La phospholipase D, une voie de signalisation lipidique impliquée ...

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LPA : acide lysophosphatidique MADS: MCM1-Agamous-Deficiens-SRF MAP Kinase: Mitogen Activated Protein Kinase MBCD: méthyl-bétacyclodextrine MDA: dialdéhyde malonique MEF2: myocyte enhancer factor 2 MHC: Complexe majeur d’histocompatibilité MRF : myogenic regulator factor NO: monoxyde d’azote PA : acide phosphatidique PAGE : électrophorèse en gel de polyacrylamide PBMC : cellules mononucléées de sang périphérique humain PBS : tampon phosphate salin PBu : phosphatidylbutanol PC : phosphatidylcholine PCR : polymerase chain reaction PDE : phosphodiestérase PDMP : phenyl-2-décanoylamino-3-morpholino-1-propanol PE : posphatidyléthanolamine PHA : phytohémaglutinine PI : phosphatidylinositol PIP2 : phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate PIP3 : phosphatidylinositol 1,4,5-trisphosphate PKC : protéine kinase C PL : phospholipide PLA2 : phospholipase A2 PLC: phospholipase C PLD : phospholipase D PMSF : phenylmethylsulfonyl fluoride PS: phosphatidylsérine PTK : protéine tyrosine kinase. SDS : dodécylsulfate de sodium SFLS : stress fiber like structures Si RNA : small interfering ribonucleic acid SMAC: Supra Molecular Activation Complexes SMase: sphingomyélinase SRF : serum response factor S1P: sphingosine-1 phosphate SVF : sérum de veau foetal TBARS: thiobarbituric acid reactive substances TBS-T : tampon tris salin + tween TCR : récepteur des lymphocytes T TEMED : N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine 1,2-bis(dimethylamino)ethane TGF-β: β transforming growth factor β TPA : 12-O-tétradécanoylphorbol-13-accétate Tween : monolaurate de polyéthylène-sorbitane VLDL : Lipoproteines de très basse densité ZO : Zonula Occludens. 17
I. INTRODUCTION : Les phospholipases D (PLD) sont des enzymes aux caractéristiques singulières. Elles possèdent une activité de remodelage des membranes : en modifiant la tête polaire d’un phospholipide leur activité conduit à la formation d’un nouveau phospholipide, l'acide phosphatidique, au sein de la membrane. Outre ses propriétés physicochimiques particulières, ce composé a un rôle très important dans la signalisation cellulaire, par lui-même ou par les effets de ses métabolites bio-actifs. Les phospholipases D constituent un système complexe. Chez les mammifères, deux gènes distincts PLD1 et PLD2 ont été décrits (Frohman et al., 1999), chaque gène donnant naissance à plusieurs variants d’épissage (Hammond et al., 1997). La régulation des PLD met en jeu une multitude de facteurs. Les deux isoformes de PLD nécessitent du phosphatidylinositol 4,5-diphosphate comme cofacteur pour leur activité, mais sont régulées différemment. La PLD1 caractérisée par une activité basale faible est activée synergiquement par les petites protéines G des familles Rho et ARF, et par les PKC conventionnelles. La PLD2 au contraire a une activité basale élevée, et sa sensibilité à des protéines activatrices est moins marquée (Exton, 2002). Divers facteurs protéiques, comme certaines protéines du cytosquelette, ou lipidiques, comme les céramides ou certains acides gras, modulent aussi l'activité des PLD. La position centrale de ce système enzymatique dans la transduction du signal, la multiplicité des régulations croisées qui l'affectent, se traduisent par son implication dans de nombreux processus physiologiques majeurs, comme la prolifération, la différenciation, le trafic vésiculaire, la migration, la sécrétion, la phagocytose. Ce mémoire porte sur l’étude des rôles physiologiques de la PLD au cours de certaines étapes de la vie cellulaire comme la prolifération, la différenciation, et l'établissement des jonctions intercellulaires, qui commandent la perméabilité paracellulaire. Ces questions ont été abordées à l'aide de différents modèles cellulaires : la différenciation a été étudiée chez une lignée myoblastique ; des lignées de cellules endothéliales ont servi à l'étude de la perméabilité paracellulaire ; l'étude de la prolifération a été réalisée chez les lymphocytes circulants et à l'aide d'une lignée de cellules T. Notre équipe étudie depuis plusieurs années la différenciation myogénique de myoblastes squelettiques de rat L6 en culture. Au cours du processus myogénique, les myoblastes, cellules précurseurs, cessent de proliférer et fusionnent pour se différencier en myotubes polynucléés, exprimant les protéines spécifiques du tissu musculaire, notamment les constituants du système contractile. La myogénèse intervient au cours de la vie embryonnaire, 18
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vimentine, deux autres protéines d
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Pénétration des LDL Oxydation des
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Les lymphocytes T cytotoxiques (Tc)
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cellulaire. Chaque interleukine agi
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des cellules T fait suite à l’in
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phosphatases, comme le CD45, sont e
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Caméra CCD ImageMaster VDS-CL AMER
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leu de Coomassie à 0,03% dans une
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de méthanol) par un courant élect
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Mode opératoire : Six jours après
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migration horizontale. Le gel polym
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Modification in vitro des LDL : L
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Les substances réagissant avec de
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la solution colorée obtenue est qu
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Précipitation des protéines à l'
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jours de culture en présence d’A
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) Effet des céramides sur l’accu
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A B a) pCMV5-GFP-RE b) pCMV5-GFP-bS
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PBu, % de PL totaux 3,5 3 2,5 2 1,5
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B densité moyenne 3500 3000 2500 2
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que la bande caractéristique de PL
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L’activité PLD est mesurée en s
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microscope à fluorescence après m
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control Contrôle LDL 1mg/ml native
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B Contrôle LPA 10µM 15min LDL1mg/
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IV1.2.8 Passage des LDL marquées
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natives, ce qui indique que l’apo
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% par rapport aux LDLnatives 100 90
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IV1.3.1.2 Effet de la SMase sur la
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l’inhibition de la transduction d
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pEGFP pEGFP-PLD1 pEGFP-PLD2 Figure
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avons réalisé un contrôle non tr
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IL-2/ß-actine IL IL-2/ß-actine IL
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la littérature : dans les PBMCs, P
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pEGFP % GM1 pEGFP-PLD1 % GM1 22 40
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IV.2 Discussion : L’objectif des
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de la sphingomyélinase adressée a
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comme le LPA, le LPC, la S-1P…On
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athérogène. On peut supposer que
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empêche la dépolymérisation init
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processus myogénique. Selon notre
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Une troisième partie du travail se
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VI REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ABER
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DUBYAK, G. R., SCHOMISCH, S. J., KU
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FURCHGOTT, R. F., ZAWADZKI, J. V. T
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HAN, J. M., KIM, J. H., LEE, B. D.,
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JAMAL, Z., MARTIN, A., GOMEZ-MUNOZ,
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KOMATI, H., MINASI, A., NARO, F., L
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LUM, H., ASCHNER, J. L., PHILLIPS,
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MIN, D. S., PARK, S. K., EXTON, J.
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NORONHA, A., TOSCAS, A., JENSEN, M.
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STULNIG, T. M., BERGER, M., SIGMUND
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WARY, K. K., MARIOTTI, A., ZURZOLO,
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