique de plaques multipuits (Powerwave X, BIOTEK
INSTRUMENTS).
Les TBARS contenus dans les échantillons sont exprimés en nmoles de MDA/mg de
protéines après extrapolation de la courbe standard.
Dosage de la vitamine E par HPLC :
Le dosage de l’α-tocophérol des lipoprotéines a été réalisé par HPLC en phase inverse
couplée à une détection fluorimétrique selon la méthode utilisée par Véricel et al., 1999. A la
suspension de lipoprotéines (50µL à 2,5mg de protéines/mL), le δ-tocophérol est ajouté
comme standard interne ainsi que 9 volumes d’eau et 10 volumes d’éthanol. L’extraction est
faite par addition de 40 volumes d’hexane, suivie d’une centrifugation à 1500g pendant
10min. La phase organique supérieure est prélevée et la phase inférieure est soumise à une
deuxième extraction par 40 volumes d’hexane. Les phases organiques combinées sont
évaporées et l’extrait sec est repris dans du solvant d’injection méthanol-eau (85 :15, v/v).
Une colonne Nucléosil C18 (150*4mm) de granulométrie 5µm est utilisée. La phase mobile
est composée du mélange méthanol-eau (92 :8, v/v) dont le débit est fixé à 1mL/min. La
quantité de vitamine E présente est évaluée par mesure de fluorescence à 340nm après
excitation à 295nm. A partir des quantités connues de standard interne présent dans les
échantillons, la concentration en α-tocophérol est calculée.
107

Figure 27 : Profil HPLC des tocophérols présents dans les LDL natives.
Les tocophérols de ces particules sont extraits. Le δ-tocophérol est ajouté comme
standard interne (1nmole). Les extraits sont repris dans le solvant d’injection
(MeOH/H2O 85 :15) et analysés par HPLC couplée à un fluorimètre
(λémission :340nm ; λexcitation : 295nm).
III.2.11 Mesure de la perméabilité des cellules endothéliales grâce aux systèmes
Transwell :
Les cellules endothéliales sont cultivées en systéme Transwell sur des filtres microporeux
préalablement gélatinés à 0,5% (taille de pores 0,4µm). Nous vérifions pour chaque puits la
confluence de la monocouche de cellules endothéliales à l’aide d’un système d’électrodes.
Celui-ci nous permet de mesurer la résistance de la monocouche.
Figure 28 : Vérification de la monocouche de cellules endothéliales.
108

La peroxydase de raifort (HRP) est ajoutée à une concentration finale de 0,5µM dans le
compartiment supérieur à la monocouche de cellules. Le compartiment supérieur contient
1,5mL de milieu sans sérum et le compartiment inférieur en contient 3mL. 50µL du milieu du
compartiment inférieur sont récupérés à différents temps afin de suivre le passage de la
peroxydase. Celle-ci est quantifiée par dosage spectrophotométrique en présence de tampon
contenant 0,5mM de guaiacol, 50mM du Na2HPO4 et 0,6mM d’H2O2. L’absorbance est
mesurée à 470 nM (Hirase et al., 2001).
Compartiment supérieur
Monocouche cellulaire
Compartiment inférieur
H 2 O 2 + R-H 2
Peroxydase (HRP 40KDa)
Figure 29 : schéma d’un système Transwell et réaction colorimétrique de la peroxydase.
III.2.12 Test de prolifération des lymphocytes :
La prolifération cellulaire en réponse aux mitogènes a été déterminée à l'aide d'un test
colorimétrique commercial (Cell Proliferation kit I MTT, Roche). Ce test est basé sur la
transformation du sel de tetrazolium MTT en cristaux de formazan violet par les cellules
métaboliquement actives. Cette réduction par les enzymes cellulaires nécessite les cofacteurs
NADH et NADPH. Les cristaux de formazan ainsi formés sont solubilisés et l’absorbance de
109
Filtres microporeux
(taille des pores
0,4µm)
2H 2 O + R
donneur Peroxydase (HRP)
donneur oxydé
d’hydrogène
(guaiacol)
coloré (470 nm)

la solution colorée obtenue est quantifiée par spectrophotométrie. En pratique, les cellules
fraîchement isolées sont reprises dans du milieu complet (RPMI 1640 avec Hepès et
bicarbonate, glutamine 2mM, pénicilline 100U/mL, streptomycine 100µg/mL et 0,1% de
sérum de veau fœtal) à la concentration de 1.10 6 cellules/mL pour les Jurkat et 2.10 6
cellules/mL pour les lymphocytes, puis des fractions de 50µL de la suspension cellulaire (soit
50000 cellules/puits pour les Jurkat et 100000 pour les lymphocytes) sont distribuées dans une
plaque à 96 puits. 10µL de la solution commerciale de MTT (concentration finale de
0,5mg/ml), sont alors ajoutés. Après 4h d'incubation, 100µL de la solution de solubilisation
finale sont ajoutés dans chacun des puits et la microplaque est incubée à 37°C pendant la nuit.
Le lendemain, les densités optiques sont lues à 550 et 690 nm à l'aide d'un lecteur
spectrophotométrique de plaques multipuits (PowerWave X, BIOTEK INSTRUMENTS). Le
nombre de cellules vivantes est proportionnel à la différence des densités optiques mesurées à
550 et 690nm (DO550nm-DO690nm). Le pourcentage de prolifération est déterminé par
comparaison au témoin non activé, traité dans les mêmes conditions.
A
B
Figure 30 : Test de prolifération :
A: Métabolisation par les cellules viables du MTT en sel de formazan. B: Comparaison du
spectre UV du MTT (ligne pointillée) et du sel de formazan après solubilisation (ligne
continue).
110

III.2.13 Caractérisation des microdomaines chez les lymphocytes :
Le protocole utilisé pour la préparation des microdomaines est celui décrit par Montixi et al.
(1998). Il utilise l’insolubilité des microdomaines dans les détergents non ioniques à 4°C et
leur propriété de flottaison sur un gradient de densité conférée par leur enrichissement
lipidique. 500.10 6 PBMCs ou 20.10 6 Jurkat sont homogénéisés au Potter verre-verre et
centrifugés 10min à 4°C (900g). Le surnageant post-nucléaire (SPN) est incubé avec du triton
X100 (1% final) pendant 1h à 4°C sous agitation douce dans un volume final de 1,5mL. Après
incubation, un même volume de solution de saccharose 2,6M est ajouté afin d'obtenir une
concentration finale de 1,3M en saccharose. Le gradient est réalisé par dépôts successifs (1ml)
de solutions de saccharose de concentrations croissantes (0,2 à 0,9M), puis l'homogénat est
déposé au fond du tube (tubes SW41, Beckman), (figure 29). L'ultracentrifugation est réalisée
à 200000g pendant 16h à 4°C dans un rotor à godets oscillants (type SW41 Kontron). A
l'issue de l'ultracentrifugation, des fractions de 1ml sont collectées du fond au sommet du tube
(fraction 1 à 11). Le pourcentage de saccharose de chaque fraction est déterminé par
réfractomètrie. La mesure est réalisée sur un aliquote de 10µL à l'aide d'un réfractomètre
portable (Brix), immédiatement après collecte des fractions. La concentration est obtenue par
lecture directe.
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
Homogénéisation de 500 millions de cellules
au potter verre-téflon
Culot
0.2M saccharose
0.3M
0.4M
0.5M
0.6M
0.7M
0.8M
0.9M
SPN traité au Triton
X100
1.33M saccharose
centrifugation 900g,
10 min
Surnageant post-nucléaire (SPN)
ultracentrifugation
200 000g, 16h
Figure 31: protocole simplifié de préparation des microdomaines membranaires.
111
fraction contenant
≈18% les microdomaines

Précipitation des protéines à l'acétone :
Un aliquote de chacune des fractions du gradient est mis de côté afin d'en précipiter les
protéines par l'acétone. Dans un bain de glace, on ajoute du CaCl2 afin de faire chuter la
température à -25°C. Lorsque la température est stabilisée, on place dans des eppendorfs de
2ml, 1,5 volume d'acétone. Dessus est déposé 1 volume de fraction à précipiter (400µL ou
700µL). Le tout est immédiatement vortexé vigoureusement, puis replacé à -25°C dans la
glace pendant 30 min. Les échantillons sont ensuite traités de la même façon que décrit dans
le paragraphe III.2.5.1 avant d'être portés à 100°C pendant 1 min puis conservés à -20°C
avant électrophorèse.
112

IV. RESULTATS ET DISCUSSION :
IV.1 RESULTATS :
IV.1.1 Rôle des céramides dans la différenciation des cellules L6 induite par
l’AVP :
IV.1.1.1 Cinétique de la production des céramides au cours de la différenciation des L6C5
induite par l’AVP :
Nous avons cherché à déterminer si les céramides sont impliqués dans le processus de
différenciation myogénique induit par l’AVP. Pour cela, les cellules L6C5 ont été traitées par
l’AVP 10 -7 M pendant des temps variables et les taux de céramides ont été dosés à l’aide
d’une méthode basée sur leur phosphorylation par la DAG kinase d’Escherichia coli en
présence de [γP33]-ATP. La figure 32 montre que pour des temps de traitements courts
(10min à 1h00), il y a une diminution du taux de céramides de l’ordre de 40%. Pour des temps
de traitements plus longs par l’AVP, on observe une augmentation du taux de céramides, par
rapport au contrôle (cellules maintenues quiescentes en BSA1%) dès 3h jusqu’au jour 8.
Les céramides peuvent être formés à travers différentes voies de synthèse, principalement la
voie de novo et la voie des sphingomyélinases. La formation des céramides issus de la voie de
biosynthèse de novo est associée soit à une augmentation de l’activité de la sérine palmitoyl
transférase, catalysant la première étape de synthèse (Paumen et al., 1997), soit de celle de la
céramide synthase (ou sphinganine acyl transférase) catalysant l’avant dernière étape (Bose et
al., 1995 ; Boland et al., 1997). La mise en évidence du rôle de la céramide synthase a été
facilitée par la découverte d’une toxine fongique qui inhibe spécifiquement cet enzyme : la
fumonisine B1 (Merrill et al., 1996). Le rôle de la sérine palmitoyltransférase peut-être mis en
évidence par l’utilisation d’un inhibiteur spécifique, la myriocine.
L’addition de la fumonisine B1 a totalement empêché l’accumulation des céramides induite
par le traitement par l’AVP. Le niveau des céramides, en présence de l’inhibiteur, est plus bas
que dans les cellules non stimulées (BSA1%). Ceci montre que les céramides impliqués sont
principalement issus de la voie de novo. La myriocine, qui agit en bloquant la serine
palmitoyltransférase, a montré un effet similaire sur les niveaux des céramides mesurés à
3h00 et 24h00. Un inhibiteur non spécifique de la sphingomyélinase, la désipramine,
n’empêche pas significativement l’augmentation du niveau des céramides observée après 6
113

jours de culture en présence d’AVP. Ceci suggère que lors de la différenciation des
myoblastes L6 par l’AVP, les céramides accumulés après 3h sont issus de la voie de novo et
non de l’hydrolyse de la sphingomyéline.
céramide, % du contrôle
120
100
80
60
40
20
A
** ** ** **
0
0 20 40 60 80 100
Temps (min)
120
Figure 32 : Variation du taux de céramides en fonction de la durée de traitement par
l’AVP.
A) Effet à court terme de l’AVP10 -7 M sur le niveau des céramides. B) Effet sur le niveau
des céramides pour des temps plus longs de traitements. Les cellules L6 sont traitées ou non
par l’AVP 10 -7 M seule ou en présence de la Fumonisine B1 20µM. Les lipides sont ensuite
extraits et la quantité de céramides est mesurée comme décrit dans la partie « matériels et
méthodes », en utilisant la méthode de la DAG kinase. Les taux de céramides sont donnés
en % du témoin (cellules en BSA 1%) et sont la moyenne de +/- SD de 3 à 7 expériences
indépendantes : différent du temps 0 : *p

UNITE ARBITRAIRE
A
B
muscle, la myogénine (maximale au deuxième jour de traitement). De façon intéressante, nous
avons observé par Western blotting que la fumonisine B1 et la myriocine, en présence d’AVP
10 -7 M pendant 48h ont augmenté l’expression de la myogénine. A l’opposé, les céramides
exogènes à chaînes courtes ont inhibé de façon significative son expression (figure 33).
250
200
150
100
50
0
Contrôle AVP AVP AVP AVP
+FB1 +myrio. +C6-cer
**
**
contrôle + FB1 +myrio. +C6-c +C6-c +C8-c +C8-c
20µM 0.1µM 5µM 10µM 5µM 10µM
________________________________________
AVP
Figure 33 : Effet des céramides sur l’expression de la myogénine.
A) Les cellules sont traitées ou non pendant 48h00 avec ou sans AVP, en présence ou non
de fumonisine B1 20µM, de myriocine 100nM, de céramides à courtes chaînes 5 ou 10µM.
Les cellules sont ensuite homogénéisées dans un tampon hypotonique et les extraits
cellulaires sont analysés par Western blotting avec un anticorps monoclonal antimyogénine.
B) Les bandes sont quantifiées par vidéodensitométrie et les résultats sont
exprimés en unité arbitraire après normalisation avec la tubuline. Ils représentent la
moyenne +/- SEM de 4 à 9 expériences. * différent du contrôle AVP p < 0,05 et ** p

) Effet des céramides sur l’accumulation nucléaire de la myogénine :
Nous avons évalué la différenciation myogénique en observant l’accumulation nucléaire de la
myogénine par immunofluorescence. Nous avons estimé le pourcentage de noyaux
myogénine-positifs par rapport aux noyaux totaux des cellules.
A
Ctrl +AVP +C6 cer + AVP
B
% de noyaux myogénine
positifs
80
60
40
20
0
FB1 +AVP ISP1 + AVP
Figure 34 : Effet des céramides sur l’accumulation nucléaire de la myogénine induite par
l’AVP.
A. Les cellules sont traitées ou non par l’AVP 10 -7 M, en présence soit de la fumonisine
B1, soit de la myriocine, soit du C6-céramide. Les cellules ont ensuite été fixées,
perméabilisées puis incubées avec l’anticorps primaire monoclonal anti-myogénine
et l’anticorps secondaire rhodamine anti-souris qui permet la révélation par
fluorescence au microscope. Les flèches montrent des noyaux myogénine-positifs
regroupés dans des myotubes.
B. Le diagramme du bas représente le pourcentage des noyaux myogénine-positifs par
rapport aux noyaux totaux déterminé dans 10 champs différents. ** différent du
contrôle AVP, p

Ces expériences montrent que la fumonisine B1 et la myriocine potentialisent l’accumulation
nucléaire de la myogénine induite par l’AVP alors que les C6-céramides ont un effet opposé.
De plus, nous observons qu’en présence des inhibiteurs de la voie de novo, de nombreux
noyaux sont regroupés, ce qui témoignent de la formation précoce de myotubes (voir figure
34). Ceci suggère que les inhibiteurs de la voie de novo accélèrent le processus de fusion
cellulaire.
Pour confirmer l’effet des céramides sur la réponse myogénique des L6 induite par l’AVP,
nous avons transitoirement surexprimé une sphingomyélinase bactérienne couplée à la GFP et
adressée au niveau du réticulum endoplasmique. La construction utilisée permet d’avoir une
production de céramides localisée au niveau du réticulum endoplasmique qui est le
compartiment où a lieu la synthèse de novo.
D’après la figure 35Aa, nous observons qu’une partie importante des cellules stimulées à
l’AVP et exprimant la protéine contrôle GFP couplée à la séquence d’adressage au réticulum
endoplasmique sont positives pour l’accumulation nucléaire de la myogénine (marquage
rouge). A l’inverse, dans les cellules surexprimant la sphingomyélinase bactérienne couplée à
la GFP et adressée au réticulum endoplasmique, il y a une inhibition de la différenciation
myogénique induite par l’AVP, se manifestant par une absence d’accumulation nucléaire de la
myogénine (figure 35 Ab).
117

A
B
a) pCMV5-GFP-RE b) pCMV5-GFP-bSMase-RE
% de noyaux
myogéninepositifs
30
25
20
15
10
5
0
pCMV5-GFP-RE pCMV5-bSMase-GFP-
RE
Figure 35 : effet de la surexpression des constructions pCMV5-GFP-RE et pCMV5-GFP-
SMase-RE sur l’accumulation nucléaire de la myogénine induite par l’AVP 10 -7 M.
A. Les cellules ont surexprimé soit la protéine GFP adressée au réticulum
endoplasmique (a), soit la protéine de fusion SMase couplée à la GFP adressée au
réticulum endoplasmique (b) et sont traitées 48h en présence de l’AVP 10 -7 M.
B. Le diagramme du bas représente les % de noyaux myogénine positifs par rapport
aux noyaux totaux, calculés dans les seules cellules vertes.
118
contrôle
AVP

IV.1.1.2.2 Effet des céramides sur la fusion des cellules musculaires
induite par l’AVP :
contrôle + AVP + AVP + FB1
Pourcentage de fusion
70
60
50
40
30
20
10
0
Contrôle
AVP
AVP + FB1
D 2 D 5 D 12 D 14
Jours de traitements
Figure 36 : Effet de la fumonisine B1 sur la fusion des cellules L6 traitées par l’AVP :
A) Les cellules sont traitées sans (contrôle) ou avec l’AVP 10 -7 M seule, ou en présence
de la fumonisine B1 20µM pendant 48h. Les cellules sont ensuite observées au
microscope en contraste de phase. La différenciation myogénique est mise en
évidence par la formation de myotubes polynucléés.
B) Les cellules sont traitées comme décrits ci-dessus et sont examinées à différents
temps : l’index de fusion est évalué, en mesurant le nombre de noyaux dans les
myotubes par rapport au nombre de noyaux totaux.
Après deux et cinq jours de traitement par l’AVP en la présence de fumonisine B1, la fusion
cellulaire est augmentée deux fois par rapport au traitement par l’AVP seule. Ce qui confirme
l’observation de la figure 34A. Pour des temps de traitements plus longs, l’effet de la
fumonisine B1 sur l’index de fusion est proportionnellement moins marqué et devient nul
après 14 jours de différenciation par l’AVP.
119

IV.1.1.2.3 Effet des céramides sur l’expression de la créatine kinase :
Un marqueur tardif de la différenciation myogénique, la créatine kinase, est dosé sur les
cellules L6 différenciées au bout de 6 jours de traitements par l’AVP, en l’absence ou en
présence de drogues modifiant les taux de céramides. L’ajout de la fumonisine B1 ou de la
myriocine entraîne une forte augmentation de l’activité créatine kinase des cellules
différenciées alors que l’ajout de C6-céramide entraîne une diminution de 50% de cette
activité.
Activité CK, % par rapport à l’AVP
350
300
250
200
150
100
50
0
* *
Figure 37 : Effet des céramides sur l’activité d’un marqueur de la différenciation
terminale : la créatine kinase.
Les myoblastes sont cultivés pendant 6 jours en milieu BSA1% en l’absence (contrôle) ou
en présence d’AVP 10 -7 contrôle AVP AVP AVP AVP AVP AVP
+FB1 +myrio +C6cer +PDMP +PDMP
10µM 20µM
M avec ou sans fumonisine B1 20µM, myriocine 0,1µM, C6céramide
5µM, ou PDMP 10 et 20µM (cette concentration a été utilisée pour éviter la mort
cellulaire observée à long terme avec une plus haute concentration). L’activité spécifique
de la créatine kinase exprimée en pourcentage de la valeur de l’AVP (1,7 +/- 0,25 mDO
par min par µg de protéines) a été mesurée sur les homogénats cellulaires. Les résultats
représentent la moyenne +/- SEM de 3 à 5 expériences indépendantes. * significativement
différent du contrôle AVP, p

myriocine peut induire une déplétion marquée en glycosphingolipides. Certains effets
biologiques des inhibiteurs de la voie de novo peuvent donc être attribués à la déplétion en
glycosphingolipides. Pour vérifier cela, nous avons utilisé le PDMP (phenyl-2décanoylamino-3-morpholino-1-propanol)
qui bloque la première étape de synthèse des
glycosphingolipides en inhibant la glucosylcéramide synthase et donc induit une déplétion en
glycosphingolipides. Il est intéressant de noter que le PDMP induit une accumulation de
céramides, contrairement à la fumonisine B1 et à la myriocine. Pour des concentration de 10
et 20µM, le PDMP en présence d’AVP10 -7 M diminue l’activité créatine kinase et s’avère
donc être un inhibiteur de la différenciation myogénique (figure 37). Il est donc clair que
l’effet positif de fumonisine B1 et myriocine sur la différenciation ne peut pas provenir de la
déplétion en glycosphingolipides.
L’ensemble des résultats suggère donc qu’en inhibant les céramides issus de la voie de
synthèse de novo, on favorise la différenciation myogénique induite par l’AVP. Ceci a été mis
en évidence par une augmentation de l’expression des protéines spécifiques du muscle comme
la myogénine et la créatine kinase et par une accélération du processus de fusion des
myoblastes.
IV.1.1.3 Implication de la PLD dans les effets des céramides sur la différenciation des
cellules L6 induite par l’AVP :
La phospholipase D, spécifiquement l’isoforme PLD1, joue un rôle important dans la
différenciation myogénique induite par l’AVP (Komati et al., 2004 et 2005). De plus, elle a
été identifiée comme cible intracellulaire des céramides (Venable et Obeid, 1999). Nous
avons donc recherché l’effet des différentes drogues modulant les taux de céramides sur
l’activité et l’expression des ARNm de la PLD, stimulée par l’AVP.
IV.1.1.3.1 Au niveau de l’activité :
L’AVP stimule l’activité PLD mesurée après 30 minutes de traitement (figure 38). Cette
réponse est augmentée de 30% quand les cellules sont prétraitées pendant 3h par la
fumonisine B1. A l’inverse, quand les cellules sont prétraitées par le C6-céramide, l’activité
PLD diminue significativement de 33% après 3h et de 50% après 24h de prétraitement.
121

PBu, % de PL totaux
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
contrôle +FB1
3h
Figure 38 : Effet des céramides sur l’activité de la PLD.
L’activité PLD a été testée en évaluant la formation de PBu dans les cellules intactes. Les
cellules sont prétraitées soit par la fumonisine B1 20µM soit par le C6-céramide 10µM
pendant 3h ou 24h. Elles sont lavées et stimulées avec ou sans AVP 10 -7 M pendant 30
minutes en présence de butanol-1 1%. La réaction est arrêtée par extraction des lipides puis
les phospholipides sont fractionnés par chromatographie sur couche mince. La
radioactivité associée au PBu est exprimée en % de la radioactivité associée aux PL totaux.
Les résultats représentent la moyenne +/- SEM de 3 à 5 expériences indépendantes : **
différents de l’AVP, p ≤ à 0,001.
Ces résultats montrent que l’effet négatif des céramides issus de la voie de novo sur la
myogénèse peut être lié à la modulation de l’activité PLD.
IV.1.1.3.2 Au niveau de l’expression des ARNm de PLD :
Les deux gènes de la PLD identifiés chez les mammifères, PLD1 et PLD2 sont exprimés dans
les myoblastes L6 (Komati et al., 2005). Des expériences de RT-PCR ont été réalisées pour
détecter les différents transcrits PLD, après traitement des L6C5 par des drogues modifiant les
niveaux de céramides, ceci afin de déterminer si les céramides peuvent réguler la PLD au
niveau de la transcription. L’incubation de 3h avec les inhibiteurs de la voie de synthèse de
novo en présence de l’AVP entraîne une augmentation de l’expression des ARNm des deux
variants d’epissage de la PLD1, PLD1a et PLD1b (+ 75% avec la myriocine et + 120% avec
la fumonisine B1). A l’inverse, l’incubation de 3h00 avec le C6-céramide en présence d’AVP
**
AVP 30min
122
**
+C6-cer
3h
**
+C6-cer
24h

a tendance à diminuer l’expression de PLD1a et PLD1b. Pour ces différents traitements,
l’expression de la PLD2 n’est pas affectée (figure 39). Ceci suggère donc que les céramides
régulent sélectivement le niveau de transcription de la PLD1, dans les myoblastes L6.
A
B
PLD1a
PLD1b
PLD2
β-actin
Unité arbitraire
Unité arbitraire
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
3
2.5
2
2.5
1
0.5
0
Contrôle AVP AVP AVP AVP
+FB1 +myrio. +C6-cer.
PLD1
control contrôle AVP AVP+FB1 AVP+myrio. AVP+C6-cer
PLD2
Contrôle AVP AVP+ FB1 AVP+myrio. AVP+C6-cer
Figure 39 : Effet des céramides sur l’expression des PLD évaluée par RT-PCR :
A) Les ARN totaux issus de myoblastes cultivés pendant 3h en milieu BSA1%, en l’absence
ou en présence d’AVP, sans ou avec les différents agents, ont été soumis à une
transcription inverse. Les ADNc ainsi obtenus ont été amplifiés par PCR avec des couples
d’amorces spécifiques de PLD1, PLD2 et β- actine (utilisée pour la normalisation).
B) Les diagrammes montrent la quantification par vidéodensitomètrie des produits
d’amplification de PLD1 et PLD2. Les résultats sont exprimés en unités arbitraires après
normalisation avec β-actine. Ils représentent la moyenne +/- SEM de trois expériences
indépendantes. Pour PLD1, ** différent de + AVP, p ≤ 0,01.
123
**
**

IV1.1.4 Effets des céramides sur la formation PLD dépendante des fibres de stress au cours
de la stimulation myogénique :
Komati et al., (2005) ont montré que la PLD intervient dans la réponse myogénique en
participant à la réorganisation du cytosquelette d’actine. Les inducteurs de différenciation
AVP et TPA provoquent une formation de fibres de stress concomitante avec l’activation de
la PLD, et PLD dépendante. Nous nous sommes donc intéressés à l’effet des céramides sur les
fibres de stress se formant soit au cours de la stimulation myogénique par l’AVP, soit en
réponse à la surexpression de PLD1.
Nous avons transfecté transitoirement les myoblastes L6 avec les plasmides pCDNA3-vide et
pCDNA3-PLD1b; nous avons ensuite traité les cellules en présence ou non de céramides
exogènes 20µM pendant 3h, et ensuite stimulé ou non par l’AVP 10 -7 M pendant 15min. Les
cellules ont été ensuite fixées et marquées avec la phalloïdine couplée à la rhodamine et
examinées au microscope à fluorescence, pour observer l’état de l’actine-F.
Nous avons observé que 37,3 +/- 1,7% des cellules surexprimant la PLD1 présentent des
fibres de stress en absence d’AVP par rapport à 4.8 +/-1.1% pour les cellules témoins. En
présence d’AVP, 68,2 +/- 3% des cellules transfectées par la PLD1 présentent des fibres de
stress et 55,3 +/- 3.3% pour les cellules témoins transfectées par le vecteur vide. En accord
avec nos résultats précédents (Komati et al., 2005), nous observons donc que la PLD1 joue un
rôle positif dans la formation des fibres de stress dans les myoblastes L6. Les cellules traitées
par l’AVP ou surexprimant la PLD présentent des fibres de stress épaisses, bien organisées et
parallèles. Le traitement des cellules par le C6-céramide altère profondément les fibres de
stress, qu’elles soient induites par l’AVP, ou par la surexpression de PLD1 : les fibres d’actine
formées sont plus fines, moins denses, souvent interrompues. On note aussi leur
désorganisation, avec apparition de foyers radiaux (figure 40).
124

A PCDNA3 PCDNA3-PLD1
+ CER +
CER
B
+ AVP
+ AVP+cer
125
+ cer
+ AVP+cer

B
densité moyenne
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
** ** **
BSA AVP C6-CER 20µM C6-CER 20µM
+ AVP
Figure 40 : Effet du C6- céramide sur la formation des fibres de stress dans les cellules L6.
A) Les cellules L6 ont été transfectées transitoirement pendant 18h avec les vecteurs
pCDNA3-vide ou pCDNA3-PLD1. Les cellules ont été prétraitées ou non pendant 3h avec
du C6-céramide 20µM et stimulées ou non pendant 15min par l’AVP. Les cellules sont
fixées, perméabilisées et incubées avec la phalloïdine couplée à la rhodamine permettant la
détection de l’actine-F par microscopie de fluorescence. Les flèches indiquent des foyers
radiaux anormaux de fibres d’actine.
B) Le diagramme représente l’intensité moyenne de la fluorescence des cellules. La
moyenne +/- SEM de la densité moyenne de fluorescence d’une vingtaine de cellules
sélectionnées au hasard dans 4 à 5 champs est montrée. ** différent des cellules
transfectées par le vecteur vide et non stimulées, ++ différent des cellules transfectées par
PLD1b traitées ou non par l’AVP. νν différent des cellules transfectées par le vecteur vide,
traitées à l’AVP10 -7 M. p

IV.1.2 Rôle de la phospholipase D dans la perméabilité endothéliale :
L’athérosclérose est initiée par l’accumulation subendothéliale de lipoprotéines athérogènes
notamment les lipoprotéines de basse densité (LDL). Un des facteurs déterminant l’entrée des
LDL dans la paroi vasculaire est la perméabilité de la barrière endothéliale. Le cytosquelette
intervient de manière cruciale dans la perméabilité de l’endothélium aux macromolécules.
Parmi les voies de signalisation régulatrices du cytosquelette, celle de la phospholipase D
prend une importance grandissante.
IV.1.2.1 Caractérisation de la PLD dans la lignée HUV-EC-C :
Pour étudier le rôle de la phospholipase D dans la régulation de la perméabilité endothéliale,
nous utilisons une lignée de cellules endothéliales issue de la veine du cordon ombilical
humain, la lignée HUV-EC-C. Ces cellules expriment différents facteurs endothéliaux et
forment une monocouche caractéristique.
Tout d’abord, nous avons recherché dans cette lignée, la présence des ARN messagers de
PLD1 et PLD2 grâce à la technique de RT-PCR et l’utilisation d’amorces spécifiques de
chaque isoforme.
PLD1a
(446pb)
PLD1b
(332pb)
Figure 41 : Expériences de RT-PCR : l’utilisation d’amorces spécifiques de PLD1 et PLD2
permet de détecter la présence de transcrits PLD1 et PLD2 dans les cellules endothéliales.
Les résultats montrent que la lignée HUV-EC-C exprime les deux isoformes de la
phospholipase D : PLD1 et PLD2. Les deux variants de PLD1, PLD1a et PLD1b sont détectés
avec une efficacité d’amplification similaire, ce qui suggère un niveau d’expression similaire.
La présence des protéines correspondantes a également été vérifiée par Western blotting. Les
anticorps utilisés sont parmi les plus spécifiques actuellement disponibles, mais ils
reconnaissent également de nombreuses bandes de façon aspécifique. Nous ne présentons ici
127
PLD2
(339pb)

que la bande caractéristique de PLD1 ou PLD2 identifiée grâce aux PLD1 et 2 recombinantes
surexprimées dans des cellules COS-1 qui servent de témoins de migration. Les HUV-EC-C
expriment PLD1 et PLD2.
PLD1 PLD2
Cos PLD1 HUV-EC-C Cos PLD2 HUV-EC-C
Figure 42 : Détection de PLD1 et PLD2 chez les cellules endothéliales.
La suspension cellulaire est reprise dans un volume de tampon laëmmli
additionné d'urée 4M et d’EDTA 2,5mM et analysée par Western-blotting avec
un anticorps polyclonal anti-PLD1 ou anti-PLD2.
IV.1.2.2 Localisation des phospholipases D1 et D2 dans les cellules endothéliales :
La localisation sub-cellulaire des phospholipases D1 et D2 a ensuite été étudiée grâce à la
technique d’immunofluorescence. Dans la plupart des champs observés, on remarque un
marquage intense autour des noyaux qui se prolonge par des zones de marquage plus diffuses
et des zones de marquage ponctuées. La localisation périnucléaire des deux PLD est évidente,
sans qu’il soit possible de localiser ces protéines dans un compartiment précis.
PLD1 PLD2
Figure 43 : Mise en évidence de la localisation subcellulaire de PLD1 et PLD2 par
immunofluorescence.
Les cellules ont été fixées, perméabilisées puis incubées avec l’anticorps primaire
polyclonal anti-PLD1 ou anti-PLD2 et l’anticorps secondaire Alexa anti-lapin qui permet
la révélation par fluorescence au microscope.
128

La localisation des isoformes de PLD a ensuite été recherchée après surexpression des
protéines étiquetées par la GFP.
pEGFP-PLD1b pEGFP-PLD2
Figure 44 : Expression des protéines de fusion PLD-GFP dans les cellules HUV-EC-C :
Les cellules en culture ont été transfectées, comme décrit dans la partie « Matériels et
Méthodes » par les plasmides pEGFP-PLD1b et pEGFP-PLD2 respectivement, et observées
au microscope à fluorescence 48h après transfection.
L'observation des cultures cellulaires, 48h après transfection, montre que les cellules
transfectées par pEGFP-PLD1b aussi bien que par pEGFP-PLD2 expriment la GFP. Le gène
de la protéine GFP se trouvant en 5' du gène de la PLD dans la séquence plasmidique,
l'expression de la GFP implique l'expression de la protéine PLD qui y est couplée. Dans les
cellules transfectées par le vecteur portant l’ADNc de PLD1, la fluorescence est
essentiellement localisée dans une zone périnucléaire alors qu’elle est beaucoup plus diffuse
pour les cellules transfectées par pEGFP-PLD2. Ceci est en accord avec la littérature puisque
les PLD ont été décrites dans de nombreux compartiments membranaires incluant l’enveloppe
nucléaire, le réticulum endoplasmique, l’appareil de Golgi, les vésicules sécrétoires et la
membrane plasmique (Liscovitch et al., 2000).
IV.1.2.3 Effets des LDL natives et oxydées sur l’activité PLD :
Afin de déterminer si la PLD peut jouer un rôle dans le processus physiopathologique
conduisant à l’athérosclérose, nous avons dans un premier temps observé l’effet des LDL
natives, ou oxydées in vitro par le sulfate de cuivre, à 1mg/mL sur l’activité de la
phospholipase D des cellules HUV-EC-C, après mise en contact avec la monocouche
cellulaire.
129

L’activité PLD est mesurée en se basant sur sa propriété de transphosphatidylation et en
mesurant la radioactivité du phosphatidylbutanol formé, comme décrit dans la partie
« matériels et méthodes ». Nous avons utilisé comme produits de référence l’acide
lysophosphatidique (LPA) 10µM, la sphingosine-1 phosphate (S1P) 1µM et l’ester de phorbol
TPA 1nM qui sont des activateurs de la phospholipase D. Il est connu que les esters de
phorbol comme le TPA stimulent la PLD, via l’activation de PKC. Certaines isoformes de
PKC (α et β) sont capables d’activer la PLD par l’intermédiaire d’une protéine G de la famille
ARF. Ceci expliquerait l’activité prolongée de la PLD (Kahn et al., 1993). Les PKC peuvent
en outre activer la PLD par une interaction protéine/protéine directe, et/ou par
phosphorylation (Xie et al., 1998). La S1P est un lysophospholipide bioactif principalement
sécrété par les plaquettes activées. Elle agit à la fois comme un ligand extracellulaire se fixant
sur des récepteurs EDG (Endothelial Differenciation Gene) spécifiques de type 1, 3 et 5
exprimés au niveau des cellules endothéliales, et comme second messager intracellulaire car
l’activation séquentielle des céramidases et de la sphingosine kinase convertit les céramides
en sphingosine-1 phosphate. La S1P induit la formation de fibres de stress dans les cellules
épithéliales humaines et la PLD serait un des composants de la voie de signalisation en aval
du récepteur de la S1P (Porcelli et al., 2002). Comme la S1P, l’acide lysophosphatidique peut
agir comme un ligand extracellulaire liant des récepteurs EDG de type 2 et 4 couplés aux
protéines G hétérotrimériques, présents chez les cellules endothéliales, et comme second
messager intracellulaire formé sous l’action d’une PLA2 spécifique (Thomson et Clarck,
1995). Ce phospholipide intervient dans l’agrégation plaquettaire (Eichholtz et al., 1993), la
prolifération, la croissance cellulaire et l’organisation du cytosquelette d’actine (Moolenar,
1995).
A
Pbut (% de la radioactivité des PL totaux)
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 5 10 30
temps en m in
LPA 10µM TPA 1nM S1P 1µM
130

B
Pbut (% de la radioactivité des PL totaux)
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Figure 45 : Effet des LDL natives et oxydées sur l’activité de la PLD.
Les cellules endothéliales préalablement marquées avec des doses traceuses de [³H]myristate
sont incubées avec les différents agonistes (A) pendant un temps variant de 5 à 30
min, et avec les LDL natives ou oxydées (B) pendant 5 à 60 min, en présence de butanol-1
1%. La radioactivité associée au phosphatidylbutanol est exprimée en % de la radioactivité
incorporée dans les phospholipides totaux.
Nous en déduisons que les LDL activent rapidement et de manière prolongée la PLD. De plus,
nous n’observons pas de différence notable entre les effets des LDL natives et des LDL
oxydées (figure 45).
IV.1.2.4 Effets de différents agonistes de la PLD et des LDL modifiées ou non sur la
réorganisation du cytosquelette :
0 5 15 30
temps en min
LDL natives 1mg/mL LDL oxydées 1mg/mL
Dans la littérature, il est connu que la PLD joue un rôle important dans des réponses rapides
comme la réorganisation du cytosquelette et le contrôle de la morphologie cellulaire.
L’isoforme PLD1 intervient dans la formation des fibres de stress et des adhésions focales
induites par le LPA dans les fibroblastes (Kam et Exton, 2001). Dans les PAEC, le LPA
induit de façon PLD dépendante la formation de fibres de stress et ceci est mimé par
l’addition de PA exogène (Cross et al., 1996). Nous avons montré que PLD1 et son produit
PA participent directement à la formation de fibres d’actine « stress fiber like» dans les
myoblastes en différenciation (Komati et al., 2005).
Nous avons donc observé l’effet des différents agonistes ainsi que des LDL natives et oxydées
sur la formation des fibres de stress dans les cellules HUV-EC-C. Celles-ci sont détectées au
131

microscope à fluorescence après marquage de l’actine F à la phalloïdine couplée à la
rhodamine. L’activation de la PLD par les différents agonistes et les LDL natives ou oxydées
s’accompagne d’une modification de l’organisation du cytosquelette, se manifestant par
l’apparition de fibres de stress, détectables dés quelques minutes de contact et restant stables,
notamment dans le cas des LDL où les fibres sont encore présentes après 3h (figure 46).
A
B
Contrôle LPA 10µM 10’ 30’ 60’
S1P 1µM 5’ 10’ 30’
TPA 1nM 5’ 10’ 30’
Contrôle LDLn 5’ 10’ 15’
30’ 1h 2h 3h
132

C
Contrôle LDL ox 15min 30min
60min
Figure 46 : Effets de différents agonistes et les LDL modifiées ou non sur la réorganisation
du cytosquelette.
Les cellules sont traitées par différents agonistes de la PLD comme l’acide
lysophosphatidique (LPA), la sphingosine-1-phosphate (S1P) et le TPA (A), par les LDL
natives (B) et oxydées (C) pendant différents temps. Les fibres d’actine sont révélées par la
phalloïdine, couplée à la rhodamine. Le DAPI colore les noyaux en bleu.
IV.1.2.5 La réorganisation du cytosquelette induite par les LDL est-elle PLD dépendante ?
Nous avons cherché à déterminer si la PLD est impliquée dans la formation des fibres de
stress induites par les différents agonistes (LPA, TPA) ainsi que les LDL natives et oxydées.
Pour cela, nous avons mis les cellules endothéliales en présence d’un alcool primaire le
butanol-1 qui détourne l’action de la phospholipase D en empêchant la formation de l’acide
phosphatidique. Nous avons réalisé un contrôle de toxicité de l’alcool en utilisant un alcool
secondaire, le butanol-2 qui n’a pas d’effet sur la PLD. Nous avons observé que la formation
des fibres de stress induite par les agonistes ainsi que les LDL natives ou oxydées est
totalement inhibée par le butanol-1 alors qu’elle est peu affectée par le butanol-2 (figure 47).
La réorganisation du cytosquelette est donc dépendante de la présence de l’acide
phosphatidique, issue de l’activation de la PLD.
133

control Contrôle
LDL 1mg/ml native 15 min LDL +but 1 0.5% 15 min LDL +but 2 0.5% 15 min
LPA 10µM
10µM 15 min
Figure 47 : La réorganisation du cytosquelette induite par les agonsites de PLD et LDL
natives ou oxydées est-elle PLD dépendante ?
Les cellules sont traitées par l’acide lysophosphatidique (LPA), l’ester de phorbol TPA,
ainsi que par des LDL natives ou oxydées pendant 15 minutes en présence ou non de
butanol-1 ou de butanol-2. Les fibres d’actine sont mises en évidence par une toxine
fongique, la phalloïdine, couplée à la rhodamine. Le DAPI colore les noyaux en bleu.
IV1.2.6 Effets des LDL natives ou oxydées sur la localisation des PLD endogènes :
Etant donné l’implication de la PLD dans la formation des fibres de stress, nous avons étudié
la localisation de la PLD endogène après stimulation par le LPA, et par les LDL modifiées ou
non. Par des expériences d’immunofluorescence, nous avons détecté les PLD1 et PLD2
endogènes à l’aide d’anticorps primaires polyclonaux anti-PLD1 et anti-PLD2, et d’un
anticorps secondaire couplé à la fluorescéine. Dans les cellules témoins quiescentes, non
stimulées, nous avons observé que PLD1 et PLD2 sont localisés dans une zone périnucléaire
qui se prolonge par des zones de marquages plus diffuses (figure 48). Lorsque les cellules
134
LPA10µM+but LPA10µM+but-1 1 0.5% 15 LPA10µM+ min but-2 0.5%
INTRO
DUCTI
ON
TPA 1nM 15 min TPA TPA1nM+but TPA0.5% 1nM + 15 but-1 min 1 0.5% 0.5% 15 min TPA 1 nM + but-2 0.5%
LDL ox
LDL ox + but-1 0. 05%
LDL ox + but-2 05%

A
sont stimulées par le LPA ou les LDL natives ou oxydées, la PLD1 (figure 48A)
contrairement à la PLD2 (figure 48B) se relocalise le long de structures filamenteuses qui
rappellent les fibres de stress. Ces résultats suggèrent que la PLD, spécifiquement, pourrait
participer à la formation des fibres de stress. Pour confirmer cela, il faudrait réaliser un
comarquage des fibres d’actine et de la PLD1.
contrôle
contrôle
LDLoxydées 15 min LDL natives 15 min
135
LPA 10µM 15 min

B
Contrôle LPA 10µM 15min
LDL1mg/mL native 15min
Figure 48 : Mise en évidence de la localisation subcellulaire de PLD1 (A) et PLD2 (B) par
immunofluorescence.
Les cellules ont été fixées, perméabilisées puis incubées avec l’anticorps primaire
polyclonal anti-PLD1 ou anti-PLD2 et l’anticorps secondaire Alexa anti-lapin qui permet
la révélation par fluorescence au microscope. Dans le premier panneau (A), le contour de
la cellule indiquée par la flèche a été tracé, en fonction de l’image obtenue en contraste de
phase, ceci pour montrer que le marquage de PLD1 ne concerne que le centre de la cellule
quiescente.
IV1.2.7 Effets des LDL natives et oxydées sur la perméabilité des cellules endothéliales :
Nous avons pensé que l’apparition des fibres de stress due à l’activation de la PLD permettrait
un changement de forme de la cellule et une désorganisation des jonctions intercellulaires,
ayant pour conséquence d’augmenter la perméabilité paracellulaire. Pour étudier cela, nous
avons cultivé des monocouches de cellules endothéliales en système Transwell sur des filtres
136
LDL oxydée 1mg/mL 15min

microporeux et nous les avons traitées soit par le LPA, soit par les LDL natives ou oxydées.
Nous avons mesuré la perméabilité en suivant le passage d’une macromolécule, la peroxydase
de raifort (HRP) à travers la monocouche. Pour chaque expérience de perméabilité, nous
avons vérifié la confluence de la monocouche de cellules endothéliales avant de réaliser les
différents traitements. Pour cela, nous utilisons un système d’électrodes qui mesure la
résistance de la couche cellulaire.
DO HR
12
10
8
6
4
2
0
0 0,5 1 1,5 2
temps en heures
2,5 3 3,5 4
HUV.EC.C HUV.EC.C+LDL HUV.EC.C+LDLox HUV.EC.C + LPA
Figure 49 : Mesure de la perméabilité de la monocouche de cellules endothéliales à la
peroxydase de raifort (HRP).
Les cellules endothéliales sont cultivées sur des filtres microporeux en système Transwell.
L’HRP est ajoutée dans le compartiment supérieur à la monocouche de cellules témoins, de
cellules traitées au LPA, aux LDL natives, ou LDL oxydées. L’HRP, présente dans le
compartiment inférieur est dosée au spectrophotomètre, par une réaction colorimétrique.
La DO est rapportée à celle mesurée au temps 1h avec les cellules non traitées.* différent
des cellules non traitées, p

IV1.2.8 Passage des LDL marquées à travers la monocouche de cellules endothéliales
Les résultats précedents ayant été obtenus avec une macromolécule type, l’HRP, nous nous
sommes demandé si, dans nos conditions expérimentales, les LDL étaient effectivement
capables de traverser la monocouche. Nous avons donc suivi le passage des LDL
préalablement radiomarquées à l’aide de dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) tritiée à
travers les monocouches de cellules endothéliales cultivées en système Transwell. Le passage
des LDL est déjà mesurable après 4h, et devient important à 24h (~30% de la radioactivité
mesurée en l’absence de cellules, qui reflète la diffusion à travers le filtre). Le LPA n’a pas
d’effet additif sur le passage des LDL radiomarquées, ce qui est cohérent avec l’hypothèse
que les deux effecteurs agissent sur la perméabilité par le même mécanisme.
DPM
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
LDL * HUV-EC-C+ LDL* HUV-EC-C + LDL* + LPA10µM
LDL *
LDL *
Figure 50 : Passage des LDL marquées à travers la monocouche de cellules endothéliales
Les LDL marquées par le [ 3 H]-DPPC sont ajoutées au compartiment supérieur au dessus
de la monocouche de cellules endothéliales cultivée sur un filtre microporeux, avec ou sans
addition de LPA. Des fractions du milieu du compartiment inférieur sont récupérées à 4h et
à 24h. La radioactivité est mesurée par comptage en scintillation liquide dans un compteur
Packard 1900TR.
138
4H
24H
LDL * + LPA

L’ensemble de ces résultats suggèrent que les LDL régulent elle-même la PLD endothéliale et
peuvent donc stimuler leur propre passage.
IV1.2.9 Recherche d’une éventuelle modification des LDL dans nos conditions
expérimentales :
Bien que les LDL oxydées in vitro n’aient pas manifesté d’effet différent des LDL natives,
nous nous sommes demandé si les effets des LDL supposées natives sur l’activation de la
PLD et la réorganisation du cytosquelette étaient dûs à leur oxydation, au cours du contact
prolongé avec les cellules endothéliales. On aurait pu craindre notamment des modifications
des LDL différentes, en nature et en degré, de celles obtenues in vitro en présence de sulfate
de cuivre. Il a été montré que les LDL natives mises en présence de cellules endothéliales en
culture voient leurs propriétés physico-chimiques modifiées et deviennent reconnaissables par
les macrophages. Ces modifications consistent notamment en une peroxydation lipidique.
L’étape initiale serait une attaque des acides gras polyinsaturés des phospholipides par des
radicaux libres de l’oxygène avec production de lipoperoxydes et d’aldéhydes. Ces produits
d’oxydation se fixent ensuite sur les résidus lysines et arginines de l’apolipoprotéine B,
impliquée dans la reconnaissance des LDL par leur récepteur. Au-delà d’un certain degré
d’oxydation, les LDL ne sont plus reconnues par leur récepteur normal, mais par le récepteur
scavenger.
IV1.2.9.1 Pureté des préparations et mobilité électrophorétique des LDL
natives et oxydées :
Pour savoir si les LDL s’oxydent au contact des cellules endothéliales, nous avons avant tout
vérifié la pureté des préparations de LDL natives et oxydées, par la technique
d’électrophorèse horizontale sur gel d’agarose qui permet de séparer les différentes classes de
lipoprotéines présentes dans un échantillon de plasma. Au niveau des pistes des LDL natives
et des LDL oxydées, la présence d’une bande unique indique que les préparations de LDL
utilisées ne sont pas contaminées par d’autres classes de lipoprotéines, prouvant ainsi leur
pureté (figure 51). La mobilité électrophorétique des LDL natives n’est pas modifiée par
rapport à celle de LDL présentes dans l’échantillon de plasma frais. Elles ne sont donc pas
oxydées, ce qui indique que les conditions antioxydantes utilisées lors de leur préparation sont
adéquates. La mobilité électrophorétique des LDL oxydées est supérieure à celle des LDL
139

natives, ce qui indique que l’apoB100 des LDL a bien été oxydée lors de l’incubation avec le
cuivre.
Figure 51 : Mobilité électrophorétique des LDL natives et oxydées.
IV1.2.9.2 Quantification de l’oxydation de la partie lipidique des LDL :
dosage des TBARS :
Les substances qui réagissent avec l’acide thiobarbiturique (TBARS) sont des aldéhydes
générés au cours de la peroxydation lipidique. Ils sont, à ce titre, utilisés comme marqueurs de
l’oxydation de la partie lipidique des LDL. Pour les LDL natives, la quantité de TBARS que
nous observons est faible. En revanche, l’oxydation des LDL par le cuivre (10µM, 2h à 37°C)
multiplie par un facteur 20 la quantité de TBARS présente.
140

MDA nmoles/mg de protéines
10
8
6
4
2
0
0 5 15 30 60 120 180 240 1440 2880 4320
temps en minutes
Figure 52 : Quantification de l’oxydation de la partie lipidique des LDL au contact des
HUV-EC-C, pour des temps variables.
Au contact des HUV-EC-C, les LDL ne s’oxydent pas de manière sensible pendant 48h. Ce
n’est qu’au bout de 72h de contact avec les HUV-EC-C que les LDL commencent à s’oxyder.
IV1.2.9.3 Dosage de la vitamine E :
La vitamine E, l’antioxydant majeur des LDL a été quantifiée par HPLC. Deux isomères sont
détectés par fluorescence, l’α-tocophérol et le γ-tocophérol, et quantifiés en fonction de la
quantité connue ajoutée d’un standard interne, le δ-tocophérol. La concentration d’αtocophérol
et γ-tocophérol ne diminue pas sensiblement pour des LDL mises en contact avec
les HUV-EC-C jusqu’à 4h. Par contre pour 72h de contact avec les HUV-EC-C, la
concentration d’α-tocophérol est effondrée, en accord avec l’état oxydé des LDL.
141
LDL natives
LDL oxydées

% par rapport aux LDLnatives
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0 5 15 30 60 120 180 240 4320
temps en minutes
alpha tocophérol gamma tocophérol
Figure 53 : Dosage de l’α-tocophérol dans les LDL au contact des HUV-EC-C, à des temps
variables.
Les lipides de ces particules sont extraits comme indiqué dans la partie « matériels et
méthodes ». Le δ-tocophérol est ajouté comme standard interne. Les lipides sont repris dans
le solvant d’injection (MeOH/H2O 85 :15) et analysés par HPLC couplée à un fluorimètre
(λ émission : 340nm; λexcitation : 295nm). A partir des quantités connues de standard
interne présent dans les échantillons, la concentration en α-tocophérol est calculée.
L’ensemble de ces résultats suggère que les effets obtenus sur la réorganisation du
cytosquelette et sur l’activité PLD sont bien dûs à des composants présents dans les LDL
natives qui ne présentent pas dans les conditions utilisées de signes d’oxydations.
IV1.2.9.4 Effet du plasma sur la réorganisation du cytosquelette :
Nous avons mis en contact du plasma avec les HUV-EC-C pendant 15 minutes en procédant
comme pour les LDL natives et observé le marquage de l’actine F au microscope à
fluorescence. Le plasma, contrairement aux LDL natives ou oxydées n’a pas d’effet sur le
142

cytosquelette. L’absence d’effet du plasma total suggère que l’un de ses composants,
éventuellement les lipoprotéines de haute densité (HDL), anti-athérogènes, empêche l’action
des LDL natives.
CONTROLE PLASMA
LDL natives 1mg/mL LDL oxydées 1mg/mL
Figure 54 : Effet du plasma sur la réorganisation du cytosquelette.
Les cellules sont traitées par les LDL natives, oxydées et du plasma respectivement pendant
15 minutes. Les fibres d’actine sont révélées par la phalloïdine couplée à la rhodamine, et
observées au microscope à fluorescence. Le DAPI colore les noyaux en bleu
143

IV.1.3 Rôle de la phospholipase D dans la prolifération lymphocytaire :
IV1.3.1 Effet de la désorganisation des radeaux sur la phospholipase D et sur la
prolifération des lymphocytes :
IV1.3.1.1 Effet de la désorganisation des radeaux sur l’activité de la
phospholipase D :
Diaz et al. ont montré en 2002 que l’enrichissement de lymphocytes périphériques humains en
DHA perturbe la cohésion des microdomaines membranaires et que cette altération est
responsable d’une relocalisation hors des radeaux de la PLD1 initialement présente dans ces
structures. Cette relocalisation s’accompagne d’une activation de l’enzyme. Pour confirmer
cela, nous avons utilisé d’autres agents pharmacologiques connus pour déstabiliser les rafts :
la filipine et la méthyl-β-cyclodextrine (MBCD), molécules capables de modifier le contenu
membranaire en cholestérol, ainsi qu’une sphingomyélinase bactérienne (Staphylococcus
aureus) qui hydrolyse la sphingomyéline en céramide. Nous avons donc observé l’effet de ces
différents agents sur l’activité de la PLD lymphocytaire.
144

PBu (% de phospholipides totaux)
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
A
*
0 10 15 20 40
MBCD (mM)
* *
B C
PBu (% de phospholipides totaux)
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 1 2 5
Figure 55 : Effet de la désorganisation des radeaux sur l’activité de la phospholipase D des PBMC :
Les cellules sont radiomarquées avec de l'acide [ 3 H] arachidonique, puis sont incubées 1h
en présence de serum albumine humaine 5µM, avant traitement avec des doses croissantes
soit de MBCD (A), soit de filipine (B), soit de sphingomyélinase (C), en présence de butan-
1-ol 1%, pendant 30min. La réaction est arrêtée par l'extraction des phospholipides puis
l'extrait lipidique est fractionné par CCM comme décrit dans la partie Matériels et
Méthodes. La radioactivité associée au phosphatidylbutanol est exprimée en % de la
radioactivité associée aux PL totaux. Les résultats représentent la moyenne ± SEM de 4
expériences indépendantes pour le MBCD, de 9 expériences pour la filipine et de 3
expériences pour la SMase. * significativement différent des cellules témoins incubées sans
traitement. p

IV1.3.1.2 Effet de la SMase sur la localisation de la PLD1 :
L'isolement des microdomaines à partir de lysats cellulaires met à profit l'insolubilité de ces
structures dans les détergents non ioniques à froid et leur propriété de flottaison sur gradient
de densité. Lors de l'ultracentrifugation sur gradient de saccharose d'un homogénat cellulaire
traité au triton X100, les microdomaines sont isolés dans les fractions de faible densité alors
que le reste des membranes est concentré dans les fractions de forte densité. C'est la
composition lipidique particulière des microdomaines qui leur confère ce comportement
caractéristique.
L'activation de la PLD observée après déstabilisation de la membrane par la
sphingomyélinase à une concentration de 0,01U/mL, s’accompagne également d’une
exclusion de la protéine PLD1 des fractions de faible densité et sa relocalisation dans les
fractions de plus forte densité. La sortie de la PLD1 des microdomaines pourrait donc
expliquer son activation.
HSA
PLD1 121
1 3 4 5 6 7 8 9 10
HSA + Smase
PLD1 121
1 3 4 5 6 7 8 9 10
Figure 56 : Délocalisation de la protéine PLD1 par la sphingomyélinase.
400µl de chacune des fractions des gradients réalisés à partir de cellules témoins (HSA) ou
traitées par la SMase 0,01U/ml (HSA+Smase) ont été précipités par de l'acétone à froid
comme indiqué dans la partie Matériels et Méthodes. Le précipité protéique obtenu a été
dissous dans 40µl de tampon Laëmmli contenant 4M d'urée. 20µl (fractions 1 et 3) et 40µl
(fractions 4 à 10) ont été déposés et analysés par Western-blotting avec un anticorps
polyclonal anti-PLD1.
146

IV1.3.1.3 Effet de la désorganisation des radeaux sur la réponse lymphoproliférative
:
La désorganisation des radeaux par enrichissement des cellules en DHA s’accompagnait
d’une inhibition de la réponse des PBMC aux lectines mitogènes (Diaz et al., 2002). Nous
avons donc recherché l’effet des trois agents déstabilisateurs sur la prolifération
lymphocytaire induite par la concanavaline A (ConA).
Réponse proliferative
(% du contrôle)
120
100
80
60
40
20
0
0
10 20 30 40
MBCD (mM)
120
100
80
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5
Filipine [µg/ml]
Figure 57 : Inhibition de la prolifération des PBMC par le MBCD, la filipine et la bSMase.
Les cellules sont isolées puis resuspendues dans du milieu complet comme décrit dans la
partie Matériels et Méthodes, avant distribution dans des plaques 96 puits. Les cellules sont
traitées avec des doses croissantes de filipine (1, 2 ou 5U/ml), MBCD (10, 15, 20 ou 40
U/ml), SMase (0,001; 0,01; 0,1 ou 1 U/ml) pendant 30min avant activation par la ConA
(5µg/million de cellules). Les cellules sont incubées 72h avant mise en contact avec le MTT,
puis solubilisation des échantillons. La proportion de cellules viables est déterminée comme
décrit dans la partie Matériels et Méthodes. Le pourcentage de prolifération est déterminé
par rapport au témoin activé en absence des différents agents. Les résultats représentent la
moyenne ± SEM de deux expériences indépendantes, réalisées en 6 exemplaires.
Nous observons qu’à des doses ayant un effet limité sur la viabilité cellulaire (non montré),
ces agents perturbant les radeaux inhibent fortement la réponse lymphoproliférative.
Ces résultats sont en bon accord avec les travaux montrant que l’intégrité des radeaux est
nécessaire à la transmission correcte des signaux d’activation mitogénique (Xavier et al.,
1998). Ils sont également cohérents avec ceux montrant que l’activation de PLD génère des
signaux antiprolifératifs dans le lymphocyte B (Gilbert et al., 1998). L'exclusion de la PLD1
des microdomaines et son activation semblent donc être l’un des facteurs responsable de
147
120
100
80
60
40
20
0
0 1 10 100
bSMase [mU/ml]
1000

l’inhibition de la transduction du signal mitogénique et donc de l'effet antiprolifératif. Pour le
vérifier, nous avons surexprimé la PLD1 dans la lignée leucémique lymphoïde T Jurkat, et
observé les conséquences sur la prolifération de ces cellules.
IV1.3.2 Rôle de la phospholipase D dans la prolifération des lymphocytes T de la lignée
Jurkat :
IV1.3.2.1 Caractérisation de la phospholipase D dans les cellules Jurkat :
Les PBMC humains expriment les deux isoformes de PLD: PLD1 et PLD2, aussi bien au
niveau des ARNm que des protéines (Diaz et al., 2002). Nous avons recherché la présence des
ARN messagers de PLD1 et PLD2 grâce à la technique de RT-PCR et l’utilisation d’amorces
spécifiques de chaque isoforme dans la lignée lymphocytaire Jurkat.
PLD 1 PLD 2 MW
Figure 58 : Détection des ARNm de PLD dans les Jurkat par RT-PCR.
L’utilisation d’amorces spécifiques de PLD1 et PLD2 permet de détecter la présence de
transcrits PLD1 et PLD2 dans les cellules Jurkat.
Les expériences de RT-PCR ont montré que les lymphocytes de la lignée Jurkat expriment
principalement PLD2 et très faiblement l’isoforme PLD1 (spécifiquement PLD1b). Ceci est
en accord avec les données de la littérature. La présence des protéines correspondantes a
également été vérifiée par Western blotting, à l’aide d’anticorps polyclonaux anti-PLD1 et
148
750
500
250

anti-PLD2. Nous ne présentons ici que la bande caractéristique de PLD1 ou PLD2 identifiée
grâce aux PLD1 et 2 recombinantes surexprimées dans des cellules COS-1, ayant migré dans
des puits parallèles et qui servent de témoins de migration. Les Jurkat expriment PLD2 et très
peu PLD1, au niveau protéique.
PLD2 PLD1
86Kda 120Kda
COS1-PLD2 Jurkat COS1-PLD1 Jurkat
Figure 59 : Détection de PLD1 et PLD2 chez les cellules Jurkat, par Western blotting.
La suspension cellulaire est reprise dans un volume minimum de tampon de Laëmmli
additionné d’urée 4M et d’EDTA 2,5mM et analysée par Western-blotting avec un
anticorps polyclonal anti-PLD1 ou anti-PLD2.
IV1.3.2.2 Effet de la surexpression de la PLD1 sur la prolifération
spontanée des cellules Jurkat :
a) Vérification de l’efficacité de la transfection :
Observation au microscope à fluorescence :
Les formes de PLD transfectées sont étiquetées par la GFP, et peuvent donc être détectées au
microscope à fluorescence. L'observation des cultures cellulaires, 48h après transfection,
montre qu'aussi bien les cellules transfectées par pEGFP-PLD1b que pEGFP-PLD2 expriment
la GFP. Le gène de la protéine GFP se trouvant en 5' du gène de la PLD dans la séquence
plasmidique, l'expression de la GFP implique l'expression de la protéine PLD qui y est
couplée. La transfection s’est déroulée efficacement car les taux de transfection correspondant
au rapport du nombre des cellules vertes exprimant la GFP sur le nombre de cellules totales
sont de 50% pour le vecteur vide témoin pEGFP, 30% pour la pEGFP-PLD1 et 42% pour la
pEGFP-PLD2.
149

pEGFP pEGFP-PLD1 pEGFP-PLD2
Figure 60 : Expression des protéines de fusion PLD-GFP dans les cellules Jurkat :
Les cellules en suspension ont été transfectées comme décrit dans la partie Matériels et
Méthodes par les plasmides pEGFP, pEGFP-PLD1b et pEGFP-PLD2 respectivement, et la
fluorescence a été observée au microscope 48h après transfection.
Vérification de la transfection par RT-PCR :
PLD1b
pEGFP PeGFP pEGFP-PLD1 PeGFP-PLD1 pEGFP PeGFP pEGFP-PLD2 PEGFP-PLD2 MW
RT-PCR PLD1 RT-PCR PLD2
Figure 61 : Vérification de la transfection par RT-PCR.
Après 48h de transfection par pEGFP, pEGFP-PLD1 et pEGFP-PLD2 respectivement, les
ARN sont extraits et sont soumis à une transcription inverse. L’ADNc est ensuite amplifié
par PCR avec des couples d’amorces spécifiques de PLD1 et PLD2.
Les expériences de RT-PCR montrent que les Jurkat ont efficacement exprimé les
constructions GFP-PLD1 ou GFP-PLD2. Pour les cellules transfectées par le plasmide
pEGFP-PLD2, on observe une forte augmentation du produit d’amplification des ARNm de la
PLD2. En ce qui concerne la PLD1 qui normalement est faiblement exprimée, elle apparaît
nettement dans les cellules transfectées par le plasmide pEGFP-PLD1.
150
750
500
PLD2
250

Vérification par dosage de l’activité de la PLD :
L’activité PLD des cellules transfectées a également été mesurée. Une augmentation d’un
fateur 4 et 2 est observée pour les cellules transfectées avec les plasmides pEGFP-hPLD1b et
pEGFP-hPLD2 respectivement (figure 62). Ce résultat montre donc bien que les plasmides
pEGFP-PLD1 et pEGFP-PLD2 permettent de transcrire des protéines de fusion GFP-PLD1 et
GFP-PLD2 fonctionnelles.
Activité PLD (% du contrôle)
600
400
200
0
pEGFP pEGFP -
PLD1
Figure 62 : Activité PLD des cellules Jurkat transfectées par les plasmides pEGFP, pEGFP-PLD1
et pEGFP-PLD2.
Les cellules en culture ont été transfectées par les différents plasmides et l'activité PLD a
été mesurée. La réaction est arrêtée par l'extraction des phospholipides puis l'extrait
lipidique est fractionné par CCM comme décrit dans la partie Matériels et Méthodes.
L'activité calculée est exprimée en % de l'activité mesurée dans le témoin (pEGFP). Les
résultats représentent la moyenne ± SEM de 3 expériences indépendantes.
b) Effet de la surexpression transitoire de la PLD1 sur la prolifération des Jurkat :
Pour étudier la prolifération spontanée des Jurkat, nous avons transfecté les différents
plasmides pEGFP, pEGFP-PLD1 et pEGFP-PLD2 pendant 48h et nous avons ensuite cultivé
les cellules pendant 24h et 48h en l’absence de mitogènes dans des plaques de 96 puits. Nous
151
pEGFP -
PLD2

avons réalisé un contrôle non transfecté. On a pu observer de façon très intéressante qu’entre
24 et 48h, le nombre de cellules a fortement augmenté de 90% pour les cellules contrôles, de
76% pour les cellules transfectées par pEGFP et de 89% pour les cellules transfectées par
pEGFP-PLD2 (figure 62). Pour les cellules surexprimant la PLD1, on n’observe qu’une petite
augmentation non significative de l’ordre de 24%, entre 24 et 48h. Ces résultats indiquent que
la surexpression de la PLD1 a fortement inhibé la prolifération spontanée des Jurkat de l’ordre
de 69%.
Proliferation (DO550-DO690)
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
* *
Contrôle pEGFP pEGFP-
PLD1
Figure 63 : Prolifération spontanée des cellules Jurkat transfectées par les plasmides
pEGFP, pEGFP-PLD1, pEGFP-PLD2.
Les cellules après 48h de transfection sont resuspendues dans du milieu complet (0,1%
SVF) comme décrit dans la partie Matériels et Méthodes, avant distribution dans des
plaques 96 puits. Les cellules sont incubées 24h ou 48h avant mise en contact avec le MTT,
puis solubilisation des cristaux de formazan. La proportion de cellules viables est
déterminée comme décrit dans la partie Matériels et Méthodes. *significativement différent
du temps 24h, p

Nous avons tout d’abord testé l’activation des Jurkat par le TPA et l’ionomycine pendant 2h
et observé l’expression de l’IL-2 grâce à la technique de RT-PCR. Contrairement aux cellules
contrôles non traitées, les cellules Jurkat activées par le TPA et l’ionomycine expriment l’IL-
2.
Ceci est donc en accord avec les données de la littérature.
MW ctrl TPA 200nM MW
+ ionomycine
500nM
Figure 64 : Effet du TPA et de l’ ionomycine sur l’expression de l’IL-2.
Les cellules sont incubées en absence (contrôle) ou en présence de TPA et ionomycine
pendant 2h à 37°C. Les ARN ont été soumis à une transcription inverse et les ADNc
obtenus ont été amplifiés par PCR avec des couples d’amorces spécifiques de l’IL-2.
Nous avons observé l’expression des ARNm de l’IL-2 après 2h de traitement par du TPA et
ionomycine sur des cellules transfectées par pEGFP, pEGFP-PLD1 ou pEGFP-PLD2,
respectivement. Les résultats (figure 64) montrent que pour les cellules surexprimant la
PLD1, l’expression des ARNm de l’IL-2 est fortement diminuée de l’ordre de 43%, tandis
que la surexpression de la PLD2 a tendance à augmenter l’expression de l’IL-2. Ceci confirme
un effet inhibiteur de la PLD1 sur l’activation des Jurkat.
153
IL-2 186 pb

IL-2/ß-actine IL IL-2/ß-actine IL IL-2/ß-actine IL ß- (unité arbitraire)
14
12
10
8
6
4
2
0
TPA
+ Ionomycine - +
Figure 65 : Effet de la surexpression de la PLD1 sur l’expression de l’IL-2.
Les cellules sont transfectées pendant 48h par pEGFP, pEGFP-PLD1ou pEGFP-PLD2 et
sont incubées en présence ou non de TPA et ionomycine pendant 2h à 37°C. Après
extraction, les ARN ont été soumis à une transcription inverse et les ADNc obtenus ont été
amplifiés par PCR avec des couples d’amorces spécifiques de l’IL-2 et de la β-actine
(utilisée pour normalisation). Les photos des gels d’une expérience représentative sont
montrées. Le diagramme montre la quantification des bandes par vidéodensimétrie
(moyennes des trois expériences). * significativement différent des cellules pEGFP + TPA +
ionomycine, p

l’intérieur de la cellule la sous-unité catalytique A. L’utilisation de la sous-unité B de la
toxine couplée chimiquement à une peroxydase (Amersham), permet de visualiser le GM1
présent dans chacune des fractions du gradient par Dot blot. L'analyse densitométrique des
taches révélées par chimioluminescence a permis de mettre en évidence un enrichissement
spécifique en GM1 des fractions de faible densité en saccharose (15 à 20%) correspondant
aux densités caractéristiques des microdomaines. L'enrichissement en ganglioside GM1 des
fractions de faible densité est cohérent avec les caractéristiques des microdomaines telles
qu'elles ont été décrites dans la littérature.
40
35
10
5
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Figure 66 : Distribution du ganglioside GM1 dans les différentes fractions du gradient de
saccharose préparé à partir des cellules Jurkat.
Les microdomaines sont préparés comme décrit dans la partie Matériels et Méthodes et les
fractions (1ml) du gradient sont collectées de 1 (fond du tube) à 11 (sommet du tube). 20µl
de chaque fraction sont déposés sur membrane immobilon et le GM1 est détecté
spécifiquement par la sous-unité B de la toxine cholérique couplée à la peroxydase, et
révélé par chimioluminescence.
b) Localisation de la protéine PLD2 endogène hors des microdomaines :
La présence de la PLD2 endogène a été recherchée dans les fractions du gradient de
saccharose, par Western-blotting à l'aide d'anticorps polyclonal spécifique anti-PLD2. La
protéine PLD2 (≈90kDa) apparaît localisée principalement dans les fractions de forte densité
(1 et 4) et principalement dans la fraction 1 (figure 67). Ceci est en accord avec les données de
155
Mise en évidence du GM1 par
Dot blot dans les fractions 5,6,7.
% GM1
30
25
20
25
% de saccharose
20
15
15
0
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11
n ° fractions
35
30
10
5
% de
saccharose
GM1

la littérature : dans les PBMCs, PLD1 est localisée dans les microdomaines, alors que PLD2
est localisée dans le reste des membranes (Diaz et al., 2002).
86kDa
PLD2
F1 F3 cos F4 F5 F6 F7 F8 F9
PLD2
Figure 67 : Détection de PLD2 dans les différentes fractions d’un gradient de saccharose
préparé à partir de cellules Jurkat.
400µl de chacune des fractions ont été précipités par de l'acétone à froid comme indiqué
dans la partie Matériels et Méthodes. Le précipité protéique est repris dans 40µl de tampon
Laëmmli contenant 4M d'urée et d’EDTA 2.5mM et analysé par Western-blotting avec un
anticorps polyclonal anti-PLD2.
c) Localisation de la PLD1 surexprimée hors des microdomaines :
A la suite des travaux de Diaz et al., (2002), notre hypothèse de travail était que PLD1 ne
trouve un environnement favorable à son activité que lorsqu’elle est localisée hors des
microdomaines.
Nous avons donc surexprimé la PLD1 dans les Jurkat et observé sa localisation par rapport
aux microdomaines. Auparavant, nous avons vérifié l’efficacité de la transfection par
observation au microscope à fluorescence (figure 68), et immunofluorescence de la GFP
(figure 69).
Vérification de la transfection au microscope à fluorescence :
GFP GFP-PLD1
Figure 68 : Expression de la protéine de fusion GFP-PLD1 dans les cellules Jurkat :
Les cellules en culture ont été transfectées comme décrit dans la partie Matériels et
Méthodes par les plasmides pEGFP, pEGFP-PLD1b, respectivement, et la fluorescence a
été observée au microscope 48h après transfection.
156

Vérification de la transfection par immunofluorescence de la GFP :
Nous avons ensuite vérifié l’expression de la protéine de fusion GFP dans les fractions
surnageants post-nucléaires des cellules transfectées par Dot blot, à l’aide d’un anticorps
spécifique anti-GFP. L’observation au microscope à fluorescence ainsi que la détection de la
GFP par Dot blot montrent que les cellules ont bien été transfectées.
SNP
pEGFP pEGFP-PLD1
Figure 69 : Détection par Dot blot des protéines GFP et GFP-PLD1 dans les surnageants
post-nucléaires
respectivement.
(SNP) des cellules transfectées par pEGFP et pEGFP-PLD1
La GFP est détectée spécifiquement par l’anticorps anti-GFP et révélée par
chimioluminescence.
Caractérisation des microdomaines :
Après 48h de transfection par les plasmides pEGFP et pEGFP-PLD1, respectivement, nous
avons réalisé deux gradients de saccharose des homogénats cellulaires traités au triton X100.
Les microdomaines, lors de l’ultracentrifugation sont isolés dans les fractions de faible densité
alors que le reste des membranes est concentré dans les fractions de forte densité. Après
l’ultracentrifugation, les deux gradients dont fractionnés en aliquots de 1mL et le % de
saccharose de chaque fraction est déterminé. Nous avons ensuite visualisé le GM1 présent
dans chacune des fractions du gradient par Dot blot, grâce à l’utilisation de la sous unité B de
la toxine cholérique couplée chimiquement à une peroxydase. L'analyse densitométrique des
taches révélées par ECL a permis de mettre en évidence un enrichissement spécifique en GM1
des fractions de faible densité en saccharose (15 à 20%) correspondant aux densités
caractéristiques des microdomaines.
157

pEGFP
% GM1
pEGFP-PLD1
% GM1
22
40
20
18
16
35
30
14
25
12
10
8
20
15
6
4
2
10
5
0
0
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10 F11
Figure 70 : Distribution du ganglioside GM1 dans les différentes fractions des gradients de
saccharose préparés à partir de cellules transfectées par pEGFP (A) et par pEGFP-PLD1(B).
Les microdomaines sont préparés comme décrit dans la partie Matériels et Méthodes et les
fractions (1ml) du gradient sont collectées de 1 (fond du tube) à 11 (sommet du tube). 20µl
de chaque fraction sont déposés sur membrane immobilon et le GM1 est détecté
spécifiquement par la sous-unité B de la toxine cholérique couplée à la peroxydase et révélé
par chimioluminescence.
Localisation de la PLD1 surexprimée hors des microdomaines :
La présence de la protéine PLD1 a été recherchée dans les fractions des gradients de
saccharose par Western blotting à l’aide d’anticorps polyclonal spécifique anti-PLD1.
Pour les cellules surexprimant la pEGFP-PLD1, une bande (figure 69) a été détectée dans
la fraction 1 correspondant à la fraction de plus forte densité. La PLD1 surexprimée dans
les Jurkat semble donc se localiser hors des fractions radeaux. En accord avec ce qui a été
suggéré dans les PBMC, la PLD1, hors des radeaux se trouverait sous sa forme active, ce
158
40
35
30
25
20
15
10
5
Mise en évidence du GM1 par Dot
blot dans les fractions 6,7,8.
% de saccharose
GM1
Mise en évidence du GM1 par Dot
blot dans les fractions 6,7.8.
% de saccharose

qui expliquerait à la fois la hausse d’activité PLD dans les cellules transfectées, et les
effets de la surexpression sur la prolifération et l’activation des cellules.
PLD1
120Kda
COS-PLD1 F1 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F9 F10
Figure 71 : Détection de PLD1 dans les différentes fractions de cellules transfectées par
pEGFP-PLD1.
400µl de chacune des fractions ont été précipités par de l'acétone à froid comme indiqué
dans la partie Matériels et Méthodes. Le précipité protéique est repris dans 40µl de tampon
Laëmmli contenant 4M d'urée et d’EDTA 2.5mM et analysé par Western-blotting avec un
anticorps polyclonal anti-PLD1.
159

IV.2 Discussion :
L’objectif des travaux présenté dans ce manuscrit a été d’élucider l’implication de la
phospholipase D à différents niveaux de la vie cellulaire : la différenciation des cellules
myogéniques, la perméabilité des cellules endothéliales et la prolifération des lymphocytes.
Dans une première partie, nous montrons l’implication des céramides dans la différenciation
myogénique induite par l’AVP, via la modulation de la phospholipase D. L’induction de la
différenciation des myoblastes de rat L6C5 par l’AVP s’accompagne d’une variation du taux
de céramides. En effet, après quelques minutes de traitement (10 à 60 min), nous avons
observé une baisse du taux des céramides alors que pour des temps de traitement plus longs
(2h jusqu’au J8), la production des céramides est stimulée. La baisse des céramides obtenue
au début du traitement pourrait être due à la stimulation de la céramidase, qui libère un acide
gras et la sphingosine. C’est une enzyme régulable par un certain nombre d’agonistes comme
le PDGF dans les cellules mésangiales (Coroneos et al., 1995), par l’interleukine-1 dans les
hépatocytes, via un mécanisme de phosphorylation des tyrosines (Nikolova-Karakashian et
al., 1997). El Bawab et al. en 2001 ont identifié une céramidase alcaline neutre issue du
cerveau de rat, activable in vitro par l’acide phosphatidique. Celui-ci s’accumule rapidement
dans les myoblastes L6 en présence d’AVP à la suite de la stimulation de la PLD (Komati et
al., 2005). On pourrait penser que l’AVP active transitoirement l’hydrolyse des céramides via
la stimulation de la céramidase consécutive à l’activation rapide de la PLD. Ceci reste à
démontrer, en dosant l’activité de la céramidase. L’accumulation plus tardive de céramides
dans les myoblastes au cours de la différenciation induite par l’AVP peut théoriquement être
attribuable à l’une des deux voies majeures de biosynthèse des céramides : la voie des SMases
ou la voie de novo. Les différentes voies de biosynthèse des céramides peuvent être plus ou
moins impliquées en fonction du type cellulaire, de la nature du stimulus et de la réponse
cellulaire. Par exemple, dans les cellules cancéreuses de sein MCF7, il a été décrit qu’au cours
de l’apoptose induite par le TNFα, la production des céramides est issue à la fois de
l’activation de la sphingomyélinase neutre et de la voie de synthèse de novo (Dbaibo et al.,
2001).
Nous observons que les céramides impliqués sont principalement issus de la biosynthèse de
novo. En effet, en présence de la fumonisine B1, inhibiteur d’une des enzymes de cette voie,
la (dihydro-) céramide synthase, on empêche l’accumulation des céramides induite par l’AVP.
160

Il en est de même en présence de la myriocine, inhibiteur de la première enzyme de la voie de
novo, la sérine palmitoyltransférase alors que la désipramine, inhibiteur de la
sphingomyélinase acide n’a pas d’effet sur l’accumulation des céramides.
Ces premiers résultats suggèrent que l’AVP pourrait être un agoniste capable d’activer la
synthèse de novo des céramides. Cependant, nous observons que les céramides issus de cette
voie sont capable d’exercer un effet négatif sur la différenciation induite par cette hormone.
En effet, les inhibiteurs de la voie de biosynthèse de novo en présence d’AVP, contrairement
aux céramides exogènes, favorisent la différenciation évaluée selon divers critères :
expression et accumulation nucléaire de la myogénine, facteur de transcription spécifique du
muscle ; vitesse de fusion des cellules ; expression du marqueur tardif créatine kinase.
La myriocine, contrairement à la fumonisine B1, n’induit pas l’accumulation de bases
sphingoïdes : 3 cétosphinganine, sphinganine, sphingosine, qui sont des composés bioactifs
(Merrill et al., 2002), et pourtant, les deux inhibiteurs de la voie de biosynthése de novo ont
les mêmes effets sur la différenciation induite par l’AVP. Cela montre que les effets obtenus
sont probablement dûs à une baisse du niveau des céramides et non pas à une accumulation
des bases sphingoïdes. Cependant, un des effets de l’inhibition de la synthèse de novo des
céramides est une déplétion généralisée en sphingolipides complexes. Certaines actions
biologiques de la fumonisine ont été attribuées à l’abaissement des taux de
glycosphingolipides complexes (Bourteele et al., 1998 ; Tepper et al., 2000). Pour écarter
cette hypothèse, nous avons étudié les effets du PDMP, un inhibiteur de la glucosylcéramide
synthase sur la différenciation induite par l’AVP. Le PDMP, en bloquant la première étape de
la formation d’une majorité de glycosphingolipides, induit une déplétion de ces composés,
mais contrairement à la fumonisine, il provoque une hausse des taux de céramides cellulaires.
Le PDMP s’est montré clairement inhibiteur de la différenciation, évaluée d’après
l’expression du marqueur tardif créatine kinase. On peut donc exclure une déplétion en
glycosphingolipdes comme explication de l’action positive de fumonisine et myriocine sur la
différenciation.
Pour confirmer l’effet négatif des céramides sur la différenciation, nous avons stimulé la
production de céramides endogènes en surexprimant une sphingomyélinase bactérienne, et en
observant les effets sur l’accumulation nucléaire de myogénine. Puisque la synthèse de novo
des céramides a lieu dans le réticulum endoplasmique, l’activation de cette voie impliquerait
une production de céramides localisée dans cet organite. L’action des céramides est
compartimentalisée et il existe différents pools de céramides associés à des réponses
physiologiques spécifiques. Nous avons donc utilisé un vecteur permettant une surexpression
161

de la sphingomyélinase adressée au réticulum endoplasmique. Cette surexpression inhibe la
différenciation myogénique induite par l’AVP, empêchant l’accumulation nucléaire de la
myogénine. Ceci confirme le rôle négatif des céramides dans le processus de différenciation
des L6C5 induit par l’AVP. Cet effet négatif est en accord avec la littérature. Divers auteurs
ont en effet montré que les céramides participent à l’inhibition par TNFα ou IL1β de la
différenciation des myoblastes C12 induite par un milieu appauvri en sérum ou par IGF1
(Meadows et al., 2000 ; Strle et al., 2004).
La baisse du niveau des céramides observée pendant la première phase de la réponse à l’AVP
serait donc essentielle pour l’initiation de la myogénèse. La phase tardive d’accumulation des
céramides serait responsable d’un rétrocontrôle négatif, freinant le processus de
différenciation. Les inhibiteurs de la voie de novo favoriseraient la différenciation en
prolongeant la baisse du niveau des céramides et en éliminant le rétrocontrôle négatif.
Plusieurs activités biologiques ont été attribuées aux céramides telles que la différenciation,
l’arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose. L’action pleïotrope des céramides est attribuée à leur
capacité à moduler l’activité ou la fonction de nombreuses protéines, enzymes importantes
dans la régulation cellulaire comme la phospholipase D. De nombreuses études ont montré
que les céramides exogènes à courtes chaînes capable de traverser la membrane plasmique
inhibent la PLD de certains types cellulaires comme les fibroblastes (Jones et Murray, 1995),
les basophiles leucémiques RBL2H3 (Nakamura et al., 1996), les neutrophiles (Nakamura et
al., 1994). Hinkovska-Galcheva et al. en 2003 ont mis en évidence une stimulation de la
fonction d’endocytose dans les neutrophiles par l’inhibition de la synthèse de novo des
céramides avec en parallèle une activation de la PLD.
Komati et al. en 2004 et 2005 ont montré que la PLD est requise pour un réarrangement du
cytosquelette et la différenciation myogénique induits par l’AVP ou par le TPA, et que la
surexpression de la PLD1b et non de la PLD2 favorise le processus de différenciation des
cellules myogéniques.
Nos résultats suggérent que les céramides peuvent réguler la myogénèse en contrôlant
l’expression et l’activité de la PLD. En effet, nous avons observé que les C6-céramides
inhibent au niveau de l’ARNm l’expression de la PLD1 et que les inhibiteurs de la voie de
novo ont l’effet contraire, aucun de ces composés n’ayant d’effet sur l’expression de la PLD2.
Les céramides pourraient de plus agir sur la PLD de façon indirecte via des protéines
impliquées dans sa régulation. En effet, divers travaux ont montré que les céramides inhibent
la translocation du cytosol à la membrane des PKCα, β1 et des protéines ARF1, CDC42 et
Rho (Venable et al., 1996 ; Singh et al., 2001). Les céramides pourraient aussi agir sur la PLD
162

à travers une interaction directe au niveau de son domaine catalytique (Singh et al., 2001).
Ainsi, les variations d’activité PLD que nous avons observées sous l’effet du C6-céramide et
de la fumonisine peuvent s’expliquer à la fois, par une modulation de l’expression et de
l’activité de l’enzyme.
Le remodelage du cytosquelette d’actine, PLD-dépendant, participe à l’induction de la
différenciation myogénique (Komati et al., 2005). Contrairement aux cellules non musculaires
dans lesquelles les fibres de stress contrôlent surtout la cytoarchitecture, les structures « stress
fiber like » (SFLS) jouent un rôle crucial dans les cellules musculaires puisqu’elles sont
impliquées dans les étapes précoces de la myofibrillogénèse (Du et al., 2003). Nous avons
montré que les céramides empêchent la formation PLD-dépendante des SFLS et désorganisent
l’actine. Ceci pourrait, au moins en partie, expliquer leur effet négatif sur la différenciation.
L’ensemble de ces résultats suggère que la baisse du niveau de céramides durant la première
phase de différenciation induite par l’AVP permettrait une activation transitoire de la PLD,
nécessaire à la réponse myogénique. Le blocage de la voie de signalisation des céramides
pourrait être une nouvelle stratégie thérapeutique dans le but de favoriser la regénération
musculaire, l’approche pharmacologique connaissant actuellement un regain d’intérêt dans
des pathologies comme l’atrophie et les dystrophies musculaires.
La deuxième partie de nos travaux porte sur l’implication de la PLD dans le contrôle de la
perméabilité de la barrière endothéliale aux macromolécules. L’organisation du cytosquelette
est un des facteurs majeurs dans le contrôle du transport paracellulaire des macromolécules
vers l’espace subendothélial. L’acide phosphatidique, produit de la PLD ayant un effet
marqué sur le cytosquelette dans des modèles cellulaires variés, il paraissait intéressant
d’envisager une contribution de la PLD à la régulation de la perméabilité endothéliale.
Les cellules endothéliales de la lignée HUV-EC-C, issue de la veine du cordon ombilical
humain, expriment les différentes isoformes de la PLD : PLD1a, PLD1b et PLD2.
Nos résultats montrent que dans les cellules endothéliales, les LDL natives et oxydées
activent la PLD. Certains travaux ont décrit l’activation de la PLD par des LDL oxydées dans
les cellules musculaires lisses de lapin (Natarajan et al., 1995), les macrophages péritonéaux
de souris (Gomez-Munoz et al., 2000). Le mode d’action des LDL oxydées sur la PLD n’est
pas encore très clair. A la différence des travaux précités, nous observons une activation de la
PLD avec des LDL ne présentant pas dans les conditions utilisées de signes d’oxydation, et de
plus les LDL préalablement oxydées donnent des réponses similaires à celles des LDL
natives. Une possibilité est qu’elles agissent via les médiateurs lipidiques qu’elles contiennent
163

comme le LPA, le LPC, la S-1P…On pourrait tester cette hypothèse en utilisant des
antagonistes des récepteurs au LPA, dont trois isoformes sont connues (LPA 1, 2 et 3).
La stimulation de la PLD s’accompagne d’une réorganisation du cytosquelette se traduisant
par la formation de fibres de stress et un changement de morphologie cellulaire. Ces réponses
sont inhibées par l’adjonction d’un alcool primaire, le butanol-1, capable de détourner
l’activité de la PLD de la formation de PA, ce qui confirme une PLD-dépendance.
L’effet de la PLD sur la réorganisation du cytosquelette, et donc sur la morphologie cellulaire,
pourrait s’expliquer en partie par le fait que le PA stimule la synthèse de PIP2 par activation
directe de la PI4P5-kinase (Jones et al., 2000). Le PIP2 est connu pour interagir avec plusieurs
protéines fixatrices d’actine comme la profiline, la gelsoline, la cofiline et promouvoir ainsi la
formation de faisceaux de filaments d’actine (Janmey et al., 1999). Par ailleurs, la protéine G
monomérique RhoA dont un des effecteurs bien identifié est la PLD1 est connue pour réguler
la perméabilité endothéliale (Van Nieuw Amerongen et al., 2003). Il est admis que la
formation de fibres de stress est Rho dépendante. De nombreux travaux ont montré
l’implication de Rho dans la stimulation de la PLD par divers agonistes tels que le LPA, les
esters de phorbol, l’endothéline-1 et le PDGF dans les fibroblastes (Malcom et al., 1996 ;
Hess et al., 1997). L’activation de la PLD par ces agonistes est associée à la translocation de
Rho vers les membranes. Nous avons pu constater que lors de la stimulation des cellules
endothéliales avec le LPA ou les LDL natives ou oxydées, il y a une délocalisation de la
PLD1, spécifiquement, PLD2 n’étant pas affectée. PLD1 est transloquée de la zone
périnucléaire vers des structures filamenteuses qui rappellent les fibres de stress. Ceci suggère
que la PLD1 pourrait participer à la formation de ces fibres. Le fait que les deux isoformes
PLD1et PLD2 ont des fonctions différentes dans un même type cellulaire a déjà été rapporté.
Par exemple, dans les fibroblastes, la PLD1, et non la PLD2, participe à la formation des
fibres de stress (Kam et Exton, 2001). Cette différence pourrait être attribuée au fait qu’elles
ont des localisations subcellulaires distinctes (Colley et al., 1997b ; Diaz et al., 2002).
Parallèlement à la stimulation de la PLD et au remodelage du cytosquelette des cellules
endothéliales, les agonistes de la PLD ainsi que les LDL natives ou oxydées augmentent la
perméabilité paracellulaire. Ceci est probablement dû au changement morphologique des
cellules endothéliales, causé par le remodelage du cytosquelette d’actine. Les fibres de stress
sont contractiles, et exercent une forte tension sur la membrane plasmique, à laquelle elles
sont fixées par les adhésions focales. Cette tension peut entraîner la rupture et la
désorganisation des jonctions adhérentes. Il est donc possible qu’en activant la PLD
endothéliale, les molécules proathérogènes comme les LDL stimulent leur propre passage du
164

sang vers le sous- endothélium. Nous avons montré à l’aide de LDL radiomarquées qu’une
fraction notable des LDL passe à travers la monocouche. A l’appui du rôle du LPA contenu
dans les LDL, le LPA n’a pas d’effet sur le passage de LDL radiomarquées, ce qui suggère un
mécanisme d’action commun.
Divers agonistes:
LPA, S1P,
TPA, LDLnatives
et oxydées.
CELLULES ENDOTHELIALES
PLD
Outre ses effets sur la perméabilité paracellulaire, la PLD pourrait favoriser le passage des
LDL par transcytose. Le rôle central de la PLD est dû aux propriétés particulières de son
produit, l’acide phosphatidique. En effet le PA est à la fois un second messager de toute
première importance et un phospholipide di-anionique aux propriétés physicochimiques
particulières, capable de changer la courbure de la membrane où il est formé à cause de sa
forme en cône inversé (Schmidt et al., 1999). Ces deux caractéristiques peuvent intervenir
indépendamment ou conjointement pour modifier la perméabilité membranaire. Il a été
montré en effet que le PA, grâce à ses propriétés particulières, favorise le bourgeonnement
vésiculaire (Chen et al ., 1997). Il est donc susceptible d’activer l’endocytose et la sécrétion
des LDL. Un autre mécanisme par lequel la PLD pourrait moduler la perméabilité
paracellulaire découle de sa localisation dans les cavéoles où elle pourrait être en contact
direct avec certaines protéines des jonctions serrées. De plus, des récepteurs aux LDL oxydées
ou glyquées sont présents dans les cavéoles. Celles-ci pourraient donc contribuer au transport
et à l’accumulation des LDL modifiées vers l’espace sous-endothélial et à leur rôle
165
Augmentation perméabilité
paracellulaire
LDL
LDL :
Accès à l’espace
sous endothélial
Processus d’accumulation lipidique
favorisant la formation de plaques
d’athérome.

athérogène. On peut supposer que dans les cellules endothéliales non stimulées, la PLD
présente dans les cavéoles est maintenue inactive par interaction avec la cavéoline. Si le
schéma démontré par notre équipe pour le lymphocyte (Diaz et al., 2002) s’applique
également aux cellules endothéliales, on peut spéculer que l’activation de PLD
s’accompagnera d’une sortie de la protéine hors des cavéoles entraînant également une sortie
des protéines associées comme l’occludine, et de la désorganisation des jonctions serrées. Il
est connu que le désassemblage des jonctions serrées entraîne une délocalisation de
l’occludine hors des radeaux (Nusrat et al., 2000).
L’étude de la perméabilité vasculaire est une voie de recherche en plein essor et à terme, cette
recherche pourrait permettre de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Il est admis
notamment qu’une partie des effets positifs des statines sur les maladies cardiovasculaires est
attribuable à leur capacité d’inhiber la voie de signalisation de RhoA (Seasholtz et Brown,
2004) avec comme conséquence probable une inhibition de la PLD. On peut par ailleurs
supposer que des antagonistes sélectifs des divers récepteurs à LPA et S1P pourraient
présenter un intérêt thérapeutique, en réduisant la perméabilité endothéliale, anormalement
élevée dans certaines situations pathologiques.
Le troisième objectif de mes travaux de thèse a été de montrer l’implication de la PLD dans la
prolifération des lymphocytes. Nous avons montré que la déstabilisation des microdomaines
par des chélateurs de cholestérol tels que la filipine ou la méthyl-béta-cyclodextrine (MBCD)
ansi que par la sphingomyélinase de S.aureus qui dégrade partiellement la sphingomyéline
présente dans le feuillet externe des microdomaines, conduit à une activation de la PLD et à
une inhibition de la prolifération lymphocytaire. Cette augmentation d’activité PLD est
concomitante avec la délocalisation de la protéine PLD1 des radeaux vers les membranes non
radeaux. Ceci s’accompagne d’un effet anti-prolifératif. Pour montrer que la PLD1 est
réellement responsable de l’inhibition de la transduction du signal mitogénique, nous l’avons
surexprimée dans la lignée lymphocytaire T Jurkat. Nous avons montré que la surexpression
de la PLD1 entraîne une inhibition de la prolifération spontanée des cellules, la surexpression
de la PLD2 ayant un effet contraire. La surexpression de la PLD1 s’accompagne aussi d’une
inhibition de l’expression de l’ARNm de l’IL-2 par les cellules stimulées par le TPA et
l’ionomycine. Ceci suggère fortement que la PLD1 spécifiquement est impliquée dans
l’inhibition de l’activation lymphocytaire. Le rôle exact des différentes isoformes de la PLD
dans la prolifération et la mort cellulaire n’est pas encore clairement défini. Suivant
l’isoforme impliquée et le modèle cellulaire, la PLD peut avoir un effet pro- ou anti-
166

apoptotique ou pro- ou anti-prolifératif. L’effet anti-prolifératif de PLD1 semble être une
particularité du modèle lymphocytaire, la PLD étant généralement décrite comme favorisant
la réponse mitogénique. Son mécanisme d’action bien qu’il reste spéculatif, pourrait passer
par l’acide phosphatidique. En effet, l’interféron β a un effet anti-prolifératif sur des PBMC
activés par la conA, et diminue la production d’IL-2. Cet effet s’accompagne d’une
augmentation du niveau d’acide phosphatidique (Noronha et al., 1993 ; Cataldi et al., 1995).
Diverses cibles intracellulaires de l’acide phosphatidique ont été identifiées, parmi lesquelles
la protéine tyrosine phosphatase 1 (SHP-1 : SH-domain containing protein tyrosine
phosphatase) (Frank et al., 1999). Sa liaison avec l’acide phosphatidique conduit à la
stimulation de son activité phosphatase. De plus, il est connu que la SHP-1 régule
négativement l’activation lymphocytaire. Elle participe à la régulation de la prolifération
cellulaire succédant à l’action de facteurs de croissance (Sathish et al., 2004). On pourrait
donc supposer que la formation de l’acide phosphatidique issue de l’activation de la PLD
pourrait inhiber la prolifération des lymphocytes en stimulant la SHP-1. Une autre hypothèse
expliquant l’effet anti-prolifératif de la PLD1 se rapporte au cytosquelette. La reconnaissance
de l’antigène par le lymphocyte T induit la réorganisation de la membrane plasmique et du
cytosquelette d’actine. Il se forme alors à la jonction entre les lymphocytes T et les cellules
présentatrices d’antigène un contact étroit appelé synapse immunologique. Celle-ci est
caractérisée par une accumulation ordonnée de récepteurs à l’antigène des lymphocytes T, des
protéines constitutives du cytosquelette et des protéines de signalisation cellulaire. De
nombreux travaux ont montré l’importance du cytosquelette d’actine dans l’activation
lymphocytaire. Des mutations de protéines régulant le cytosquelette d’actine affectent les
réponses immunes. La cytochalasine D, en bloquant la polymérisation de l’actine empêche
l’activation et la prolifération lymphocytaire. La polymérisation de l’actine serait impliquée
dans la rigidification de la structure de la synapse immunologique (Cheng et al., 1999 ; Janes
et al., 1999 ; Penninger et Crabtee., 1999). Cependant, il a été observé récemment que la
formation de la synapse immune nécessite, dans un premier temps, une dépolymérisation de
l’actine permettant le recrutement des radeaux et des protéines de signalisation (Hao et
August, 2005).
Comme il est convenu que l’acide phosphatidique favorise la polymérisation de l’actine dans
différents types cellulaires dont les fibroblastes rat1, swiss 3T3 et IIC9 (Ridley et al., 1992 ;
Van der Bend et al., 1992 ; Ha et Exton , 1993 ; Ha et al., 1994), les cellules endothéliales
(Siddiqui et English, 1997) , les monocytes (Zhou et al., 1995) et les cellules musculaires
squelettiques (Komati et al., 2005), on peut faire l’hypothèse que l’activation de la PLD
167

empêche la dépolymérisation initiale de l’actine, et compromet la formation du complexe de
signalisation.
Une autre hypothèse est que la diminution de la lymphoprolifération pourrait être due à une
apoptose des lymphocytes. Certains inducteurs d’apoptose (Fas ligand, ATP) stimulent la
PLD lymphocytaire. Cependant, nos résultats permettent d’écarter cette hypothèse, puisque
nous avons observé une absence de corrélation entre la baisse de la prolifération et la
mortalité cellulaire, en présence des agents perturbant les radeaux et activant la PLD. Ceci est
particulièrement évident avec la sphingomyélinase bactérienne. Une dernière hypothèse
explicative paraît particulièrement attractive. Il est de plus en plus largement accepté que la
nature des espèces moléculaires du PA, et du DAG qui en découle par déphosphorylation,
influe considérablement sur la capacité de ces messagers à transmettre les signaux. Le PA et
le DAG issus de l’hydrolyse de la phosphatidylcholine par la PLD, riches en acides gras
saturés, auraient des capacités de signalisation réduites par rapport aux messagers issus de
l’hydrolyse du PIP2 par la phospholipase C, plus riches en acides gras polyinsaturés. Ils
pourraient, éventuellement par compétition, bloquer les cascades normales de signalisation
mises en jeu lors de l’activation lymphocytaire.
168

V. Conclusions et perspectives :
L’étude du rôle biologique de la PLD est d’autant plus complexe que cette enzyme est
impliquée dans de multiples fonctions. Nous montrons qu’elle intervient dans des fonctions
aussi diverses que la différenciation des cellules myogéniques, le contrôle des jonctions
intercellulaires qui commandent la perméabilité paracellulaire de l'endothélium, et la
prolifération des lymphocytes. On pourrait penser que des mécanismes de régulation distincts
sont sollicités dans chaque processus et impliquent des molécules régulatrices différentes.
Cependant, certains traits communs peuvent être identifiés dans les différents modèles
étudiés: la PLD pourrait dans tous les cas intervenir par le biais de remaniements du
cytosquelette d'actine, bien que cela reste spéculatif en ce qui concerne les lymphocytes.
D'autre part, dans les différentes fonctions étudiées, c'est l'isoforme PLD1 qui semble jouer un
rôle prépondérant, ce qui pourrait suggérer que PLD2 a un rôle plus subalterne de maintien de
l'homéostasie cellulaire, malgré le fait que certaines fonctions lui aient été attribuées, comme
par exemple la formation des "ruffles" dans les mastocytes. Notre travail permet en outre de
mettre en évidence, dans tous les modèles étudiés, un rôle prééminent de la signalisation
lipidique: en effet, dans le cas de la différenciation des myoblastes, nous avons montré
l'importance d'une régulation croisée entre la voie de la PLD et celle des sphingolipides ; dans
les cellules endothéliales, nos résultats suggèrent qu'un messager lipidique présent dans les
lipoprotéines, qui pourrait être le lysophosphatidate, est responsable de l'activation de la PLD
et des changements morphologiques ; dans les lymphocytes, nous avons montré le rôle
essentiel de la composition lipidique des radeaux pour la régulation de la PLD et de la
prolifération.
Une première partie de ce travail a consisté à montrer que les céramides jouent un rôle
important dans le contrôle de la différenciation myogénique, par l'intermédiaire d'une
régulation de la PLD. L'induction de la différenciation par l'AVP entraîne une régulation
biphasique des taux cellulaires de céramides, avec une décroissance dans les premières
heures, suivie d'une augmentation, attribuable à la voie de biosynthèse de novo. L'ensemble de
nos résultats nous conduit à proposer un modèle selon lequel la baisse initiale des céramides
est essentielle pour l’initiation de la myogénèse. Elle autoriserait notamment la hausse
précoce d'activité PLD, dont nous avions démontré le caractère indispensable à la myogénèse,
et la réorganisation PLD-dépendante du cytosquelette d’actine, une des premières étapes du
169

processus myogénique. Selon notre modèle, les céramides accumulés lors de la deuxième
phase ont un effet négatif sur la différenciation, au moins en partie à cause du contrôle négatif
qu’ils exercent sur l’expression de l’isoforme PLD1. Cette deuxième phase correspondrait à
un rétro-contrôle négatif, freinant le processus myogénique. La régulation de la PLD par les
céramides semble constituer une cible pharmacologique intéressante pour des actions visant à
favoriser la régénération musculaire dans diverses situations pathologiques. Les inhibiteurs
de la voie de biosynthèse de novo des céramides, puissants activateurs de la myogénèse,
pourraient ainsi présenter un intérêt thérapeutique dans les cas d'atrophie ou de dystrophie
musculaires.
Pour compléter cette étude, il serait intéressant de déterminer par quel mécanisme les
céramides inhibent la PLD. Ils peuvent agir en inhibant les protéines régulatrices de la PLD
comme les protéines ARF, Rho et PKC. Komati et al. en 2005 ont montré que l’activation de
la PLD dans les myoblastes L6 est majoritairement Rho-dépendante. L’AVP induit la
translocation et donc l’activation de Rho dans ces cellules, suggérant ainsi que Rho agit en
amont de la PLD. Un effet des céramides sur ces étapes est donc envisageable. Par ailleurs, il
serait intéressant de déterminer comment ceux-ci régulent l'expression de PLD1 : il
conviendra d'établir si les céramides inhibent la transcription de PLD1 par des expériences de
"nuclear run-on", ou bien s'ils affectent la stabilité des transcrits ARNm.
L’effet inhibiteur des céramides issus de la voie de novo sur la différenciation induite
par l’AVP pourrait être confirmé en surexprimant soit la sérine palmitoyltransférase, soit la
céramide synthase, et en observant l’effet sur les différents marqueurs de différenciation
précoces et tardifs. Pour mettre en évidence le pool intracellulaire de céramides impliqué dans
le contrôle de la différenciation, nous pourrons réaliser des expériences d’adressage
subcellulaire de sphingomyélinases vers des compartiments autre que le reticulum
endoplasmique. Nous disposons de vecteurs permettant l’expression localisée de la
sphingomyélinase couplée à la GFP dans divers compartiments.
Pour évaluer la pertinence physiopathologique des observations faites in vitro, il sera
intéressant d'étudier l'effet des inhibiteurs de la synthèse des céramides dans des modèles de
souris myodystrophiques. De plus, la vérification dans des myocytes humains en culture,
provenant de biopsies de sujets sains et pathologiques, de l'implication des mécanismes que
nous avons mis en évidence, présente un intérêt certain.
170

Nous avons montré dans une deuxième partie qu’il existe un contrôle de la
perméabilité paracellulaire de la monocouche endothéliale par la PLD, reposant sur un
remodelage du cytosquelette d’actine. Nous avons observé un lien entre l'activation de la PLD
par ses agonistes et la perméabilité d’une monocouche de cellules endothéliales. Des LDL
natives ou oxydées en contact avec la monocouche sont capables, de même, de stimuler
l’activité PLD et la perméabilité paracellulaire de la monocouche. En parallèle, nous avons
observé que l’augmentation de la perméabilité induite par l'activation de PLD s’accompagne
d’un remodelage du cytosquelette, avec formation de fibres de stress, et changement de la
morphologie cellulaire susceptible d'augmenter les espaces intercellulaires. Nous avons
montré que ces réponses sont PLD-dépendantes. Nous déduisons de nos résultats que les
LDL, au contact de l’endothélium, stimulent leur propre passage en modulant l’activité PLD.
Un défaut de regulation du système de la PLD pourrait ainsi contribuer à une perméabilité
endothéliale anormale et à l’accélération du processus athérogène.
De nombreuses pistes restent à explorer pour mieux comprendre le mécanisme
d'implication de la PLD. Des expériences de surexpression et de sous-expression de PLD1,
PLD2, de facteurs régulateurs (RhoA, PKCs) dans les cellules endothéliales devraient
permettre de confirmer l’hypothèse d’un effet de la PLD sur la fonction de la barrière
endothéliale, et de déterminer l’isoforme de PLD plus particulièrement concernée. Ceci nous
permettrait en outre de rechercher le mécanisme d’activation de la PLD par les LDL : serait il
PKC- ou Rho-dépendant ? L'emploi d'antagonistes specifiques des récepteurs des divers
facteurs lysophospholipidiques (LPA, S-1P) présents dans les LDL permettrait de déterminer
s'ils sont impliqués dans les effets des LDL observés.
Il sera aussi important de vérifier si l’inhibition de la production de PA par le butanol-
1, ou les changements d’expression des PLD, influent sur la morphologie des jonctions
intercellulaires, en relation avec la perméabilité paracellulaire. Ceci pourra être étudiée par
immunofluorescence, en microscopie confocale. De plus, Il est admis que le cytosquelette est
en contact avec la membrane plasmique au niveau des radeaux, microdomaines membranaires
détergent-résistants (Meiri, 2004). Une hypothèse est que le PA, en s’accumulant dans des
domaines membranaires particuliers, modifie les interactions cytosquelette/membranes, et par
là, les jonctions intercellulaires. Nous chercherons à identifier dans les cellules endothéliales
les domaines membranaires d’accumulation du PA, leur lien éventuel avec les radeaux, et leur
localisation par rapport aux fibres d’actine et aux protéines de jonction.
171

Une troisième partie du travail se situe dans le prolongement de travaux réalisés par
l’équipe, qui suggéraient un lien entre l'exclusion de la PLD1 des microdomaines, son
activation, et une inhibition de la prolifération lymphocytaire. Nous avons confirmé que la
déstabilisation des microdomaines par des agents spécifiquement actifs sur des lipides de ce
compartiment, cholestérol et sphingomyéline, s’accompagne d’une activation de la PLD et
d’une inhibition de la réponse proliférative des lymphocytes. Dans le cas de la
sphingomyélinase exogène, nous confirmons aussi que l'activation de la PLD est corrélée à
une sortie de PLD1 hors des radeaux. Nous pouvons donc proposer un nouveau mode de
régulation de l'activité de PLD1, par inclusion / exclusion des radeaux. Il est possible de
supposer que l'environnement lipidique ou protéique propre aux radeaux exerce une action
inhibitrice sur l'activité de l'enzyme, et que dans l'environnement différent rencontré dans les
membranes "non-radeaux", cette inhibition est levée. Par ailleurs, en surexprimant chacune
des deux isoformes de PLD, nous avons montré que la PLD1, spécifiquement, est associée à
une inhibition de la réponse lymphoproliférative. Elucider le mode d’action de la PLD1 sur la
prolifération nous permettrait de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués
dans diverses pathologies de l’immunité.
Différents axes peuvent être envisagés pour la poursuite de ces travaux : il serait
possible d'étudier par imagerie la localisation des isoformes de la PLD par une approche en
microscopie de fluorescence, dans les lymphocytes. Pour cela, il est possible de réaliser un coimmunomarquage
de la protéine PLD1 et de marqueurs spécifiques des microdomaines tels
que le GM1. Ceci permettrait de confirmer que la PLD1 est présente dans les microdomaines.
Après transfection des cellules Jurkat par le plasmide pEGFP-PLD1, on pourrait aussi suivre
en temps réel, sur cellule vivante, la localisation de la protéine, lors du traitement des cellules
par des agents déstabilisant les rafts. Il serait aussi intéressant d’observer l’effet de la
surexpression de la PLD1 sur le cytosquelette grâce à un marquage de l’actine par la
phalloïdine couplée à la rhodamine. Il conviendrait aussi de suivre la formation du PA, grâce
à une sonde fluorescente capable de reconnaître et de lier spécifiquement ce messager. Il
serait ainsi possible de déterminer dans quel compartiment subcellulaire membranaire le PA
produit lors de l'activation de PLD se trouve localisé.
Afin d'écarter définitivement l'hypothèse que la diminution de la lymphoprolifération
est due à une apoptose, il serait important de surexprimer la GFP-PLD1, de marquer les
cellules avec l’annexine 5 et de les observer en cytométrie de flux.
Sur un plan physiopathologique, nos travaux montrant un effet négatif de PLD1 sur
l'activation lymphocytaire suggèrent l'étude de nouvelles voies thérapeutiques. En effet, un
172

certain nombre de lignées lymphocytaires leucémiques n'expriment pas cette isoforme (Jurkat,
EL4, L1210), alors que les lymphocytes normaux l'expriment. On peut faire l'hypothèse que la
perte de l'expression de PLD1 est liée à la transformation cellulaire et à la perte du contrôle de
la prolifération. Il sera donc intéressant de rechercher l'expression des isoformes de PLD dans
une large série de cellules T leucémiques, et de vérifier l'effet inhibiteur de la surexpression
de PLD1 dans ces lignées. Si certaines expriment PLD1, il conviendra de rechercher si
l'inhibition de l'expression, par transfection de PLD1 mutante dominant-négative, ou l'emploi
d'ARNi, stimule la prolifération. Si l'hypothèse du rôle négatif de PLD1 est confirmée, on
pourrait envisager des interventions thérapeutiques destinées à stimuler cette enzyme, par
exemple par l'ingestion de doses importantes d'acide docosahexaènoïque, dont nous avons
montré l'efficacité in vitro.
173

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