11 BIOTEC GenMol 10_11 tripl

Espansione di ripetizioni
Lezione 11
1

Anticipazione
alcuni fenotipi a trasmissione autosomica dominante diventano
piu’ gravi nelle generazioni successive perche?
espansione di triplette: tipo di mutazione
individuata nel 1990
Corea di Hunghinton, X fragile, Distrofia Miotonica…………
premutazione : stato che aumenta il rischio di trasmettere
il fenotipo patologico. Il rischio non e’ piu’ quantizzabile in
termini mendeliani
prudenza nel considerare neutri i polimorfismi
2

Polimorfismo PCR
Mini e micro satelliti: Riconosciuti su gel dopo amplificazione con
PCR
3

Espansioni di triplette instabili:
mutazioni dinamiche
Mutazioni dovute all’espansione di trinucleotidi localizzati nelle regioni
codificanti o non-codificanti di alcuni geni, si originano per errori nella
replica del DNA. Possono originare un sito fragile visibile citogeneticamente.
Se si trova in una regione codificante il prodotto del gene
presentera’ n numero di residui amminoacidici corrispondenti
alla tripletta superiori al prodotto dell’allele selvatico. Di solito la tripletta
coinvolta e’ CAG (acido glutammico).
Se si trova in una regione non-codificante possono alterare l’espressione
del gene in cis. Distrofia miotonica: 3’UTR; atassia di Friedrich: introne1;
X-fragile:5’UTR……..
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Mutazioni dinamiche: origine
Le triplette possibili sono 64, ma in realta’ le
combinazioni sono solo 10 (per la lettura su entrambi i
filamenti):
AAC/GTT
AAG/CTT
AAT/ATT
ACC/GGT
ACG/CGT
ACT/AGT
AGG/CCT
ATC/GAT
CAG/CTG
CCG/CGG
Tutte le altre sono permutazioni cicliche di queste
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Mutazioni dinamiche: caratteristiche comuni
La variabilita’ degli alleli ripetuti dipende dalla loro lunghezza
Il tasso di mutazione dipende dalla lunghezza
Le unita’ ripetute tendono ad aumentare piuttosto che a
diminuire
Presenza dello stato di premutazione: espansione di triplette non
ancora associato alla comparsa del fenotipo, ma che rende la regione
instabile e piu’ suscettibile a raggiungere il livello di mutazione
completa.
Difficolta’ nel definire la correlazione genotipo fenotipo per la
presenza di un range di espansione che si puo’associare alla comparsa
del fenotipo.
Presenza di anticipazione: aumento della gravita’ del fenotipo
nelle generazioni successive
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Mutazione
completa,
range di
mutazione
Premutazione
Normale
Schema di mutazioni dinamiche
CGG
CGG
CGG
CGG
CGG
CGG
CGG
CGG
CGG
CGG
CGG
CGG
200
60
1000
280
GAA
GAA
GAA
GAA
200
GAA
GAA
GAA 22
GAA
GAA
900
CTG
CTG
CTG
CTG
CTG
CTG
CTG
CTG
52
GAA
CTG
GAA
6
7
CTG
GAA CTG
5’UTR esone introne esone introne esone 3’UTR
X-fragile
Atassia di
Friedrich
CTG
37
3
50
Distrofia
miotonica
3000
Mutazione
completa,
range di
mutazione
Premutazione
Normale
CAG
CAG
CAG
CAG 36
CAG
CAG 35
CAG
CAG
CAG
10
121
CGG
CGG
CGG
CGG 25
Esone ORF
Corea di Huntington Atassia spinocerebellare 1
CGG
CGG
CGG
7
75
49
7

Mutazioni dinamiche: effetti I
Perche’ l’espansione origina un fenotipo patologico?
Espansioni molto ampie esterne alla sequenza codificante:
perdita di funzione.
Espansioni modeste di CAG nelle regioni codificanti
La premutazione e’ uno stato di suscettibilita’: l’instabilita’
puo’ essere considerata una patologia della macchina della
replicazione .
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Mutazioni dinamiche: effetti II
Perche’ l’espansione origina un fenotipo patologico?
Espansioni molto ampie esterne alla sequenza codificante: perdita di funzione.
CGG
CGG
CGG
CGG
CGG
CGG
CGG
CGG
CGG
CGG
CGG
CGG
200
60
52
6
1000
280
GAA
GAA
GAA
GAA
GAA
GAA
GAA
GAA
GAA
GAA
GAA
GAA
7
22
900
200
CTG
CTG
CTG
CTG
CTG
CTG
CTG
CTG
5’UTR esone introne esone introne esone 3’UTR
X-fragile Atassia di Friedrich Distrofia miotonica
CTG
CTG
CTG
CTG
37
3
50
Possono abolire o interferire con la trascrizione.
Sono presenti anche mutazioni puntiformi nella regione codificante che hanno lo stesso
effetto.
Il fenotipo e’ sempre recessivo eccetto per la distrofia miotonica e la SCA8.
A questa classe appartiene il gene per l’epilessia mioclonica giovanile (JME) che e’
originata da espansionedi 12 monomeri (CCCCGCCCCGCG)n
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Mutazioni dinamiche: effetti III
Perche’ l’espansione origina un fenotipo patologico?
Espansioni modeste di CAG nelle regioni codificanti
CAG
CAG
CAG
CAG
CAG
CAG 35
CAG
CAG
CAG
10
121
36
CGG
CGG
CGG
CGG 25
Esone ORF
Corea di Huntington Atassia spinocerebellare 1
CGG
CGG
CGG
7
75
49
Codificano tratti di poliglutammina nel prodotto del gene. Si
determina l’aggregazione delle molecole e la morte cellulare.
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Mutazioni dinamiche: effetti IV
Espansioni modeste di CAG nelle regioni codificanti
Caratteri comuni alle malattie di questa classe
Il fenotipo ha trasmissione dominante eccetto per la malattia di Kennedy
(X-linked) e sono patologie neuroderegenitive ad insorgenza tardiva
Malattia di Kennedy o atrofia muscolare spino bulbare. Il gene responsabile
è il recettore degli androgeni
L’allele espanso viene trascritto e la ripetizione codifica per un tratto di
poliglutammina
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X-fragile
Ripeto che questo e’ solo un modello, per spiegare il
fenomeno e capire come funziona il nostro genoma
1/4000 maschi e 1/7000 femmine
È la causa di ritardo mentale più importante nei maschi
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Metafase di affetto da X-fragile
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Sindrome X fragile
E’ originata dalla mancata espressione del gene FMR1
Il prodotto del gene lega diversi mRNA ed e’ importante per la
loro corretta traduzione.
Il cromosoma X della quasi totalita’ degli affetti presenta un sito
fragile in Xq28 in una percentuale variabile delle metafasi, se la
coltura di sangue viene eseguita aggiungendo particolari sostanze al
terreno coltura.
Nelle femmine di solito non si riesce ad evidenziare.
Solo una piccola percentuale delle sicure portatrici manifesta il
ritardo mentale
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X fragile
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Modalita’ di trasmissione X-fragile
Dal momento che il locus mappa sul
cromosoma X dovrebbe seguire un pattern
di trasmissione X-linked
E’ cosi’, ma analizzando le famiglie e eseguendo
analisi di linkage,prima dell’identificazione del tipo di
mutazione e del clonaggio del gene, emerse quello
che fu chiamato paradosso di Sherman, che porto’ a
ipotizzare la presenza della premutazione
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Paradosso di Sherman 1985
...... the first mutation caused a “premutation” state
that produced no clinical symptoms, and that a second
mutation was required to convert the premutation to a
“full mutation” form that was associated with the
characteristic symptoms
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Paradosso di Sherman
La figlia III di un maschio II non affetto, ma portatore, ha un
rischio più elevato di avere figli affetti rispetto a sua nonna I
anche se di fatto ha il suo “stesso” allele
Di qui l’ipotesi che qualcosa nel gene sia
cambiato durante le generazioni.
La mutazione è dinamica
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Identificazione della mutazione e
clonaggio di FMR1
ripetizione CGG
5-50
Normale
polimorfismo
stabile in meiosi
50-200
Premutazione sia nei maschi che nelle femmine
instabile anche se non compromette la funzione
del gene
>200 Mutazione completa
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Quando avviene l’espansione
•Nella meiosi, soprattutto femminile
•Infatti sembra che la conversione da premutazione a
mutazione avvenga nella gametogenesi femminile e non
avvenga in quella maschile
•(nella corea di Huntington l’espansione è nella gametogenesi maschile)
•Nella mitosi, femminile e maschile (esiste un mosaicismo
somatico nei tessuti e nel tempo)
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FMR1
polimorfismi
Il gene e’ composto di 17 esoni
ed e’ lungo 38 Kb.All’interno del
primo esone al 5’UTR e’ presente
una serie di CGG.Nella popolazione
questa regione e’ polimorfica: varia
da 7 a 52 ripetizioni: l’allele piu’
comune e’ quello di 30 (effetto
fondatore).
Gli alleli premutati sono compresi
fra 60 e 200. Gli alleli
completamente mutati possono
raggiungere le centinaia di ripetizioni
Quando il numero delle triplette
supera 230 l’intera regione viene
ipermetilata aggiungendo un gruppo
metilico a C su entrambe le eliche
il promotore del gene viene inattivato e FRM1 diviene silente
Inoltre la cromatina non riesce a condensare correttamente
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Fenotipo di maschi e femmine con mutazione
•I maschi con la mutazione manifestano il
fenotipo
•Le femmmine: hanno un fenotipo piu’ lieve,
•1) sono 46,XX (quindi hanno un allele che produce la
proteina normale)
•2) Inattivazione casuale della X
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X fragile: diagnosi molecolare
La PCR permette di identificare gli alleli normali e le
premutazioni, ma per le espansioni maggiori, la presenza di un
elevato numero di GC (la tripletta e’ CGG) rende meno
efficiente la tecnica.
Si ricorre al Southern Blot dopo doppia digestione con enzimi
sensibili alla metilazione: la regione espansa fino a mutazione
completa e’ ipermetilata e l’enzima non taglia.
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Analisi delle mutazioni:PCR
Primer
Normale
5-50
Premutazione
50-200
Mutazione
completa
>200
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Meccanismo di formazione dell’espansione
25

Distrofia miotonica
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(AD) ~ 1/20000
Distrofia miotonica
Fenotipo:
problemi alla muscolatura scheletrica, liscia, oculare
(facies caratteristica,difficolta’ ad utilizzare gli utensili,
i muscoli si contraggono facilmente ma si rilassano con
difficoltà)
cataratta,
difetti cardiaci (pace maker, terapia farmacologica)
Intelletto: normale o lievemente deficitario
Anomalie del sistema endocrino (spesso i pazienti sono
diabetici)
Aspettativa di vita ridotta
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Distrofia miotonica
(AD) ~ 1/20000
DMPK (mappata sul cromosoma 19) è una Ser-thr Kinasi
-E’ espressa in cervello, muscolo, cuore
- Il cui ruolo non è chiaro(regolazione componenti del citoscheletro,
omeostasi del calcio)
-Contiene (CTG)n al 3’UTR,
-Nei pazienti sembra esserci un deficit di questa proteina
Lieve diagnosi 20-60 anni, n=50-150, cataratta, miotonia lieve
Classica diagnosi 10-35 anni, n=100-1500, muscoli, cuore, occhi,
intelletto
Congenita diagnosi entro i 10 anni, generalmente alla nascita, pochi
movimenti fetali, grave ipotonia, MR nel 50% dei casi n=1000-2000, di
solito ereditano l’allele espanso dalla madre,
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Il gene DMPK
29

Il gene DMPK
Nei pazienti (CTG)n è espanso
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Distrofia miotonica
questo non e’ sufficiente per dire che quel gene e’ il
responsabile della malattia: bisogna individuare anche affetti con
mutazioni puntiformi.
Nel caso di FMR1 ci sono affetti senza espansione con
mutazioni puntiformi che impediscono l’espressione.
si ritiene che il gene identificato sia il principale, ma non si
e’ ancora compreso perche l’espansione provochi la patologia.
Forse altera l’espressione dei geni adiacenti. Esistono modelli
murini che sembrerebbero validare questa ipotesi.
Ma allora bisogna ritenere DM una sindrome da geni contigui
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La diagnosi molecolare
Distrofia Miotonica
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Il materiale didattico e’ presente in rete:
http://www.biologia.uniba.it/DIGEMI/Didattica.html
NON sono dispense, ma un ausilio allo studio sul
libro
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