ANALYSETECHNIEKEN IN HET LABORATORIUM. - Favv

BESTUUR LABORATORIA
Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen
ANALYSETECHNIEKEN IN HET LABORATORIUM.
Gecertificeerde Opleiding
Niveau B/C
Versie 1 van 15/02/2010
Verantwoordelijke uitgever : Geert De Poorter

Woord vooraf
Bij meerdere gelegenheden, zoals tijdens de roadshows in de verschillende laboratoria, kwamen er
vragen van medewerkers naar meer informatie over de mogelijkheden van Gecertificeerde
Opleidingen van de niveaus A, B, C.
Gezien er voor laboratoriummedewerkers geen specifieke Gecertificeerde Opleidingen meer
georganiseerd worden door het Opleidingsinstituut van de Federale Overheid (OFO), en gezien de
nieuwe mogelijkheden van de wetgeving zodat het FAVV zelf Gecertificeerde Opleidingen kan
organiseren, heb ik in dit kader de beslissing genomen om een competentievorming en competentiemeting
te organiseren voor de medewerkers van niveau A, B en C van onze laboratoria. In deze
vorming zal ingegaan worden op de voornaamste parameters die bepaald worden en de belangrijkste
analysemethoden die toegepast worden in de eigen laboratoria. Tevens zullen ook het kwaliteitsaspect
en de milieu- en veiligheidsaspecten behandeld worden. Tenslotte is er ook een verwijzing
naar de geldende wetgeving.
Ik wens aan alle medewerkers een goede vorming en een geslaagde competentietest voor deze
Gecertificeerde Opleiding. De voorziene competentievorming zal wegens zijn specifieke technische en
ondersteunende informatie zeker bijdragen tot een competentie surplus voor alle medewerkers van
mijn Bestuur. Dit is ook het uiteindelijke doel van de organisatie van een Gecertificeerde Opleiding.
ir. Geert De Poorter
Directeur-generaal
Bestuur Laboratoria FAVV

Inhoud
1 INLEIDING .................................................................................................................................. 9
1.1 DE GEZONDHEIDSRISICO’S EVOLUEREN ............................................................................................................... 9
1.2 MICROBIOLOGISCH RISICO ............................................................................................................................... 9
1.2.1 Micro-organismen en levensmiddelen die het vaakst de oorzaak zijn van voedselvergiftiging .... 10
1.3 CHEMISCH RISICO......................................................................................................................................... 11
1.3.1 Contaminanten .............................................................................................................................. 11
1.3.2 Residu’s ......................................................................................................................................... 12
2 BIOLOGISCHE TECHNIEKEN................................................................................................. 13
2.1 MICROBIOLOGIE .......................................................................................................................................... 13
2.1.1 Achtergrond .................................................................................................................................. 13
2.1.2 Microbiologische analyses............................................................................................................. 15
2.1.3 Overzicht van de belangrijkste microbiologische analyses ........................................................... 29
2.2 FYTHOPATHOLOGIE ...................................................................................................................................... 58
2.2.1 De fytopathogene organismen ...................................................................................................... 58
2.2.2 De analysemethoden in de fytopathologie ................................................................................... 65
2.2.3 Voorbeelden van toepassingen in het FAVV .................................................................................. 71
2.3 PCR EN GGO ............................................................................................................................................. 73
2.3.1 Biologische Achtergrond ............................................................................................................... 73
2.3.2 PCR : de Polymerase Chain Reaction ............................................................................................. 88
2.3.3 PCR en GGO ................................................................................................................................. 114
3 MATRIX – PARAMETERS ...................................................................................................... 122
3.1 INLEIDING ................................................................................................................................................. 122
3.2 COMPONENTEN MET HORMONALE WERKING ................................................................................................... 123
3.2.1 Stilbenen en afgeleiden ............................................................................................................... 123
3.2.2 Thyreostatica ............................................................................................................................... 124
3.2.3 Steroïden: stoffen met androgene, estrogene of gestagene werking ......................................... 128
3.2.4 Zeranol en afgeleiden .................................................................................................................. 133
3.2.5 ß-agonisten ................................................................................................................................. 134
3.2.6 Annex IV componenten ............................................................................................................... 138
3.3 ANTIBIOTICA ............................................................................................................................................. 142
3.3.1 Inleiding ....................................................................................................................................... 142
3.3.2 Sulfonamiden en Trimethoprim ................................................................................................... 143
3.3.3 ß-lactam antibiotica .................................................................................................................... 144
3.3.4 Fluoroquinolonen ........................................................................................................................ 146
3.3.5 Macroliden .................................................................................................................................. 147
3.3.6 Florfenicol en aanverwante stoffen ............................................................................................. 148
3.3.7 Tetracyclines ................................................................................................................................ 148
3.3.8 Lincosamiden ............................................................................................................................... 149
3.3.9 Aminoglycosiden ......................................................................................................................... 149
3.3.10 Polypeptiden ................................................................................................................................ 151
3.3.11 Glycopeptiden.............................................................................................................................. 151
3.3.12 Nitrofuranen en Nitro-imidazolen ............................................................................................... 151
3.3.13 Herkomst van antibiotica residu’s in de voedselketen ................................................................ 151
3.3.14 Schadelijke effecten van antibiotica residu’s............................................................................... 152
3.3.15 Risico-evaluatie en het vastleggen van MRL’s............................................................................. 153

3.3.16 Detectie van kiemgroeiremmende stoffen in dierlijke producten ............................................... 154
3.4 ACRYLAMIDE ............................................................................................................................................. 155
3.4.1 Structuur en /of belangrijkste groepen ....................................................................................... 155
3.4.2 Analysetechniek........................................................................................................................... 155
3.4.3 Toxiciteit voor mens en/of dier .................................................................................................... 155
3.5 DIOXINES ................................................................................................................................................. 156
3.5.1 Inleiding ....................................................................................................................................... 156
3.5.2 Structuur en/of belangrijkste groepen ........................................................................................ 157
3.5.3 Analysemethodes ........................................................................................................................ 158
3.5.4 Toxiciteit voor mens en/of dier .................................................................................................... 159
3.6 ZWARE METALEN EN ARSENICUM .................................................................................................................. 160
3.6.1 Belangrijkste groepen ................................................................................................................. 160
3.6.2 Analysetechniek........................................................................................................................... 160
3.6.3 Toxiciteit voor mens en/of dier .................................................................................................... 161
3.7 COCCIDIOSTATICA ...................................................................................................................................... 169
3.7.1 Inleiding ....................................................................................................................................... 169
3.7.2 Structuur en/of belangrijkste groepen ........................................................................................ 170
3.7.3 Analysetechnieken ....................................................................................................................... 173
3.7.4 Toxiciteit voor mens en/of dier .................................................................................................... 174
3.8 MYCOTOXINES .......................................................................................................................................... 177
3.8.1 Aard en oorsprong ....................................................................................................................... 177
3.8.2 Risico’s van mycotoxines ............................................................................................................. 177
3.8.3 Mycotoxicose ............................................................................................................................... 177
3.8.4 Condities voor de productie van mycotoxines ............................................................................. 178
3.8.5 Ochratoxine A .............................................................................................................................. 180
3.8.6 Deoxynivalenol (DON) ................................................................................................................. 183
3.8.7 Fumonisines ................................................................................................................................. 185
3.8.8 Trichothecenen (T-2 en HT-2 toxine) ........................................................................................... 187
3.8.9 Zearalenon .................................................................................................................................. 189
3.8.10 Aflatoxine .................................................................................................................................... 190
3.8.11 Moederkoren ............................................................................................................................... 194
3.8.12 Patuline ....................................................................................................................................... 195
3.9 ALLERGENEN ............................................................................................................................................. 196
3.9.1 Voedselallergenen ....................................................................................................................... 196
3.9.2 Histamine .................................................................................................................................... 199
3.10 CONTACTMATERIALEN ............................................................................................................................... 201
3.10.1 Inleiding ....................................................................................................................................... 201
3.10.2 Specifieke migraties .................................................................................................................... 202
3.11 VITAMINES.............................................................................................................................................. 210
3.11.1 Inleiding ....................................................................................................................................... 210
3.11.2 Vitamines, tekort en overmaat.................................................................................................... 211
3.11.3 Soorten vitamines ........................................................................................................................ 212
3.11.4 Technieken voor de analyse van vitamines ................................................................................. 235
4 ANALYSETECHNIEKEN ........................................................................................................ 241
4.1 VLOEISTOFCHROMATOGRAFIE ...................................................................................................................... 241
4.1.1 Algemene principes ..................................................................................................................... 241
4.1.2 Indeling op basis van de aard van de fase ................................................................................... 241
4.1.3 Indeling op basis van het chromatografisch principe .................................................................. 241
4.1.4 Indeling op basis van de uitvoering ............................................................................................. 242

4.1.5 Indeling op basis van de fysico-chemische processen die tijdens de scheiding optreden ............ 242
4.1.6 Stationaire fasen bij HPLC ........................................................................................................... 242
4.1.7 Keuze van de HPLC-methode ....................................................................................................... 256
4.1.8 Instrumentele aspecten ............................................................................................................... 260
4.1.9 Praktische toepassing .................................................................................................................. 270
4.2 IONENCHROMATOGRAFIE ............................................................................................................................ 273
4.2.1 Principe ........................................................................................................................................ 273
4.2.2 Toepassingen ............................................................................................................................... 273
4.2.3 Keuze van het eluent ................................................................................................................... 273
4.2.4 Monstervoorbereiding ................................................................................................................. 274
4.2.5 Kolommen ................................................................................................................................... 274
4.2.6 Detectie ....................................................................................................................................... 275
4.2.7 Ionensuppressie van elektrolytionen ........................................................................................... 275
4.3 GASCHROMATOGRAFIE ............................................................................................................................... 276
4.3.1 Inleiding ....................................................................................................................................... 276
4.3.2 Derivatisatie ................................................................................................................................ 276
4.3.3 Monsterinjectie ........................................................................................................................... 277
4.3.4 De scheiding ................................................................................................................................ 283
4.3.5 Detectoren ................................................................................................................................... 284
4.4 MASSASPECTROMETRIE............................................................................................................................... 291
4.4.1 Inleiding ....................................................................................................................................... 291
4.4.2 Principe ........................................................................................................................................ 291
4.4.3 Monsterintroductie ..................................................................................................................... 292
4.5 ICP - OES ................................................................................................................................................ 295
4.5.1 Principe ........................................................................................................................................ 295
4.5.2 Emissie ......................................................................................................................................... 295
4.5.3 Het ontstaan van het plasma ...................................................................................................... 297
4.5.4 Het omzettingsproces van monster tot stralende deeltjes .......................................................... 298
4.5.5 RF generator en vermogen .......................................................................................................... 299
4.5.6 Axiaal en radiaal plasma ............................................................................................................. 300
4.5.7 Detectie ....................................................................................................................................... 301
4.6 DOSERING VAN ZWARE METALEN MET AMA, GFAAS EN ICP-MS ..................................................................... 302
4.6.1 Welke metalen ............................................................................................................................ 302
4.6.2 De aard van de matrices.............................................................................................................. 302
4.6.3 Monstervoorbereiding ................................................................................................................. 302
4.6.4 Detectie van kwik met AMA ........................................................................................................ 303
4.6.5 Detectie van metalen met AAS Grafietoven ................................................................................ 304
4.6.6 Detectie van metalen met ICP-MS ............................................................................................... 304
4.7 IMMUNOASSAYS ........................................................................................................................................ 305
4.7.1 Inleiding ....................................................................................................................................... 305
4.7.2 Algemeen principe ....................................................................................................................... 305
4.7.3 RIA ............................................................................................................................................... 305
4.7.4 ELISA ............................................................................................................................................ 306
4.8 MICROSCOPIE ........................................................................................................................................... 308
4.8.1 Algemeen .................................................................................................................................... 308
4.8.2 Lichtmicroscopie .......................................................................................................................... 308
4.8.3 Praktische toepassing : Dierenmelen .......................................................................................... 309
5 KWALITEIT ............................................................................................................................. 317
5.1 KWALITEITSMANAGEMENTSYSTEEM ............................................................................................................... 317

5.1.1 ISO 9001 / ISO 17025 ................................................................................................................... 318
5.1.2 Accreditatie ................................................................................................................................. 320
5.1.3 Kwaliteitscontrole........................................................................................................................ 321
5.1.4 Validatie van methoden .............................................................................................................. 331
5.1.5 Meetonzekerheid voor kwantitatieve chemische analyses ......................................................... 338
5.2 EMAS / OHSAS ....................................................................................................................................... 341
5.2.1 Arbomanagementsysteem (veiligheid) ....................................................................................... 341
5.2.2 Milieumanagementsysteem – ISO 14001 .................................................................................... 344
5.2.3 Milieumanagementsysteem – EMAS ........................................................................................... 346
5.2.4 Certificatie ................................................................................................................................... 348
5.2.5 Integratie van managementsystemen ........................................................................................ 349
5.3 FOODLIMS ............................................................................................................................................. 351
5.3.1 Inleiding ....................................................................................................................................... 351
5.3.2 Foodlims (Unilab) ........................................................................................................................ 351
5.3.3 Koppeling met andere applicaties ............................................................................................... 354
5.3.4 Extra modules op maat gemaakt ................................................................................................ 354
5.3.5 Hulpsoftware ............................................................................................................................... 355

1 INLEIDING
De gezondheidsrisico’s die verband houden met voedselveiligheid kunnen worden ingedeeld in twee
grote categorieën: microbiologische risico’s die te maken hebben met bacteriën, virussen, schimmels,
parasieten, e.d. en chemische risico’s die onder meer verbonden zijn met chemicaliën in het
leefmilieu, resten van diergeneesmiddelen of pesticiden, zware metalen of elk ander residu dat
onopzettelijk in de voedingsketen is terechtgekomen tijdens het oogsten, het vetmesten, of tijdens de
daaropvolgende bewerkingen.
1.1 De gezondheidsrisico’s evolueren
Vroeger maakten infectieziekten veel meer slachtoffers dan nu. De hygiënische omstandigheden
waren veel slechter en talrijke “natuurlijke” risico’s waren nog niet gekend. Er werd bijgevolg niets aan
gedaan. Tegenwoordig zijn talrijke ziekten waarmee de mens via het vee besmet werd, nagenoeg
verdwenen.
Anderzijds steken nu bepaalde nieuwe risico’s de kop op. Een voorbeeld is het gebruik van pesticiden
in de landbouw of, op grotere schaal, de milieuvervuiling in het algemeen en haar impact op de
voedselketen. Op een aantal ongevallen na, gaat het om risico’s die over het algemeen veel minder
acuut zijn (d.w.z. er zijn geen onmiddellijke gevolgen) dan de risico’s die te maken hebben met
gebrekkige hygiëne (een voedselvergiftiging manifesteert zich doorgaans vrij snel en hevig). Ze zijn
eerder sluipend (de effecten worden pas duidelijk op langere termijn zoals bij kanker). Kanker is
evenwel niet het lot van deze moderne tijd alleen : we weten met zekerheid dat sommige volledig
natuurlijke giftige stoffen die al lang bestaan, kankerverwekkend kunnen zijn.
Wetenschappers erkennen dat het nu met de voedselveiligheid over het algemeen beter gesteld is
dan vroeger.
1.2 Microbiologisch risico
Micro-organismen zijn de belangrijkste oorzaak van voedselvergiftiging. Ze zijn echter niet allemaal
gevaarlijk : sommige zijn perfect onschadelijk, andere zijn zelfs uiterst nuttig. Denk maar bijvoorbeeld
aan de micro-organismen die worden gebruikt bij het maken van yoghurt, zuurkool, brood, bier, het
laten rijpen van kaas, worsten enz. Hetzelfde geldt eveneens voor een groot deel van de bacteriën in
onze darmen. Ze zitten met miljarden in ons darmkanaal en bevorderen een goede darmtransit,
beschermen ons tegen schadelijke bacteriën en verhogen onze natuurlijke weerstand.
Daartegenover staat dat bepaalde micro-organismen ons ziek kunnen maken. Vandaar dus de
benaming pathogene micro-organismen. Het micro-organisme dat via de voeding wordt opgenomen,
kan zelf toxisch zijn of het kan een stof aanmaken die in ons voedsel geraakt en die ons ziek maakt.
Er zijn meer dan 250 soorten van voedselvergiftiging bekend. Zij kunnen veroorzaakt worden door
tientallen ziekteverwekkers. Momenteel zijn Salmonella en Campylobacter de twee soorten bacteriën
die de meeste voedselvergiftigingen in ons land veroorzaken.
Salmonellabacteriën zijn in de natuur zeer wijdverbreid aanwezig en komen meer bepaald voor bij
pluimvee en gevogelte. Het eten van besmette levensmiddelen kan leiden tot een vergiftiging:
9

salmonellose. De levensmiddelen met de grootste kans op een dergelijke Salmonellabesmetting zijn
rauwe of onvoldoende gekookte eieren of gerechten op basis van rauwe eieren (bijv. tiramisu) en
gehakt.
Bij talrijke gerechten worden rauwe ingrediënten gebruikt. Zij zijn een ideale voedingsbodem voor
bacteriën en kunnen dus een bedreiging vormen. Dat is bijvoorbeeld het geval met gerechten op basis
van rauwe eieren, zoals tiramisu, chocolademousse of zelfbereide aardappelpuree. Daarom worden
deze gerechten beschouwd als risicovoedsel. De verhitting bij het koken, bakken, braden of stoven
van voedsel vernietigt de bacteriën waardoor het voedingsmiddel hygiënisch gezien minder riskant
wordt.
Met uitzondering van bepaalde voedingsmiddelen die tijdens de productie worden gesteriliseerd
(bijvoorbeeld conserven), zitten er in nagenoeg alle voedingsmiddelen micro-organismen.
Levensmiddelen kunnen tijdens de productie, maar net zo goed thuis door een gebrek aan hygiëne
(bijvoorbeeld: de handen niet wassen na een bezoek aan het toilet) besmet worden met pathogene
bacteriën. Gebrekkige hygiëne thuis wordt als de belangrijkste oorzaak van voedselvergiftiging
beschouwd. Dit wordt vooral verklaard door een gebrek aan kennis over dit type risico.
Het kan ook gaan om een “kruisbesmetting”. Zo treft men bijvoorbeeld vaak salmonellabacteriën aan
op eierschalen. Dat vormt geen probleem als het eitje zachtgekookt wordt gegeten: de
onderdompeling in kokend water vernietigt de salmonellabacteriën op de eierschaal. Als men
daarentegen eerst rauwe eieren heeft aangeraakt en daarna een stuk fruit pakt zonder eerst zijn
handen te wassen, kunnen de bacteriën van de eierschaal op het fruit terechtkomen. En als de eieren
niet in hun oorspronkelijke verpakking of in het eierrekje van de koelkast worden bewaard, kunnen ze
andere levensmiddelen besmetten waarmee ze op een bepaald ogenblik in aanraking komen (kruisbesmetting).
1.2.1 Micro-organismen en levensmiddelen die het vaakst de oorzaak zijn van
voedselvergiftiging
1.2.1.1 Bacteriën
o Bacillus cereus: Opgewarmde gekookte rijst, bereide vleeswaren, pudding op basis
van zetmeelhoudende ingrediënten, groenten en vis. Een verkeerde behandeling na
het klaarmaken is vaak de oorzaak van een besmetting met B. cereus.
o Clostridium perfringens: Opgewarmd voedsel, restjes van buffetten, vlees en
gevogelte, peulvruchten, sausen, ragouts en soepen.
o Clostridium botulinum: Ambachtelijk vervaardigde conservenblikken (groenten, vis,
vlees en gevogelte).
o Escherichia coli (E. coli): Salades en rauwe groenten, onvoldoende gaar vlees, niet
gepasteuriseerde melk, kaas.
o Campylobacter jejuni: Rauwe melk, gevogelte.
10

1.2.1.2 Parasieten
1.2.1.3 Virussen
o Listeria monocytogenes: Niet gepasteuriseerde melk en zuivelproducten zoals zachte
kazen, rauw vlees, gevogelte, schaal- en schelpdieren, groenten, paté, vlees en
gerookte vis, koolsalade.
o Salmonella enteritidis: Onvoldoende gaar gevogelte, vlees, schelpdieren, salades,
eieren en zuivelproducten.
o Staphylococcus aureus: Ham, gevogelte, eieren, ijs, kazen, salades, crème anglaise
en gebakjes met room, saus. Een verkeerde behandeling na de bereiding en
gebrekkige hygiëne zijn veelvuldige oorzaken van besmetting.
o Vibrio parahaemolyticus en andere mariene Vibriostammen: Rauwe en onvoldoende
gekookte vis, schelpdieren.
o Trichinella spiralis: Onvoldoende gaar varkensvlees.
o Toxoplasma gondii: Onvoldoende gaar vlees, gevogelte en rauwe melk.
o Hepatitis-A-virus (HAV): Schaal en schelpdieren, vruchten en ongekookte groenten
zijn veelvuldig oorzaak van hepatitis A. Dit virus kan ook worden overgebracht bij een
verkeerde behandeling van het voedingsmiddel.
1.3 Chemisch risico
1.3.1 Contaminanten
Onder contaminant verstaan we elke ongewenste stof die op onopzettelijke wijze in de
levensmiddelen is terechtgekomen (in tegenstelling tot additieven die er bewust worden aan
toegevoegd). Contaminanten kunnen tijdens verschillende stadia van de productie, het transport of de
opslag van de levensmiddelen in de voeding terechtkomen. Ze kunnen zelfs het gevolg zijn van een
verontreiniging van het milieu.
Het gaat bijgevolg om een grote, uiterst gevarieerde groep van stoffen. Ze kunnen een perfect
“natuurlijke” oorsprong hebben, zoals mycotoxinen. Ze kunnen echter ook door de mens
geproduceerd zijn (PCB’s, acrylamide) of een natuurlijke en menselijke oorsprong hebben (dioxines).
Uiteraard kunnen we in deze laatste categorie (de menselijke activiteiten) iets doen om de besmetting
van levensmiddelen te beperken.
Hierbij dienen we op te merken dat we met menselijke activiteiten zowel de grootschalige industriële,
als de kleine, traditionele productie bedoelen, of zelfs gewoon bepaalde huishoudelijke handelingen
(bijvoorbeeld het bereiden van voedsel op een barbecue).
De contaminatie met zware metalen (lood, cadmium, kwik) en arsenicum zijn vooral het gevolg van
industriële activiteiten.
11

Mycotoxines zijn toxinen die worden geproduceerd door bepaalde soorten schimmels of gisten die
zich op levensmiddelen ontwikkelen (dierenvoeders en/of voedsel voor menselijke consumptie).
1.3.2 Residu’s
De aanwezigheid van bepaalde substanties in de voeding is het resultaat van een doelbewust gebruik.
Dat is het geval bij residu’s van pesticiden en van diergeneesmiddelen in levensmiddelen van dierlijke
oorsprong.
Pesticiden (fytosanitaire producten) worden gebruikt om de natuurlijke vijanden van planten te
bestrijden. Ze mogen enkel worden gebruikt na een toxicologische evaluatie waarbij wordt nagegaan
of ze niet schadelijk zijn voor de gezondheid van de mens. Er zitten nog steeds residu’s van
pesticiden in levensmiddelen. Regelmatige controles zijn noodzakelijk om na te gaan of de normen in
acht worden genomen.
Bij de diergeneesmiddelen gaat het vooral om antibiotica voor de preventieve of curatieve
behandeling van dieren. Ze werden eveneens gebruikt om de groei van de dieren te stimuleren. De
Europese Unie heeft evenwel deze toepassing verboden sinds 2006. Residu’s van geneesmiddelen
kunnen worden teruggevonden in vlees, melk, enz., zonder evenwel een rechtstreeks risico voor de
volksgezondheid te betekenen. Zowel bij dier als mens kan het gebruik van antibiotica evenwel het
ontstaan van resistente bacteriestammen bevorderen (d.w.z. stammen die resistent zijn geworden
tegen het toegediende antibioticum). Hierdoor steken er ziekten de kop op die steeds moeilijker te
behandelen zijn en waarvoor andere antibiotica moet gezocht worden, wat tot een soort
sneeuwbaleffect leidt.
In heel Europa is het sinds 1988 verboden om hormonen toe te dienen aan vee om de groei te
bevorderen of de melkproductie te verhogen. Dit resulteerde in een controverse met de Verenigde
Staten, waar het gebruik van bepaalde hormonen wel is toegelaten.
Zolang de wettelijke voorschriften, meer bepaald inzake de aard van de gebruikte producten, de
dosissen en de wachttijden, worden nageleefd, vormen de residu’s van pesticiden en veterinaire
geneesmiddelen geen acuut probleem voor de mens. Het is echter niet uitgesloten dat ze op lange
termijn wel bepaalde schadelijke effecten hebben zoals het onomkeerbaar verstoren van de
ontwikkeling van baby’s en jonge kinderen bij blootstelling aan bepaalde gechloreerde pesticiden.
12

2 BIOLOGISCHE TECHNIEKEN
2.1 Microbiologie
2.1.1 Achtergrond
2.1.1.1 Micro-organismen leven !
Micro-organismen komen zowat overal voor : in water, lucht,
voedsel, bodem enz. Daardoor is elk product dat geen
speciale behandeling ondergaan heeft, van nature
gecontamineerd met bacteriën, gisten, schimmels, virussen
e.d..
Een belangrijk verschil met andere contaminaties is dat
micro-organismen leven : wanneer de omstandigheden
gunstig zijn kunnen ze groeien en zich vermenigvuldigen, bij
ongunstige omstandigheden stopt de groei of sterven ze af.
Dit betekent dat de mate van contaminatie van een
voedingsmiddel op het moment van de consumptie niet
alleen bepaald wordt door de begincontaminatie, maar ook
door de bewerkingen die het ondergaan heeft en de
omstandigheden waarin het bewaard werd tot op het
moment van de consumptie.
Of een initiële microbiologische contaminatie zal toenemen dan wel afnemen hangt onder meer af van
de volgende omgevingscondities :
• de beschikbaarheid van water (de wateractiviteit) : zonder water is er geen groei.
• de temperatuur : elk organisme heeft een bepaald temperatuurinterval waarbinnen groei en
vermenigvuldiging optimaal verlopen, buiten dit interval ligt de groei ofwel stil (lage
temperatuur) of sterft het organisme af (verhitting, invriezen).
• de aanwezige voedingsstoffen (eiwitten, suikers, vetten, vitamines, mineralen,..). Bij groei
neemt het organisme stoffen uit zijn omgeving op en zet die om tot 'lichaamseigen' stoffen of
gebruikt die als energiebron. Bij gebrek aan deze voedingsstoffen wordt de groei geremd.
• de aan- of afwezigheid van noodzakelijke of remmende stoffen zoals zuurstof (noodzakelijk
voor aëroben, schadelijk voor anaëroben) of antibiotica (sterk groeiremmend of dodelijk voor
sommige organismen).
• sommige omgevingsfactoren, zoals de zuurtegraad (pH), kunnen op bepaalde organismen
een remmend effect hebben.
Welke waarden voor deze factoren optimaal zijn verschilt van organisme tot organisme; zo kunnen
melkzuurbacteriën een vrij lage pH tolereren, terwijl bij de meeste andere bacteriën de groei juist sterk
geremd wordt. Het zal duidelijk zijn dat de bewaaromstandigheden van een product uiterst belangrijk
zijn als men een ongewenste toename van de contaminatie op het moment van consumptie wenst te
vermijden.
13

Deze kenmerken zijn ook van belang bij het uitvoeren van microbiologische analyses : de ‘levende’
natuur van de organismen impliceert dat de bewaarcondities van een product na monstername uiterst
belangrijk zijn: als er geen gepaste voorzorgen genomen worden tijdens het volledige proces van
monstername tot analyseresultaat, kunnen de aantallen die gerapporteerd worden zeer sterk
verschillen van de aantallen die op het moment van de monstername aanwezig waren.
Een bijkomende factor die vaak over het hoofd wordt gezien is het feit dat micro-organismen niet
gelijkmatig verdeeld zijn over een product. In een product zal vermenigvuldiging van microorganismen
vooral daar plaatsvinden waar aan hun behoeften voldaan is (temperatuur, water,
voedingsstoffen,...) Een voorbeeld hiervan is boter dat vooral bestaat uit vet waarin kleine
waterdruppeltjes verdeeld zijn. Het is alleen in die waterdruppeltjes dat de micro-organismen groeien
en zich kunnen vermenigvuldigen en niet in de vetfase. Dit aspect is vooral belangrijk bij zeer
heterogene voedingsmiddelen, waar als gevolg van dit fenomeen bepaalde delen sterk en andere
weinig gecontamineerd kunnen zijn.
2.1.1.2 Betekenis van contaminatie door micro-organismen
We kunnen bij de contaminatie van voedingsmiddelen drie aspecten beschouwen :
• de volksgezondheid, waarbij we vooral geïnteresseerd zijn in pathogenen, organismen die
ziekten kunnen veroorzaken (Salmonella, Listeria,...) of toxines kunnen produceren
(mycotoxines, enterotoxines,...),
• de productiecondities : sommige organismen zijn op zich geen ziekteverwekkers maar zijn
eerder een indicatie voor de hygiënische condities waaronder het product geproduceerd werd.
Zo is de aanwezigheid van E. coli in dierlijke producten een indicator van fecale contaminatie,
wat bij hoge aantallen de waarschijnlijkheid groter maakt dat er ook andere ziekteverwekkers
aanwezig zijn.
• de kwaliteit van het product : het betreft hier organismen die ongewenste veranderingen in
het product (bederf) veroorzaken waardoor de houdbaarheid beperkt wordt. In deze optiek is
vooral de totale contaminatie van belang. Er moet echter rekening mee gehouden worden dat
er bij bepaalde technologische processen bewust micro-organismen (gist,
melkzuurbacteriën,...) toegevoegd worden om het product karakteristieke kenmerken te geven
(boter, kaas, yoghurt, salami,…), waardoor de ‘totale contaminatie’ in dergelijke gevallen
weinig zegt over de kwaliteit van het product.
2.1.1.3 Processen tot verlenging van de houdbaarheid
Industrieel worden verschillende processen toegepast om de houdbaarheid van een product te
vergroten of om de aanwezige pathogenen te remmen of te doden. Deze processen zijn :
• bij de verwerking van rauwe producten (rauwmelkse boter, kaas, worst…) wordt een
rijpingscultuur toegevoegd die tot doel heeft om enerzijds het product een karakteristieke
smaak- of textuurontwikkeling te laten doormaken, en anderzijds om de omstandigheden in
het product zo te wijzigen dat die ongunstig worden voor de vermenigvuldiging van
ongewenste organismen (meestal verzuring). Omdat er hierbij geen afdodingsproces
toegepast wordt, kunnen er nog altijd pathogenen aanwezig zijn in het product.
14

• verhitting. Afhankelijk van de temperatuur en de duur van de behandeling heeft dit tot doel
ofwel om mogelijke pathogenen te doden (pasteurisatie van melk) of om het product
commercieel steriel te maken ter verlenging van de houdbaarheid (UHT-behandeling bij
dranken, sterilisatie in glas of blik).
• invriezen. Bij bewaring bij temperaturen onder het vriespunt treden twee effecten op die de
houdbaarheid van een product verlengen. Enerzijds wordt het aanwezige water minder
beschikbaar daar het vooral als ijskristallen voorkomt; het resterende vloeibaar water tussen
de ijskristallen bevriest niet wegens de vriespuntverlaging door de hoge concentratie aan
opgeloste stoffen. Naarmate de temperatuur daalt neemt het aandeel vloeibaar water af,
vandaar dat bewaring bij –20°C beter is dan bij –5°C. Anderzijds verlopen de levensprocessen
bij lagere temperatuur veel trager, waardoor de groei sterk vertraagd wordt en sommige
organismen zelfs afsterven.
• verminderen van de wateractiviteit. Door toevoegen van zout (pekelen) of suiker (konfijten)
wordt het water in het voedingsmiddel minder beschikbaar, wat een remmend effect heeft op
de groei.
• controle van de zuurtegraad. Omdat de meeste bacteriën niet goed gedijen bij een lage pH,
zijn zure producten minder vatbaar voor bederf. Dit kan door toevoegen van zuur
(azijnzuur,…) of door fermentatie (melkzuur, propionzuur).
• controle van de atmosfeer. Door de zuurstof in de atmosfeer van een verpakking te
vervangen door een ander gas (stikstof, CO2) kan de ontwikkeling van de bederfflora geremd
worden en blijft het product langer houdbaar.
2.1.2 Microbiologische analyses
2.1.2.1 Principes
Wegens de meestal zeer geringe afmetingen van de cel van een micro-organisme en de
onregelmatige verspreiding ervan in een voedings- of voedermiddel is het meestal onpraktisch om die
cellen rechtstreeks op te sporen, hun aantallen te bepalen en de identiteit ervan vast te stellen.
Daarom maakt men meestal gebruik van 2 principes om op een indirecte manier de aanwezigheid
vast te stellen : groei en remming.
2.1.2.1.1 Groei
Wanneer een micro-organisme zich bevindt in optimale omstandigheden voor groei en
vermenigvuldiging (temperatuur, pH, voedingsstoffen,...), dan kan de tijd die nodig is voor de
verdubbeling van een enkele cel zeer kort zijn, van 20 – 30 minuten tot enkele uren. Zo geeft een cel
bij een verdubbelingstijd van 1h na 24h het ontstaan aan 16 miljoen cellen. Daardoor kan een enkele
cel, die met het blote oog onzichtbaar is, na enkele uren onbeperkte groei het ontstaan geven aan
tientallen miljoenen nakomelingen. In een vloeistof resulteert dit in het vertroebelen van de vloeistof,
op een vast oppervlak leidt dit tot het ontstaan van een hoopje
cellen dat met het blote oog zichtbaar is : een kolonie. Het laten
uitgroeien van een cel tot een zichtbare kolonie is een van de
basisprincipes van de klassieke microbiologische analyses.
15

Hierbij moet wel opgemerkt worden dat de veronderstelling dat elke kolonie die men ziet afkomstig is
van slechts één enkele cel een idealisering is. Vaak is het onmogelijk om tijdens de analyse de cellen
helemaal van elkaar los te maken, zodat een kolonie kan ontstaan uit een klein groepje cellen en niet
uit één enkele cel (vb. Staphylococcen, die van nature in groepjes voorkomen). Vandaar dat men
spreekt over ‘kolonievormende eenheden’ (kve, cfu – colony forming unit) en niet over
‘kolonievormende cellen’.
2.1.2.1.2 Selectieve remming
In een monster komen meestal veel verschillende soorten micro-organismen voor waarvan maar een
beperkt aantal van belang is, zoals een bepaalde pathogeen of een groep indicatororganismen. Om
het gezochte organisme of groep te selecteren moeten er enerzijds groeicondities toegepast worden
waarbij de gezochte organismen zich kunnen vermenigvuldigen, anderzijds moet de groei van andere
organismen die de analyse zouden kunnen storen, geremd worden zodat na verloop van tijd het
gezochte organisme de overhand haalt op alle andere (survival of the fittest).
De remming van organismen die de analyse zouden kunnen storen kan gebeuren door controle van
de atmosfeer (aëroben - anaëroben), van de pH, van de groeitemperatuur, van de aanwezige
voedingsstoffen of van de aanwezigheid van remmende verbindingen zoals antibiotica. Deze
parameters moeten natuurlijk zo ingesteld worden dat het gezochte organisme er zelf zo weinig
mogelijk door geremd wordt.
2.1.2.2 Telling en detectie
Bij een microbiologische analyse kunnen er twee vragen gesteld worden :
• Hoeveel cellen van een bepaald organisme zijn er aanwezig in een bepaalde hoeveelheid
monster. Dit is van belang wanneer er een bovengrens vastgesteld is voor de aanwezigheid
van een bepaald organisme of groep in een product (vb. minder dan 100 per gram).
• Om hierop een antwoord te geven moet men een telling uitvoeren van het aantal gezochte
organismen. Bij deze techniek worden de cellen eerst verspreid om afzonderlijke cellen te
krijgen, waarna men die cellen laat uitgroeien tot kolonies en men het aantal kenmerkende
kolonies telt. Dus eerst verspreiden, dan groei.
• Een variant hierop is de methode van het Meest Waarschijnlijke Aantal (MPN, Most Probable
Number) waarbij men niet met kolonies maar met het kenmerk groei/geen groei werkt over
verschillende deelmonsters.
• Is een bepaald organisme aanwezig in een bepaalde hoeveelheid monster ? Dit is van belang
bij pathogenen, waar een norm vastgelegd is dat het organisme afwezig moet zijn in een
bepaalde hoeveelheid monster (vb. afwezig in 25 g product).
• In dit geval voert men een detectie uit van het organisme in de betreffende hoeveelheid
monster. Omdat het aantal aanwezige cellen van geen belang is (het maakt niet uit of er 1 dan
wel 100 in de gestelde hoeveelheid product voorkomen), voert men eerst een aanrijking uit
waarna men een bevestiging uitvoert om te zien of het organisme in de aanrijking aanwezig is.
Dus eerst groei en dan bevestiging.
16

2.1.2.3 Microbiologische standaardtechnieken
In het microbiologisch onderzoek worden een aantal standaardtechnieken toegepast; een (klassieke)
microbiologische analysemethode is een combinatie van een welbepaalde volgorde van deze
technieken, toegespitst op het te onderzoeken organisme of groep. Hieronder volgt een overzicht van
deze technieken.
2.1.2.3.1 Aanrijking
Doel: een klein aantal organismen in een monster vermenigvuldigen tot een groot aantal om hun
aanwezigheid gemakkelijk te kunnen bepalen.
Principe: het (gehomogeniseerde) monster in een vloeibaar voedingsmedium brengen en een tijdlang
bewaren bij de optimale condities voor groei. Bij een gewone aanrijking zullen alle organismen die
onder die omstandigheden groeien, zich vermenigvuldigen ! Vandaar dat dit ook een niet-selectieve
aanrijking genoemd wordt.
2.1.2.3.2 Vooraanrijking
Doel: organismen die gestresseerd zijn (bv. omdat ze tijdens de productie een temperatuurschok
ondergaan hebben) de mogelijkheid geven om te herstellen, zodat ze de stresserende condities bij de
volgende stappen van de analyse (vooral aanwezigheid van een hoge concentratie aan remmende
stoffen) kunnen doorstaan.
Principe: het (gehomogeniseerde) monster in een vloeibaar voedingsmedium brengen en een tijdlang
(meestal minder dan 24h) bewaren bij de optimale condities voor groei. Het medium is ofwel nietselectief
ofwel beperkt selectief, dit laatste (en de korte incubatietijd) om het overgroeien van
concurrerende organismen tegen te gaan.
2.1.2.3.3 Selectieve aanrijking
Doel: een klein aantal organismen in een monster vermenigvuldigen tot een groot aantal om hun
aanwezigheid gemakkelijk te kunnen bepalen, maar dan zo dat die toename vooral optreedt bij het
gezochte organisme of de gezochte groep.
Principe: uitvoeren van een aanrijking waarbij er echter in het vloeibaar voedingsmedium remstoffen
aanwezig zijn die andere organismen dan de gezochte belemmeren in hun groei (vb. galzouten bij
coliformen). Daardoor zullen vooral de gezochte organismen en/of er nauw aan verwante organismen
zich vermenigvuldigen.
2.1.2.3.4 Verdunningsreeks
Doel: hoge aantallen verdunnen zodat die in een interval komen waarbij een betrouwbare telling
mogelijk wordt. Dit is dus eigenlijk het tegengestelde van een aanrijking.
17

Principe: men start met een hoeveelheid monster (1g, 25g,...). Dit wordt gemengd met een
hoeveelheid steriele verdunningsvloeistof dat de micro-organismen niet beschadigt, waarna het
geheel gehomogeniseerd wordt. Vervolgens maakt men uit dit homogenaat een reeks decimale
verdunningen (1 ml homogenaat + 9 ml verse verdunningsvloeistof, mengen, hiervan 1 ml nemen + 9
ml verse verdunningsvloeistof enz.) zodat elke verdunning slechts een tiende van het aantal
organismen bevat van de vorige verdunning.
Figuur 4.1.1 Verdunningsreeks
Als men ver genoeg verdunt krijgt men tenslotte 1 of 2 verdunningen die een aantal organismen
bevatten dat bij de verdere analyse (uitplaten en tellen) een telbaar resultaat geeft.
2.1.2.3.5 Uitplaten
Doel: de individuele cellen in een hoeveelheid monster verspreiden op een vaste voedingsbodem
zodat zich uit elke cel een afzonderlijke kolonie kan ontwikkelen die van de andere kolonies
gescheiden is. Die afzonderlijke kolonies kunnen ofwel geteld worden of kunnen als uitgangsmateriaal
dienen voor verder onderzoek.
Principe: een hoeveelheid verdunningsmedium (vb. 0,1 ml) wordt uitgespreid over een vaste
voedingsbodem, meestal in een ronde schaal (Petriplaat). Die bodem bestaat uit agar - een
polysaccharide dat niet afgebroken wordt en dus als vaste matrix dient - met daarin voedingsstoffen
en eventueel indicatoren (vb. voor pH-verandering). Tijdens de groei blijven alle cellen afkomstig van
een enkele cel in de buurt van die eerste cel; als de gebruikte verdunning hoog genoeg is zullen de
individuele cellen ver genoeg van elkaar verspreid zijn zodat afzonderlijke, geïsoleerde kolonies
gevormd worden. De groei kan veranderingen in de voedingsbodem tot gevolg hebben (zuurvorming,
neerslagvorming, afbraak van bepaalde componenten,..) die tot uiting kunnen komen door
kleurveranderingen e.d. rondom de kolonie (pH-omslag door de vorming van zuren als
afbraakproducten bij groei, de neerslag van zwart FeS bij afbraak van S-houdende aminozuren tot
H2S in aanwezigheid van Fe-zouten, ontstaan van een heldere zone bij afbraak van bijvoorbeeld
lecithine e.d.). Daardoor ontstaan kolonies met een typisch uitzicht (kleur, uitzicht, glans, zone...) die
kunnen onderscheiden worden van kolonies ontstaan uit andere organismen dan het gezochte.
18

2.1.2.3.6 Uitplaten op selectieve bodem
Doel: uitplaten op een bodem waaraan een of meer remstoffen toegevoegd zijn om de groei van
ongewenste groepen organismen tegen te gaan (vb. galzouten bij coliformen).
2.1.2.3.7 Telling
Doel: bepalen hoeveel organismen van een bepaalde groep of soort er aanwezig zijn in een bepaalde
hoeveelheid monster.
Er zijn twee basismethodes om dit aantal te bepalen : de rechtstreekse telling op een vaste bodem
(plaattelling) en de MPN-methode of methode van het Meest Waarschijnlijke Aantal.
Principe van de plaattelling: als er op een plaat van elkaar goed gescheiden kolonies voorkomen (zie
verder) en men weet van welke hoeveelheid van een verdund monster dit afkomstig is (vb. 0,1 ml op
plaat geënt van een 100-voudige verdunning afkomstig van 25 ml van een homogenaat van 1 g
monster), dan kan men het aantal – al dan niet typische - kolonies op die plaat tellen en omrekenen
naar de hoeveelheid monster waarmee dit aantal overeenstemt. In ons voorbeeld : het homogenaat
bevat 1/25 = 0,04 = 4 x 10 -2 g monster/ml; de 100-voudige verdunning bevat 100 x minder of 4 x 10 -4
g/ml, en 0,1 ml ervan komt dan overeen met 4 x 10 -5 g monster. Als er op de plaat 20 typische
kolonies geteld worden, dan waren die afkomstig uit 4 x 10 -5 g monster, of het monster bevat per gram
20/4 x 10 -5 = 5 x 10 5 = 500 000 cfu (kolonievormende eenheden, zie verder).
Principe van MPN (most probable number): bij de techniek van het Meest Waarschijnlijke Aantal werkt
men met een vloeibaar medium in proefbuizen. Er wordt een verdunningsreeks aangelegd en per
verdunning ent men meerdere proefbuizen (meestal 3 of 5). Na incubatie gedurende een
voorgeschreven tijd gaat men na in hoeveel proefbuizen er groei opgetreden is (zichtbaar door het
troebel worden van het oorspronkelijk heldere voedingsmedium). Op basis van het aantal proefbuizen
met groei en van welke verdunning die afkomstig zijn, kan men uit tabellen schatten hoeveel
organismen zich in het monster bevonden.
2.1.2.3.8 Uitzuiveren van een kolonie
Doel: zich ervan verzekeren dat een kolonie op basis waarvan men de aard van het organisme zal
bevestigen, effectief afkomstig is van één enkele cel en geen mengeling is van twee of meer
verschillende organismen.
Principe: in het ideale geval is een geïsoleerde kolonie op een plaat afkomstig van een enkele cel en
zijn alle cellen in die kolonie klonen daarvan. In de praktijk kunnen er in de nabijheid van die ene cel
ook cellen van andere organismen voorkomen die in de gegeven omstandigheden weinig tot niet
groeien, maar ook niet afsterven. Als men dan die kolonie verder kweekt op een andere
voedingsbodem (bijvoorbeeld voor identificatie) dan loopt men het risico dat die 'vreemde' cellen wel
groeien en de verdere testen vervalsen. Daarom is het nodig om een kolonie na groei eerst nog uit te
zuiveren vooraleer de bijkomende testen uit te voeren. Daarvoor pikt men een geïsoleerde kolonie af
van de plaat en strijkt men die uit op een andere, meestal niet-selectieve plaat (streepenting). Die
plaat wordt geïncubeerd tot er afzonderlijke kolonies verschijnen en men werkt verder met een van die
kolonies. De kans dat een geïsoleerde kolonie na uitzuiveren nog gecontamineerd is met een
vreemde cel is dan wel erg klein geworden.
19

2.1.2.3.9 Bevestiging
Doel: controleren of de geïsoleerde kolonie inderdaad het gezochte organisme is of de identiteit van
een geïsoleerde kolonie bepalen (meestal op speciesniveau).
Principe van een biochemische bevestiging: op een geïsoleerde kolonie worden een aantal
biochemische testen uitgevoerd. Daarbij test men de groei onder verschillende omstandigheden en op
verschillende voedingsmedia om na te gaan of er typische reacties optreden zoals zuurvorming,
fermentatie van bepaalde suikers, afbraak van een bepaalde verbinding e.d. Uit het patroon van de
reacties (vb. de API-galerij) kan men afleiden of men met het gezochte organisme te maken heeft of
kan men een organisme (species) binnen een groep identificeren (vb. de species binnen het genus
Listeria bepalen).
2.1.2.3.10 Serotypering
Doel: nadere identificatie van een organisme op een niveau lager dan species (bepaling serovars).
Principe: bij deze testen wordt een kolonie gemengd met specifieke antilichamen tegen bepaalde
celcomponenten (celwand, flagella,…). Agglutinatie wijst op de aanwezigheid van deze componenten.
Serotypering gaat meer in detail dan biochemische testen (niveau serovar i.p.v. species). Serotypering
wordt enerzijds uitgevoerd om de traceerbaarheid van een besmetting te bepalen (zoals serotypes
van Salmonella) en anderzijds om de aanwezigheid van virulentiefactoren – en zo ook de mogelijkheid
tot ziekteverwekking – te bepalen (zoals de aanwezigheid van antigeen H7 bij E. coli O157).
2.1.2.4 Verloop van een microbiologische analyse
Het opsporen van een organisme of een groep organismen verloopt in meerdere stappen : de
monstername, de eigenlijke analyse, het bepalen van het resultaat en de interpretatie ervan. Elke
stap is belangrijk en kan de eindbeoordeling sterk beïnvloeden.
2.1.2.4.1 De monstername
In veel opzichten is de monstername de meest kritische factor ! Het heeft immers weinig zin om
zich het hoofd te breken over de interpretatie van een analyseresultaat als de problemen al begonnen
zijn bij de monstername. Belangrijke aspecten daarbij zijn :
• de representativiteit van een monster of de mate waarin het monster een weerspiegeling is
van het eindproduct dat op het bord van de consument komt. Het ligt voor de hand dat een
analyse van het 'niet-eetbaar gedeelte' van een voedingsmiddel maar weinig nuttige
informatie zal verschaffen. Alhoewel dit niet altijd even eenvoudig is : of de korst van een
schimmelkaas als eetbaar moet beschouwd worden, daarover lopen de meningen nogal eens
uiteen...
• de homogeniteit heeft betrekking op de verdeling van de micro-organismen in het product. Bij
vloeibare producten of producten in poedervorm levert dit meestal weinig problemen op, maar
bij sommige vaste producten (slaatjes, sommige soorten kaas, paté...) kan de plaats van de
monstername (dicht bij het oppervlak of in de kern van het product, meer of minder van een
bepaald ingrediënt) een belangrijk effect hebben op het resultaat. Daardoor kan het ene
20

monster voor een bepaalde parameter een lage waarde geven en een monster vlak ernaast
genomen een hoge waarde. Dit probleem kan opgevangen worden door meerdere monsters
te nemen op verschillende plaatsen, die dan samengevoegd kunnen worden tot een
mengmonster ofwel elk afzonderlijk onderzocht worden. In dit laatste geval kan de spreiding
van de resultaten een aanwijzing geven voor de verdeling van de contaminatie op grotere
schaal.
Vooral bij het opsporen van zeer lage aantallen van een organisme (vb. Salmonella) is de
homogeniteit van het monster een zeer kritisch punt. Bij een weinig homogeen product is de kans om
die enkele aanwezige bacteriën daadwerkelijk te vinden direct gerelateerd met de kans om het
monster op de ‘verkeerde’ plaats te nemen.
2.1.2.4.2 De monsterbewaring
Ook de bewaring van het monster tussen de monstername en het begin van de analyse is een kritisch
punt. Tijdens de bewaring moet vermenigvuldiging van de organismen verhinderd worden zonder ze
te doden. Het is dan ook uiterst belangrijk om vanaf de monstername tot de analyse de koudeketen
niet te onderbreken bij producten waarin groei mogelijk is; vandaar dat men algemeen stelt dat een
microbiologische analyse binnen de 24 uur na de monstername moet ingezet worden. Om voor de
hand liggende redenen is dit bij gesteriliseerde, diepgevroren of droge producten minder van belang.
2.1.2.4.3 De analyse
De uitvoering van klassieke microbiologische analyses volgt een standaardverloop dat steunt op het
uitvoeren van de standaardtechnieken in een welbepaalde volgorde. Welke technieken gebruikt
worden hangt af van de vraag of men een telling dan wel een detectie wenst uit te voeren.
Bij een telling worden de volgende stappen doorlopen :
• homogeniseren van een hoeveelheid monster (1g, 25g,...) met een hoeveelheid steriele
verdunningsvloeistof – doel : gelijkmatig verspreiden van de cellen in het homogenaat,
• aanleggen van een decimale verdunningsreeks – doel : verkrijgen van een verdunning die
telbare aantallen zal opleveren,
• uitplaten uit de verdunningsreeks van een hoeveelheid op een plaat met een vaste
voedingsbodem. Doel : cellen verspreiden. Deze voedingsbodem kan zowel selectief als nietselectief
zijn, afhankelijk van het gezochte organisme.
• incuberen van de geënte voedingsbodems gedurende een welbepaalde tijd bij een
welbepaalde temperatuur (vb. 48 h bij 37°C) – doel : groei tot vorming van zichtbare kolonies,
• tellen van het aantal (typische) kolonies op de platen,
21

• indien nodig : afpikken van een of meerdere typische kolonies, uitzuiveren en bevestigen dat
ze afkomstig zijn van het gezochte organisme.
• berekenen van het resultaat.
Merk nogmaals op dat bij een telling de uitplating gebeurt kort na de homogenisatie van het monster,
zodat er in de tussentijd geen groei kan optreden.
Bij een detectie zijn de analysestappen de volgende :
• homogeniseren van een hoeveelheid monster met een hoeveelheid steriel niet-selectief
vloeibaar voedingsmedium – doel : gelijkmatig verspreiden van de cellen in het homogenaat.
• incuberen van het voedingsmedium gedurende een welbepaalde tijd bij een welbepaalde
temperatuur (vb. 18 h bij 37°C). Doel : eventueel lichtbeschadigde cellen van het gezochte
organisme de tijd geven om zich te herstellen en te groeien,
• overbrengen van een deel van het geïncubeerde voedingsmedium in een selectief vloeibaar
aanrijkingsmedium. Doel : remmen van andere organismen dan het gezochte bij de
eropvolgende incubatie.
• incuberen van het aanrijkingsmedium gedurende een welbepaalde tijd bij een welbepaalde
temperatuur. Doel : selectieve groei van het gezochte organisme tot grote aantallen.
• uitstrijken uit het aanrijkingsmedium op een of meer platen met een vaste selectieve
voedingsbodem met indicatoren. Hiervoor kunnen platen met verschillende voedingsmedia
gebruikt worden. Doel : ontwikkelen van typische kolonies.
• incuberen van de geënte voedingsbodem gedurende een welbepaalde tijd bij een
welbepaalde temperatuur – doel : groei tot vorming van zichtbare kolonies,
• beoordelen van de platen:
Indien er geen typische kolonies aangetroffen worden, was het gezochte
organisme niet aanwezig in het monster en is de analyse afgelopen. Meedelen
van het resultaat als ‘afwezig in X g monster’.
Indien er wel typische kolonies aangetroffen worden : afpikken van een of
meerdere typische kolonies, uitzuiveren en bevestigen aan de hand van
biochemische of andere testen. Indien het organisme bevestigd wordt : het
resultaat meedelen als ‘aanwezig in X g monster’.
Merk op dat er bij detectie eerst een aanrijking gebeurt en pas daarna een uitplating die de isolatie van
het organisme tot doel heeft. Het oorspronkelijke aantal in het monster is hier van geen belang. Dank
zij de aanrijking kan een zeer klein aantal cellen toch nog gedetecteerd worden (vb. 1 Salmonella in
25g monster).
22

Fig. 4.1.2: Petriplaat met de typische zwarte kolonies van Salmonella die in een later stadium moeten
uitgezuiverd en bevestigd worden.
Voor een correcte uitvoering of interpretatie van een analyse, of het nu een telling dan wel de detectie
van een organisme of een groep micro-organismen betreft, moeten een aantal punten in acht
genomen worden :
• Welke kenmerken bezit het organisme ? Sommige organismen komen voor in groepjes (zoals
Staphylococcus), waarbij het niet altijd eenvoudig is om de homogenisatie van het monster zo
ver te krijgen dat alle groepjes volledig loskomen en men alleen nog individuele cellen
overhoudt. Omdat een groepje cellen ook aanleiding geeft tot een enkele kolonie, is het
resultaat van een telling bij dergelijke organismen altijd een onderschatting van het
werkelijke aantal organismen.
• Wat is de toestand van het organisme in het monster ? Vooral bij producten die een
hittebehandeling ondergaan hebben, zijn de organismen 'gestresseerd' waardoor hun groei
belemmerd wordt, zeker wanneer het voedingsmedium groeiremmende stoffen (bedoeld voor
de concurrenten) bevat. Vandaar dat men bij dergelijke monsters een korte 'recuperatiestap' in
een niet-selectief voedingsmedium inlast vooraleer de eigenlijke analyse aan te vatten.
• Hoe selectief is de voedingsbodem waarop het organisme gekweekt wordt ? Vaak kan er
verwarring ontstaan met verwante organismen die kolonies vormen met ongeveer hetzelfde
uitzicht. Daarom zijn er soms nog bijkomende testen nodig om de aard van de verdachte
kolonie te bevestigen. Zo worden bij het opsporen van Salmonella de verdachte kolonies van
de plaat afgepikt en daarna op voedingsmedia met een andere samenstelling geënt waarop
Salmonella-kolonies een ander uitzicht geven. Wanneer ook deze stap op Salmonella wijst,
kunnen nog een reeks biochemische testen uitgevoerd worden voor een definitieve
bevestiging.
• Welke methode moet er toegepast worden ? Verschillende methodes die 'hetzelfde' bepalen
geven niet noodzakelijk dezelfde resultaten ! Het ene voedingsmedium kan selectiever zijn
dan het andere. Ook kunnen verschillende methodes steunen op een verschillend principe. Zo
kan Salmonella opgespoord worden met een klassieke methode (groei, typische kolonies op
plaat, biochemische reacties) maar ook met een immunologische methode (ELISA) of PCR.
• Precies omwille van het probleem van de vergelijkbaarheid van methodes werden er
internationaal referentiemethodes vastgelegd die geacht worden om het 'juiste' resultaat te
23

geven, wat hier betekent dat ze hetzelfde resultaat geven in verschillende laboratoria. De
alternatieve methodes zijn niet noodzakelijk slechter maar meestal wel sneller.
2.1.2.4.4 Het resultaat
Microbiologische resultaten kunnen op verschillende manieren uitgedrukt worden, afhankelijk van de
gebruikte methode en de manier van bemonsteren.
Detectie
Dit criterium geldt voor pathogene organismen zoals Salmonella en Listeria; meestal eist men de
controle op de afwezigheid in een bepaalde hoeveelheid product (vb. afwezig in 25 g of 25 ml). Het
resultaat wordt dan ook meestal uitgedrukt als 'aanwezig’ of ‘afwezig’ in X g (of ml)' of als '< 1 / X g'.
Tellingen
Bij tellingen wordt een numeriek resultaat vermeld omdat het betreffende organisme of groep
organismen in een bepaalde mate aanwezig mag zijn maar een vastgelegde limiet niet mag
overschrijden (aëroob kiemgetal voor de houdbaarheid, het aantal Staphylococcen voor de kans op
toxinevorming).
Wat men telt zijn kolonievormende eenheden op een plaat – geen cellen.
Een belangrijke voorwaarde voor een telling is dat de kolonies voldoende van elkaar gescheiden zijn
om als afzonderlijke kolonies herkend te worden. Bij te grote aantallen raken de kolonies elkaar of
lopen ze in elkaar, en is telling onmogelijk. Bovendien remmen kolonies die dicht bij elkaar staan
elkaars groei, waardoor de getelde waarden onbetrouwbaar worden.
Omdat de grootte van een plaat beperkt is, is ook het maximale aantal van elkaar gescheiden kolonies
dat men kan tellen beperkt. Afhankelijk van de kenmerken van de kolonies wordt een grens van 150 -
300 kolonies/plaat vastgelegd.
Omdat de tellingen kunnen gebeuren op platen die afkomstig zijn van verschillende verdunningen,
zullen hogere verdunningen minder kolonies bevatten zodat men bij 'ontelbare' platen zijn toevlucht
kan nemen tot platen afkomstig van een hogere verdunning.
Naast een bovengrens van 150 – 300 voor het aantal kolonies is er ook nog een ondergrens. Omdat
de telling van kolonies analoog is met de telling van deeltjes, worden kleine waarden al snel
onbetrouwbaar. Daarom legt men meestal een grens van 10 vast; waarden lager dan 10 zijn te
onbetrouwbaar om als dusdanig door te geven. Indien mogelijk neemt men in dergelijke gevallen zijn
toevlucht tot een lagere verdunning. Alleen wanneer er geen enkele kolonie aangetroffen werd, kan
een resultaat als

Fig. 4.1.3: Het effect van verdunningen op de spreiding en groei van kolonies.
Het uiteindelijke resultaat bij een telling wordt verkregen door het aantal getelde kolonies te
vermenigvuldigen met de verdunningsfactor van de plaat waarop de telling gebeurde, vb. 54
(getelde kolonies) x 10 3 (verdunning van de plaat die geteld werd). Dit resultaat moet dan nog
gereduceerd worden naar de hoeveelheid monster in de startverdunning (vb. in 1 g, in 0,1 g of in 0,01
g).
Bij de interpretatie van het resultaat kan nog het volgende opgemerkt worden :
• de eenheden zijn 'kolonievormende eenheden' (kve of cfu - colony forming units); vaak wordt
dit impliciet verondersteld en duidt men dit niet aan (dus 1200/g i.p.v. 1200 kve/g)
• omdat de telling gebeurde tussen 10 en 150 - 300 kolonies, is het aantal beduidende cijfers in
het resultaat zelden groter dan 2. Een resultaat als 29 356/g is dus klinkklare onzin !
• resultaten kunnen uitgedrukt worden in gewone schrijfwijze (vb. 54 000), in exponentiële vorm
(5,4 x 10 4 of 7,1 x 10 8 ) of logaritmisch (4,7 log, 8,9 log), wat soms handiger is bij zeer grote
aantallen.
• het (on)betrouwbaarheidsinterval van het resultaat is relatief groot. Men kan berekenen
dat in het ideale geval het betrouwbaarheidsinterval van een telling bij 10 kolonies ongeveer
120% bedraagt, bij 150 kolonies ongeveer 33% en bij 300 kolonies ongeveer 23% relatief.
Deze berekeningen houden alleen rekening met de spreiding van de resultaten die afkomstig zijn van
de telling zelf, in de praktijk is die spreiding groter wegens het homogeniseren, het maken van de
verdunningen en de techniek van het uitplaten. Als gevolg hiervan moet men voor de volledige
analyse rekenen op een betrouwbaarheidsinterval van minstens 50% relatief. En zelf 50% is nog
een optimistische waarde, want in de praktijk is de grootste bron van spreiding meestal de
monstername en niet zozeer de analyse !
Eisen van het type n, M, m en c
In bepaalde reglementeringen worden eisen gesteld waarbij een combinatie van criteria in aanmerking
moet genomen worden. De bedoeling hiervan is om een beter idee te krijgen van de verdeling van de
contaminatie en tegelijkertijd een soort waarschuwing in te bouwen.
25

Bij deze eisen worden de criteria voorgesteld door de letters n, M, m en c waarbij n het aantal
afzonderlijke monsters is dat moet genomen worden (meestal 5, soms 10), M een absolute
maximumwaarde is die door geen enkele van de n onderzochte monsters mag overschreden worden,
m een relatieve maximumwaarde is die altijd kleiner is dan M en c het aantal monsters van die n is die
de waarde m mogen overschrijden (maar natuurlijk steeds lager dan M moeten zijn).
Zo is er een eis voor het aantal staphylococcen in rauwmelkse kaas met als waarden n = 5, M =
10000 /g, m = 1000 /g en c = 2. Dit betekent dat er 5 monsters moeten genomen worden, dat geen
enkel ervan meer dan 10000 staphylococcen per gram mag bevatten en dat hoogstens 2 monsters
een waarde tussen 1000/g en 10000/g mogen hebben.
Bij pathogenen worden vaak alleen n en c=0 vermeld, waarbij impliciet M = m = 0 verondersteld wordt
(pathogeen afwezig in alle n monsters).
2.1.2.5 Klassieke en moderne technieken
De hierboven vermelde microbiologische technieken van uitplating op plaat met de ontwikkeling van
typische kolonies worden al tientallen jaren toegepast, vandaar dat ze beschouwd worden als
‘klassieke’ technieken. Een nadeel van de klassiek methodes is de tijdsduur van de analyse, meestal
enkele dagen, die nodig is voor de groei en de bevestiging. Maar ook hier staat de techniek niet stil en
worden er ook nieuwe principes toegepast.
Als belangrijkste evoluties kunnen vermeld worden :
• Een verdere verfijning van de klassieke technieken, vooral door het ontwikkelen van meer
specifieke voedingsmedia die een betere detectie mogelijk maken.
• Zo bestond halverwege de jaren ’80 de detectie van Listeria monocytogenes uit een
langdurige aanrijking in een selectief milieu, gevolgd door uitplaten op een weinig selectieve
voedingsbodem. Na incubatie moesten met een stereomicroscoop met schuine belichting de
typische staalblauwe kolonies van Listeria opgespoord worden. Daarna moesten de verdachte
kolonies uitgezuiverd worden vooraleer er een aantal testen konden op uitgevoerd worden om
het species monocytogenes te identificeren. Tegenwoordig plaat men uit op een
voedingsbodem (ALOA) waarop de kolonies van Listeria monocytogenes direct kunnen
onderscheiden worden van de andere Listeria-species.
• De opkomst van selectieve media gebaseerd op de Inhibigen-techniek. Een molecule
inhibigen bestaat uit twee delen : een specifieke remmer en een substraat. Gekoppeld aan het
substraat is de remmer niet giftig, alleen de micro-organismen die het complex kunnen
opnemen en over de vereiste enzymen beschikken, kunnen de binding van de remmer met
het substraat verbreken. Deze splitsing gebeurt in de cel, de vrijgestelde inhibitor onderbreekt
de synthese van de celwand en veroorzaakt celdood. De vrijgestelde inhibitor kan andere
cellen niet aanvallen, zodat het een gerichte remming betreft. Dit maakt het een aantrekkelijk
alternatief voor antibiotica die gebruikt worden voor de remming van niet gezochte bacteriën.
Het terugvindingsgehalte is op twee manieren verbeterd: door vermindering van de groei van
de competitieve flora en door het minimaliseren van de blootstelling aan mogelijke remmende
stoffen.
• De toepassing van ELISA voor het opsporen van bepaalde pathogenen (VIDAS). Hierbij wordt,
na aanrijking, nagegaan of er in het monster specifieke antigenen afkomstig van een bepaalde
26

pathogeen voorkomen. Dit heeft als grootste voordeel een verkorting van de detectiestap
(bevestiging met een klassieke methode is meestal nog wel nodig voor maximale zekerheid).
• PCR is een techniek die sterk in opkomst is. Hierbij gebeurt de detectie door het opsporen in
het monster van een kenmerkend DNA-fragment afkomstig van een gezocht pathogeen. Als
eerste stap is nog wel een aanrijking nodig om voldoende DNA te krijgen, waarna de gezochte
fragmenten met PCR (Polymerase Chain Reaction) vermenigvuldigd en vervolgens
gedetecteerd worden. Bij een recente variant, de Real-Time PCR, kan de aanwezigheid reeds
tijdens de reactie vastgesteld worden zodat vermenigvuldiging en detectie samenlopen.
Met deze nieuwe methoden kan de analysetijd na de aanrijking soms ingekort worden van dagen naar
uren.
2.1.2.6 Kwaliteitsaspecten bij microbiologische analyses
Bij de kwaliteitsparameters van microbiologische analyses moet een onderscheid worden gemaakt
tussen de parameters die bij de validatie van een methode zullen worden gebruikt en de parameters
die zullen worden gebruikt om de resultaten van een ringanalyse te beoordelen.
De parameters verschillen ook al naargelang het gaat om kwantitatieve analyses (tellingen) of om
kwalitatieve analyses (detectie van pathogene micro-organismen).
2.1.2.6.1 Validatie van een methode
Kwantitatieve methoden
In dit geval moeten de herhaalbaarheid, de reproduceerbaarheid en de juistheid van de methode
worden bepaald. De werkwijze en de gegevensverwerking die hierbij moeten worden toegepast, staan
beschreven in de internationale norm ISO 5725.
De precisie is de mate van overeenstemming tussen de bepalingen die zijn uitgevoerd op
verschillende exemplaren van een homogeen monster. De precisie wordt geraamd op basis van twee
extreme analysesituaties : de herhaalbaarheid en de reproduceerbaarheid.
De herhaalbaarheid is een maat voor de precisie wanneer de bepalingen worden uitgevoerd door
een en dezelfde analist, met hetzelfde instrument (indien van toepassing) met dezelfde methode en
binnen een korte tijdsspanne.
De reproduceerbaarheid is een maat van de precisie wanneer de analyse-omstandigheden
veranderen, er meerdere analisten en/of instrumenten en/of methoden, enz . . . zijn.
De juistheid is de mate van overeenstemming tussen een bepaling en een aanvaarde referentiewaarde
van het monster ; die waarde vloeit voort uit een consensus die steunt op de waarden van
herhaalde bepalingen.
27

Kwalitatieve methoden
De prestaties van een kwalitatieve methode (detectie) worden uitgedrukt in de parameters efficiëntie,
gevoeligheid, specificiteit, percentage vals positieve en percentage vals negatieve resultaten.
De gevoeligheid is de fractie van alle bij de analyse correct toegekende positieve resultaten (=
organisme aanwezig).
De specificiteit is de fractie van alle bij de analyse correct toegekende negatieve resultaten (=
organisme afwezig).
Het percentage vals positieve resultaten is de fractie verkeerdelijk als positief (= aanwezig)
gevonden resultaten.
Het percentage vals negatieve resultaten is de fractie verkeerdelijk als negatief (= afwezig)
gevonden resultaten.
De efficiëntie is de fractie correct toegekende resultaten.
Als de resultaten dus in de volgende vier categorieën worden ingedeeld :
• het aantal vermoedelijk positieve resultaten dat als positief bevestigd is (correct positieve) (a)
• het aantal vermoedelijk negatieve resultaten dat positief blijkt te zijn (vals negatieve) (b)
• het aantal vermoedelijk positieve resultaten dat negatief blijkt te zijn (vals positieve) (c)
• het aantal vermoedelijk negatieve resultaten dat als negatief bevestigd werd (correct
negatieve) (d)
dan verloopt de berekening van de prestatieparameters als volgt :
• gevoeligheid = a/(a+b)
• percentage vals positieve resultaten = a/(a+c)
• specificiteit = d/(a+d)
• percentage vals negatieve resultaten = b/(b+d)
• efficiëntie = a+d/(a+b+c+d)
Er moet echter ook een aantoonbaarheidsgrens worden vastgelegd voor de kwalitatieve analyses,
die voor elk laboratorium specifiek is. De aantoonbaarheidsgrens is het kleinste aantal organismen dat
het laboratorium nog in staat is om met een bepaalde waarschijnlijkheid in een bepaalde matrix aan te
tonen.
2.1.2.6.2 Ringanalyses
De parameters die worden gebruikt om de prestatie van een laboratorium bij een ringanalyse te
omschrijven verschillen al naargelang van de organisatie die de ringanalyse organiseert.
28

Kwantitatieve methoden
De resultaten worden geëvalueerd op precisie en juistheid.
Als precisieparameter wordt de herhaalbaarheid van de in het laboratorium verkregen resultaten
gebruikt. De standaardafwijking van de resultaten van het laboratorium wordt vergeleken met de
standaardafwijking van alle resultaten van de ringanalyse.
De juistheid geeft aan hoe dicht de resultaten van het laboratorium de waarde benaderen die aan de
microbiologische contaminatie van het monster werd toegekend. De Z-score wordt hiervoor het vaakst
gebruikt :
Z-score = (x – X)/s
Waarin: x het resultaat van het laboratorium is
X de toegekende waarde
s de standaardafwijking van alle resultaten van de ringanalyse.
Kwalitatieve methoden
De prestatie van het laboratorium wordt bepaald door de bekwaamheid om de monsters die met de op
te sporen bacterie gecontamineerd zijn, correct te identificeren. De resultaten worden meestal
ingedeeld in de fractie juiste resultaten (efficiëntie), de fractie vals positieve resultaten en de fractie
vals negatieve resultaten.
2.1.3 Overzicht van de belangrijkste microbiologische analyses
Dit deel alinea beoogt een bondig overzicht te geven van de reden of het doel van de verschillende
microbiologische analyses en daarnaast het principe van de analyse bondig te beschrijven.
Men onderscheidt enerzijds micro-organismen die wijzen op een gebrek aan hygiëne zoals het totaal
aantal kiemen of totaal kiemgetal, gisten en schimmels, Enterobacteriaceae, coliformen en
Escherichia coli, en anderzijds pathogene kiemen die voedseltoxi-infecties veroorzaken zoals
coagulase-positieve staphylococcen, Salmonella, Listeria monocytogenes, E. coli O157:H7,
Campylobacter, Bacillus cereus, Clostridium perfringens en C. botulinum, Yersinia enterocolitica en
Vibrio.
2.1.3.1 Totaal kiemgetal of totaal aantal aërobe mesofiele bacteriën
Het totale aantal aërobe mesofiele bacteriën omvat alle micro-organismen die zichtbare kolonies
kunnen vormen na een incubatie van 3 dagen bij 30°C op een vaste bodem van het type Plate Count
Agar (PCA). Het totaal kiemgetal geeft een aanwijzing omtrent de gezondheid en de kwaliteit van het
product. In technologisch opzicht wijst een hoog kiemgetal op een groot risico voor microbieel bederf.
In hygiënisch opzicht bestaat er geen nauwe correlatie tussen de omvang van de totale flora en de
aanwezigheid van pathogene micro-organismen. Het totaal kiemgetal bepalen is nog steeds de beste
methode om de algemene microbiologische kwaliteit van een product te beoordelen.
29

2.1.3.1.1 Analyse
De procedure voor de bepaling van het totaal kiemgetal verloopt als volgt (ISO 4833: 2003):
• afwegen van een hoeveelheid monster, overbrengen in verdunningsvloeistof en
homogeniseren,
• aanmaken van een decimale verdunningsreeks,
• van elke verdunning 1 ml in een petriplaat brengen, er een hoeveelheid gesmolten Plate
Count Agar (PCA) aan toevoegen, mengen en de bodem laten stollen,
• incuberen bij 30°C gedurende 72 uur,
• alle zichtbare kolonies tellen,
• het aantal cfu’s berekenen uit het getelde aantal kolonies, rekening houdend met de gemaakte
verdunningen.
Figuur 4.1.4 Petriplaat met PCA
30

2.1.3.1.2 Analyseschema: Bepaling van het totaal kiemgetal
Monstervoorbereiding
Incubatie
Telling
Vloeibaar monster of primaire
verdunning
(monstername x g of ml in 9x ml
verdunningsvloeistof)
Aanmaken decimale verdunningsreeks in tryptoon zoutoplossing
Enting van gietplaten PC(M)A met 1ml
(1 plaat per verdunning)
Incubatie 72±3h; 30±1°C
Telling van alle kolonies
31

2.1.3.2 Gisten en schimmels
Schimmels veroorzaken een – vaak alleen maar oppervlakkige - aantasting van levensmiddelen
waardoor het uitzicht dermate kan veranderen dat de goederen in waarde dalen of onverkoopbaar
worden. Soms houden zij een gevaar in voor de consument wanneer het schimmels betreft die
mycotoxines kunnen produceren.
Gisten kunnen tijdens hun groei eveneens ongewenste veranderingen in het product veroorzaken
zoals troebelheid (gistcellen), abnormale geur of smaak e.d. waarbij de verpakking vaak uitzet.
Gisten en schimmels worden dus niet opgespoord vanuit een hygiënisch standpunt. Technologisch
kunnen zij echter tot aanzienlijke verliezen aanleiding geven.
2.1.3.2.1 Analyse
De procedure voor het tellen van gisten en schimmels is als volgt (ISO 21527-1 en 2: 2008):
• afwegen van een hoeveelheid monster, overbrengen in verdunningsvloeistof en
homogeniseren,
• aanmaken van een decimale verdunningsreeks indien vereist,
• van elke verdunning 0.1 ml op het oppervlak van een plaat Dichloran Bengaalroze
Chlooramfenicol (DRBC) brengen voor stalen met een wateractiviteit (aw) groter dan 0,95 of
op een plaat Dichloran Glycerol (DG18) voor monsters met een aw

2.1.3.2.2 Analyseschema : Bepaling van het aantal gisten en schimmels
Telling
Vloeibaar monster of primaire
verdunning
(monstername x g of ml in 9x ml
EPT 0.1 %)
Aanmaken decimale verdunningsreeks in tryptoon zoutoplossing
*
Enting van het oppervlak van
DRBC (producten met een aw > 0.95)
DG18 (producten met een aw ≤ 0.95)
Incubatie 5 dagen: 25 +/- 1 C***
Telling van alle kolonies **
* de platen worden gecontroleerd na 3 en 4 dagen incubatie
** gisten: kolonies die meestal een regelmatige vorm hebben en een min of meer convex oppervlak
schimmels: platte of pluizelige kolonies of kolonies met gekleurde vruchtlichamen en
sporulatievormen
*** omringen van petriplaten met petrifilm ; platen rechtop incuberen
33

2.1.3.3 Enterobacteriaceae
De naam Enterobacteriaceae verwijst naar het feit dat deze bacteriën meestal normale of met
ziekteverschijnselen samenhangende gasten zijn in het spijsverteringskanaal van mensen en dieren.
Zij vormen zowel naar kwantiteit als naar kwaliteit een van de belangrijkste bacteriënfamilies. Onder
meer de coliformen, en meer bepaald Escherichia coli, maar ook pathogene kiemen zoals Salmonella,
enterotoxische Escherichia coli, Shigella of Yersinia, en veel andere bacteriën behoren tot deze
familie. Men spoort ze op om de gezondheidskwaliteit van levensmiddelen te kunnen bepalen.
2.1.3.3.1 Analyse
De procedure voor het tellen van Enterobacteriaceae is als volgt (ISO 2158-2:2004)
• afwegen van een hoeveelheid monster, overbrengen in verdunningsvloeistof en
homogeniseren,
• aanmaken van een decimale verdunningsreeks,
• van elke verdunning 1 ml in een petriplaat brengen, er een hoeveelheid gesmolten Violet Red
Bile Glucose Agar (VRBG) aan toevoegen, mengen en de bodem laten stollen. Daarna een
bijkomend laagje VRBG-agar aanbrengen om de geënte bodem af te sluiten van de lucht
(anaëroob milieu) en zo de groei van sommige stoorflora te remmen.
• incuberen bij 30°C gedurende 24 uur,
• de typische rood-paarse kolonies met een diameter van 0,5 mm of meer, soms omringd door
een rood-paarse neerslagzone tellen evenals de niet-typische kleurloze kolonies. Voer, indien
twijfel bestaat, een oxidasetest uit op de kolonie (Enterobacteriaceae zijn oxidase-negatief),
• het aantal cfu’s berekenen uit het getelde aantal kolonies, rekening houdend met de gemaakte
verdunningen.
Figuur 4.1.6 VRBG petriplaat
34

2.1.3.3.2 Analyseschema : Bepaling van het aantal Enterobacteriaceae
Telling Monstervoorbereiding
Incubatie
Bevestiging
Vloeibaar monster of primaire
verdunning
(monstername x g of ml in 9x ml
verdunningsvloeistof)
Aanmaken decimale verdunningsreeks in tryptoon zoutoplossing
Enting van gietplaten VRBG met 1ml
(1 plaat per verdunning)
Incubatie 24±2h; 30±1°C
semi-anaëroob
Oxidase test
* voor swabs: + 100ml verdunningsvloeistof
** 5 kolonies afpikken of alle indien < 5 aanwezig
Telling van de verdachte kolonies
**
Nutriënt-agar
Incubatie 24±2h; 37±1°C
Indien
oxidase
negatief
Fermentatie test
Incubatie 24±2h; 37±1°C
*
35

2.1.3.4 Coliformen en Escherichia coli
Om een contaminatie aan te tonen kan men ofwel meteen de pathogene soorten opsporen of, wat
soms gemakkelijker en/of sneller is of een betere gevoeligheid oplevert, een verwante soort of groep
soorten opsporen. Die soort of groep geldt dan als een aanwijzing voor mogelijke besmetting met het
pathogeen. Coliformen en Escherichia coli zijn micro-organismen die normaal in de ingewanden van
mensen en dieren leven. Zij worden dan ook opgespoord als een aanwijzing voor fecale contaminatie.
Door deze indicatoren te bewaken kan de naleving van de hygiënenormen in de volledige keten van
de productie worden nagegaan.
2.1.3.4.1 Analyse coliformen
De procedure voor het tellen van coliformen verloopt als volgt (ISO 4832: 1991) :
• afwegen van een hoeveelheid monster, overbrengen in verdunningsvloeistof en
homogeniseren,
• eventueel aanmaken van een decimale verdunningsreeks (indien hoge waarden verwacht
worden),
• 1 ml monster of verdunning in een petriplaat brengen, er een hoeveelheid gesmolten violet
red bile lactose agar (VRBL) aan toevoegen, mengen en de bodem laten stollen. Daarna een
bijkomend laagje VRBL-agar aanbrengen om de geënte bodem af te sluiten van de lucht
(semi-anaëroob milieu) en zo de groei van sommige stoorflora te remmen.
• incuberen bij 30°C gedurende 24 uur,
• de violet- of purperkleurige kolonies met een diameter van 0,5 mm of meer tellen,
• bevestiging : selecteren van vijf kolonies van elk type en enten in lactose broth met briljant
groen, incuberen bij 30 ° C gedurende 24 uur, kolonies waarbij er gasvorming te zien is in de
Durham buisjes, worden beschouwd als coliformen
• het aantal cfu’s berekenen uit het getelde aantal kolonies, rekening houdend met de gemaakte
verdunningen.
Figuur 4.1.7 VRBL petriplaat
36

2.1.3.4.2 Analyse E. coli
Voor het tellen van E. coli wordt de volgende werkwijze toegepast (AFNOR BRD-07/1-07/93):
• afwegen van een hoeveelheid monster, overbrengen in verdunningsvloeistof en
homogeniseren,
• eventueel aanmaken van een decimale verdunningsreeks (indien hoge waarden verwacht
worden),
• 1 ml monster of verdunning in een petriplaat brengen, er een hoeveelheid gesmolten selectief
chromogeen agarmedium aan toevoegen, mengen en de bodem laten stollen.
• incuberen bij 44°C gedurende 24 uur,
• de purpergekleurde kolonies tellen,
• het aantal cfu’s berekenen uit het getelde aantal kolonies, rekening houdend met de gemaakte
verdunningen.
Figuur 4.1.8 Petriplaat RAPID’ E.coli 2
37

2.1.3.4.3 Analyseschema : Bepaling van het aantal E. coli
Monstervoorbereiding
Incubatie
Telling
Bijlage : Schema werkwijze – Telling van Escherichia coli
Vloeibaar monster of primaire
verdunning (monstername x g of ml
in 9x ml verdunningsvloeistof)
Aanmaken decimale verdunningsreeks in tryptoon zoutoplossing
Enting van RAPID’E coli 2 medium met 1 ml
(1 plaat per verdunning)
Incubatie 24±2h; 44±1°C
Telling van de roze-violet kolonies
38

2.1.3.5 Coagulase-positieve staphylococcen
Terwijl Salmonella de voornaamste overbrenger van voedseltoxi-infecties is, komen staphylococcen al
naargelang het jaar op de tweede of de derde plaats. Gelet op de betrekkelijk onschuldige symptomen
die ze veroorzaken, is het vrij waarschijnlijk dat het aantal intoxicaties door staphylococcen ruim wordt
onderschat. De ziekteverschijnselen bij een voedselvergiftiging door staphylococcen worden vooral
veroorzaakt door de toxines die deze organismen produceren.
Contaminatie met Staphylococcus aureus is afkomstig van twee bronnen : dieren (uierontstekingen)
en mensen. Deze kiem komt voor in de flora van huid en slijmvliezen; stammen van S. aureus van
verschillende oorsprong kunnen rauwe levensmiddelen besmetten. Omdat ze warmtegevoelig zijn,
worden ze meestal vernietigd wanneer het voedsel wordt gepasteuriseerd of verhit (de toxines zijn
echter tamelijk hitteresistent).
De aanwezigheid van S. aureus in verhit en na verhitting verder verwerkt voedsel wijst veeleer op een
contaminatie van menselijke oorsprong. Het contaminatieniveau is meestal laag maar als het voedsel
wordt bewaard in omstandigheden die gunstig zijn voor de groei en de productie van toxinen, kan een
hoeveelheid enterotoxinen worden aangemaakt die groot genoeg is om enterotoxicose te
veroorzaken.
Een belangrijk criterium bij het opsporen van S. aureus is de aanwezigheid van coagulase, een enzym
dat de eerste stap van de bloedstolling in gang zet. Afwezigheid van coagulase impliceert dat de stam
geen S. aureus kan zijn.
2.1.3.5.1 Analyse
Voor het tellen van het aantal coagulase-positieve staphylococcen wordt de volgende werkwijze
toegepast (ISO 6888 –2 :1999):
• afwegen van een hoeveelheid monster, overbrengen in verdunningsvloeistof en
homogeniseren,
• eventueel aanmaken van een decimale verdunningsreeks (indien hoge waarden verwacht
worden),
• 1 ml monster of verdunning in een petriplaat brengen, er een hoeveelheid gesmolten selectief
agarmedium (Baird-Parker-telluriet met Rabbit Plasma Fibrinogeen supplement) aan
toevoegen, mengen en de bodem laten stollen.
• incuberen bij 37°C gedurende 24 uur en, indien nodig, gedurende nog eens 24 uur,
• tellen van het aantal typische kolonies : zwart-grijze kolonies omringd door een melkwitte of
troebele zone,
• in geval van twijfel : verdachte kolonies bevestigen met een coagulasetest,
• het aantal cfu’s berekenen uit het getelde aantal kolonies, rekening houdend met de gemaakte
verdunningen.
39

Figuur 4.1.9 Petriplaat Baird-Parker
40

2.1.3.5.2 Analyseschema: Bepaling van het aantal coagulase-positieve staphylococcen
Monstervoorbereiding
Incubatie
Telling
Vloeibaar monster of
primaire verdunning
(monstername x g of ml in 9x
ml verdunningsvloeistof)
Aanmaken decimale verdunningsreeks in tryptoon zoutoplossing
Enting van gietplaten BP + RPF met 1ml
(1 plaat per verdunning)
Incubatie 24±2h; 37±1°C *
Telling van grijs-zwarte kolonies omgeven door een halo
* Indien geen typische kolonies aanwezig zijn, de platen nog eens 24h incuberen
41

2.1.3.6 Salmonella
Salmonella is de belangrijkste oorzaak van voedseltoxi-infecties. Salmonella behoort tot de
Enterobacteriaceae en is afkomstig uit het spijsverteringsstelsel van warmbloedige dieren. De
aanwezigheid kan meestal worden verklaard door een besmetting van fecale oorsprong door
individuen die ziek of drager zijn. Salmonella kan zich gedurende min of meer lange tijd handhaven
buiten het fecale materiaal en kan zo water en levensmiddelen besmetten.
2.1.3.6.1 Analyse
De detectie van Salmonella volgens ISO 6579:2002 verloopt als volgt :
• afwegen van een hoeveelheid monster, overbrengen in gebufferd peptonwater en
homogeniseren,
• niet-selectieve vooraanrijking door incuberen bij 37°C gedurende 18 uur,
• daarna een parallelle selectieve aanrijking in twee verschillende vloeibare media :
o ml vooraangerijkte cultuur overbrengen in Rappaport Vassiliadis bouillon met
soja (RVS) en gedurende 24 uur incuberen bij 41,5°C,
o ml vooraangerijkte cultuur overbrengen in Muller-Kauffmann Tetrathionaat
novobiocine bouillon (MKTTn) en gedurende 24 uur incuberen bij 37°C,
• isolatie vanuit elke selectieve aanrijking (RVS en MKTTn) op twee verschillende agarmedia
(Xylose Lysine Deoxycholaat agar, XLD, en Brilliance Salmonella), door uitstrijken met behulp
van een entnaald, gevolgd door incubatie gedurende 24 uur bij 37°C,
• indien op deze agarmedia kolonies aangetroffen worden met het typische uitzicht van
Salmonella (zwarte kolonies of rode kolonies met een zwart centrum op XLD, paarse kolonies
op Brilliance Salmonella) dan de bevestiging uitvoeren door afpikken van enkele typische
kolonies, uitplaten op Nutrient Agar (NA) en incuberen gedurende 24 uur bij 37°C, gevolgd
door het uitvoeren van een aantal biochemische testen (de API-galerij) om te bevestigen dat
het gevonden organisme inderdaad Salmonella is.
De detectie van Salmonella met PCR volgens AFNOR iQ-Check Salmonella II (BRD 07/06-07/04
verloopt als volgt :
• afwegen van een hoeveelheid monster, overbrengen in gebufferd peptonwater en
homogeniseren,
• niet-selectieve vooraanrijking door incuberen bij 37°C gedurende 21 uur
• selectieve aanrijking op twee media en uitvoering van PCR:
o 0.1 ml vooraangerijkte cultuur overbrengen in Rappaport Vassiliadis broth met soja
(RVS) en gedurende 24 uur incuberen bij 41,5°C,
o 1 ml vooraangerijkte cultuur overbrengen in Muller-Kauffmann broth (MKTTn) en
gedurende 24 uur incuberen bij 37°C
o Extractie van het DNA van 100 µl vooraangerijkte cultuur met 100 µl lysereagens,
42

o incuberen gedurende 10 min bij 95-100 °C, centrifugeren, 5 µl van het supernatans
nemen, 45 µl PCR mix toevoegen en de screening met PCR uitvoeren
• isolatie vanuit elke selectieve aanrijking (RVS en MKTTn) op twee verschillende agarmedia
(Xylose Lysine Deoxycholaat agar, XLD, en Brilliance Salmonella), door uitstrijken met behulp
van een entnaald, gevolgd door incubatie gedurende 24 uur bij 37°C,
• indien op deze agarmedia kolonies aangetroffen worden met het typische uitzicht van
Salmonella (zwarte kolonies of rode kolonies met een zwart centrum op XLD, paarse kolonies
op Brilliance Salmonella), de bevestiging uitvoeren door het afpikken van enkele typische
kolonies, ze uitplaten op Nutrient Agar (NA), incuberen gedurende 24 uur bij 37°C, gevolgd
door het uitvoeren van een aantal biochemische testen (de API-galerij) om te bevestigen dat
de gevonden bacterie inderdaad Salmonella is.
Figuur 4.1.10 Petriplaat XLD
43

2.1.3.6.2 Analyseschema : Detectie van Salmonella spp.
Monstervoorbereiding
Aanrijking
Isolatie
Bevestiging
Bijlage : Schema werkwijze – Detectie van Salmonella spp.
0.1ml cultuur + 10ml RVS
broth
Incubatie 24±3h; 41.5±1°C
XLD
Incubatie 24±3h;
37±1°C
**
Als API 20E en
een
agglutinatietest
positief is
Monstername x g
+
9x ml gebufferd peptoonwater *
Incubatie 18±2h; 37±1°C
OSCMII
Incubatie 24±3h;
37±1°C
API 20E
Incubatie 18-24 h; 37±1°C
Nutriënt-agar
Incubatie 24±2h; 37±1°C
1ml cultuur + 10ml MKTTn
broth
Incubatie 24±3h; 37±1°C
XLD
Incubatie 24±3h;
37±1°C
Agglutinatietesten
Bepalen van het serotype
en indien van toepassing faagtypering en
bepaling van antibioticaresistentie bij het W.I.V.
OSCMII
Incubatie 24±3h;
37±1°C
* Voor swabs : + 100ml gebufferd peptoonwater
** 1 typische kolonie van één medium en als deze niet bevestigd wordt, 4 bijkomende kolonies
bevestigen
44

2.1.3.6.3 Analyseschema: Detectie van Salmonella spp. met PCR
Monstervoorbereiding
DNA extractie
PCR
Aanrijking
Isolatie
Bevestiging
Bijlage : Schema werkwijze – Detectie van Salmonella spp. (PCR methode)
0.1ml cultuur + 10ml RVS broth
Incubatie 24±3h; 41.5±1°C
XLD
Incubatie 24±3h;
37±1°C
Als API 20E en
de
agglutinatietest
positief is
***
****
API 20E
Incubatie 18±3h; 37±1°C
Monstername x g of ml
+
9x ml gebufferd peptoonwater *
Incubatie 21±1h; 37±1°C
100 µl + 100 µl lyse reagens
Voorzie een blanco staal (100 µl steriel water)
Vortex
Incubeer 10 min bij 95-100 °C
Vortex
Centrifugeer 2’ bij 10000-12000 rpm
45 µl PCR mix per well **
+ 5 µl supernatans
Sluit de wells af
Screening met PCR
Brilliance Salmonella
Incubatie 24±3h;
37±1°C
Nutriënt-agar
Incubatie 24±2h; 37±1°C
1ml cultuur + 10ml MKTTn broth
Incubatie 24±3h; 37±1°C
XLD
Incubatie 24±3h;
37±1°C
Agglutinatietesten
Bepalen van het serotype
en indien van toepassing faagtypering en
bepaling van antibioticaresistentie bij het W.I.V.
Brilliance Salmonella
Incubatie 24±3h;
37±1°C
* Voor swabs : + 100ml gebufferd peptoonwater
** Voorbereiding PCR mix: reagens C (amplificatiemix) + reagens B (fluorescente probes). Aan te maken in
functie van het aantal stalen en controles (1 positieve controle en 1 negatieve controle per reeks)
*** Indien PCR positief
**** 1 typische kolonie van één medium en als deze niet bevestigd wordt, 4 bijkomende kolonies
bevestigen
***
45

2.1.3.7 Listeria monocytogenes
Zeer veel levensmiddelen kunnen met Listeria monocytogenes gecontamineerd zijn: plantaardige
producten, melk en melkproducten, geslacht pluimvee, varkensvlees, rundvlees, schapenvlees,
vleesproducten, vis en visproducten, schelp- en schaaldieren. Een met L. monocytogenes besmet
levensmiddel is niet altijd gevaarlijk; zo blijkt dat de meeste gevallen van listeriose bij mensen te wijten
zijn aan levensmiddelen die meer dan 100 cellen L. monocytogenes per gram of per milliliter bevatten.
De gevoeligste producten zijn die welke de groei van Listeria kunnen bevorderen, een lange
levensduur hebben en onverhit kunnen worden gegeten. Een van de belangrijkste problemen met L.
monocytogenes is dat het organisme zich nog bij temperaturen van om en bij het vriespunt kan
ontwikkelen.
2.1.3.7.1 Analyse
De detectie van L. monocytogenes verloopt als volgt (ISO 11290-2 : 1998 deel 1):
• afwegen van een hoeveelheid monster, overbrengen in een vloeibaar medium met een
verlaagde concentratie aan selectieve componenten (Half Fraser Broth) en homogeniseren,
• half-selectieve vooraanrijking door incuberen bij 30°C gedurende 24 uur,
• daarna uit de vooraanrijking 0.1 ml overbrengen in hetzelfde medium met de volledige
concentratie aan selectieve componenten (Fraser Broth i.p.v. Half Fraser Broth) en gedurende
48 uur incuberen bij 37°C,
• isolatie vanuit zowel de vooraanrijking in Half-Fraser als vanuit de selectieve aanrijking in
Fraser naar ALOA-agar (Agar Listeria Ottaviani & Agosti) door uitstrijken met behulp van een
entnaald, gevolgd door incubatie gedurende 24 uur bij 37°C.
• indien op ALOA kolonies aangetroffen worden met het typische uitzicht van L. monocytogenes
(1-2 mm groot, lichtblauw gekleurd en met een heldere halo) dan de bevestiging uitvoeren
door afpikken van enkele typische kolonies, uitplaten op Tryptone Soy Yeast Extract Agar
(TSYEA), incuberen gedurende 24 uur bij 37°C gevolgd door het uitvoeren van een
hemolysetest, een CAMP test en een aantal biochemische testen (de API-galerij) om te
bevestigen dat het gevonden organisme inderdaad L. monocytogenes is.
De telling van L. monocytogenes verloopt als volgt ( ISO 11290-2 : 1998 deel 2) :
• afwegen van een hoeveelheid monster, overbrengen in gebufferd peptonwater en
homogeniseren,
• een uur incuberen bij 20°C om de gestresseerde organismen de tijd te geven om te
recupereren,
• 1 ml van de verdunning verdelen over het oppervlak van 3 selectieve isolatieplaten (ALOA) en
0.1 ml op 1 petriplaat brengen en gedurende 48 u incuberen bij 37 °C.
• tellen van het aantal kolonies op ALOA met het typische uitzicht van L. monocytogenes (1-2
mm groot, lichtblauw gekleurd en met een heldere halo). Indien dergelijke kolonies
aangetroffen worden, dan de bevestiging uitvoeren door afpikken van enkele typische
kolonies, uitplaten op Tryptone Soy Yeast Extract Agar (TSYEA), incuberen gedurende 24 uur
bij 37°C gevolgd door het uitvoeren van microscopisch onderzoek en een aantal
46

iochemische testen (de API-galerij) om te bevestigen dat het gevonden organisme inderdaad
L. monocytogenes is.
• indien bevestigd wordt dat de afgepikte kolonies inderdaad L. monocytogenes zijn, dan het
aantal cfu’s berekenen uit het getelde aantal kolonies, rekening houdend met de gemaakte
verdunningen.
Detectie van L. monocytogenes met de VIDAS methode (VIDAS LMO2 - AFNOR gevalideerd Nr BIO-
12/11-03/04) :
• een hoeveelheid monster afwegen en overbrengen in een vloeibaar medium met een lage
concentratie aan selectieve componenten (Half-Fraser broth) en mengen,
• semi-selectieve vooraanrijking door te incuberen bij 30 °C gedurende 24 uur,
• secundaire aanrijking, overbrengen van 0,1 ml van de vooraangerijkte cultuur in een
selectieve broth met volledige concentratie in selectieve agentia (Fraser) en 48 uur incuberen
bij 37 °C,
• enzym immunoassay voor het opsporen van antigenen van Listeria monocytogenes met het
geautomatiseerde Vidas systeem,
• bevestiging van positieve resultaten door uitplaten op ALOA en RAPID'L.Mono (RLM).
Figuur 4.1.11 Tubes Fraser en half-Fraser broth
Figuur 4.1.12 ALOA petriplaat
47

2.1.3.7.2 Analyseschema: Bepaling van het aantal Listeria monocytogenes
Bijlage : Schema werkwijze – Bepaling van het aantal Listeria monocytogenes
Monstervoorbereiding
Vloeibaar monster of primaire
nalyseschema 4.1.9 : Detectie van Listeria monocytogenes verdunning met de Vidas-methode
(monstername x g in 9x ml
verdunningsvloeistof)
Incubatie
Telling
Bevestiging
Hemolyse-test
Incubatie 24±2h
37±1°C
Enting van ALOA strijkplaten
(1ml verdeeld over drie platen en 0.1ml over een
plaat)
Incubatie 48±2h; 37±1°C
Telling van verdachte kolonies
TSYEA
Incubatie 24±2h; 37±1°C
**
Serotypering door W.I.V.
API Listeria
Incubatie 18-24 h
37±1°C
* 1 typische kolonie van elke platenreeks en als deze niet bevestigd wordt, 4 bijkomende kolonies bevestigen
** de CAMP test wordt enkel uitgevoerd bij twijfelachtig API test resultaat (L. mono/ivanovii of L. mono/innocua)
*
Bloed agar (Camp test)
Incubatie 18-24 h
37±1°C
Als de
bevestigingstesten
positief zijn
48

2.1.3.7.3 Analyseschema: Detectie van Listeria monocytogenes met de Vidas-methode
Bijlage : Schema werkwijze – Detectie van Listeria monocytogenes met de Vidas-methode
monstername x g (of ml)
+ 9x ml Half-Fraser broth
Incubatie 24-26 h; 30±1°C
0.1 ml cultuur + 10 ml Fraser broth
Incubatie 24-26h; 37±1°C
500 µl in strip Vidas LM02
Screening met Vidas
een öse vanuit de Fraser broth enten op ALOA en
RLM
Incubatie 24±2h; 37±1°C
Als é én van
de twee
positief is
Serotypering door W.I.V.
Resultaat VIDAS Resultaat ALOA Resultaat RLM Interpretatie
-
Afwezig
+ + + Aanwezig
+ + - Aanwezig
+ - + Aanwezig
+ - - Afwezig
Indien Vidas
positi ef
49

2.1.3.8 E. coli O157 :H7
Tot het species E. coli behoren ook stammen die cytotoxines kunnen aanmaken, nl. verotoxine of
verocytoxine (VTEC). Maar niet alle VTEC-producerende stammen zijn voor mens ziekteverwekkend.
Het vaakst voorkomende en meest pathogene serotype is O157:H7 of enterohemorragisch E. coli. De
code O157:H7 verwijst naar specifieke antigenen op de celwand en flagella van de bacterie. Net als
bij de andere E. coli gaat het om een fecale bacterie die vooral wordt overgedragen door
gecontamineerd voedsel, vooral (rund-)vlees, rauwe melk en levensmiddelen die onvoldoende verhit
zijn. Een andere besmettingsbron is water, vooral zwembadwater.
2.1.3.8.1 Analyse
De detectie van E. coli O157:H7 verloopt als volgt :
• afwegen van een hoeveelheid monster, overbrengen in het vloeibare aanrijkingsmedium
Tryptone Soy Broth (TSB) en homogeniseren,
• vooraanrijking door incuberen bij 41,5°C gedurende 7 uur,
• uit de vooraanrijking 1 ml overbrengen in het vloeibaar selectief medium CT-MAC (Cefixime
Telluriet MacConkey) en gedurende 18 uur incuberen bij 37°C,
• hierna kan men ofwel op een hoeveelheid selectief medium CT-MAC een ELISA uitvoeren
(immunologische detectie van O157:H7, VIDAS), waarbij men bij een positief resultaat een
immunoconcentratie uitvoert om een hogere concentratie aan cellen van E. coli O157:H7 te
verkrijgen, ofwel kan men direct vanuit CT-MAC een concentratie met immunomagnetische
beads uitvoeren met hetzelfde doel,
• het concentraat wordt uitgeplaat op CT-SMAC (= CT-MAC met toevoeging van sorbitol) en op
een chromogeen medium, gevolgd door incubatie gedurende 24 uur bij 37°C.
• indien op CT-SMAC of het chromogeen medium kolonies aangetroffen worden met het
typische uitzicht (kleurloos, soms bruinachtig, diameter > 1 mm op CT-SMAC, purper,
diameter > 1 mm op chomogeen medium) dan de bevestiging uitvoeren door afpikken van
enkele typische kolonies, uitplaten op Nutrient Agar, incuberen gedurende 24 uur bij 37°C
gevolgd door het uitvoeren van een aantal biochemische testen (de API-galerij,
agglutinatietest) om te bevestigen dat het gevonden organisme inderdaad E. coli O157:H7 is.
Figuur 4.1.13 Petriplaat CT-SMAC
50

2.1.3.8.2 Analyseschema: Detectie van E. coli O157 met de Vidas-methode
Vooraanrijking
Aanrijking
Screening
Isolatie
Bevestiging
g
in
n
rijk
a
A
g
in
n
e
c
re
S
CT-SMAC
Incubatie CT-SMAC 21±3h; 37±1°C
Incubatie 21 3h; 37 1 C
Indien agglutinatie
Indien positief
agglutinatie
positi ef
monstername
x x g g (of (of ml) ml) * *
+ +
9x 9x ml ml mTSB (acriflavine of of
novobiocine) novobiocine)
Incubatie 6-7h; 6-7h; 41.5±1°C 41.5 1 C
1ml 1ml cultuur cultuur
+ +
9ml
9ml
CT-MAC
CT-MAC
Incubatie
Incubatie
18±1h;
18 1h;
37±1°C
37 1 C
1 ml cultuur
1 ml cultuur
15min;
15min;
100°C
100°C
500µl in strip Vidas ECO
500µl in strip Vidas ECO
Screening met Vidas
Screening met Vidas
500µl in strip Vidas ICE
500µl in s trip Vidas ICE
Immuno-concentratie met Vidas
Immuno-concentratie met Vidas
** Nutrient-agar **
** 24±2h; Nutrient-agar 37±1°C **
24 2h; 37 1 C
Bevestigingstest API 20E
Incubatie Bevestigingstest 18-24 h; 37±1°C API 20E
Incubatie 18-24 h; 37 1 C
Agglutinatietest
Agglutinatietest
Bepalen van virulentiefactoren bij AZ-VUB
Bepalen van virulentiefactoren bij AZ-VUB
Indieni Vidas positief
Indieni Vidas positief
CHROMagar O157
Incubatie CHROMagar 21±3h; 37±1°C O157
Incubatie 21 3h; 37 1 C
Indien API positief
Indien API positief
* Voor swabs: + 100ml m-TSB (novobiocine)
** 1 typische kolonie en * als Voor deze swabs: niet bevestigd + 100ml m-TSB wordt, 4 (novobiocine) bijkomende kolonies bevestigen
** 1 typische kolonie en als deze niet bevesti gd wordt, 4 bijkomende kolonies bevestigen
51

2.1.3.9 Campylobacter
De aanwezigheid van Campylobacter in levensmiddelen wijst op een fecale besmetting aangezien
deze kiem alleen leeft in het spijsverteringsstelsel van mensen en dieren. De contaminatie gebeurt
door contact tussen levensmiddelen en mensen die ziek of drager zijn. Melkproducten, gevogelte en,
in mindere mate, vlees zijn de levensmiddelen die het grootste risico leveren voor
campylobacteriosen. De belangrijkste oorzaken van aan Campylobacter te wijten voedseltoxi-infecties
zijn het eten van rauw of onvoldoende verhit voedsel en kruiscontaminatie. In ontwikkelingslanden
gebeurt het echter niet zelden dat epidemieën worden veroorzaakt door het drinken van verontreinigd
water.
2.1.3.9.1 Analyse
De detectie van Campylobacter verloopt als volgt (ISO 10272-1:2006) :
• afwegen van een hoeveelheid monster, overbrengen in een selectief vloeibaar medium
(Bolton Broth) en homogeniseren. Zoveel mogelijk lucht verwijderen uit de zak met het geënte
aanrijkingsmedium (micro-aërofiele omstandigheden).
• eerste stap van de vooraanrijking door incuberen bij 37°C gedurende 4 tot 6 uur,
• tweede stap van de vooraanrijking door incuberen bij 41,5°C gedurende 44 uur,
• isolatie vanuit de vooraanrijking naar twee verschillende agarbodems : mCCDA (modified
charcoal cefoperazone deoxycholaat agar) en een chromogene agar door uitstrijken met
behulp van een entnaald, gevolgd door incubatie onder micro-aërofiele condities gedurende
44 uur bij 41,5°C.
• indien er op de platen kolonies aangetroffen worden met het typische uitzicht van
Campylobacter (grijs, vlak, vochtig met neiging tot spreiden op mCCDA, klein, dieprood tot
oranjerood, soms met een metallische schijn op chromogene agar) dan de bevestiging
uitvoeren door afpikken van enkele typische kolonies, uitstrijken op Columbia bloedagar en
incuberen onder micro-aërofiele condities gedurende 24 tot 48 uur bij 41,5°C.
• uitvoeren van bevestigende testen op de typische donkergrijze kolonies op Columbia
bloedagar : microscopisch onderzoek, mobiliteitstest, groeitest bij 25 °C (micro-aërofiel) en bij
41,5 °C (aëroob) en een oxidasetest. Uitvoeren van een aantal biochemische testen (de APIgalerij)
om te bevestigen dat het gevonden organisme inderdaad Campylobacter is.
Bepaling van het aantal Campylobacter (ISO 10272-2 : 2006) :
• afwegen van een hoeveelheid monster, in gebufferd peptonwater brengen en homogeniseren
• 1 ml van de verdunning op het oppervlak van 3 selectieve isolatieplaten brengen (mCCDA),
0,1 ml van de verdunning op 1 plaat brengen en incuberen gedurende 44 h bij 41,5 °C
• telling van de verdachte kolonies
• bevestiging van verdachte kolonies door microscopie (morfologie en karakteristieke
beweging), groei op Columbia bloedagar onder micro-aërobe omstandigheden bij 25 °C en
aëroob bij 41,5 °C, gevolgd door een oxidasetest
52

Figuur 4.1.14 Petriplaat Columbia agar
53

2.1.3.9.2 Analyseschema: Detectie van Campylobacter spp.
(Voor-)aanrijking
Isolatie
Bevestiging
Bijlage: Schema werkwijze - Detectie van Campylobacter spp.
mCCDA
Incubatie 44±4h; 41.5±1°C
Micro-aëroob
Monstername
x g (of ml) *
+
9x ml de Bolton broth
Incubatie 4-6h; 37±1°C
Incubatie 44±4h; 41.5±1°C
Micro-aëroob
Columbia bloed agar
Incubatie 24-48h; 41.5 ±1°C
Micro-aëroob
1ml Brucella broth
Microscopie
Morfologie en beweeglijkheid
* Voor swabs: + 100 ml Bolton broth
** 1 typische kolonie van 1 isolatiemedium en als niet bevestigd wordt, 4 bijkomende kolonies bevestigen
Indien microscopisch
onderzoek positief
Oxidase Columbia bloed agar
Columbia bloed agar
Incubatie 44±4h; 41.5±1°C
aëroob
Antibioticaresistentie bij WIV
Campyfood ID agar
Incubatie 24-48h; 41.5±1°C
Micro-aëroob
** **
Incubatie 44±4h; 25±1°C
Micro-aëroob
Indien bevestiging positief
54

2.1.3.9.3 Analyseschema : Bepaling van het aantal Campylobacter spp.
Monstervoorbereiding
Incubatie
Telling
Bevestiging
Bijlage : Schema werkwijze – Bepaling van het aantal Campylobacter spp.
Monstername x g (of ml)
+
9x ml gebufferd peptoonwater
Enting van mCCDA strijkplaten
(1ml verdelen over 3 platen en 0.1ml over 1
platen)
Incubatie 44±4h; 41.5±1°C
Micro-aëroob
Telling van verdachte kolonies
Columbia bloed agar
Incubatie 24-48h; 41.5 ±1°C
Micro-aëroob
1ml Brucella broth
* 5 verdachte kolonies afpikken of alle indien < 5 aanwezig
*
Microscopie
Morfologie en beweeglijkheid
Indien microscopisch
onderzoek positief
Oxidase Columbia bloed agar
Columbia bloed agar
Incubatie 44± 4h; 41.5±1°C
aëroob
Incubatie 44± 4h; 25±1°C
Micro-aëroob
Bepaling van de antibioticaresistentie bij het W.I.V.
Indien de bevestigingstesten positief zijn
55

2.1.3.10 Bacillus cereus
Bacillus cereus is een bacterie die men vooral in de grond aantreft en die bijgevolg levensmiddelen
kan contamineren als die met aarde bevuild zijn. Men vindt bijvoorbeeld kleine concentraties ervan
terug in rauwe, gedroogde en verwerkte levensmiddelen. De bacterie is echter slechts gevaarlijk voor
de mens in concentraties van 10 5 kiemen per gram levensmiddel. De gevoeligste levensmiddelen zijn
rijst, aardappelsalade of –puree, groentesalades, specerijen, graan, enz...
2.1.3.10.1 Analyse
De telling van Bacillus cereus verloopt als volgt (ISO 7932:2004):
• afwegen van een hoeveelheid monster, overbrengen in verdunningsvloeistof en
homogeniseren,
• aanmaken van een decimale verdunningsreeks,
• 0,1 ml monster of verdunning uitstrijken op een petriplaat met het selectief medium MYP-agar
(Mannitol egg Yolk Polymyxine) en incuberen bij 30°C gedurende 18 tot 24 uur,
• tellen van het aantal typische kolonies op de platen met MYP-agar (grote, roze kolonies
omringd door een neerslagzone). Indien dergelijke kolonies aangetroffen worden, dan de
bevestiging uitvoeren aan de hand van een hemolysetest : afpikken van enkele typische
kolonies, een streepenting uitvoeren op bloedagar en incuberen gedurende 24 uur bij 30°C.
Een heldere zone rondom de kolonie wijst op hemolyse.
• indien bevestigd wordt dat de afgepikte kolonies inderdaad B. cereus zijn, dan het aantal cfu’s
berekenen uit het getelde aantal kolonies, rekening houdend met de gemaakte verdunningen.
Figuur 4.1.15 Petriplaat MYP agar
56

2.1.3.10.2 Analyseschema : Bepaling van het aantal vermoedelijke Bacillus cereus.
Monstervoorbereiding
Incubatie
Telling
Bevestiging
Vloeibaar monster of primaire
verdunning
(monstername x g of ml in 9x ml
verdunningsvloeistof)
Aanmaken decimale verdunningsreeks in tryptoon zoutoplossing
Enting van strijkplaten MYP agar met 0.1ml
(1 plaat per verdunning)
Incubatie 18-24h; 30±1°C *
Telling van de verdachte kolonies
Bloedagar 2 + schapenbloed
Incubatie 18-24h; 30±1°C
* indien geen duidelijke kolonies aanwezig zijn, nogmaals 24 h incuberen
** 5 kolonies afpikken of alle indien < 5 aanwezig
**
57

2.2 Fythopathologie
Planten vormen een integraal onderdeel van ons ecosysteem op aarde. Ze zijn onmisbare elementen
voor het behoud van het evenwicht van het leven zoals we dit kennen. Planten zijn een cruciale
schakel in de voedselketen en hun (niet) beschikbaarheid heeft belangrijke gevolgen voor onze
maatschappij, zeker voor wat betreft de planten met een economisch belang en planten die gebruikt
worden in de geneeskunde. Zich verzekeren van de goede gezondheid van planten is dan ook van
kapitaal belang. Om dit te realiseren, is een stringente en goed georganiseerde bewaking nodig om
verspreiding van schade te beperken in geval van problemen. Deze bewaking impliceert de kennis
van fytopathogene organismen en de beschikbaarheid van analysemethoden om diagnoses te stellen.
In het eerste hoofdstuk dat volgt, worden de grote categorieën van fytopathogene organismen
voorgesteld. Het tweede hoofdstuk behandelt de actuele analysemethoden. In het laatste hoofdstuk
worden enkele praktische laboratoriumtoepassingen voorgesteld.
2.2.1 De fytopathogene organismen
Plantenziekten resulteren in ontregelingen veroorzaakt door niet-levende of levende factoren.
Tot de categorie van de niet-levende factoren behoren bijvoorbeeld het niet aangepast zijn aan de
temperatuur, aan de vochtigheidsgraad, aan de intensiteit van de belichting, aan minerale zouten, enz.
Deze factoren zijn in het algemeen makkelijk beheersbaar in het kader van de opvolging van culturen.
Tot de tweede categorie, deze van de levende factoren, behoren de zogenaamde « fytopathogene »
organismen. Hiervan bestaan verschillende types, algemeen geassocieerd met volgende
taxonomische groepen: bacteriën en mollicuten, schimmels, nematoden, insecten en andere
geleedpotigen, virussen en viroïden.
• De bacteriën en mollicuten: deze organismen behoren tot de groep van de prokaryoten, ze
hebben geen celkern. De bacteriën hebben een stevige celwand terwijl de mollicuten (letterlijk
« weke huid ») geen celwand hebben. In de groep van de mollicuten onderscheiden we de
fytoplasmen (= plantpathogene mycoplasmen) en de spiroplasmen (= spiraalvormige
mollicuten). De afwezigheid van de celwand bij deze laatste heeft als gevolg dat ze een
verminderde gevoeligheid hebben voor antibiotica, maar dan wel weer veel fragieler zijn en
bijvoorbeeld niet goed bestand zijn tegen osmotische druk.
• De bacteriën hebben een grootte van ongeveer 1-2 µm terwijl de mollicuten veel kleiner
zijn en 0,1 µm meten. Het genoom van de mollicuten is ook veel kleiner.
• In de taxonomische classificatie van deze organismen worden de begrippen pathovar en ras
gebruikt. Het pathovar (pv.) is, binnen een soort, een groep die een parasitaire specificiteit
vertoont tegenover een gegeven type plant, bijvoorbeeld Pseudomonas syringae pv. tabaci.
Het ras of biotype is, binnen een pathovar, een groep die enkel bepaalde cultivars van een
plantensoort aanvalt. Deze classificatie berust op de verschillen in metabolische activiteit.
• De micro-organismen hebben een belangrijke capaciteit om te overleven in diverse milieus
(aarde, water, plantenreservoir,…), ze verspreiden zich gemakkelijk (met inbegrip van de lucht
en de insecten) en koloniseren extreem vlug plantaardige weefsels.
58

• De ziekten veroorzaakt door bacteriën zijn gevarieerd, zoals bijvoorbeeld gallen (geslacht
Agrobacterium) (Figuur 4.2.1a), rot (bvb. Ralstonia solanacearum verantwoordelijk voor
bruinrot van de aardappel), verwelking (vb. Clavibacter michiganensis op tomaat) of nog
necrose (bvb. Pseudomonas syringae pv. phaseolicola op boon).
• De fytoplasmen bevinden zich bijna uitsluitend in de cellen van het floëem (Figuur 4.2.1b) en
beïnvloeden het reproductieve stelsel van vegetatieve planten.
• Zo veroorzaken ze dwerggroei, geligheid, « heksenbezems » (onregelmatige groei),
vervorming van de vruchten, enz. De parasitaire spiroplasmen zijn minder goed gekend,
slechts twee ziektes zijn beschreven, waaronder dwerggroei van maïs. De mollicuten worden
verspreid door insecten en zijn moeilijk (zo niet onmogelijk) te kweken in artificiële
omstandigheden.
Figuur 4.2.1a: Foto links: bacteriën Agrobacterium tumefaciens gezien met een
rasterelektronenmicroscoop (= scanning). Foto rechts: tumoren geïnduceerd door A. tumefaciens op
een plant.
59

Figuur 4.2.1b: Foto links : fytoplasmen (pijltjes) van de geelziekte heksenbezem van de Aster (Aster
yellows Witches’ broom of AY-WB) geobserveerd met een transmissie elektronenmicroscoop in een
coupe van cellen (se1 en se2) van het floëem (de kanalen waar doorheen het sap stroomt) van een
blad van Aster. Zoom balk = 1 µm. Foto rechts: Aster in goede gezondheid (links) en Aster
geïnfecteerd met het fytoplasma AY-WB.
• De schimmels: vormen over een heterogene groep van eukaryoten (met celkern) die
gemeenschappelijk hebben dat ze zich heterotroof (« hetero » betekent ander en « troof »
betekent voeding) voeden via absorptie. Bijna de helft van de plantenziekten zijn veroorzaakt
door fytopathogene schimmels, waarvan men meer dan 10.000 bekende soorten telt. Hun
grootte gaat van enkele micrometers tot meerdere millimeters, en zelfs centimeters.
• De meerderheid van de schimmels heeft de mogelijkheid om zich voort te planten op zowel
een seksuele als een aseksuele manier. De seksuele sporen vertegenwoordigen over het
algemeen de bron van het primaire inoculum. Zij verzekeren het behoud van het bestaan van
de ziekte. De aseksuele sporen worden in grote getale geproduceerd. Zij zorgen voor de
verspreiding van de ziekte.
• Drie grote groepen kunnen worden beschouwd:
• de schimmels type plasmodium of slijmzwam (amoeboïde meerkernige cellen zonder
celwand): obligate parasieten van de hogere planten, ze tasten vooral de ondergrondse
organen en de stengels aan, en spelen een belangrijke rol als vectoren van virussen.
Bijvoorbeeld: Polymyxa betae, vector van het virus van de rhizomanie van de suikerbiet
(Figuur 4.2.2 – foto links).
• de schimmels met draadvormige koenocyte (eencellige) thalli (dit is mycelium zonder
tussenschot, niet onderverdeeld): veroorzaken diverse ziekten zoals het smelten van het
zaadbed (verrotting van granen en vergeling van plantjes), wortelrot op houtachtige of
kruidachtige planten, meeldauw (bvb. Plasmopara viticola op de wijnstok) (Figuur 4.2.2 – foto
in het midden), witte roest. Zij tasten ook bovengrondse delen van planten aan.
• de schimmels met draadvormige thalli waarvan de cellen gescheiden zijn door septa of
« echte schimmels »: veroorzaken een waaier van ziekten zoals vervormingen van organen
(bvb. Taphrina deformans die de perzikkrulziekte veroorzaakt), meeldauw (witachtige
afzettingen op het oppervlak van de gastplant), kankers (zweren die leiden tot vermindering in
groei en tot afsterven), aantasting van de vruchten (bvb. Claviceps purpurea of moederkoren,
perenschurft,…), vasculaire ziekten met verwelking, roest (puisten op bladeren en stengels) of
nog brand (bvb. Tilletia die steenbrand van tarwe veroorzaakt) (Figuur 4.2.2 – foto rechts).
60

Figuur 4.2.2: Foto links: Rhizomanie van suikerbiet veroorzaakt door een virus overgebracht door de
schimmel Polymyxa betae. Foto in het midden: aantasting van een wijnstok door de meeldauw
Plasmopara viticola. Foto rechts: steenbrandziekte van tarwe veroorzaakt door Tilletia indica.
• De nematoden: ook « rondwormen » genoemd, deze eukaryoten vormen een groep die vrij
homogeen is qua morfologie – toch wat betreft de wormvormige verschijningen die alle tussen
de 0,2 en 12 millimeter lang zijn (voor de fytopathogenen) (Figuur 4.2.3 – foto links) met een
dikke cuticula – maar heterogeen qua levenswijze. Ze kunnen leven in de bodem, het water of
nog parasiteren op dieren of planten. Ze beschikken over een genitaal orgaanstelsel en de
voortplanting gebeurt via het leggen van eieren. Er bestaan verschillende stadia juvenielen en
een volwassen stadium. Om van het ene stadium in het andere te komen, ondergaan ze een
gedaanteverandering. Ze beschikken ook over een spijsverteringsstelsel en sommige
rondwormen zijn in staat om zich «vast te bijten» in plantaardig weefsel met behulp van
tanden of met een stilet om zo verteringsenzymen te injecteren. Andere dringen tot in de
cellen van de gastheer. Bovendien hebben ze een spierstelsel die hen toelaat zich voort te
bewegen. Ze hebben geen bloedvatenstelsel of ademhalingsstelsel. Om hen visueel te
herkennen en te onderscheiden is een doorgedreven training nodig.
• De nematoden veroorzaken diverse problemen bij gewassen, zoals problemen met groei
(dwerggroei), verminderd rendement en zelfs afsterven van de plant. Ze zijn ook vectoren van
andere ziekten.
• Bij de nematoden die het meest problematisch zijn, onderscheiden we in het bijzonder de
nematoden die cysten vormen (bvb. Globodera rostochiensis en Globodera pallida) en de
nematoden die gallen vormen (bvb. Meloidogyne chitwoodi en Meloidogyne fallax).
• De cysten zijn het resultaat van een transformatie van een wijfje na de bevruchting: het wijfje
sterft en haar lichaam wordt een zak gevuld met eieren (tot 1000 !). De cysten kunnen
zichtbaar zijn met het blote oog, als kleine gele of bruine bolletjes op plantenwortels (bvb.
aardappelplanten) of in de bodem (Figuur 4.2.3 – foto in het midden). De cysten zijn extreem
resistent, zelfs bij zeer lage temperaturen, ze kunnen nog levensvatbaar zijn na 15-20 jaar.
• De gallen verschijnen op wortels en ondergrondse stengels (rizomen of wortelstokken bvb.
stolonen van de aardappel), als bulten en knobbels (Figuur 4.2.3 – foto rechts).
61

Figuur 4.2.3: Foto links: Nematoden van de den; de staaf van de maatverdeling geeft 100 µm aan.
Foto in het midden: cysten van Globodera rostochiensis op wortels. Foto rechts: gallen op peen
veroorzaakt door Meloidogyne fallax.
• De insecten en andere geleedpotigen: een grote diversiteit aan geleedpotigen is schadelijk
voor planten, hetzij op een directe manier zoals de fytofagen (t.t.z. die plantaardig weefsel
eten), hetzij indirect, via het verspreiden van ziekten (bvb. de fytopathogene virussen en
bacteriën). Sommige organismen brengen tegelijk direct en indirect schade toe aan planten.
• De fytofagen kunnen verschillende weefsels aantasten: bladeren (fyllofagen), stengels
(caulifagen), wortels (radicifagen), bloemknoppen en bloemen (florifagen), vruchten
(frugifagen), hout (xylofagen), enz. Hun oraal stelsel is aangepast aan de functie, zo is er
bijvoorbeeld het type prikker-zuigmond of het type dat in staat is te bijten en te vermalen.
• Zowel de volwassen vormen als de juvenielen zijn in staat om planten aan te tasten. De larven
van vlinders, in de volksmond rupsen genoemd, zijn in het bijzonder verschrikkelijke vernielers
van de gewassen.
• Verscheidene orden van insecten zijn fytopathogeen, bijvoorbeeld de Lepidoptera of
schubvleugeligen (vlinders en rupsen, bvb. de bananenboommot (Figuur 4.2.4 – foto in het
midden)), de Coleoptera of kevers (bvb. de coloradokever, de Aziatische boktor (Figuur 4.2.4
– foto links)), de Orthoptera of rechtvleugeligen (bvb. de krekel), de Hemiptera of
snavelinsecten, onderorde Homoptera of gelijkvleugeligen (bvb. de bladluis, de cicade), de
Hemiptera, onderorde Heteroptera of wantsen (bvb. de wandluis), de Thysanoptera of tripsen
(bvb. de trips, ook "oranje dier" genoemd), de Diptera of tweevleugeligen (bvb. de koolvlieg),
de Hymenoptera of vliesvleugeligen (bvb. eikengalwesp), enz.
• In de groep van de geleedpotigen, vindt men naast insecten, bijvoorbeeld schadelijke
mijtachtigen zoals de Tetranychidae (bvb. rode spintmijt) (Figuur 4.2.4 – Foto rechts).
• De diagnose gebeurt minstens door een observatie, bij voorkeur met een microscoop en door
ervaren personen.
62

Figuur 4.2.4: Foto links: Anoplophora of Boktor, fytofaag insect van de orde Coleoptera. Foto in het
midden: larve van Opogona sacchari of bananenboommot, fytofaag insect van de orde Lepidoptera.
Foto rechts: Tetranychus urticae of rode spintmijt, mijtachtige fytofaag.
• De virussen en viroïden: De virussen zijn eenheden samengesteld uit nucleïnezuren (DNA of
RNA) ingesloten in een eiwitmantel of capside. In uitzonderlijke gevallen bevat het capside
ook nog vetten of een RNA-polymerase. De grootte van de fytopathogene virussen varieert
gemiddeld van enkele tientallen tot enkele honderden nanometers, maar een langwerpig virus
kan tot 2 µm groot zijn. In dit laatste geval spreekt men van draadvormigen; maar er bestaan
ook isometrische vormen (bvb. van het hexagonale type), bolvormige types, staafvormigen,
enz. (Figuur 4.2.5a).
• De viroïden zijn structureel veel eenvoudiger dan de virussen, omdat zij uitsluitend bestaan uit
een circulaire RNA-molecule van maximum 400 nucleotiden. Viroïden detecteren kan dan ook
enkel via moleculaire technieken (bvb. PCR) en niet door observatie met een microscoop
zoals dit wel het geval is voor virussen.
• Virussen en viroïden zijn obligate intracellulaire parasieten van levende cellen. Zij gebruiken
de metabolische processen van deze cellen (factoren van replicatie, transcriptie, vertaling) om
zich te vermeerderen.
• De virussen en viroïden verplaatsen zich in de plant hetzij van cel naar cel via de
plasmodesmata (intercellulaire communicatiekanalen tussen cytoplasma’s), hetzij over veel
langere afstand via het floëem (circulatiekanalen van het plantensap). Om de intercellulaire
doortocht te vergemakkelijken, gebruiken virussen bewegingseiwitten die zich eventueel
polymeriseren tot buisjes. De overgang van plant naar plant gebeurt hetzij via verticale
transmissie (van een moederplant naar de afstammelingen via vegetatieve
vermenigvuldiging), hetzij via horizontale transmissie, d.w.z. door contact ter hoogte van een
letsel, door enting, door tussenkomst van vectoren zoals schimmels, nematoden, mijten,
insecten enz.
• De fytopathogene virussen worden geklasseerd in vijf groepen op basis van het type
nucleïnezuur en de voortplantingsstrategie:
o GROEP 1 : ENKELSTRENGIG POSITIEF (BOODSCHAPPER-)RNA-VIRUS,
o GROEP 2 : DUBBELSTRENGIG RNA-VIRUS,
o GROEP 3 : ENKELSTRENGIG NEGATIEF (ANTI-BOODSCHAPPER-)RNA-VIRUS,
o GROEP 4 : ENKELSTRENGIG DNA-VIRUS,
o GROEP 5 : DUBBELSTRENGIG DNA MET EEN RNA TUSSENVORM.
• De meerderheid van de fytopathogene virussen behoren tot groep 1. Binnen de vijf groepen
zijn nog onderklassen (familie, geslacht, soort, enz.) volgens morfologie, eigenschappen van
het genoom (aantal gecodeerde producten, homologie van de sequenties…), biologische
63

eigenschappen (type gastheer, manier van transmissie,…) en de serologische eigenschappen
(type eiwitten).
• De fytopathogene viroïden worden in twee groepen onderverdeeld: de Pospiviroidae (tot deze
familie behoren de meeste viroïden) en de Avsunviroidae. De virale infectie is gericht hetzij op
precieze organen van de plant (bvb. vasculair systeem), hetzij op de volledige plant. De
symptomen – als ze zichtbaar zijn – zijn erg gevarieerd: verandering van kleur, misvormingen,
necrose (= ongecontroleerde celdood), enz.
• Enkele voorbeelden van virussen en viroïden:
o ALFALFA MOZAÏEK VIRUS (AMV) (FIGUUR 4.2.5A – FOTO LINKS), GROEP VAN ENKELSTRENGS POSITIEVE
RNA-VIRUSSEN, FAMILIE VAN DE BROMOVIRIDAE, GESLACHT ALFAMOVIRUS, VERANTWOORDELIJK VOOR
ZIEKTEN BIJ DIVERSE PLANTEN ZOALS BIJVOORBEELD DE MOZAÏEK BIJ LUZERNE, NECROSE BIJ DE AARDAPPEL EN
BIJ DE TOMAAT (FIGUUR 4.2.5B – FOTO LINKS).
o CITRUS PSOROSIS VIRUS (CPSV), GROEP VAN ENKELSTRENGIG NEGATIEVE RNA-VIRUSSEN, FAMILIE VAN DE
OPHIOVIRIDAE, GESLACHT OPHIOVIRUS, VEROORZAAKT SCHADE AAN BOMEN VAN HET GESLACHT CITRUS,
ZOALS BIJVOORBEELD SCHEUREN IN DE SCHORS VAN DE STAM VAN SINAASAPPELBOMEN (FIGUUR 4.2.5B –
FOTO IN HET MIDDEN) EN VLEKKEN OP BLADEREN.
o TOMATO YELLOW LEAF CURL VIRUS (TYLCV), GROEP VAN ENKELSTRENGIG DNA-VIRUSSEN, FAMILIE VAN DE
GEMINIVIRIDAE, GESLACHT BEGOMOVIRUS, VERANTWOORDELIJK VOOR DE ZIEKTE VAN DE GELE
LEPELVORMIGE BLADEREN BIJ DE TOMAAT, MET ALS GEVOLGEN MISVORMINGEN, BEPERKING VAN DE GROEI
EN RENDEMENTSVERLIES VAN DE VRUCHTEN.
o POTATO SPINDLE TUBER VIROID (PSTVD), GROEP VAN DE VIROÏDEN, TAST TOMATEN EN AARDAPPELEN AAN,
GEEFT VERSCHROMPELING VAN DE PLANTEN, VERTRAAGDE GROEI, VERVORMDE EN KLEINERE
WORTELKNOLLEN (FIGUUR 4.2.5B – FOTO RECHTS), NECROSE OF ABNORMAAL KLEINE BLADEREN, ZELFS TOT
AFSTERVEN.
Figuur 4.2.5a: Afbeeldingen van verschillende fytopathogene virussen, negatief gekleurd en bekeken
met een transmissie elektronenmicroscoop, ter illustratie van enkele morfologische mogelijkheden.
Afbeelding links: Alfalfa mozaïek virus. Afbeelding in het midden: Tobacco mozaïek virus. Afbeelding
rechts: Tomato bushy stunt virus. Alle afbeeldingen zijn 300.000x vergroot.
64

Figuur 4.2.5b: Foto links: ziekte van het Alfalfa mozaïek virus op tomatenplanten. Foto in het midden:
aantasting van de schors van een sinaasappelboom door Citrus psorosis. Foto rechts: wortelknollen
van de aardappelplant geïnfecteerd door Potato spindle tuber viroïd (links op de foto) die abnormaal
klein zijn in vergelijking met de wortelknollen van gezonde planten (rechts op de foto).
• Andere fytopathogene organismen: afgezien van de vijf categorieën hierboven vermeld,
bestaan er nog organismen, marginaal of in geringe mate beschreven, die ook vijanden zijn
van planten.
• Tot deze behoren de protozoa (ééncellige dieren) van het type trypanosomatiden (dezelfde
categorie als de pathogeen van de slaapziekte !), zoals bijvoorbeeld de melksaphoudende
protozoa die verschrompeling van maniok veroorzaken.
• Verder zijn er planten die parasitair zijn op andere planten: het gaat over bloemdragende
planten die in de loop van de evolutie hun autotrofie hebben verloren, en die het water, de
koolhydraten en minerale zouten van de waardplant afleiden met behulp van zuigstructuren
(zuigorganen genoemd). Een gekend voorbeeld is dat van de maretak (geluksbrenger
waaronder men moet zoenen met Nieuwjaar) die coniferen parasiteert.
2.2.2 De analysemethoden in de fytopathologie
De allereerste benadering van een plantaardige ziekte, van zodra het ontdekt wordt, is visueel. Een
abnormaal voorkomen of het verschrompelen van de plant of delen ervan zijn de eerste alarmsignalen
van het bestaan van een ziekte. De karakteristieke symptomen van goed gekende ziekten, zelfs de
duidelijk zichtbare aanwezigheid van parasieten, dragen in min of meerdere mate bij tot het bepalen
van de diagnose. Het zijn voornamelijk insecten, die soms flagrante aanwijzingen achterlaten zoals
bijvoorbeeld: typische aantasting van stengels, aanwezigheid van larven op granen, grote witte
vlekken van schildluizen, karakteristieke vervorming « in de wortelrozet » aan de uiteinden van de
uitlopers geassocieerd met de aanwezigheid van honingdauw, tunnels die aparte vormen tekenen op
bladeren, een vernielde ring weefsel rond de apex van vruchten, fecale bolletjes op gallen, speciale
positie van het lichaam van het insect, enz.
Evenwel, een definitieve diagnose enkel op basis van visuele symptomen is niet altijd gemakkelijk en
ook niet altijd betrouwbaar. De symptomen van de meerderheid van de ziektes bij de planten zijn heel
algemeen en niet karakteristiek (verwelking, vergeling, het verschijnen van vlekken, dons op bladeren,
reliëfs, bederf van weefsels, beperking van de groei, enz.) en kunnen leiden tot verwarring. Anderzijds,
sommige ziektes geven geen aanleiding tot weinig zichtbare symptomen, en in sommige gevallen zijn
65

de symptomen zelfs helemaal afwezig, bijvoorbeeld tijdens een latente fase (bvb.: de latente fase van
bacterievuur op perenbomen in de winter). Zodoende zijn goed uitgewerkte laboratoriumtesten nodig
in het merendeel van de gevallen.
In de fytopathologie zijn de actuele analysemethoden heel divers en continu in ontwikkeling. Naast
eenvoudige klassieke methoden, tot de welke men zijn toevlucht vandaag nog neemt, zijn er meer
gesofistikeerde methoden aangepast of ontwikkeld voor de fytopathologen. In het eerstvolgende punt
worden de belangrijkste klassieke methoden voorgesteld en in het tweede deel komen de meer
modernere methoden en methoden die nog in ontwikkeling zijn aan bod.
2.2.2.1 Klassieke methoden
2.2.2.1.1 Biotesten op planten en fytopathogeniciteit
Een grote klassieker bij de diagnostische methoden in de fytopathologie is de biotest op planten.
Indicatorplanten worden geïnoculeerd vanuit een staal dat verondersteld wordt gecontamineerd te zijn
door een bepaalde pathogeen, en na een periode van incubatie worden de planten geanalyseerd om
de symptomen van de ziekte op te sporen (Figuur 4.2.6). De observatie kan met het blote oog
gebeuren voor de algemene staat van de plant, of beter via microscopische analyse van de
plantaardige weefsels na een kleurbehandeling om preciezer de beschadigde zones aan te tonen. De
plantentesten kunnen ook gebruikt worden om de vermoedelijke pathogeen te vermeerderen, om erna
zijn aanwezigheid makkelijker aan te tonen en dit door hem te isoleren vertrekkende van de plant die
werd geïncubeerd. Nog andere methoden worden gebruikt om een pathogeen te isoleren, zoals via
een voedingsbodem of met PCR.
Figuur 4.2.6: Test voor bepaling van de fytopathogeniciteit op planten van de wijnstokvariëteit
Cabernet Sauvignon. In het bassin links bevinden zich de planten geïnoculeerd met de schimmel
Phaemonella chlamydospora, en in het bassin rechts de controleplanten geïnoculeerd met steriel
water.
66

2.2.2.1.2 Voedingstesten
Welke voedingsstoffen een micro-organisme gebruikt en meer bepaald welke koolstofbronnen, kan als
indicator dienen om de identiteit van het micro-organisme vast te stellen en dit voor bacteriën en
schimmels. Momenteel bestaan er commerciële kits om vrij snel (van enkele uren tot enkele dagen)
het « metabolisch profiel » van een gekend micro-organisme te bepalen.
2.2.2.1.3 Morfologie op een voedingsbodem
Als iets zichtbaar voorgesteld kan worden, en dit geldt voor de bacteriën en de schimmels, is één van
de eerste handelingen die zich opdringt natuurlijk het isoleren en vermeerderen van de fytopathogeen
in een laboratorium. Zo wordt een ongelimiteerde hoeveelheid van het organisme beschikbaar en kan
het organisme onderworpen worden aan een hele batterij testen.
Het isoleren op zich is dikwijls al een test op zichzelf, omdat de groeisnelheid van het geïsoleerde
organisme en de morfologie ervan reeds een zwakke of sterke oriëntatie geeft richting de diagnose. Er
bestaat werkelijk een waaier aan vormen, kleuren, geuren, texturen, groottes, enz. die fytopathogene
bacteriën en schimmels kenmerken.
Door gebruik te maken van verschillende voedingsbodems kan veel informatie verzameld worden. Er
zijn selectieve bodems, niet-selectieve, semi-selectieve, totaal selectieve…in functie van bijvoorbeeld
de beschikbare nutriënten of nog van de aanwezigheid van een inhibitor zoals een antibioticum
waartegen het te bestuderen organisme resistent is, enz. Het stimuleren van de productie van
moleculen die makkelijk gedetecteerd worden zoals bijvoorbeeld pigmenten, fluorochromen of
polysacchariden, geeft waardevolle informatie.
Deze methode is over het algemeen makkelijk uitvoerbaar en toegankelijk qua prijs. Daarentegen
volstaat ze niet altijd om tot een definitieve diagnose te komen.
2.2.2.1.4 Visuele analyse met een vergrootglas of met een microscoop
Een andere analyse die vanzelfsprekend is, is de directe observatie van het organisme met het blote
oog, met een vergrootglas of met een microscoop. De observatie met het blote oog of met een
vergrootglas is mogelijk voor insecten, nematoden en schimmels. De morfologische structuren worden
scrupuleus onderzocht op elk verdacht detail dat opvalt, want 2 soorten (of andere taxonomische
niveaus) verschillen soms maar heel weinig op morfologisch vlak. Voor de insecten en de nematoden
zijn er tekeningen en determinatiesleutels beschreven in de literatuur. Een dissectie onder een
microscoop kan overwogen worden, of nog een voorbehandeling (fixatie, kleuring,…) om de analyse
te vergemakkelijken.
2.2.2.1.5 Analyse van nucleïnezuren
PCR of « Polymerase Chain Reaction » is een technologie die op punt werd gesteld in de jaren 1980.
PCR bestaat uit het repliceren van een groot aantal kopijen van een specifieke DNA-sequentie, a.h.v.
het enzym DNA-polymerase. Bij een diagnose kan het aantonen van een DNA-sequentie die specifiek
is voor een bepaald organisme dienen om de aanwezigheid van dat organisme te bewijzen.
67

PCR is heel populair. Het is momenteel zelfs de meest gebruikte techniek in de moleculaire biologie.
PCR is toepasbaar op alle levenden, voor zover er DNA of RNA beschikbaar is. Het is een gevoelige
methode, want zelfs een oneindig kleine hoeveelheid DNA wordt detecteerbaar na de amplificatie
reactie. Het is ook een relatief snelle techniek: in enkele uren is het resultaat bekend. Qua kostprijs is
het redelijk, voor zover er reeds was geïnvesteerd in een thermocyclermachine (enkele duizenden
euro’s) en materiaal voor de elektroforese (enkele honderden tot duizenden euro’s). De reagentia
(enzymen, nucleotiden) zijn makkelijk te vinden in de handel. De primers (startpunt van de PCRreactie)
worden hetzij verkocht in een vooraf gedefinieerde vorm (bijvoorbeeld in een kit waarbij wordt
aangegeven waarvoor de amplificatie bestemd is: van welk gen tot welk gen van een welbepaald
organisme), hetzij gedefinieerd door de klant en gesynthetiseerd door een firma.
PCR heeft ook enkele nadelen: voor veel protocollen is er nog een voorbereidende stap nodig van
DNA extractie vertrekkende van het te bestuderen organisme, wat resulteert in een langere
analyseduur, en bovendien zijn de extractiemethoden nog altijd niet eenvoudig in gebruik (bijvoorbeeld
technieken voor de DNA opzuivering maken gebruik van solventen die omzichtig moeten
gemanipuleerd worden zoals fenol, enz.). Een andere moeilijkheid is dat men minstens een idee moet
hebben van de sequentie in de genetische zone die men wenst te vermeerderen teneinde de juiste
primers te gebruiken en dit terwijl nog lang niet van alle levenden het genoom in kaart is gebracht.
Een ander potentieel probleem is het risico op contaminatie en dit juist door de gevoeligheid van de
techniek. Het volstaat om per ongeluk een klein stukje DNA in de proefbuis te hebben om een vals
positief signaal te bekomen. Daarentegen kan de PCR reactie juist geïnhibeerd worden door
ongewenste moleculen, zoals bijvoorbeeld fenolische componenten aanwezig in extracten van planten
waarin de aanwezigheid van een fytopathogeen wordt gezocht. Men krijgt zo vals negatieve
resultaten. Bijgevolg is het noodzakelijk om meerdere controles op te nemen in een PCR experiment.
Het is moeilijk om alle artikels in de literatuur te tellen die PCR vernoemen voor de diagnose van
plantenziekten. Louter indicatief kan men de sleutelwoorden « PCR » + « plant » + « pathogeen » in
een zoekmotor zoals Pubmed (www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) intypen en dan bekomt men 1272
referenties van publicaties.
PCR is duidelijk een methode die, ondanks het feit dat het een moeilijke techniek is, niet kan
genegeerd worden in de diagnostiek. Enerzijds moet de techniek voor sommige fytopathogene
organismen nog verder ontwikkeld worden (de nematoden en de insecten inbegrepen) en anderzijds
zijn er al spectaculaire verbeteringen gemaakt.
2.2.2.1.6 Analyse van eiwitten
De hoeveelheid eiwitten van een individu is ook een goede bron van aanwijzingen voor de richting
waarin de diagnose moet gezocht worden. In principe zou deze techniek toepasbaar moeten zijn op
alle fytopathogenen.
De eiwitten worden geëxtraheerd en worden vervolgens onderworpen aan een analyse, gewoonlijk
één van de volgende:
• Een algemeen profiel van het totaal eiwit, na scheiding via elektroforese;
• Detectie van een welbepaalde enzymatische activiteit.
68

2.2.2.1.7 Chemische methoden en analyse van vetzuren
Naast de moleculaire methoden met als doelgroep het DNA en RNA en de methoden die gericht zijn
op eiwitten, bestaan er nog chemische analyses, chromatografische en spectroscopische, die gericht
zijn op metabolieten en verbindingen zoals suikers, vetten en vetzuren en vluchtige moleculen.
2.2.2.1.8 Serologie
De serologische technieken worden vrij frequent gebruikt in parallel met de moleculaire technieken.
De serologische technieken zijn alle gebaseerd op het gebruik van antilichamen van een specifiek
antigeen van de onderzochte fytopathogeen. Er bestaan verschillende methoden: sero-agglutinatie,
ELISA en immuno-markering.
2.2.2.2 Moderne methoden
2.2.2.2.1 Sequencing
Het genoom bepaalt de identiteit van elk organisme. Kennis van het genoom onder de vorm van een
sequentie van nucleotiden van elke pathogeen is een grote troef in het domein van de diagnose van
ziektes, plantenziektes inbegrepen. In deze context levert het sequencen van genetisch materiaal en
het vergelijken met bekende sequenties informatie over twee zaken: enerzijds zullen gemeenschappelijke
elementen van twee verschillende genoomsequenties toelaten een verband te leggen
tussen twee individuen, t.t.z. om de positie in de fylogenetische boom te bepalen. Anderzijds opent de
ontdekking van nieuwe genetische sequenties/mutaties die uniek zijn voor een bepaalde groep van
organismen de weg naar ontwikkeling van moleculaire tools voor de routine diagnose. Een voorbeeld
hiervan is PCR.
2.2.2.2.2 Barcoding
Het ambitieus idee van « barcoding » houdt in dat aan elke levende bekend op Aarde een unieke
barcode wordt toegekend onder de vorm van meerdere korte sequenties van nucleïnezuren
karakteristiek voor het genoom van dit individu, net zoals barcodes worden gebruikt in de handel. In
de fytopathologie in het bijzonder zijn deze barcodes een groot gemak, want ze vergemakkelijken de
diagnose via moleculaire technologieën.
2.2.2.2.3 De technologie van de elektronische neus
De elektronische neus is een apparaat met verschillende sensoren die in staat zijn diverse vluchtige
organische moleculen te herkennen in een aromatisch mengsel. De signalen van de sensoren worden
opgevangen en geanalyseerd met software via een artificieel neuraal netwerk dat de signalen omzet
in digitale afdrukken. De combinatie van al deze afdrukken afkomstig van het aromatisch mengsel
geeft een « aromatische handtekening » die wordt geïdentificeerd door vergelijking met reeds
gecodeerde handtekeningen in een databank.
Dit type instrument is niet nieuw, maar zijn gebruik was tot nu toe beperkt tot kwaliteitscontroles in de
levensmiddelensector (controle van de versheid van levensmiddelen, onderzoek van contaminatie van
69

vlees, ..) en gebruik in de medische sector (onderzoek van pathogenen in menselijke weefsels, ..). Het
idee om deze machine te gebruiken als diagnosemiddel voor plantenziektes is heel recent (Figuur
4.2.22), wat enkele publicaties van de laatste jaren illustreren.
Figuur 4.2.22: Voorbeeld van de montage van een elektronische neus voor gebruik in het kader van
een analyse in het domein van de fytopathologie.
2.2.2.2.4 Microarray (DNA spots) als nieuw middel in de diagnose
De techniek DNA-microarray is gebaseerd op het principe van hybridisatie (binding) van
complementaire sequenties nucleïnezuren. Enerzijds worden heel verschillende sequenties DNAstrengen
die overeenkomen met verschillende regio’s uit het genoom van het organisme dat wordt
bestudeerd, vastgehecht op een gestructureerde manier op een glazen plaatje (microfluïde chip met
grote hoeveelheid spots) om indien mogelijk op die wijze het volledig genoom van dat organisme voor
te stellen. Anderzijds worden vrije DNA-strengen gebruikt die fluorescerend gelabeld zijn met een
fluorochroom.
2.2.2.2.5 Analyse van het iso-elektrisch punt: capillair iso-elektrisch focusseren
De techniek van het capillair iso-elektrisch focusseren (CIEF of capillary isoelectric focusing) is een
methode om elementen te scheiden op basis van hun iso-elektrisch punt. De elementen migreren in
een capillair van silica (grootte orde 100 µm diameter) waarover een pH-gradiënt is gebracht door
toepassing van een elektrische stroom op een reeks amfoteren die een verschillend iso-elektrisch punt
hebben (resulterend in een zure pH aan de anode en een basische pH aan de kathode). Het principe
is dat de stof stopt met migreren van zodra zijn globale lading nul is, wat gebeurt bij een bepaalde pH.
Het bestudeerde element kan bijvoorbeeld een eiwit zijn, maar evengoed een intacte bacterie !
70

2.2.2.2.6 Variante van de serologische testen : Lateral Flow Device
De serologische testen hebben hun doeltreffendheid bewezen in de diagnostiek en blijven behoren tot
de favoriete testen. Toch ontsnappen ze niet aan de actuele trend om de testen steeds eenvoudiger
en sneller te maken met behoud van een goed niveau van gevoeligheid en specificiteit van de meting.
We beschrijven hier een ultra-eenvoudige test die tracht te beantwoorden aan deze criteria: de Lateral
Flow Device of « LFD ». Het gaat letterlijk over een voorwerp met een laterale flux waarbij twee
vormen mogelijk zijn: ofwel een strip ofwel een type « zwangerschapstest ».
2.2.2.2.7 Varianten van PCR
Naast de klassieke PCR (zie hoger) bestaan er varianten geïnspireerd door het principe van deze
technologie en ontwikkeld met als doel kapitale criteria als daar zijn gevoeligheid, specificiteit,
snelheid, gebruiksgemak enz. te verbeteren.
2.2.2.2.8 Akoestische analyses
Een nieuwe originele methode die recent is voorgesteld, is de herkenning van xylofage insecten direct
op de plaatsen die worden verdacht van contaminatie via het beluisteren van geluiden geproduceerd
door deze pathogenen. De geluiden zijn karakteristiek voor elk gegeven type organisme. Deze
geluiden kunnen voortvloeien uit bewegingen van het insect of nog uit knagen van het insect in het
hout.
2.2.2.2.9 Satellietbeelden
Het principe van deze methode is de staat van de aanplantingen en bossen op aarde te bewaken via
satellietbeelden van hoge resolutie. Bepaalde ziekten hebben namelijk symptomen die potentieel
zichtbaar zijn vanuit een observatiepunt dat voldoende ver verwijderd is van de planten: bijvoorbeeld:
de nematode van dennen geeft vrij snel (na ongeveer 3 maanden) een algemene bruinkleuring van de
geïnfecteerde bossen. Bovendien wijzigt het (reflecterend) infrarood spectrum dat wordt uitgezonden
door de vegetatie in geval van ziekte. De ontwikkeling van deze methode is een project in het
Verenigd Koninkrijk (Rutherford Appleton Laboratory).
2.2.3 Voorbeelden van toepassingen in het FAVV
Binnen het FAVV worden de fytopathogenen gecontroleerd die quarantaine organismen zijn. Deze
worden aangeduid als “fytosanitaire parameters”. Het gaat om organismen waarvan hun introductie op
het grondgebied of toch in het slechtste geval de verspreiding ervan, tot elke prijs moet vermeden
worden, en er moet getracht worden de haarden uit te roeien, want ze betekenen een grote bedreiging
voor de teelten en aanplantingen.
Elk jaar wordt de lijst herzien (door DG Controlebeleid) en van commentaar voorzien door de
Nationale Referentielaboratoria. Voor het jaar 2009 werden precies 35 parameters vastgelegd voor
gerichte onderzoeken, alsook een generische lijst van bacteriën, virussen, schimmels, nematoden en
insecten voor het algemeen onderzoek gericht tegen alle plantaardige ziekten, in het bijzonder
wanneer ze worden geïmporteerd.
71

Vernoemen we enkele voorbeelden van parameters die op de lijst van de 35 doelstellingen
voorkomen:
• Schimmels: Claviceps purpurea (moederkoren) in granen, Guignardia citricarpa in Citrus,
Phytophtora kernoviae in planten van het type Rhododendron,…
• Bacteriën: Ralstonia solanacearum in aardappel, planten en oppervlaktewateren, Erwinia
amylovora in rosaceën, Xanthomonas fragariae in aardbeiplanten,…
• Fytoplasmen: Apple proliferation mycoplasm in planten in het bijzonder van het type appelaar
en perenboom, Pear decline mycoplasm in planten zoals de perenboom,…
• Virussen: Plum pox virus (Sharka) in steenvruchtbomen van het type Prunus, Pepino mosaïc
virus in tomaten en andere planten, Tomato spotted wilt virus in tomaten en andere planten,…
• Viroïden: alle viroïden van de groep van de Pospiviroïden
• Nematoden: Globodera spp. in grond, Meloidogyne chitwoodi in aardappelen en andere
planten, Ditylenchus dipsaci (parasiet van uiplanten) in grond,…
• Insecten: Anoplophora chinensis (Aziatische boktor) in planten en hout, Diabrotica virgifera
virgifera (coleopteer, goudhaantje op maïswortels) in vallen met feromonen, Opogona
sacchari (lepidopteer, bananenboommot),…
Alle analyses worden verdeeld over 5 laboratoria:
2 EXTERNE LABO'S ZIJN NRL voor plantenziektes:
• ILVO gesitueerd in Merelbeke: alle categorieën van fytopathogenen behalve virussen, viroïden
en fytoplasmen
• CRA-W gesitueerd in Gembloux: virussen, viroïden, schimmels en fytoplasmen
1 SUPPLEMENTAIR EXTERN LABO:
• CORDER gesitueerd in Louvain-la-Neuve (einde in 2009): voor de bacteriën Ralstonia en
Clavibacter voornamelijk in aardappelen / BLGG gesitueerd in Nederland (vanaf 2009): voor
nematoden en een schimmel van uiplanten
2 INTERNE LABO'S:
• FLVVG: voor goudbruine nematoden Globodera spp.
• LFSAGx: voor de bacterie verantwoordelijk voor het bacterievuur: Erwinia amylovora
De methoden gebruikt in de verschillende laboratoria variëren volgens het type organisme: er zijn
bijvoorbeeld veel microscopische analyses voor de insecten en de nematoden, veel PCR of RT-PCR
voor de virologie en de mycologie, kweek op voedingsbodems voor de mycologie en de bacteriologie,
enz. De "klassieke" technieken worden momenteel dus nog veel gebruikt, zelfs voor quarantaine
organismen.
72

2.3 PCR en GGO
2.3.1 Biologische Achtergrond
2.3.1.1 De cel
We stellen vast dat zowat alle levende wezens bestaan uit een of meer cellen (virussen kunnen in
deze context beschouwd worden als extreme parasieten). Die cellen bezitten allemaal een
fundamenteel gelijkaardige structuur en maken gebruik van zeer analoge moleculen om de functies in
de cel te vervullen.
Bij nader toezien kunnen we cellen in twee grote groepen verdelen op basis van de inwendige
structuur :
• de prokaryotische cel : het eenvoudigste celtype dat aangetroffen wordt bij de microorganismen
van de groepen Bacteria en Archaea. De prokaryotische cel heeft meestal geen
echte inwendige structuur (er zijn uitzonderingen zoals de cyanobacteria) en kan
vereenvoudigd voorgesteld worden als een celwand met daarin het cytoplasma, de
verzameling van moleculen die instaan voor de levensprocessen (‘zak met moleculen’). Soms
zijn er uitwendige structuren aanwezig (flagellae,...),
• de eukaryotische cel : een celtype met een veel complexere structuur dat aangetroffen wordt
bij de eencelligen (Protista), gisten en schimmels (Fungi), planten (Plantae) en dieren
(Animalia). De eukaryotische cel heeft een complexe inwendige structuur : de cel bestaat uit
een celwand met daarin een cytoskelet met cytoplasma; hierin bevinden zich organellen die
een welbepaalde functie vervullen. De belangrijkste organellen zijn de celkern, de
mitochondriën, de chloroplasten (bij planten), het golgi-apparaat, lysosomen, vacuolen,...
Bepaalde levensprocessen vinden plaats in gescheiden compartimenten: energievoorziening
in de mitochondriën, excretie in het golgi-apparaat, afbraak in lysosomen, genetische
informatie in de celkern, fotosynthese in chloroplasten, osmotische controle in vacuolen...
Figuur 4.3.1 Een bacteriecel
F
Figuur 4.3.2 De twee types van eukaryotische cel
73

Cellen blijken voor hun structuur en werking gebruik te maken van een beperkt aantal basismoleculen.
De belangrijkste basismoleculen zijn de aminozuren, de suikers, de vetzuren en de nucleotiden.
2.3.1.2 Aminozuren en eiwitten
Eiwitten zijn complexe moleculen die opgebouwd zijn uit een keten van aminozuren. Omdat
aminozuren van elkaar verschillen in chemische eigenschappen, zullen de eigenschappen van
eiwitten met een verschillende aminozuurvolgorde van elkaar verschillen in eigenschappen. Door een
verschillende aminozuurvolgorde kan er een quasi onbeperkt aantal eiwitten met verschillende
eigenschappen bestaan.
Aminozuren zijn moleculen waarvan de
basisstructuur kan voorgesteld worden zoals in de
figuur hiernaast. In de figuur is R een zijgroep die
verschilt van aminozuur tot aminozuur; deze
zijgroep bepaalt de eigenschappen van het
aminozuur zoals de polariteit (hydrofiele of
hydrofobe zijgroepen), zuur / base eigenschappen,
aromatische kenmerken, ruimtelijke grootte e.d. In
de natuur blijken er een 20-tal ‘universele’
aminozuren voor te komen die door elk type van cel
gebruikt worden.
De ruggengraat van een aminozuur is de structuur H2N – CH(R) – COOH. Deze structuur bevat een
aminogroep en een carboxylgroep.
Bij 2 aminozuren kan de aminogroep van het ene aminozuur reageren met de carboxylgroep van het
andere aminozuur en een binding vormen die bekend staat als de peptidebinding :
Figuur 4.3.3 De vorming van een peptidebinding
74

Dergelijke reactie kan herhaald worden zodat we op die manier een lange keten van aminozuren
krijgen : een polypeptide.
Eiwitten verschillen van elkaar in de aminozuurvolgorde : deze volgorde noemt men de primaire
structuur.
Delen van de keten kunnen een ruimtelijke structuur aannemen, meestal een helix of een regelmatige
‘plaat’structuur. Dit is de secundaire structuur van het eiwit.
Deze secundaire structuur kan zich op een analoge manier opvouwen tot de tertiaire structuur. Dit is
bij enzymen de belangrijkste structuur omdat in de tertiaire structuur het actieve centrum waarin de
chemische reacties plaatsvinden, gevormd wordt.
In sommige gevallen, meestal bij complexe structurele eiwitten, kunnen verschillende eiwitten
samenkomen en een quaternaire structuur vormen. Een bekend voorbeeld is hemoglobine, dat
bestaat uit vier eenheden : 2x een alfa-hemoglobine-eiwit en 2x een beta-hemoglobine-eiwit.
Figuur 4.3.4 Overzicht van de verschillende structuurniveau’s bij eiwitten
2.3.1.3 Nucleotiden en nucleïnezuren
Nucleotiden zijn de bouwstenen van RNA, DNA en enkele energiestockerende / energieleverende
moleculen (ATP).
Nucleotiden bestaan uit 3 componenten :
• een base, waarvan er universeel 5 verschillende voorkomen : Adenine (A), Cytosine (C),
Guanine (G), Thymine (T) en Uracil (U),
75

• een suiker, waarvan er in de natuur 2 verschillende voorkomen : Ribose en Deoxyribose,
• 1 tot 3 fosfaatgroepen (mono, di en tri).
Een nucleotide is opgebouwd uit de koppeling van een base met een suiker waaraan dan weer een
of meerdere fosfaatgroepen bevestigd zijn.
76

Nucleotiden zijn de bouwstenen van nucleïnezuren, het zijn lineaire moleculen die bestaan uit een
keten van aan elkaar gekoppelde nucleotiden. Net zoals twee aminozuren aan elkaar gekoppeld
worden door een peptidebinding, zo kan de fosfaatgroep van een nucleotide een binding aangaan met
de suikergroep van een andere nucleotide en een suiker-fosfaatbinding vormen.
Een nucleïnezuur is een keten van nucleotiden die dus bestaat uit een suiker-fosfaat ruggengraat met
de basen als zijgroepen. En net zoals bij eiwitten is het ook hier de volgorde van de basen die
kenmerkend is voor een nucleïnezuur. Het is deze basenvolgorde die de informatie bevat voor de
sturing van de cel (controle, aanmaak eiwitten,...); nucleïnezuren zijn dan ook de informatiedragers in
de cel.
Figuur 4.3.5 Schematische voorstelling van een nucleïnezuurketen
77

Afhankelijk van het soort suiker en de aanwezige nucleotiden kunnen we twee soorten nucleïnezuur
onderscheiden :
• RNA – ribonucleïnezuur. Hierbij komen alleen de basen A, C, G en U voor (dus geen T) en is
de suiker ribose. Een RNA-molecule komt voor als een enkele streng; bij lange ketens kan
er tussen bepaalde stukken interactie optreden en kan RNA een ruimtelijke vorm aannemen.
Er komen in de cel drie soorten RNA voor :
o mRNA (messenger – boodschapper RNA), een lange keten die gebruikt wordt voor de
synthese van eiwitten (zie verder),
o tRNA (transport-RNA) die gebruikt wordt voor het vervoer van aminozuren tijdens de
eiwitsynthese, en
o rRNA (ribosomaal RNA), RNA dat deel uitmaakt van de ribosomen, de eiwitcomplexen
waar de eiwitsynthese plaatsvindt.
• DNA – deoxyribonucleïnezuur. Hierbij komen alleen de basen A, C, G en T voor (dus geen U)
en is de suiker deoxyribose. DNA komt echter meestal voor als een dubbelstrengige
molecule die bestaat uit twee aan elkaar complementaire ketens :
o de basen kunnen als zijgroep waterstofbruggen vormen met andere basen. Hierbij
blijken er slechts 2 stabiele paren gevormd te kunnen worden : A met T (2
waterstofbruggen) en C met G (3 waterstofbruggen).
o dit betekent dat twee complementaire DNA-ketens (ketens waarvan een A in de ene
keten overeenkomt met een T in de andere keten en een C met een G) een stabiele
dubbele keten kunnen vormen door baseparing.
o de ruimtelijke structuur van een dubbele keten is een dubbele helix : twee enkele
strengen winden zich om elkaar,
o een dubbele helix heeft 2 groeven : een grote en een kleine.
o een van de gevolgen van de vorming van een dubbele helix is dat DNA stabieler is
dan RNA; dit maakt DNA tot de ideale informatiedrager in de cel.
78

Figuur 4.3.6 Schematische structuur van een dubbele DNA-helix (links) en de overeenstemmende
ruimtelijke structuur (rechts)
Figuur 4.3.7 Verkorte voorstelling van een DNA-keten met letters. Let op de complementariteit van de
basen.
Een belangrijk aspect van nucleïnezuurketens is de polariteit, een term waaronder men de chemische
verschillen tussen de uiteinden van de keten verstaat. Een stukje nucleïnezuur bezit twee uiteinden:
een 5’-kop en een 3’-staart (zie Figuur 4.3.6). Bij de dubbele helix van DNA is de polariteit van de twee
strengen tegengesteld : de ene streng loopt van 5’ naar 3’ terwijl de complementaire streng van 3’ naar
5’ gaat. Deze polariteit is zeer belangrijk bij het aflezen van een streng !
79

2.3.1.4 DNA en genen
De functie van nucleïnezuren in de cel is tweevoudig :
• DNA is het archief dat de informatie bevat voor sturing van de cel (permanent archief),
• RNA is de informatiedrager voor de aanmaak van eiwitten (tijdelijk – wordt na gebruik weer
afgebroken en gerecycleerd).
Het algemene principe is dat informatie van DNA gekopieerd wordt naar RNA (gebeurt in de celkern bij
eukaryoten) waarna het RNA door de ribosomen afgelezen wordt voor de synthese van eiwitten :
DNA => RNA => eiwit.
De stap DNA => RNA is de transcriptie, de stap RNA => eiwit is de translatie.
Figuur 4.3.8 Schema van de omzetting van DNA-informatie naar eiwit
Het DNA bevat de informatie voor de aanmaak van eiwitten; elke eenheid (basenvolgorde) in het DNA
die alle informatie bevat voor een eiwit is een ‘gen’. De totaliteit van alle genen in een cel is het
‘genoom’.
Een gen bevat
• alle informatie om de aminozuurvolgorde van een eiwit te bepalen,
• de informatie voor de controle van de eiwitsynthese.
Bij eukaryoten bevat het DNA naast ‘coderende’ delen met informatie die effectief gebruikt wordt, ook
niet-coderende delen die vaak moleculaire fossielen zijn uit de evolutionaire geschiedenis van de
soort (pseudogenen, ‘junk’DNA,...).
80

De algemene structuur van een gen bestaat uit (zie figuur) :
• controlesequenties :
o aan het begin : de promotor, een sequentie die bepaalt waar het gen begint en dat
het startpunt is voor de transcriptie van DNA naar RNA,
o aan het einde : de terminator, een sequentie die aangeeft waar het gen eindigt en dat
de transcriptie naar RNA dus moet stoppen,
• tussen de promotor en terminator : de sequentie die moet omgezet worden in RNA en die de
aminozuurvolgorde van het aan te maken eiwit bepaalt.
Meestal zijn er ook nog bijkomende controle-elementen aanwezig die de transcriptie sturen, zoals
genen die coderen voor een eiwit dat een promotor kan blokkeren e.d. Die bijkomende elementen
kunnen zich op het DNA soms ver van het te controleren gen bevinden. De functie ervan is vooral om
ervoor te zorgen dat genen alleen afgelezen worden wanneer dat nodig is; het is immers een
verspilling van energie en materiaal om continu een eiwit aan te maken waarvan er al genoeg is in de
cel of dat op dat moment niet echt nodig is.
Bij eukaryoten is het gen vaak langer dan het RNA dat nodig is voor de synthese van het eiwit; na
transcriptie wordt het gevormde RNA dan geknipt om er de overbodige stukken uit te verwijderen
(‘splicing’) vooraleer de eiwitsynthese uitgevoerd wordt.
2.3.1.5 DNA, RNA en eiwitsynthese
De eiwitsynthese is de vertaling van de basenvolgorde in het DNA via RNA naar de
aminozuurvolgorde van een eiwit.
Bij dit proces zijn zowel DNA als de verschillende soorten RNA als eiwitten zelf betrokken; het proces
van de eiwitsynthese gebeurt in de ribosomen (‘eiwitmachientjes’) :
• DNA is het archief met de nodige informatie en neemt zelf niet actief deel aan de aanmaak
van eiwitten,
• RNA is wel direct betrokken bij de eiwitsynthese :
o mRNA : boodschapper RNA brengt de informatie over van DNA naar de ribosomen,
o tRNA : transport RNA dat de aminozuren naar de ribosomen brengt. Er zijn
verschillende tRNA’s en aan elk verschillend tRNA is een ander aminozuur gebonden,
o rRNA : ribosomaal RNA is een essentiële component van de ribosomen.
81

Het proces van de eiwitsynthese verloopt als volgt (zie figuur) :
• de eerste stap is de transcriptie : de aanmaak van mRNA met DNA als matrijs. Dit gebeurt
door het enzym RNA-polymerase, dat
zich bindt op het DNA op de promotor
van het gen en de helix plaatselijk opent
zodat de twee DNA-strengen uit elkaar
gaan. Het polymerase maakt dan een
complementaire kopie van het gen door
aanmaak van een mRNA-streng.
Complementair betekent dat er
tegenover elke A in het DNA een U komt
in het mRNA, tegenover elke T een A,
tegenover elke C een G en tegenover
elke G een C. De transcriptie stopt
wanneer het RNA-polymerase de
terminator bereikt, waarna het mRNA
vrijgesteld wordt.
• de tweede stap is de translatie : de
aanmaak van een eiwit met mRNA als
matrijs. Dit gebeurt op/in de ribosomen. Het mRNA wordt ‘vastgegrepen’ door een ribosoom
waarna het mRNA wordt afgelezen per drie basen. Per groep van 3 basen wordt een
overeenstemmende t-RNA gebruikt waarvan het aminozuur gekoppeld wordt aan het
aminozuur van het vorige tRNA (peptidebinding). Op die manier wordt een nieuw eiwit
gevormd dat zich kan opvouwen in een secundaire en tertiaire structuur.
2.3.1.6 DNA-replicatie
Wanneer een cel zich deelt moet elk van de dochtercellen een identieke kopie van het DNA van de
moedercel krijgen. Daarom is het nodig dat de cel over een mechanisme beschikt om een exacte
kopie te maken van het aanwezige DNA. Dit proces staat bekend als de replicatie van het DNA.
Het proces van de replicatie verloopt in de volgende stappen :
• de twee strengen in DNA worden eerst ‘ontwonden’ worden door het enzym helicase om
toegankelijk te zijn voor het enzyme dat het kopiëren zal uitvoeren; er wordt een replicatievork
(voor te stellen als een Y) gevormd waar de eigenlijke replicatie plaatsvindt.
82

Figuur 4.3.9 Het ontwinden van de DNA-helix
• eenmaal de twee strengen ontwonden zijn, en we dus met twee enkelvoudige strengen te
maken hebben, kan op elk ervan een complementaire streng gesynthetiseerd worden door het
enzym DNA-polymerase. Hierbij komen er wel twee problemen kijken :
1. DNA-polymerase kan alleen een bestaande complementaire streng verlengen en
kan het proces niet starten ‘de novo’. Dit probleem wordt opgelost door een ander
enzym, het ‘primase’ dat op een enkelvoudige DNA-streng een kort stukje
complementair RNA synthetiseert : de ‘primer’. Het DNA-polymerase kan deze
primer als startsequentie gebruiken en van daaruit de complementaire keten
verlengen.
Figuur 4.3.10 Synthese van de RNA-primer en verlenging ervan door DNA-polymerase
83

2.3.1.7 De prokaryotische cel
2. DNA-strengen hebben een polariteit (zie boven); bij het ontwinden van de
strengen krijgen we dus twee enkelvoudige strengen met een tegengestelde
polariteit. Het DNA-polymerase kan echter alleen een complementaire keten
verlengen in de 5’->3’ richting, waardoor slechts op 1 van de 2 strengen de
verlenging zou kunnen doorgaan. De oplossing hiervoor is de synthese van de
complementaire streng op de andere keten in korte stukjes in de omgekeerde
richting, waarna deze korte fragmenten aan elkaar gekoppeld worden. Deze
fragmenten staan bekend als de Okazaki-fragmenten.
Figuur 4.3.11 Synthese van de Okazaki-fragmenten
Op genetisch vlak heeft het genoom van prokaryoten de volgende kenmerken :
• het is circulair : het DNA is vormt een ring waarop de essentiële genen voor het functioneren
van de prokaryotische cel liggen.
• de genen zijn georganiseerd in operons :
o een operon is een genetische eenheid waarbij verschillende genen die betrokken zijn
bij eenzelfde functie (vb. een biochemische pathway), zich naast elkaar bevinden,
o de controle van de expressie van het volledige operon gebeurt door slechts een
enkele controlestructuur, zodat deze controlestructuur de volledige functie beheerst,
o het best bekende voorbeeld van een operon is het lac-operon bij E. coli dat het
metabolisme van lactose regelt. Dit operon bestaat uit een sequentie [Promotor –
Operator – structurele genen voor de afbraak van lactose – Terminator]. De Operator
is de ‘schakelaar’ die de expressie van het operon bepaalt en wordt op zijn beurt
gestuurd door de aan- of afwezigheid van lactose in de cel.
84

Figuur 4.3.12 Structuur van het lac-operon
Naast de essentiële genen die zich op het circulaire genoom bevinden, kan een prokaryotische cel
ook nog afzonderlijke genen bevatten die coderen voor niet-essentiële kenmerken van de cel en in
principe dus kunnen gemist worden. Deze genen bevinden zich ook op circulaire stukken DNA en
worden plasmiden genoemd. Hun aantal in de cel is variabel; ze vermenigvuldigen zich autonoom,
dus onafhankelijk van de replicatiecyclus van het genoom.
Enkele voorbeelden van plasmiden :
• plasmiden met genen voor antibioticaresistentie (R-plasmiden),
• plasmiden met seksdeterminanten (F-plasmiden) – spelen een rol bij het uitwisselen van
genetisch materiaal,
• virulentiedeterminanten bij pathogenen (Salmonella,...).
Plasmiden verklaren waarom bacteriestammen in sommige gevallen hun virulentie kunnen verliezen
(verlies van het plasmide) of waarom andere organismen zeer snel resistent kunnen worden tegen
sommige antibiotica (uitwisselen van resistentieplasmiden tussen organismen).
In de natuur blijken sommige soorten prokaryoten in zeer extreme omstandigheden aangetroffen te
worden. Ze staan bekend als extremofielen en hebben als kenmerk dat ze kunnen groeien en zich
vermenigvuldigen bij extreme waarden van pH, zoutconcentratie, temperatuur, metaalionen e.d.
Thermofielen en hyperthermofielen leven bij temperaturen tot 120ºC. Ze bezitten hittestabiele eiwitten
en enzymen die bij deze hoge temperaturen niet denatureren. Ook het DNA-polymerase is hittestabiel.
Een aantal belangrijke prokaryoten die verder nog ter spraken zullen komen zijn :
• Thermus aquaticus (‘Taq’). Deze extremofiel leeft in heetwaterbronnen wat tot gevolg heeft
dat de enzymen, waaronder die betrokken bij de replicatie van DNA, nog actief zijn bij hoge
temperatuur (rond 100°C). Dit is van belang bij de PCR-techniek waarbij hittestabiel DNApolymerase
(‘Taq-polymerase’) gebruikt wordt,
• Agrobacterium tumefaciens. Dit is een plantpathogeen die galvorming veroorzaakt op de
bladeren van een grote groep planten. Agrobacterium beschikt over een mechanisme om een
plasmide (het Ti-plasmide) over te brengen in de plant waarna dit plasmide zich integreert in
het DNA van de plantencel. Een aantal genen op dat plasmide worden dan actief en zetten de
85

plant aan tot galvorming. Daarnaast bevat het plasmide ook genen waardoor de plant speciale
aminozuren (opines) kan aanmaken die door Agrobacterium gebruikt worden als stikstofbron.
Het belangrijkste opine bij A. tumefaciens is nopaline; het enzyme voor de vorming ervan is
nopaline synthase (NOS). Het gen voor NOS wordt geflankeerd door een promotorsequentie
(pNos) en een terminatorsequentie (tNos). Door de eigenschap om het Tiplasmide
in het DNA van een plantencel te integreren wordt dit plasmide vaak gebruikt voor
het inbrengen van vreemde genen in planten (Genetische modificatie, genetic engineering).
Figuur 4.3.13 Het Ti-plasmide van A. tumefaciens. ori is de replicatie-oorsprong, T-DNA is het
fragment waarmee de plant geïnfecteerd wordt (de rest van het plasmide wordt niet overgedragen
naar de plant). Dit fragment bevat tumorgenen waardoor de plant gallen aanmaakt en genen voor de
synthese van nopaline. Daarnaast bevat het plasmide ook nog genen voor het infecteren van de plant
met T-DNA en genen waarmee A. tumefaciens het door de plant aangemaakte nopaline (een opine)
kan metaboliseren
2.3.1.8 Virussen en fagen
Virussen kunnen beschouwd worden als de ultieme parasieten : voor hun vermenigvuldiging zijn ze
volledig afhankelijk van het replicatiemechanisme van de gastheer. Er zijn zowel plantenvirussen als
dierenvirussen en bacterievirussen of bacteriofagen (kortweg fagen).
Als ultieme parasieten is hun structuur zo sterk vereenvoudigd dat ze uit niet veel meer bestaan dan
genetisch materiaal, een eiwitmantel, eventueel een injectiestuk om het genetisch materiaal in de
gastheer te brengen en eventueel een bijkomend omhulsel van glycoproteinen.
86

Figuur 4.3.14 : Structuur van een influenzavirus (links) en van een faag (rechts)
Afhankelijk van de aard van het erfelijk materiaal (DNA of RNA, enkelstrengig of dubbelstrengig) en de
manier waarop dit omgezet wordt naar mRNA (dat de eiwitten voor de vorming van nieuwe
virusdeeltjes moet vormen) worden virussen in verschillende groepen onderverdeeld.
Een interessant virus is het Bloemkoolmozaïekvirus (CaMV, Cauliflower Mosaic Virus) dat
kruisbloemigen aantast. Dit virus heeft een eiwitmantel waarin zich circulair dubbelstrengig DNA
bevindt. Dit DNA bevat een promotor (de 35S-promotor of p35S) die toegepast wordt bij genetische
modificatie.
2.3.1.9 De eukaryotische cel
De organisatie van het DNA in de eukaryotische cel vertoont belangrijke verschillen met dit in de
prokaryotische cel :
• DNA is geconcentreerd in de celkern,
• het DNA is verdeeld in chromosomen, complexen van DNA en basische eiwitten (histonen).
Figuur 4.3.15 Een chromosoom.
87

• de verschillende genen voor een biochemische pathway zijn bij eukaryoten meestal verspreid
over het DNA, soms zelfs over verschillende chromosomen, en er zijn meerdere
controlestructuren,
• het DNA bevat ook veel niet-coderende gebieden (‘junk-DNA’), vaak binnenin een gen voor
een bepaald eiwit. Deze interne niet-coderende stukken in een gen staan bekend als introns;
de coderende stukken zijn dan de exons. Bij de transcriptie van DNA tot RNA worden de
introns verwijderd uit het RNA om een volledig coderende mRNA-streng te krijgen. De
eiwitsynthese bij eukaryoten kan dan ook voorgesteld worden als DNA => pre-mRNA =>
mRNA => eiwit.
De meeste genen van de eukaryotische cel bevinden zich in de celkern; er zijn echter twee organellen
die zelf ook genen bevatten : de mitochondriën en de chloroplasten. Hun aantal genen is echter
gering, maar ze vertonen wel enkele verschillen met die in de celkern zoals het feit dat sommige
basentriplets voor andere aminozuren coderen.
2.3.1.10 Relaties
De organismen op Aarde kunnen we onderverdelen in verschillende grote groepen die evolutionair
met elkaar verwant zijn doordat ze een gemeenschappelijke voorouder hebben. Die evolutionaire
relaties verklaren een aantal vaststellingen :
• alle leven gebruikt dezelfde aminozuren,
• alle leven is gebaseerd op RNA en DNA,
• alle leven gebruikt dezelfde principes voor replicatie, transcriptie en translatie.
In deze context is het dus niet zo verwonderlijk dat de uitwisseling van genetische elementen
tussen organismen die tot zeer verschillende domeinen van het leven behoren, mogelijk is.
2.3.2 PCR : de Polymerase Chain Reaction
2.3.2.1 Het analytisch probleem
Stel dat we de aanwezigheid van een bepaald gen, of algemener van een bepaalde DNA-sequentie,
wensen te bepalen in een cel. Hierbij stoten we op drie problemen :
• de gezochte sequentie maakt slechts een zeer klein deel uit van het totale aanwezige DNA,
• het aantal kopijen van die sequentie is meestal zeer klein, soms is er maar één kopie in de cel
aanwezig, waardoor directe detectie onmogelijk is, en
• we zoeken naar de spreekwoordelijke naald in de hooiberg : hoe kunnen we de gezochte
sequentie onderscheiden van de rest van het DNA ?
We hebben dus te maken met het probleem van een te lage concentratie en een gebrek aan
specificiteit.
88

De oplossing van dit probleem is om
• ervoor te zorgen dat op de een of andere manier de gezochte sequentie vermenigvuldigd
wordt zodat de concentratie groot genoeg wordt om detectie mogelijk te maken, en
• ervoor te zorgen dat die vermenigvuldiging alleen slaat op de gezochte sequentie en niet op
het andere aanwezige DNA. We hebben dus behoefte aan een selectieve vermenigvuldiging.
2.3.2.2 De analytische oplossing : PCR
De oplossing voor het gestelde probleem bestaat er in dat men voor de vermenigvuldiging van het
gezochte fragment gebruik maakt van de processen die in de natuur aangetroffen worden om DNA te
vermenigvuldigen, maar deze stuurt volgens onze doelstellingen. Deze techniek, die bekend staat als
PCR (Polymerase Chain Reaction of polymerase kettingreactie) werd in 1983 voorgesteld door
Kary Mullis, die daarvoor in 1993 de Nobelprijs ontving.
Het uitgangspunt voor de PCR is de replicatie van DNA zoals die in de natuur plaatsvindt, in vitro toe
te passen mits een aantal aanpassingen :
• het scheiden van de 2 DNA-strengen gebeurt niet door helicase maar door ‘smelten’ : het
DNA wordt verwarmt waarbij dit overgaat van dubbelstrengig naar enkelstrengig DNA,
• de primers worden niet aangemaakt door het enzym primase, maar worden kant-en-klaar in
de proefbuis gebracht. Dit is zeer belangrijk, want het betekent dat men op die manier
controle heeft over de sequentie van de primer – zoals we zullen zien is dit essentieel voor
PCR. Bij afkoelen van de oplossing zullen de primers in oplossing zich hechten op het
enkelstrengig DNA en wel op de plaatsen met een basenvolgorde die complementair is
aan die van de primers,
• het aldus gevormde primer – DNA complex is het startpunt voor hechting van DNApolymerase
waarna het polymerase de primer kan verlengen in de 5’ => 3’ richting zodat
opnieuw een dubbelstrengig DNA gevormd wordt.
89

Dit proces wordt schematisch voorgesteld in de volgende figuur :
Het belangrijkste aspect van dit proces is dat het herhaald kan worden ! Bij elke cyclus waarbij het
volledige proces doorlopen wordt, wordt DNA vermenigvuldigd vanaf de primersequentie. Als men dit
een voldoende aantal malen na elkaar uitvoert – en bij elke cyclus treedt er een verdubbeling op – dan
kan de concentratie tenslotte groot genoeg worden voor detectie.
Bij PCR zijn er nog een aantal aspecten waarmee rekening moet gehouden worden om het principe
zinvol te kunnen toepassen :
• het DNA-polymerase moet bestand zijn tegen de smelttemperatuur van het DNA (95°C).
Gewone polymerase is daar niet tegen bestand en wordt bij deze temperatuur gedenatureerd,
daarom wordt als alternatief een hittestabiel polymerase gebruikt afkomstig van extreme
thermofielen. Meestal is dit het polymerase van Thermus aquaticus (Taq-polymerase).
• in de oplossing moeten de individuele nucleotiden (A T C G) aanwezig zijn, anders kan het
polymerase zijn functie natuurlijk niet vervullen, daarnaast moeten de omstandigheden
geschikt zijn voor de activiteit van het polymerase (ionensterkte, de aanwezigheid van Mg ++ ,
K + e.d.),
• de geschikte primers moeten in de oplossing aanwezig zijn. De primers zijn cruciaal want zij
bepalen het startpunt vanaf waar de complementaire DNA-streng zal verlengd worden; ze
moeten dan ook complementair zijn aan de sequentie van dit startpunt. Dit betekent dat,
wanneer men een bepaalde sequentie wenst op te sporen, de primers moeten aangrijpen in
90

de buurt van de gezochte sequentie. In de praktijk worden 2 primers gebruikt : een die
complementair is met een sequentie bij het begin van het gezochte fragment (de ‘forward
primer’), en een die complementair is met een sequentie aan het einde ervan (de ‘reverse’
primer).
Schematisch kan het principe als volgt voorgesteld worden :
• we starten met een oplossing met het originele enkelstrengige DNA (na ‘smelten’), de
geschikte ionen en nucleotiden, een primer en het DNA-polymerase. ‘Startsequentie’ is het
gebied op het DNA waarop de complementaire primer aangrijpt :
• tijdens de eerste cyclus bindt de primer zich tijdens het afkoelen op de complementaire
sequentie van het DNA en vormt daardoor een kort dubbelstrengig stukje. Het Taqpolymerase
gebruikt dit als startpunt voor de verlenging van de keten – deze verlenging
gebeurt in principe tot het einde van de keten. We krijgen daardoor een stuk dubbelstrengig
DNA dat start vanaf de primer.
• bij verhogen van de temperatuur worden de twee strengen van elkaar gescheiden en kan het
proces zich herhalen.
91

• merk op dat er in het voorbeeld bij elke cyclus een enkele nieuwe keten gevormd wordt. Dat
betekent dat het aantal nieuwgevormde strengen maar langzaam toeneemt (1 per cyclus),
• elke nieuwgevormde streng begint bij de primer en gaat tot waar het polymerase stopt. Dat
betekent dat de nieuwe streng meestal veel langer is dan de gezochte sequentie.
Deze uitvoering is dus weinig efficiënt. Om het proces efficiënter te laten verlopen voegt men een
tweede primer toe, de ‘reverse’primer :
• deze tweede primer bindt zich op de complementaire DNA-streng en wel op een plaats in de
buurt van het einde van de gezochte sequentie (gerekend op de eerste streng),
• omdat deze primer zich op de complementiare streng bindt, verloopt de verlenging door
polymerase in de 5’=> 3’ richting op die streng, waardoor de verlenging ‘van achter naar voor’
loopt gezien vanuit de eerste streng. Dat is de reden waarom deze tweede primer de
‘reverse primer’ genoemd wordt terwijl de primer die zich bindt met de eerste streng bekend
staat als de ‘forward primer’.
Bij het gebruik van een dergelijk primerpaar wordt het proces van de PCR opeens veel efficiënter,
zoals uit volgend overzicht blijkt :
92

Bij gebruik van de twee primers verloopt de eerste cyclus nu als volgt :
• denatureren van het dubbelstrengig DNA naar enkelstrengig DNA door verwarmen,
• bij afkoelen : binden van de forward primer op de eerste streng aan kant van het begin van het
gezochte fragment en van de reverse primer op de complementaire streng aan de kant van
het einde van het gezochte fragment,
• het Taq-polymerase verlengt de twee ketens vanaf elke primer in de 5’ => 3’ richting zodat die
gedeeltelijk dubbelstrengig worden,
• we hebben nu twee gedeeltelijke dubbele strengen gescheiden die bestaan uit de 2 originele
strengen (volledige lengte) en twee verschillende nieuw aangemaakte kortere ketens die elk
starten bij een verschillende primer en een verschillende lengte hebben.
Tijdens de tweede cyclus gebeurt het volgende :
• bij de volgende verwarmingscyclus worden de dubbele strengen gescheiden; we krijgen dan 4
enkele strengen : de 2 originele met de volle lengte en de twee nieuwe met een kortere
lengte,
• bij afkoelen binden de primers zich op de complementaire plaatsen, zowel van de originele
strengen als van de nieuwe. Merk op dat de primers ‘ergens middenin’ de strengen binden
(zie figuur),
• het Taq-polymerase verlengt de ketens vanaf elke primer in de 5’ => 3’ richting,
• er zijn nu in totaal 8 strengen :
o de 2 originele strengen met de volledige lengte,
o 4 ‘kortere’ nieuw aangemaakte ketens : 2 met een (theoretische) lengte vanaf de
forward primer tot het einde van het oorspronkelijke template en 2 met een
(theoretische) lengte vanaf het begin van de template tot de reverse primer
(complementair),
o 2 korte strengen met een lengte die de afstand is tussen de forward en de reverse
primers (aangeduid met pijltjes in de figuur).
93

De korte strengen omvatten het DNA-fragment dat we zoeken; in het ideale geval is deze streng
precies even lang als de gezochte sequentie, maar in de praktijk kan het wat langer of korter zijn (de
primers voor het exacte begin en einde van het gezochte fragment kunnen bijvoorbeeld niet selectief
genoeg zijn, of het fragment kan te lang zijn om goed vermenigvuldigd te worden).
Het fragment met een lengte tussen de forward en de reverse primer wordt het amplicon genoemd.
Bij elke volgende PCR-cyclus nemen de strengen toe als volgt :
• er komen telkens twee nieuwe ‘kortere’ strengen bij,
• elke ‘kortere’ streng is de template voor een nieuwe korte streng,
• elke korte streng is de template voor een nieuwe korte streng met precies dezelfde lengte. Dit
betekent dat bij elke cyclus het aantal korte strengen verdubbelt.
94

Als we de aantallen van elke soort streng uitrekenen voor elke cyclus krijgen we de volgende tabel :
Tabel 4.3.1 : ‘Lang’ is het aantal strengen met de volledige lengte (= originele DNA-strengen, blijft 2
tijdens de volledige analyse), ‘Ingekort’ is het aantal DNA-strengen met een lengte vanaf een primer
tot het einde van de originele streng, ‘Kort 1 e duplex’ geeft de exponentiële vermenigvuldiging van de
eerste korte streng (lengte van forward primer tot reverse primer) aan en ‘Kort totaal’ het totale aantal
korte strengen aanwezig in die cyclus (denk er aan dat er bij elke cyclus een bijkomende nieuwe korte
duplex gevormd wordt).
Het is duidelijk uit de tabel dat het aantal korte strengen exponentieel toeneemt, waardoor er na een
15-tal cycli al een toename is met een factor 65 000. Deze sterke concentratietoename, die praktisch
volledig op rekening kan geschreven worden van de korte ketens (= het gezochte fragment), maakt
detectie mogelijk. Dit kan gebeuren met UV-detectie (DNA absorbeert sterk bij 260 nm) maar in de
praktijk neemt men zijn toevlucht tot fluorimetrische methoden (zie verder).
95

Wanneer de reactie in een speciaal daarvoor bestemd instrument (een thermocycler met real-time
detector) gevolgd wordt, krijgt men de volgende grafiek :
Men kan elke curve in deze grafiek verdelen in een aantal gebieden :
• eerst een vlakke fase (A) : de toename aan amplicons is nog te klein voor detectie,
• dan een exponentiële fase (B) : het aantal amplicons wordt detecteerbaar en stijgt
exponentieel. De reactie is goed op gang gekomen en de stijging kan bijna uitsluitend op
rekening van de toename aan korte ketens geschreven worden,
• tenslotte een afvlakkende fase (C) die eindigt in een plateau (D) : de reactie wordt geremd
zodat het verloop niet meer exponentieel is. De reden voor de remming is meestal het
opraken van een van de reagentia (nucleotiden en primers).
96

Wegens de exponentiële toename kunnen we de aantallen amplicons ook transformeren in hun
logaritme, waarbij de exponentiële fase een rechte wordt in de grafiek :
Bij een ideaal verloop krijgt men bij gebruik van een logaritme met basis 10 een helling van 3,3; als
men een logaritme met basis 2 gebruikt, wordt de helling precies 1,0.
2.3.2.3 Voorwaarden voor PCR
Bij de uitvoering van PCR moet met de volgende zaken rekening gehouden worden op het vlak van de
gebruikte reagentia :
• de concentratie aan DNA-template (= het DNA van het monster waarin het gezochte fragment
moet opgespoord worden) mag niet te hoog zijn, want dit kan storen bij de detectie en gaat
meestal samen men een verhoogde concentratie aan inhibitoren,
• het gebruikte polymerase
• de primers
o moet bestand zijn tegen de dissociatietemperatuur van het DNA (95°C),
o meestal wordt Taq-polymerase gebruikt dat herhaalde cycli van 95 °C verdraagt,
o Taq-polymerase bezit 5’ => 3’ exonuclease-activiteit en kan daardoor de
nucleïnezuursequenties die het op zijn weg ontmoet, afbreken.
o Taq-polymerase voert geen proofreading (‘proeflezen’) uit van de gesynthetiseerde
kopie en maakt daardoor relatief vaak fouten bij het synthetiseren van een nieuwe
keten (ca. 1 verkeerde nucleotide per 10 000 basen). Dit betekent dat na 30 cycli
ongeveer 50% van de amplicons een of meer mutaties ondergaan heeft !
o er zijn 2 primers nodig : een forward primer en een reverse primer,
o de primers moeten de juiste sequentie hebben : primers worden ontworpen in functie
van het gezochte fragment en op bestelling gesynthetiseerd. De voorwaarden voor
goede primers zijn dat ze uniek zijn voor de doelsequenties rond het fragment
(selectiviteit), dat ze geen complementaire gebieden hebben en daardoor met elkaar
97

• vrije nucleotiden
dimeren kunnen vormen en dat ze niet te kort zijn. Meestal wordt gekozen voor
primers met een lengte van 20 – 30 basen.
o dA, dT, dC en dG moeten aanwezig zijn als bouwstenen voor de nieuwe ketens,
o soms wordt dT vervangen door dU. Men krijgt dan een type keten dat in de natuur
niet voorkomt (DNA met U i.p.v. T). Voor de uitvoering van de reactie maakt het niet
uit, Taq-polymerase maakt immers geen onderscheid tussen dT en dU en incorporeert
beide in de groeiende keten. Het gebruik van dU levert echter voordelen op bij het
vermijden van contaminatie door reactieproducten van een vorige analyse.
o de ideale concentratie aan nucleotiden bedraagt ongeveer 1mM.
• reactiecondities
o in het reactiemengsel moeten Mg ++ en K + aanwezig zijn,
o Mg ++ wordt toegevoegd als MgCl2, (ca. 2 mM) voor Taq-polymerase (Mg ++ is een
cofactor voor het polymerase),
o de ideale concentratie aan K + is 50 mM, vooral voor de regeling van de ionensterkte.
• afwezigheid van inhibitoren
2.3.2.4 Detectie
o inhibitoren zijn componenten die de reactie kunnen vertragen. De meest voorkomende
zijn polysacchariden (plantaardig materiaal !), ethanol en isopropanol (> 1%), NaCl (>
25 mM), EDTA (> 0,5 mM), SDS, fenol,...
o de meeste van deze inhibitoren worden jammer genoeg vaak gebruikt in een van de
stappen bij de extractie van het DNA...
Er zijn twee grote types van uitvoering van PCR : klassieke PCR en RT-PCR (Real Time PCR, soms
ook QRT-PCR genoemd voor Quantitative Real Time PCR, dit om een onderscheid te maken met
Reverse Transcriptase PCR dat ook als RT-PCR afgekort wordt).
Bij klassieke PCR wordt het resultaat van de analyse pas bepaald nadat de analyse volledig
afgelopen is : men analyseert het reactiemengsel achteraf op de aanwezigheid van de reactieproducten.
Het is de oudste vorm van PCR die tegenwoordig vooral toegepast wordt wanneer men
verder wil werken met de gevormde reactieproducten. De detectie gebeurt meestal met elektroforese
waarbij de producten gescheiden en semi-kwantitatief bepaald worden. Met elektroforese kan ook de
lengte van de aanwezige amplicons bepaald worden, wat een bevestiging kan opleveren dat het
reactieproduct effectief dat is wat men zoekt.
De nadelen van klassieke PCR zijn dat het resultaat van de analyse pas later bekend wordt, en dat
men hiervoor een afzonderlijk lokaal nodig heeft i.v.m. het grote risico op contaminatie.
Bij RT-PCR wordt het verloop van de reactie al tijdens de uitvoering gevolgd, zodat men nog voor de
analyse afgelopen is al een idee heeft van het resultaat. Daartoe worden aan de uitvoering een aantal
aanpassingen aangebracht die de detectie mogelijk moeten maken. Er zijn twee basissystemen voor
detectie tijdens RT-PCR :
98

• niet-specifieke detectie door de vorming van een fluorescerend DNA-complex en
• specifieke detectie met een fluorescerend afbraakproduct dat gevormd wordt bij de verlenging
van het DNA. Van dit principe bestaan verschillende varianten; de meest bekende is het
TaqMan-systeem.
2.3.2.4.1 Niet-specifieke detectie met een fluorescerend DNA-complex
Bij deze detectiemethode wordt aan het reactiemengsel een intercalerende kleurstof toegevoegd : een
verbinding die zich bindt aan dubbelstrengig DNA door zich tussen de basen te wringen aan de kant
van de kleine groeve (minor groove) van het dsDNA. De meest gebruikte intercalerende kleurstof is
SybrGreen I, een cyanineverbinding.
Figuur 4.3.16 Intercaleren van SybrGreen in het dsDNA waarbij fluorescentie optreedt
Het gevormde SybrGreen-dsDNA complex absorbeert licht met een golflengte van 488 nm (blauw) en
stuurt dit opnieuw uit (fluorescentie) bij 560 nm (groen, vandaar de naam); daardoor kan aan de hand
van de sterkte van de fluorescentie de hoeveelheid dsDNA bepaald worden. De binding met dsDNA is
echter niet specifiek in de zin dat SybrGreen zich bindt aan alle dsDNA, wat betekent dat de
fluorescentie wel een maat is voor het aantal plaatsen waar SybrGreen gebonden is (en van de totale
hoeveelheid dsDNA) maar niets zegt over de aard van dit DNA.
De binding van SybrGreen met dsDNA is reversibel : wanneer de temperatuur stijgt en dsDNA
overgaat in ssDNA, gaat de kleurstof terug in oplossing en verdwijnt de fluorescentie. Bij afkoelen,
wanneer het ssDNA terug samenkomt om dsDNA te vormen, wordt het SybrGreen-dsDNA complex
opnieuw gevormd en verschijnt de fluorescentie opnieuw. Dit betekent ook dat de meting moet
gebeuren bij lagere temperatuur want het DNA moet zich in de dubbelstrengige vorm bevinden.
Dit reversibel gedrag is de basis voor het opstellen van een smeltcurve. Hierbij start men bij een lage
temperatuur, waarbij het DNA als dsDNA aanwezig is en de SybrGreen moleculen hierop gebonden
zijn, waardoor er een sterke fluorescentie optreedt. Men drijft de temperatuur dan langzaam op; vanaf
een bepaalde temperatuur begint het dsDNA te denatureren en komen de twee strengen van elkaar
99

los. Daardoor neemt de fluorescentie af; binnen een beperkt temperatuurtraject van enkele graden
wordt het dsDNA bijna volledig gedenatureerd tot ssDNA en verdwijnt de fluorescentie bijna volledig.
De temperatuur waarbij de helft van het DNA omgezet is in ssDNA is de smelttemperatuur Tm. De
smelttemperatuur kan daardoor gebruikt worden voor de bevestiging van de aard van een
amplificatieproduct. Men gebruikt in de praktijk meestal de eerste afgeleide van de smeltcurve,
waardoor het sigmoïde verloop omgezet wordt in een piek en de top van de piek overeenstemt met de
smelttemperatuur (zie figuur).
Figuur 4.3.17 Drie smeltcurves en hun afgeleiden.
100

2.3.2.4.2 Specifieke detectie met fluorescentie
Bij deze specifieke detectie worden korte DNA-sequenties – de ‘probes’ - gebruikt die complementair
zijn met een deel van het fragment dat zich tussen de primers bevindt en dat gedetecteerd moet
worden. Dit impliceert dat de probes zich zeer specifiek kunnen binden (hybridiseren) aan een
bepaald DNA-fragment.
Als de probe dan nog voorzien is van een systeem om de hybridisatie te detecteren, dan kan de
aanwezigheid van een DNA-fragment zeer selectief opgespoord worden.
Van het principe van de selectieve detectie met probes bestaan verschillende varianten waarvan de
meestgebruikte hierna overlopen worden.
2.3.2.4.3 Hydrolyseprobes : TaqMan
Het TaqMan-systeem maakt gebruik van de 5’ – 3’ exonuclease activiteit van het Taq-polymerase
tijdens het verlengen van de keten. Wanneer Taq-polymerase tijdens de verlenging een reeds
bestaande complementaire sequentie tegenkomt, dan wordt dit gehydrolyseerd en zo verwijderd,
waarna het polymerase op het vrijgekomen stuk de nieuwe complementaire sequentie verder
synthetiseert.
Een TaqMan probe bestaat uit drie delen (zie figuur) :
• de complementaire basensequentie, meestal 20 tot 30 basen lang,
• een fluorofoor, een molecule aan het 5’- einde van de probesequentie die fluoresceert bij
bestraling met licht van de geschikte golflengte. Veelgebruikte fluoroforen zijn FAM (6carboxyfluoresceïne),
VIC (gepatenteerd, structuur wordt niet gegeven), TET
(tetrachlorofluoresceïne), HEX (hexachlorofluoresceïne) en JOE (6-carboxy-4',5'-dichloro-2',
7'-dimethoxyfluoresceïne).
• een quencher, een molecule aan het 3’- einde van de probesequentie die in de nabijheid van
de fluorofoor de fluorescentie ervan onderdrukt. De meestgebruikte quencher is TAMRA (6carboxytetramethylrhodamine).
Bij een intacte probe bevinden de fluorofoor en de quencher zich in elkaars buurt, waardoor de
quencher de fluorescentie van de fluorofoor sterk onderdrukt en er dus praktisch gesproken geen
fluorescentie gemeten wordt. Een vrije fluorofoor zonder quencher in de buurt daarentegen wordt niet
onderdrukt en fluoresceert bij bestraling.
Omdat het 3’-einde van de probe geblokkeerd wordt door de quencher, kan de probe niet gebruikt
worden als primer en bestaat er dus geen gevaar dat het polymerase de keten vanaf de probe zou
verlengen.
101

Figuur 4.3.18 Structuur van een TaqMan probe; R is de fluorofoor (‘Reporter’), Q is de quencher.
Tijdens de analyse met een TaqMan probe gebeurt het volgende :
• bij het begin van de analyse bevat de oplossing het dsDNA, het Taq-polymerase, de
nucleotiden, de primers en de probe,
• bij opwarmen smelt het dsDNA naar ssDNA,
• bij afkoelen zal de probe zich het eerst binden met de doelsequentie. Omdat de
smelttemperatuur van de probe ongeveer 10°C hoger is dan die van de primers, zijn de
primers dan nog niet gebonden aan het DNA,
• bij verder afkoelen binden zich ook de primers met het DNA. Vanaf dat ogenblik kan het Taqpolymerase
het DNA-primercomplex gebruiken als startpunt voor de synthese van de
complementaire keten,
• tijdens de verlenging van de keten ontmoet het polymerase de probe. Wegens de
exonuclease-activiteit van het polymerase wordt de probe gehydrolyseerd en komen de
fluorofoor en de quencher vrij van elkaar in de oplossing terecht. Het gevolg is dat de
fluorescentie niet meer onderdrukt wordt (geen contact meer tussen fluorofoor en quencher)
en de fluorofoor vrij kan fluoresceren bij bestraling. De fluorescentie van de oplossing neemt
toe. Het is in deze stap dat de fluorescentie afgelezen wordt.
• bij de volgende stap wordt de temperatuur weer verhoogd om het dsDNA te laten smelten en
wordt de cyclus herhaald.
102

Figuur 4.3.19 Verloop PCR met TaqMan-probes
We merken dus dat bij elke cyclus de fluorescentie toeneemt; vanaf een bepaalde cyclus zal die goed
meetbaar worden en de typische S-vormige curve van een RT-PCR-reactie vormen.
De detectie gebeurt dus door de afbraak van de probe met toename van het fluorescentiesignaal tot
gevolg. Merk op dat dit een irreversibele reactie is : de fluorescentie kan alleen maar toenemen, dit
in tegenstelling met het gebruik van intercalerende kleurstoffen van het type SybrGreen. Een gevolg
daarvan is dat er geen smeltcurve ter bevestiging kan opgesteld worden; anderzijds is de reactie zeer
specifiek : men detecteert niet meer de toename aan totaal DNA maar de toename aan het gezochte
fragment.
2.3.2.4.4 FRET-probes
FRET staat voor Fluorescence Resonance Energy Transfer, dus de overdracht van resonantie-energie
bij fluorescentie.
In tegenstelling tot TaqMan probes maakt men hier gebruik van 2 probes : een eerste probe met op
het 3’-einde een donor-fluorofoor (meestal fluoresceïne) en een tweede probe met op het 5’- einde
een acceptor-fluorofoor (Red-640 of Red-705).
Wanneer de donor-fluorofoor bestraalt wordt (ideale excitatiegolflengte 493 nm), fluoresceert die bij
een bepaalde golflengte. Als de donor-fluorofoor echter in direct contact staat met de acceptor-
103

fluorofoor (afstand 1 tot 10 nm), dan wordt de aangeslagen energietoestand van de donor
overgedragen naar de acceptor en door deze laatste uitgestraald als licht met een langere golflengte
(640 of 710 nm). We krijgen hier dus het verschijnsel dat er slechts fluorescentie door de acceptor
optreedt wanneer donor en acceptor zich in elkaars onmiddellijke buurt bevinden.
Om dit toe te passen voor detectie van een welbepaalde DNA-sequentie ontwerpt men de twee
probes zo dat ze naast elkaar binden op het gezochte DNA-fragment en waarbij de donorfluorofoor
(het 3’-einde van de eerste probe) zich vlak naast de acceptorfluorofoor (het 5’-einde van de tweede
probe) bevindt. Alleen in deze configuratie kan er fluorescentie bij lange golflente door de acceptor
optreden bij bestraling.
Tijdens de analyse met FRET-probes gebeurt het volgende :
• bij het begin van de analyse bevat de oplossing het dsDNA, het Taq-polymerase, de
nucleotiden, de primers en de twee probes,
• bij opwarmen (naar 95 °C) smelt het dsDNA naar ssDNA,
• bij afkoelen (tot 50 – 55 °C) zullen de primers en de twee probes zich binden,
• de twee probes bevinden zich vlak naast elkaar zodat FRET mogelijk is. Bij bestralen zal de
acceptor fluoresceren; het is in deze stap dat de fluorescentie gemeten wordt.
104

• daarna wordt de temperatuur verhoogd naar de optimale temperatuur voor het Taqpolymerase
(72 °C) waarna het Taq-polymerase de primers verlengt met vorming van de
complementaire keten; tijdens de verlenging ontmoet het polymerase de probes en breekt die
af waardoor de donor- en acceptorfluoroforen vrij van elkaar in de oplossing terechtkomen.
Het gevolg is dat er geen fluorescentie van de acceptor meer kan optreden. De fluorescentie
van de oplossing neemt in deze stap dus af.
• bij de volgende stap wordt de temperatuur weer verhoogd naar 95 °C om het dsDNA te laten
smelten en wordt de cyclus herhaald.
Merk op dat er hierbij 3 temperatuurstappen moeten gebruikt worden : om de acceptorfluorescentie te
kunnen meten moet dit gebeuren voordat het Taq-polymerase de verlenging uitvoert en dit kan door
de temperatuur te verlagen onder de optimale temperatuur voor het polymerase zodat dit nauwelijks
actief is na de binding van de primers en de probes.
Bij elke stap worden de gebonden probes afgebroken door het polymerase, zodat de concentratie aan
probes in de oplossing in het begin groot genoeg moet zijn om ook bij de laatste cyclus aan voldoende
kopijen van het amplicon te kunnen binden.
Het is mogelijk om met FRET-probes een smeltcurve op te stellen : bij lage temperatuur is er
uitsluitend dsDNA. Bij toename van de temperatuur worden de strengen ontwonden tot ssDNA waarop
de FRET-probes kunnen binden en de fluorescentie kan gemeten worden. In tegenstelling tot de
smeltcurve met SybrGreen is er hier een toename en geen afname van de fluorescentie bij
toenemende temperatuur.
2.3.2.4.5 Molecular beacons
Molecular beacons zijn verwant aan TaqMan probes, maar vertonen enkele belangrijke verschillen.
Een molecular beacon is een probe die bestaat uit 4 delen :
• een sequentie van 15 tot 30 basen die complementair is aan een deel van het gezochte
fragment (de ‘loop’),
• aan elk einde van deze sequentie bevindt zich een kortere sequentie van 5 tot 7 basen die
complementair zijn aan elkaar zodat die met elkaar kunnen hybridiseren,
• aan het 5’-einde bevindt zich een fluorofoor, en
• aan het 3’-einde bevindt zich een quencher.
In normale toestand (lage temperatuur en geen complementair DNA aanwezig) is een molecular
beacon opgevouwen in een haarspeldstructuur : de twee korte complementaire stukken hybridiseren
105

met elkaar waardoor de fluorofoor en de quencher met elkaar in contact komen en er geen
fluorescentie optreedt.
Wanneer een molecular beacon in contact komt met een sequentie die complementair is aan de
sequentie van de ‘loop’, dan zal de beacon zich bij voorkeur daarmee binden en een dubbelstrengig
fragment vormen (de stabiliteit van een gebonden ‘loop’ is groter dan die van de haarspeldstructuur)
waardoor de uiteinden van de haarspeld loskomen en de fluorofoor en quencher van elkaar
gescheiden worden; in deze toestand kan de fluorofoor fluoresceren.
In de praktijk wordt de lengte van de ‘loop’ meestal zo gekozen dat het dubbelstrengig gebonden
fragment slechts weinig stabieler is dan de haarspeld. Daardoor is een zeer grote specificiteit mogelijk:
de aanwezigheid van één enkele niet-complementaire base in het DNA kan de binding met de
moleculaire beacon al verhinderen !
Bij gebruik van moleculaire beacons gebeurt de meting van de fluorescentie tijdens de stap waarbij de
beacon zich bindt aan het DNA, want alleen in die fase van de analyse zijn fluorofoor en quencher
gescheiden.
Na de meting wordt de temperatuur verhoogd en voert het polymerase de verlenging uit van de keten
vanaf de primers. Wanneer hierbij een molecular beacon ontmoet wordt, wordt dit vrijgesteld (niet
afgebroken !) waardoor het weer in oplossing terechtkomt en de haarspeldstructuur opnieuw gevormd
wordt. Moleculaire beacons kunnen dus bij elke PCR-cyclus hergebruikt worden.
2.3.2.4.6 Scorpion primers
Scorpion primers zijn een combinatie van primers en een molecular beacon. Net zoals molecular
beacons bestaan scorpions uit een haarspeldstructuur met een fluorofoor en een quencher. Het 3’einde,
waaraan de quencher gebonden is, is hier echter verlengd met een niet-nucleotide molecule
die bekend staat als de PCR-blocker, en hieraan is op zijn beurt een primersequentie bevestigd. Die
PCR-blocker tussen de haarspeld en de primer is er om te verhinderen dat het polymerase de
106

haarspeld zou openen tijdens de binding op de primer en zo aanleiding zou kunnen geven tot de
vorming van niet-specifieke producten.
Een PCR-analyse met scorpions verloopt in de volgende stappen :
• de scorpions bevinden zich in oplossing in de haarspeldvorm,
• bij denaturatie worden zowel het doel-DNA als de haarspeld van de scorpion gedenatureerd,
• bij afkoelen bindt de primer van de scorpion zich op het ssDNA en wordt de haarspeld
opnieuw gevormd,
• het polymerase verlengt de keten uitgaande van de primer met vorming van dsDNA,
• bij de volgende denaturatiestap komt de streng [scorpion + verlengde keten] weer vrij en wordt
de haarspeld geopend,
• bij afkoelen bindt de sequentie van de ‘loop’ van de haarspeld zich met de complementaire
sequentie op dezelfde nieuwgevormde streng (dus een interne hybridisatie) waardoor
fluorofoor en quencher vrijkomen van elkaar en er dus fluorescentie kan optreden. Deze
configuratie is energetisch gunstiger dan binding van de verlengde keten met een
complementaire DNA-streng. Bij deze stap wordt de fluorescentie gemeten. Omdat deze stap
ook die is waarop de primers binden, kan een complementaire scorpion zich op het einde van
de verlengde streng van een dergelijke configuratie binden en vervolgens verlengd worden tot
de PCR-blocker. Op die manier treedt ook bij scorpions de normale verdubbeling van het
aantal strengen per PCR-cyclus op.
Omdat de scorpion verlengd wordt waardoor de primerfunctie verdwijnt, wordt bij elke cyclus scorpion
verbruikt en is het gebruik ervan niet reversibel. Bij elke cyclus neemt de fluorescentie toe. Meestal
beperkt men de afstand van de primer tot de doelsequentie van de probe tot minder dan 200 basen.
107

2.3.2.4.7 Andere varianten
Naast de bovenstaande toepassingen bestaan er nog een aantal andere varianten. Het kenmerk is dat
ze allemaal werken volgens het principe quenching fluorescentie bij binden aan de gezochte
sequentie.
2.3.2.5 Gecombineerde PCR
Het is mogelijk om combinaties van primers en fluoroforen te gebruiken hetzij om verschillende
reacties tegelijkertijd uit te voeren hetzij om het amplicon van een reactie te gebruiken als
startsequentie voor een andere reactie.
Bij singleplex-PCR gebeurt er een enkele bepaling : er is slechts één primerpaar/probe aanwezig. Dit
is de eenvoudigste en meest uitgevoerde variant.
Bij duplex-PCR worden simultaan twee bepalingen uitgevoerd. Dit gebeurt door twee primerparen en
twee verschillende probes toe te voegen zodat er twee reacties tegelijk en onafhankelijk van elkaar
kunnen doorgaan. Om bij RT-PCR de twee reacties van elkaar te kunnen onderscheiden zijn de
probes gekoppeld aan fluoroforen die straling uitzenden bij een verschillende golflengte (vb. FAM en
HEX). Door gebruik te maken van de geschikte filters kunnen de fluorescentiekleuren van elkaar
gescheiden worden waardoor metingen van twee verschillende reacties in eenzelfde well mogelijk
zijn.
Multiplex-PCR is een verder uitgewerkte variant van duplex-PCR waarbij er meer dan twee sets van
primers en probe gebruikt worden. De kleurscheiding van de uitgestraalde fluorescentie evenals de
optimalisatie van de reactiecondities is dan wel een stuk moeilijker.
Nested PCR : hierbij worden twee primersets gebruikt. De eerste set geeft aanleiding tot de vorming
van een lang amplicon waarvan de doelsequentie deel uitmaakt. De tweede primerset omspant de
doelsequentie; omdat deze laatste ook aanwezig is in het lange amplicon gevormd door de eerste
primerset kan het amplicon van deze eerste set gebruikt worden als template voor de tweede reactie.
Er wordt slechts 1 probe gebruikt die zich bindt in het gebied van het korte amplicon waardoor detectie
specifiek is voor de doelsequentie. Dit wordt vaak toegepast bij moeilijk te amplificeren DNA omdat de
amplificatie met het eerste amplicon als template veel gemakkelijker gaat.
108

2.3.2.6 Uitvoering PCR
Figuur 4.3.20 Principe van nested PCR
Alle varianten van PCR starten met een oplossing waarin dsDNA (of RNA in het geval van sommige
speciale toepassingen) aanwezig is met een voldoende zuiverheid.
2.3.2.6.1 Apparatuur
Het basistoestel voor de uitvoering van PCR is de thermocycler. Dit toestel bestaat hoofdzakelijk uit
een verwarmingsplaat waarin een microtiterplaat (96 of 384 wells) past. Deze verwarmingsplaat,
meestal uit aluminium, kan zeer snel opgewarmd of afgekoeld worden. Om die snelle opwarming en
afkoeling mogelijk te maken is deze plaat bevestigd op een Peltier-element waarvan de temperatuur
aan de hand van het Peltier-effect kan geregeld worden.
109

Figuur 4.3.21 Een thermocycler voor RT-PCR. Het onderste gedeelte is de thermocycler voor
klassieke PCR, de geopende kap boven bevat de detector voor RT-PCR.
Naast de verwarmingsplaat waarmee de temperatuur van de microtiterplaat geregeld wordt, wordt ook
de temperatuur van het deksel dat de plaat afsluit verwarmd om condensatie op de top van de wells te
vermijden.
Een thermocycler voor klassieke PCR bestaat uit niet veel meer dan de verwarmingsblok, de
gethermostatiseerde kap en de elektronica om de temperatuur van de verwarmingsblok te controleren
en de temperatuurcyclus te programmeren.
110

Bij een thermocycler voor RT-PCR is er ook nog een detectorblok aanwezig die het mogelijk maakt om
in een bepaalde stap van elke temperatuurcyclus de fluorescentie van de wells te meten. Een dergelijk
detectiesysteem bestaat uit:
• een excitatiebron om de fluorescentie op te wekken. Dit kan een xenonlamp zijn maar ook een
LED die straling uitstraalt in een nauw golflengtegebied. Na de excitatiebron gaat de straling
nog door een filter om het golflengtegebied voor de excitatie te beperken.
• filters om het golflengtegebied af te bakenen waarin de meting van de fluorescentie zal
plaatsvinden,
• een camera of fotodiodes om de intensiteit van de fluorescentiestraling te meten.
Figuur 4.3.22 Een detector voor RT-PCR (Bio-Rad). De LED’s stralen licht in een bepaald
golflengtegebied uit, de fotodiodes meten de intensiteit van de fluorescentie. Merk op dat zowel de
LED’s als de fotodiodes hun eigen filters hebben.
2.3.2.6.2 Uitvoering klassieke PCR
De uitvoering van een klassieke PCR-analyse bestaat uit de volgende stappen :
• Stap 1 : verdunnen van het DNA tot een standaardconcentratie. Een te hoge concentratie aan
DNA kan de reactie remmen.
• Stap 2 : maak een mix die alle basiscomponenten voor de reactie bevat : nucleotiden,
TaqPolymerase, ionen,… Dergelijke mix is kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar.
• Stap 3 : verdeel de mix in buisjes volgens het aantal primerparen dat gebruikt zal worden. Dit
is van belang wanneer men bij een analyse verschillende sequenties samen wenst op te
sporen : elke op te sporen sequentie heeft zijn eigen primerpaar.
• Stap 4 : voeg aan elke (deel)mix het primerpaar toe voor de doelsequentie,
• Stap 5 : pipetteer de mengsels van mix + primers over een microtiterplaat (96 of 384 wells)
volgens een vooraf bepaald schema,
• Stap 6 : voeg aan de wells monsterDNA of controles (positieve controles, negatieve controles,
blanco’s e.d.) toe,
111

• Stap 7 : sluit de plaat af met folie of strips om te verhinderen dat er tijdens de analyse
verdamping optreedt,
• Stap 8 : plaats de plaat in de thermocycler, sluit de kap, programmeer de temperatuurcyclus
en start de analyse,
• Stap 9 : neem de plaat uit de thermocycler en voer de nodige analyses uit om het resultaat
van de reactie te bepalen (vb. gel-electroforese op het PCR-product met kleuring om na te
gaan of een kenmerkende band aanwezig is met de verwachte lengte van een amplicon).
Een temperatuurprogramma bestaat vooral uit de herhaling van een temperatuurcyclus (meestal 40
tot 50 herhalingen) die opgedeeld is in verschillende temperatuurstappen die elk gedurende een
bepaalde tijd aangehouden worden.
2.3.2.6.3 Uitvoering Real-Time PCR
Figuur 4.3.23 Schema van een PCR-temperatuurcyclus
De uitvoering van een Real-Time PCR-analyse verschilt van de uitvoering van een klassieke PCR op
twee belangrijke vlakken :
• toevoegen aan de mix van reagentia die de detectie van de gezochte amplicons moeten
mogelijk maken (SybrGreen of probes),
• de aanwezigheid van een detectormodule op de thermocycler.
De uitvoering van een RT-PCR analyse verschilt bij het gebruik van SybrGreen als detectiesysteem
iets van het gebruik van probes.
RT-PCR met SybrGreen of een probe als detectiesysteem bestaat uit de volgende stappen :
• Stap 1 : verdunnen van het DNA tot een standaardconcentratie,
112

• Stap 2 : maak een mix die alle basiscomponenten voor de reactie bevat : nucleotiden,
TaqPolymerase, ionenen, SybrGreen indien dit als detectiesysteem gebruikt wordt, …
• Stap 3 : verdeel de mix in buisjes volgens het aantal primerparen dat gebruikt zal worden,
• Stap 4 : voeg aan elke (deel)mix het primerpaar en eventueel probe (indien dit als
detectiesysteem gebruikt wordt) toe voor de doelsequentie,
• Stap 5 : pipetteer de mengsels van mix + primers over een microtiterplaat (96 of 384 wells)
volgens een vooraf bepaald schema,
• Stap 6 : voeg aan de wells monsterDNA of controles (positieve controles, negatieve controles,
blanco’s e.d.) toe,
• Stap 7 : sluit de plaat af met folie of strips om te verhinderen dat er tijdens de analyse
verdamping optreedt,
• Stap 8 : plaats de plaat in de thermocycler, sluit de kap, programmeer de temperatuurcyclus
en start de analyse,
• Tijdens de analyse wordt in elke cyclus de fluorescentie van elke well gemeten; de evolutie
ervan wordt grafisch voorgesteld tijdens de analyse zelf.
• Stap 9 : Bij PCR met SybrGreen : na de laatste temperatuurcyclus kan een smeltcurve
opgenomen worden. Hierbij wordt de smelttemperatuur Tm van het product bepaald; deze
smelttemperatuur kan gebruikt worden om de aard van het amplicon te bevestigen.
• Stap 10 : neem de plaat uit de thermocycler. Vaak is de analyse dan volledig afgelopen en kan
de plaat vernietigd worden.
Na elke cyclus wordt de intensiteit van de fluorescentie voorgesteld op grafiek zodat men het verloop
van de reactie in elke well nog tijdens de analyse kan volgen.
2.3.2.7 Interpretatie RT-PCR
De resultaten van klassieke PCR worden pas bekend nadat de post-PCR analyses uitgevoerd zijn. Bij
RT-PCR zijn de resultaten al bekend na de laatste temperatuurcyclus.
Bij RT-PCR wordt het verloop van de reactie (de gemeten fluorescentie) grafisch voorgesteld; bij een
normale reactie verkrijgt men dan een typische sigmoïde curve (zie hoger).
113

SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS
De fase die gebruikt wordt bij de interpretatie en evaluatie van de curve is de exponentiële fase.
Omdat dit gebied na logaritmische transformatie een rechte wordt, zet men in de praktijk alle
fluorescentiewaarden om in hun logaritme vooraleer de resultaten verder verwerkt worden.
2.3.3 PCR en GGO
2.3.3.1 Achtergrond
GGO staat voor Genetisch Gemodificeerd Organisme (fr. OGM = Organisme Génétiquement Modifié,
en. GMO = Genetically Modified Organism). Deze term maakt duidelijk waar het over gaat :
organismen die gewijzigd zijn door veranderingen aan te brengen in hun genetisch materiaal.
De klassieke manier om eigenschappen van organismen te wijzigen is selectie : het selecteren van de
nakomelingen op ‘gunstige’ eigenschappen en het verder kweken met deze nakomelingen in de hoop
dat de eigenschap erfelijk is en zich in het nageslacht zal verspreiden. De klassieke manier is echter
zeer tijdrovend en beperkt : tijdrovend omdat men moet wachten tot de nakomelingen zelf vruchtbaar
zijn om verder te kunnen werken, en beperkt omdat er slechts kan gewerkt worden met kenmerken die
ofwel al aanwezig zijn ofwel spontaan en dus ongecontroleerd optreden. Hoeveel gemakkelijker zou
het niet zijn als men de modificaties zou kunnen kiezen en gestuurd inbrengen in het gewenste
organisme ?
Aangezien de fundamentele principes bij alle organismen gelijk zijn (DNA, replicatie, expressie,…)
leek het niet zo ver gezocht om te zien wat er gebeurde als men genen van een organisme overbracht
in het genoom van een ander organisme. Toen men door kreeg dat dergelijke overdracht ook in de
natuur gebeurde (tussen bacteriën onderling en van bacterie naar eukaryotische cel) had men meteen
een mechanisme dat men voor eigen doeleinden kon aanpassen om andere modificaties over te
dragen.
114

Dergelijke modificaties worden tegenwoordig vooral commercieel toegepast op bacteriën en planten.
De laatste jaren begint men dit ook commercieel toe te passen op dieren. Alles wijst er op dat er met
de jaren steeds meer genetisch gemodificeerde organismen of producten ervan op de markt zullen
komen.
2.3.3.2 Principe
Het principe van een GGO is het wijzigen van het genetisch materiaal van het organisme om een of
meer kenmerken van een cel of organisme te veranderen.
Als startpunt heeft men een sequentie nodig van het gen dat codeert voor de gewenste modificatie,
bijvoorbeeld herbicidetolerantie. Men kan dit gen isoleren en in een plasmide (meestal het Ti-plasmide
van A. tumefaciens) inbouwen en dit dan in een bacterie brengen om het plasmide te laten
vermenigvuldigen. Afhankelijk van de verdere procedure kan men de plant laten infecteren door de
bacterie ofwel kan men het plasmide isoleren uit de bacteriecultuur om het op een andere manier
(micro-injectie, gene gun waarbij men metalen deeltjes gecoat met plasmide in de cel schiet,…) in een
plantencel te brengen. Als geïnfecteerd wordt met A. tumefaciens, dan gebruikt men een defect Tiplasmide
dat dus geen gallen meer vormt.
Aan dit eenvoudige principe moeten echter enkele aanpassingen aangebracht worden om het in de
praktijk ook te laten werken :
• naast het gen moeten er ook controle-elementen (promotor, terminator) aanwezig zijn.
Zonder deze controle-elementen zal het gen niet tot expressie komen. Daarom koppelt men in
het plasmide aan het begin van het gen een promotorsequentie en aan het einde een
terminatorsequentie.
• een veelgebruikte promotor is de p35S-promotor van het bloemkoolmozaïekvirus (CaMV); een
courante terminator is de tNos-terminator van het nopalinegen van A. tumefaciens.
115

• de meeste cellen die men behandelt leveren geen resultaat op. Om de met succes
behandelde cellen te kunnen selecteren, brengt men in het plasmide ook nog een gen voor
resistentie tegen een antibioticum of dat een product aanmaakt waardoor een behandelde cel
kan opgespoord worden. Men kweekt dan bijvoorbeeld de behandelde cellen op in een
voedingsmedium dat het betreffende antibioticum bevat, zodat alleen die waarin het
selectiegen voor de antibioticumresistentie tot expressie komt, zich kunnen ontwikkelen.
Na deze eerste selectie moet er dan verder geselecteerd worden op de expressie en overerfbaarheid
van de modificatie zelf.
De ongerichtheid van de integratie van de modificatie in het genoom betekent ook dat verschillende
cellen waarbij het gen tot expressie komt, dit gen op een andere plaats in het genoom kunnen
hebben. Een cellijn met een welbepaalde plaats van invoegen noemt men een ‘event’.
Een van de eerste toepassingen in de landbouw was RoundUp Ready Soja. In 1996 bracht Monsanto
deze genetisch gemodificeerde soja op de markt waarin een gen gebracht was dat codeerde voor een
enzym (EPSPS) dat minder gevoelig is voor het totaalherbicide RoundUp waardoor deze sojacultivar
tolerant is tegen dit totaalherbicide. Later werden er door een aantal firma’s (Monsanto, Pioneer,
Syngenta, Bayer Crop Sciences,…) ook andere modificaties op de markt gebracht, niet alleen van
soja maar ook van maïs, koolzaad, tomaat, aardappel, papaya, biet, katoen,…
Commercieel is de aandacht vooral toegespitst op modificaties
• van economisch belangrijke gewassen (soja, maïs, koolzaad, aardappel…),
• voor resistentie tegen totaalherbiciden (RoundUp – glyfosaat, Basta – glufosinaat,…)
• voor resistentie tegen insecten (zoals de maïswortelboorder) of virussen (Papaya ringspot
virus),
• voor specifieke eigenschappen (langere stevigheid bij tomaat, meer amylopectine in
aardappelzetmeel, hoger vitamine-A gehalte in rijst,…).
Wanneer men een aantal cultivars van eenzelfde soort (species) heeft die gemodificeerd zijn voor
verschillende kenmerken, vb. een maïsvariëteit die tolerant is voor een herbicide en een maïsvariëteit
die resistent is tegen de maïswortelboorder, dan kan men die kruisen om een cultivar te krijgen die
beide modificaties bevat en dus de twee kenmerken samen bezit. Men spreekt dan van een cultivar
met stacked events: de combinatie van twee of meer modificaties in dezelfde plant.
116

2.3.3.3 Toegepaste modificaties
De op dit ogenblik commercieel belangrijkste modificaties zijn herbicidetolerantie en resistentie tegen
insecten.
Opmerking : de afkortingen van genen worden cursief geschreven (pat), de genproducten (eiwitten,
enzymen) worden met hoofdletters aangeduid (PAT).
2.3.3.3.1 Herbicidetolerantie
Totaalherbiciden werken door in de cel een bepaalde metabolische weg te storen door het inactiveren
van een of meer enzymen. Om herbicidetolerantie in te brengen in een plant die van nature niet
tolerant is, bestaan er twee mogelijke benaderingen : inbrengen van een gen dat codeert voor een
enzym dat de actieve stof onschadelijk maakt, of het inbrengen van een gen dat codeert voor een
gemodificeerd enzym waarop de actieve stof geen effect meer heeft.
2.3.3.3.2 Resistentie tegen insekten
De bacterie Bacillus thuringiensis (Bt) produceert een eiwit dat toxisch is voor de larven van een groot
aantal insecten (het δ-endotoxine, CRY-toxine). Inbrengen van het Cry gen zorgt voor de
aanwezigheid van dit CRY-eiwit in de plant waardoor larven die de plant aanvreten het toxine
binnenkrijgen en sterven.
Het Cry gen bevat een variabel gebied, waardoor er veel verschillende varianten van dit gen bestaan
die elk voor een toxine coderen dat schadelijk is voor een andere groep insecten.
2.3.3.4 Toepassingen : enkele gecommercialiseerde GGO’s
2.3.3.4.1 Soja (Glycine max)
Identificatie Gen Promotor Terminator
MON 40-3-2, RoundUp
Ready Soja
cp4-epsps p35S tNos
MON89788 cp4-epsps / ctp2 p-FMV/Tsf1 T-E9
A2704-12 pat p35S t35S
Soja was een van de eerste teelten waarvoor een GGO op de markt gebracht werd (RoundUp Ready
Soja, Monsanto). Zoals hierboven vermeld bezit deze GGO een betere tolerantie biedt tegen het
totaalherbicide glyfosaat (RoundUp). Als promotor en terminator werden p35S en tNos gebruikt.
Een glyfosaat-tolerante soja van de tweede generatie is MON89788 (Monsanto); hierbij werden een
andere promotor en terminator gebruikt voor een betere controle van de expressie.
117

LibertyLink soja (Soja A2704-12, Bayer Crop Science) bezit een modificatie voor tolerantie tegen het
totaalherbicide glufosinaat dat op de markt gebracht wordt onder de namen Liberty, Basta, Rely en
Finale.
Omdat er bij bepaalde onkruiden resistentie tegen glyfosaat vastgesteld werd zodat dit herbicide
minder effectief is, kan teeltrotatie met verschillende soja-GGO’s gekoppeld aan het gebruik van
verschillende totaalherbiciden het optreden van resistentie vertragen.
2.3.3.4.2 Maïs (Zea mays)
Maïs is de soort waarvan er het meest GGO’s op de markt gebracht zijn. De maïs-GGO’s kunnen in
de volgende groepen ingedeeld worden :
• alleen modificatie voor herbicidetolerantie
Identificatie Gen Promotor Terminator
T25 pat p35S t35S
NK603 epsps / epsps
elk epsps gen heeft
eigen promotor,
waaronder p35S
tNos (2x)
GA21 mepsps (modified epsps) p-ract1 (rijst actine) tNos
• alleen modificatie voor insectenresistentie
Identificatie Gen Promotor Terminator
MON810 Cry1Ab p35S tNos
MIR604 Cry3A / pmi pMTL / pUbi tNos (2x)
MON863 Cry3Bb1 / nptII p35S (2x) tNos
pmi bij MIR604 en nptII bij MON863 zijn selectiegenen.
De verschillende CRY-eiwitten zijn werkzaam tegen Diabrotica spp., Ostrinia nubilialis en Sesamia
spp. (maïswortelboorders).
118

• modificatie voor herbicidetolerantie en insectenresistentie
Identificatie Genen Promotor Terminator
Bt11 Cry1Ab / pat p35S (2x) tNos (2x)
Bt176 Cry1Ab (2x) / bar
DAS59122 (Herculex)
1507 Cry1F / pat
Cry34Ab1 / Cry35Ab1 /
pat
2.3.3.4.3 Koolzaad (Brassica napus)
elk gen heeft een eigen
promotor waaronder
p35S bij bar
elk gen heeft een eigen
promotor waaronder
p35S bij pat
elk gen heeft een eigen
promotor waaronder
p35S bij pat
t35S (3x)
elk gen heeft een eigen
terminator waaronder
t35S van CaMV bij pat
elk gen heeft een eigen
terminator waaronder
t35S van CaMV bij pat
Identificatie Gen Promotor Terminator
GT73 (canola) cp4-epsps / goxv247 p-CMoVb (2x) t-E9
Topas 19/2 pat / nptII p35S / pNos t35S / tActS
T45 pat p35S
2.3.3.4.4 Rijst (Oryza sativa)
Identificatie Gen Promotor Terminator
LLRICE62 bar p35S t35S
Daarnaast zijn er ook GGO’s van tomaat (Solanum lycopersicum), aardappel (Solanum tuberosum),
katoen (Gossypium hirsutum), papaya (Carica papaya) enz.
2.3.3.5 Wettelijk kader
Het wettelijk kader voor het op de markt brengen van GGO’s in de Europese Unie wordt vastgelegd in
twee verordeningen uit 2003 en een Aanbeveling van de Commissie van 2004.
De essentie van de twee Verordeningen kan als volgt samengevat worden :
• de verplichting van de producent om de klant in te lichten wanneer men GGO’s of een
afgeleide daarvan levert en de verplichting om voor alle schakels van de voedselketen de
traceerbaarheid te voorzien,
• de producten afgeleid van GGO’s moeten worden geëtiketteerd, zelfs als ze geen sporen
meer vertonen van DNA of eiwitten die uit de genetische modificatie voorkomen,
119

• de etikettering van voor diervoeder bestemde producten is verplicht en is afgestemd op de
normen die op de etikettering van levensmiddelen van toepassing zijn,
• de tolerantiedrempel voor traceerbaarheid en etikettering is 0,9%.
In de Europese Unie wordt een onderscheid gemaakt tussen 2 groepen GGO’s : die waarvoor een
autorisatie voor gebruik in diervoeder of als levensmiddel toegekend werd en die zonder autorisatie.
De algemene regel is dat bij een geautoriseerde GGO de aanwezigheid en het gehalte ervan moet
voorkomen op het etiket wanneer het gehalte meer bedraagt dan 0,9 %; lagere gehaltes worden
beschouwd als insleep van een vorige productie tijdens het verwerkingsproces en moeten niet
gedeclareerd worden op het etiket.
Voor niet-geautoriseerde GGO’s is aanwezigheid niet toegelaten; voor deze GGO’s geldt een
nultolerantie en bij aanwezigheid van een niet-geautoriseerde GGO mag het product niet in de handel
gebracht worden.
De lijst van de geautoriseerde GGO’s wordt bijgehouden door DG SANCO en kan gevonden worden
op http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm.
2.3.3.6 Analyse van GGO’s
De analyse van GGO’s heeft twee doelstellingen :
• het opsporen van de aanwezigheid van GGO’s in een product, en
• bij aanwijzingen voor de aanwezigheid : identificatie van de aanwezige GGO en de bepaling
van het gehalte in het product. Dit laatste is vooral van belang om de limiet van 0,9% die in de
Verordening vastgelegd is, te controleren.
De belangrijkste aspecten waar men bij het opsporen van de aanwezigheid van een GGO rekening
mee moet houden zijn :
• de gensequentie voor het kenmerk : dit bepaalt de aard van het nieuwe kenmerk,
• de promotor en terminator voor de expressie van het gen,
• de integratieplaats van de genetische functionele eenheid in het genomisch DNA van de plant:
bepaalt de event.
De analyse bestaat uit de volgende stappen :
• screening, waarbij kwalitatief bepaald wordt welke taxa aanwezig zijn (soja, maïs,
koolzaad,…) en de aanwezigheid van twee soorten ‘merkers’ nagegaan wordt : de
veelgebruikte promotor p35S en de terminator tNos. Een positief resultaat voor een van beide
wijst op genetische modificatie. Daarnaast kan men eventueel nog een of meer
veelvoorkomende gemodificeerde genen opsporen om het verdere onderzoek te beperken.
• identificatie : wanneer de aanwezigheid van een GGO vermoed wordt op basis van de
resultaten van de screening, moet de aanwezige event geïdentificeerd worden. Bij de
identificatie worden de verschillende mogelijke events allemaal kwalitatief getest op hun
aanwezigheid door een PCR uit te voeren voor het overgangsgebied waar het construct
120

geïntegreerd is in het genoom. De aanwezigheid van een sequentie die de overgang tussen
het genomisch DNA van de plant en het DNA van de modificatie (promotor of terminator)
omvat legt het event eenduidig vast.
• kwantificatie : eenmaal de aanwezige events geïdentificeerd zijn, moet hun gehalte bepaald
worden. Daarvoor gebruikt men standaarden met een gekend gehalte die men samen met het
monster analyseert en op basis waarvan men het gehalte van het onbekende monster afleidt.
121

3 MATRIX – PARAMETERS
3.1 Inleiding
Het FAVV controleert talrijke componenten die voorkomen in de voedselketen. Hiertoe behoren de
residu’s en contaminanten in producten van dierlijke oorsprong waarvan de controle wordt opgelegd
door Richtlijn 96/23/EG van de Raad van 29 april 1996.
Deze richtlijn bevat controlemaatregelen ten aanzien van bepaalde stoffen en residu’s daarvan in
levende dieren en in producten daarvan, zoals vlees, melk en honing. Deze richtlijn bepaalt hoe een
nationaal controleprogramma moet worden opgesteld: welke residu’s jaarlijks moeten worden
opgespoord, in welke matrix en met welke frequentie. Elk jaar dient elke lidstaat een nationaal
controleplan op te stellen en voor te leggen aan de EU.
De Europese wetgeving wordt door België vertaald in het ‘Nationaal Plan voor Residuen en
Contaminanten in levende dieren en dierlijke producten’.
Bijlage I van deze richtlijn verdeelt de residu’s in 2 groepen: groep A omvat de verboden stoffen en
groep B de diergeneesmiddelen en contaminanten.
Tabel 3.1.1: Bijlage I van EU Richtlijn 96/23/EG
Groep A: Stoffen met anabole werking en niet-toegelaten stoffen
(1) Stilbenen, derivaten, zouten en esters daarvan
(2) Thyreostatica
(3) Steroïden
(4) Resorcyclische zure lactonen, met inbegrip van zeranol
(5) Beta-agonisten
(6) Verbindingen opgenomen in Annex IV van Verordening (EEG) 2377/90 van de Raad van
26 juni 1990
Groep B: Diergeneesmiddelen 1 en contaminanten
1. Infectiewerende middelen, met inbegrip van sulfonamiden en quinolonen
2. Andere diergeneesmiddelen
a) Anthelmintica – ontwormingsmiddelen
b) Anticoccidia, met inbegrip van nitro-imidazolen
c) Carbamaten en pyrethroïden
d) Tranquillizers – kalmeermiddelen
e) Niet-steroïdale anti-inflammatoire farmaca (NSAID)
f) Overige farmaca
3. Andere in het milieu aanwezige stoffen en milieucontaminanten
g) Organische chloorverbindingen, met inbegrip van PCB’s
h) Organische fosforverbindingen
i) Scheikundige elementen
j) Mycotoxinen
k) Kleurstoffen
l) Overige verbindingen
1 Met inbegrip van niet-geregistreerde stoffen die eventueel voor veterinaire doeleinden kunnen
worden gebruikt.
122

In dit hoofdstuk worden vele van deze groepen besproken en worden ook de belangrijkste
analysetechnieken vermeld.
Verder worden ook nog andere belangrijke componenten behandeld zoals antibiotica, dioxines,
acrylamide, zware metalen, coccidiostatica, vitamines…
3.2 Componenten met hormonale werking
3.2.1 Stilbenen en afgeleiden
3.2.1.1 Structuur
Deze groep van stoffen zijn synthetische estrogenen. Zij bezitten een activiteit vergelijkbaar met het
natuurlijke hormoon estradiol, doch hebben in tegenstelling tot de geslachthormonen geen steroïde
structuur. Het diëthylstilbestrol (DES) is de meest bekende vertegenwoordiger van de groep der
stilbenen en staat chemisch gezien niet zo ver van de natuurlijke estrogenen als op het eerste zicht
kan worden vermoed. Dit komt duidelijk tot uiting bij nader toezicht op de structuur van
diëthylstilbestrol.
Figuur 3.2.1: de overeenkomst in structuur tussen diëthylstilbestrol (links) en 17ß-estradiol (rechts)
Het estrogeen effect wordt vooral toegeschreven aan het feit dat de twee hydroxylgroepen op dezelfde
ruimtelijke afstand staan als bij estradiol. Er zijn nog een aantal andere aan diëthylstilbestrol verwante
verbindingen, eveneens met estrogene werking (zie Figuur 3.2.2).
HO
HO
Diëthylstilbestrol
OH
HO
OH
Figuur 3.2.2: analogen van DES: hexestrol en dienestrol
3.2.1.2 Effecten en toxiciteit voor mens en/of dier
Hexestrol
Diëthylstilbestrol werd gebruikt als voederadditief of als implant in het oor van runderen om de groei te
stimuleren. Het bleek echter kankerverwekkend.
OH
HO
Dienestrol
OH
123

'DES-dochters' (waarvan de moeders DES voorgeschreven kregen ter voorkoming van een miskraam)
hadden een vergrote kans op vruchtbaarheidsproblemen en kregen soms ook een bijzondere vorm
van kanker aan de vagina of de baarmoedermond.
Het gebruik van stilbenen is dan ook overal verboden.
3.2.1.3 Analysetechnieken
DES wordt langzaam gemetaboliseerd in de lever en geëxcreteerd in urine en faeces. Er werden ook
methodes ontwikkeld voor het opsporen in spierweefsel, vaak de enige matrix bij invoer.
De gebruikte technieken zijn GC-MS (en/of GC-MS n en GC-MS/MS) en meer en meer ook LC-MS
(en/of LC-MS n en LC-MS/MS).
3.2.2 Thyreostatica
3.2.2.1 Inleiding
Bij de industrialisatie van de veeteelt probeert men de productiviteit te verhogen door meer
vlees/gewicht te produceren tegen een gelijke of geringere kostprijs. De thyreostatica of schildklierremmers
behoren tot de hulpmiddelen die daarbij, zij het illegaal, zijn aangewend.
3.2.2.2 Effecten en toxiciteit voor mens en/of dier
De effecten bij runderen van thyreostatica of schildklierremmers zijn toe te schrijven aan het
onderdrukken van de normale werking van de schildklier. Daardoor ontstaat een verlaagde productie
van schildklierhormonen, het thyroxine (T4) en het trijodothyronine (T3). Hierdoor ontstaat er een
verhoogde vulling van het maag-darmkanaal en een grotere retentie van water in de weefsels. Dit
resulteert in een spectaculaire gewichtstoename op korte tijd.
Het vlees, afkomstig van dieren behandeld met thyreostatica is veelal nat en druiperig, vaak bleker en
zeker van mindere kwaliteit. Het gebruik van thyreostatica kan dan ook als een duidelijke vorm van
bedrog beschouwd worden: men verkoopt immers aan de consument "water" voor de prijs van vlees.
Bovendien zijn er sterke aanwijzingen dat de aanwezigheid van residuen van thyreostatica en van hun
metabolieten in vlees schadelijk kan zijn voor de volksgezondheid. Sommige stoffen zijn
kankerverwekkend en teratogeen 1 .
Het gebruik van thyreostatica bij slachtvee is dan ook in de EU en vele andere landen verboden. Door
het opleggen van het verbod dient een efficiënte controle opgezet voor de opsporing van de
toediening van dergelijke verbindingen.
1 teratogeen: eigenschap van een stof om bij de foetus afwijkingen te veroorzaken als de moeder tijdens de
zwangerschap met de stof in aanraking komt, deze inademt of inneemt.
124

3.2.2.3 Structuur en belangrijkste groepen
De schildklierremmers, van belang bij het vetmesten van runderen, kunnen in grote lijnen in twee
groepen onderverdeeld worden:
• een eerste groep wordt gevormd door de natuurlijke thyreostatica, een reeks natuurproducten
met thyreostatische werking;
• een tweede groep omvat dan de lichaamsvreemde of xenobiotische thyreostatica.
De natuurlijke thyreostatica worden voornamelijk aangetroffen in plantenmateriaal onder de vorm van
precursoren, glucosinolaten genoemd. Op het volgende schema is de algemene afbraak van glucosinolaten
weergegeven. Onder invloed van een enzyme, het thioglucosidase of myrosinase, worden
glucose en sulfaat afgesplitst.
R – C
R – C
S-glucose
N-OSO 2 O-
thioglucosidase
R – N = C = S
pH= 5-9 pH = 3-4
isothiocyanaat
nitrile
"R"
R – S – C ≡ N
"R"
oxazolidine-2-thion CN -
SCN- R
C N + S
Figuur 3.2.3 : Algemeen schema van de enzymatische hydrolyse van glucosinolaten (“R” afhankelijk
van de structuur van de R-groep)
De rest van de molecule legt zich dan, afhankelijk van de pH, om tot een isothiocyanaat of tot een
nitrile. Afhankelijk van de structuur van de R-groep, wordt het isothiocyanaat verder omgezet tot een
thiocyanaat en eventueel verder tot het thiocyanaation of tot een oxazolidine-2-thion.
De structuurformule van het belangrijkste oxazolidine-2-thion, het 5-vinylderivaat, is weergegeven in
Figuur 3.2.4. Hierin is de N-C-S sequentie te zien, welke typisch is voor een product met thyreostatische
werking. Het 5-vinyl-1,3-oxazolidine-2-thion kreeg bij zijn ontdekking de triviale naam
"goitrine", dit wegens zijn vermogen om bij de mens en bij het dier een kropgezwel, een "goiter", op te
wekken. Het glucosinolaat waaruit goitrine wordt gevormd, werd "progoitrine" genoemd. Raapzaad
kan tot 1% glucosinolaten bevatten.
S-
N-
+ glucose
+ sulfaat
125

Figuur 3.2.4: structuurformule van 5-vinyl-1,3-oxazolidine-2-thion
De N-C-S sequentie is ook terug te vinden in de meest belangrijke lichaamsvreemde thyreostatica.
Deze omvatten de thiouracil- en mercaptoimidazol-derivaten:
• thiouracil-analogen (met o.a. thiouracil, methylthiouracil en propylthiouracil);
• mercaptoimidazole-analogen (met tapazol en mercaptobenzimidazole).
In de illegale praktijk was vooral het methylthiouracil (MTU) van belang. MTU werd zeer intensief
gebruikt gedurende de 70-er jaren.
C H 3
N
O H
N
Figuur 3.2.5: structuurformules van enkele belangrijke thyreostatica: methylthiouracil, tapazol,
mercaptobenzimidazole
Naast de twee besproken groepen van thyreostatica zijn er verder ook een aantal anorganische ionen,
zoals Li + - -
, ClO4 en SCN die een thyreostatische werking bezitten.
3.2.2.4 Analytiek
S H
C H 3
De opsporing van thyreostatica kan in principe gebeuren op twee manieren:
• indirect (screening): door het waarnemen van symptomen van hypothyreose,
• direct (bevestiging): door het aantonen van residuen van thyreostatica.
N
N
Methylthiouracil Tapazol Mercaptobenzimidazole
S H
N H
N
S H
126

De symptomen van hypothyreose kunnen worden waargenomen op volgende manieren:
• macroscopisch: bv. het waterig uitzicht van het karkas en vooral het voorkomen van een
vergroting van de schildklier;
• gravimetrische analyse: door het wegen van de schildklier van runderen (> 60 g: verdacht),
• microscopisch: veranderingen in het histologisch beeld van de schildklier,
• klinisch-biologisch: door daling van de concentratie van de schildklierhormonen.
De eerste twee methodes liggen meer op het diergeneeskundig vlak, de derde, en ook het aantonen
van residuen van thyreostatica, op het chemische vlak.
Normaal hebben schildklieren van runderen een gewicht van ongeveer 20 gram. Soms werden
kropgezwellen of goiters, typisch voor een dier behandeld met thyreostatica, waargenomen die 200
gram en in een uitzonderlijk geval zelfs tot 1200 gram wogen. Het is echter eveneens mogelijk dat
behandelde dieren, met bvb. MTU, toch geen vergroting van de schildklier vertonen.
Figuur 3.2.6:schildklieren Figuur 3.2.7: een goiter bij de mens
Vaak zijn duidelijke discordanties vastgesteld tussen het chemisch onderzoek en methodes gebaseerd
op symptomen van hypothyreose. Het voornaamste argument dat kan aangehaald worden tegen het
gebruik van de symptomen van hypothyreose als detectiemiddel van thyreostatica is, dat deze
symptomen kunnen worden veroorzaakt door verschillende oncontroleerbare factoren zoals bepaalde
ziekten, jodiumdeficiëntie en het voorkomen van natuurlijke thyreostatica. Deze methodes
(=screeningmethoden) kunnen enkel worden aangewend om monsters voor een beslissend
scheikundig onderzoek (bevestigingsonderzoek) te selecteren.
3.2.2.5 Analysetechnieken voor de lichaamsvreemde thyreostatica
Vroeger werd vaak dunnelaagchromatografie (vb. HPTLC) gebruikt voor de lichaamsvreemde
thyreostatica. Voor een gevoelige detectie diende gederivatiseerd te worden, waarbij de verschillende
thyreostatica dezelfde kleur verkregen.
127

In de EU-lidstaten is heden voor de verboden stoffen (Annex A verbindingen) massaspectrometrie
verplicht volgens Beschikking 2002/657/EG. Oorspronkelijk werd GC-MS (of GC-MS n ) gebruikt, doch
heden worden deze stoffen nog vrijwel uitsluitend opgespoord via LC-MS n of LC-MS/MS.
3.2.2.6 Matrices
Uit dierproeven blijkt dat concentraties van MTU in schildklieren ongeveer 20 tot 100 maal hoger
liggen dan deze in het vlees. Ook in de nier is de MTU concentratie hoger dan in vleesmonsters. Het
is duidelijk dat de schildklier de ideale matrix is om toediening van thyreostatica op te sporen.
Wanneer de schildklier echter ontbreekt, wordt bij voorkeur de M. diaphragma (middenrifspier)
onderzocht. Deze spier kan gemakkelijk worden uitgesneden en geïdentificeerd, heeft weinig
economische waarde en bevat, in verhouding tot de andere spieren, een relatief hoge concentratie
aan thyreostatica. Bij levende dieren is urine geschikt.
3.2.3 Steroïden: stoffen met androgene, estrogene of gestagene werking
3.2.3.1 Inleiding
Het gebruik van hormonale preparaten werd, in de jaren vijftig in de veekweek geïntroduceerd. Het
betreft hier stoffen met estrogene, androgene of gestagene werking, vaak aangeduid met de
benaming anabolica. De aanwending van anabolica resulteert in een snellere gewichtsaanzet van het
dier en een verbeterde voederconversie door toegenomen stikstofretentie tijdens de behandeling.
Het besef dat bepaalde van deze stoffen een gevaar kunnen opleveren voor de volksgezondheid heeft
de wetgevers binnen de EU ertoe aangezet het gebruik van deze stoffen in de veekweek totaal te
verbieden en de slachtdieren op residuen te onderzoeken.
Gezien de te realiseren winst bij gebruik van anabolica in de vetmesterij wordt er nog af en toe
gegrepen naar hormonale preparaten waarvan het gebruik niet altijd eenvoudig kan worden
vastgesteld. Het inzetten van specifieke en universele methodes ter controle van het illegaal gebruik
van anabolica veronderstelt een doelgericht residuonderzoek in het dierlijk materiaal. Onontbeerlijk
hiertoe is een kennis van de stoffen, hun metabolieten, uitscheidings- en residugehalten in functie van
de behandelingswijze en de matrix.
3.2.3.2 Structuur en indeling
3.2.3.2.1 Indeling
De term "anabolicum" omvat een brede waaier van verbindingen die, volgens hun biologische activiteit
in de dierlijke productie, ondergebracht worden bij de geslachtshormonen. De anabolica kunnen op
basis van verschillende criteria ingedeeld worden (Tabel 3.2.1).
De meeste anabolica hebben een steroïde structuur. De steroïden kunnen ingedeeld worden aan de
hand van het aantal koolstofatomen en de voornaamste productieplaats. De estrogenen, androgenen
en gestagenen bezitten respectievelijk 18, 19 en 21 koolstofatomen.
128

Ook volgens hun hormonale activiteit kunnen de anabole hormonen ingedeeld worden in estrogenen,
androgenen en gestagenen.
Tabel 3.2.1 : Classificatie van een aantal anabolica
natuurlijke steroïden
(oraal weinig actief)
synthetische
anabolica
(meestal oraal
actief)
steroïden
niet-
steroïden
estrogenen
androgenen gestagenen
estrone testosteron progesteron
17ß-estradiol hydroxyprogesteron
estriol
ethinylestradiol nortestosteron medroxyprogesteron
mestranol methyltestosteron melengestrol
diëthylstilbesterol
dienestrol
hexestrol
zeranol
trenbolone megestrol
boldenon chloormadinon
methylboldenon
chloortestosteron
stanozolol
fluoxymesterone
Verder is naast een classificatie van de gebruikte anabolica volgens de chemische structuur (steroïde
of niet-steroïde) ook een indeling mogelijk volgens de herkomst (lichaamseigen of lichaamsvreemd).
Als dusdanig kunnen de anabolica worden ingedeeld in:
• endogene steroïden: geslachtshormonen welke van nature in het lichaam aanwezig zijn. Deze
steroïden worden vooral door de lever geïnactiveerd en zijn dus oraal weinig actief.
• synthetische hormonen: lichaamsvreemde steroïden of chemische verbindingen welke
sommige effecten van de endogene steroïden nabootsen (ook exogene of xenobiotische
anabolica genoemd).
Xenobiotische anabolica zijn voor het merendeel oraal actief. Esters van de natuurlijke hormonen,
estradiol, testosteron en progesteron, kunnen als een tussenklasse worden beschouwd. De term
endogeen of exogeen dient ook steeds te worden gezien in functie van species en geslacht van het
dier. Zo is bij het mannelijk varken, de hengst en het drachtige rund 19-nortestosteron endogeen.
3.2.3.3 Estrogenen
Deze kunnen verder worden ingedeeld in lichaamseigen, semisynthetische en synthetische
estrogenen.
Lichaamseigen estrogenen:
• estrone;
• estradiol;
129

HO
• estriol.
Estrone
O OH
HO
Estradiol
HO
Estriol
Figuur 3.2.10: Formules van estrone, estradiol en estriol
Van deze verbindingen is alleen de 17- β vorm actief.
Naast de groep van de afgeleiden van de natuurlijke hormonen zijn er ook twee belangrijke groepen
van niet-steroïde estrogenen: enerzijds de stilbenen (zie hierboven) en anderzijds zeranol en
afgeleiden (zie verder).
3.2.3.4 Androgenen
De basisstructuur van de androgenen is het androstaan-skelet met 19 koolstofatomen en met verder
een 17-hydroxylgroep, een 3-ketogroep en een dubbele binding tussen C4 en C5.
De androgenen kunnen eveneens ingedeeld worden in lichaamseigen, semisynthetische en
synthetische androgenen.
3.2.3.4.1 Lichaamseigen androgenen
In strikte zin behoren hiertoe enkel testosteron en zijn metabolieten (zoals androsteron en
androstenolone). In Figuur 3.2.12 wordt testosteron en één van zijn metabolieten, androsteron,
weergegeven.
0
Testosteron
OH
H0
H
Androsteron
Figuur 3.2.12: testosteron en één van zijn metabolieten
O
OH
OH
130

3.2.3.4.2 Semisynthetische androgenen
Bij deze derivaten is de 17-OH-groep veresterd met een organisch zuur. Daardoor ontstaan "retard"preparaten,
met verlengde werking door het trager vrijstellen van de stof uit de injectieplaats. Eens in
het bloed opgenomen, wordt de ester gehydrolyseerd zodat vrij testosteron (het lichaamseigen
steroïde) ontstaat.
De meest gebruikte ester is het propionaat. De verlenging van de werkingsduur is nagenoeg
evenredig met de lengte van de koolstofketen in het zuur.
In spuitplaatsen worden diverse esters van testosteron aangetroffen.
3.2.3.4.3 Lichaamsvreemde androgenen
Er zijn verschillende lichaamsvreemde androgenen afgeleid van testosteron. Diverse groepen worden
hieronder besproken.
Een belangrijke groep omvat 19-nortestosteron of nandrolone en zijn esters.
Nortestosteron is een der belangijkste anabolica. Het bekleedt echter ook een speciale plaats bij de
androgenen, gezien zijn natuurlijk voorkomen bij de beer (mannelijk varken) en de hengst. Ook komen
lage concentraties voor bij het vrouwelijk rund op het einde van de dracht.
Een andere groep van adrogenen zijn de alkylderivaten, zoals 17α-methyltestosteron. Door de
alkylgroep op C17 is de 17-OH-groep beschermd tegen de lever-enzymes zodat de perorale (via
drinkwater of voeder) toediening mogelijk is.
Bij een volgende groep komt een bijkomende dubbele binding voor op de 1,2 plaats: boldenon en
methylboldenon (of methandienon)
Trenbolone kan worden afgeleid van testosteron door twee bijkomende dubbele bindingen: op de 9,10
en de 12,13 plaats (‘tren’ is trouwens afkomstig van trieen: drie dubbele bindingen)
Een ander belangrijk anabolicum dat bij de androgenen wordt geklasseerd is stanozolol. De structuur
van stanozolol is sterk verschillend van de vorige androgenen door de aanwezigheid van een
pyrazolring.
3.2.3.5 Gestagenen
De basisstructuur van de gestagenen is het pregnaanskelet. Zoals bij de estrogenen en androgenen
kan ook hier het onderscheid gemaakt worden tussen de lichaamseigen gestagenen, de
semisynthetische en de synthetische gestagenen.
3.2.3.5.1 Lichaamseigen gestagenen
Progesteron wordt ook het "corpus luteum" hormoon genoemd. De uitscheidingvorm van progesteron
in de urine is het pregnaandiol.
131

Een ander belangrijk natuurlijk gestageen is het 17α-hydroxyprogesteron.
0
Progesteron
CH 3
C=0
0
Hydroxyprogesteron
CH 3
C=0
OH
17
Figuur 3.2.18: structuurformules van progesteron en 17α-hydroxyprogesteron
3.2.3.5.2 Semisynthetische gestagenen
De esters van hydroxyprogesteron kunnen in deze klasse worden ingedeeld. Vooral het acetaat- en
caproaatester van 17-hydroxyprogesteron zijn van belang (acetoxyprogesteron en caproxyprogesteron).
Bij hydrolyse geven deze het 17-hydroxyprogesteron. De esters kunnen als dusdanig in
niervet worden teruggevonden.
3.2.3.5.3 Synthetische gestagenen
Enkele van de belangrijkste synthetische gestagenen zijn: medroxyprogesteron(acetaat),
chloormadinon(acetaat), megestrol(acetaat) en melengestrol(acetaat). Ze kunnen worden afgeleid van
(hydroxy)progesteron door substitutie van een methylgroep op de 6-plaats en een bijkomende dubbele
binding op de 6,7 plaats. Melengestrol(acetaat) kent een bijkomende CH 2 -groep op C16 en bij
chloormadinon is de methylgroep op C6 vervangen door een chloorgroep. Vooral de acetaatesters zijn
bekend en accumuleren in niervet.
3.2.3.6 Groeirespons
Het eerste onderzoek naar het gebruik van anabolica als groeipromotor bij dieren dateert van 1939,
met name i.v.m. estradiolbenzoaat bij pluimvee (Zandek en Marx,1939). Na de synthese van DES
(Dodds et al, 1938) werd dit relatief goedkoop, oraal werkzaam product ook het eerst uitgetest bij
pluimvee. Proeven met androgenen startten ongeveer 10 jaar later (Andrews et al, 1949). De
economische impact van anabolica is substantieel: bij aanwending in de VS van anabolica bij rundvee
zijn winstmarges van ca $17 per dier vermeld. In de detailhandel zou deze winstmarge nog verder
oplopen (VS, legale praktijk, Hancock, 1990).
Anabolica versnellen over het algemeen de weefselgroei en verhogen tevens de omzet van voeder in
spiereiwit (verhoogde voederconversie). Naast deze verhoogde gewichtswinst treedt meestal een
verbetering van de karkaskwaliteit op. De respons is echter sterk verschillend naargelang het
preparaat, de species en het geslacht van het dier. Bovendien heeft de toepassing van anabolica ook
invloed op de kwaliteit van het vlees zelf.
132

3.2.4 Zeranol en afgeleiden
3.2.4.1 Structuur
Zeranol is een product met estrogene werking, doch met structuur totaal verschillend van estradiol en
de steroïden. Het bezit groeistimulerende eigenschappen. Er dient vermeld dat de "actieve" vorm van
zeranol de 7-α vorm is, terwijl dit bij de stoffen met steroïde structuur de β-vorm is.
Zeranol kan in vivo 2 gevormd worden uit het mycotoxine zearalenon. Zearalenon wordt o.a.
aangetroffen in geïnfecteerde maïs. Het bezit estrogene eigenschappen en kan in grote hoeveelheden
worden geproduceerd door culturen van bepaalde schimmels (o.a. Fusarium roseum, 3-15 g product
per kg schimmelcultuur). Zeranol heeft een grotere estrogene activiteit dan zearalenon. Het gebruik
van zeranol is verboden in de EU.
Bij het aantonen van zeranol en/of taleranol (de belangrijkste metaboliet van zeranol) in bv. urine van
dieren is het belangrijk om na te gaan of de aanwezigheid niet te wijten is aan het voorkomen van
schimmeltoxines. Uit onderstaand schema blijkt duidelijk dat in het geval van schimmeltoxine ook
zearalenon, β-zearalenol en/of α-zearalenol zullen aanwezig zijn, wat niet het geval is bij toepassing
van zeranol als anabolicum.
HO
HO
Figuur 3.2.25: Zeranol en afgeleiden afkomstig van een behandeling en de verwante stoffen
geproduceerd door de schimmel Fusarium
2 in het levende organisme
HO
O
O
CH 3
OH O CH3 OH
β-zearalenol
OH
O
β-zearalanol
( taleranol)
O
O
CH3
HO
OH
H
O
OH HO
H
α-zearalenol
H
OH
OH
zearalenone
FUSARIUM
FUNGUS
O
O
zearalanone
CH3
HO
OH
O
O
O
O
O
CH 3
CH3
α-zearalanol
(zeranol)
OH
ZERANOL IMPLANT
OH
H
133

3.2.4.2 Analysetechnieken
Toegepaste technieken : GC-MS/MS of GC-MS n en LC-MS/MS of LC-MS n .
3.2.5 ß-agonisten
3.2.5.1 Inleiding
De eisen van de consument ten aanzien van vlees worden steeds strenger. Hij vraagt mals en mager
vlees aan een redelijke prijs. De kwaliteit van slachtdieren wordt wel eens gelijkgesteld met een
maximale bespiering op het slachtmoment.
Hierbij wordt soms gegrepen naar niet toegelaten / niet erkende middelen of naar het oneigenlijk
gebruik van geneesmiddelen. De ß-agonisten, met clenbuterol als bekendste voorbeeld, zijn op die
manier als groeipromotor in de vetmesterij terechtgekomen: aanvankelijk aangewend als bronchodilatator
(gebruikt in de humane geneeskunde bij ademhalingsproblemen en asthma) en nadien op
basis van hun neveneffect van betere benutting van de nutriënten als zogenaamde herverdeler. Er
wordt minder vet aangezet en vetweefsel wordt zelfs actief afgebroken, terwijl meer spierweefsel
aangezet wordt. Dit resulteert in een verbeterde voederconversie.
3.2.5.2 Effecten en toxiciteit voor mens en/of dier
Clenbuterol en andere ß-agonisten behoren tot de groep van de ß2-selectieve agonisten of ßmimetica.
De werking wordt uitgeoefend door stimulatie van specifieke receptoren. Deze receptoren
worden normaal gestimuleerd door de hormonen adrenaline en noradrenaline (die door de bijnieren
worden gesynthetiseerd en afgegeven, na stimulatie door het sympathisch zenuwstelsel) (Figuur
3.2.26). Na binding van de agonisten aan deze receptoren, die zich bevinden op de celmembraan,
vindt een aantal vervolgreacties plaats. Na stimulatie van de receptoren wordt cyclisch-AMP
aangemaakt dat in de cel als een "second messenger" fungeert en door beïnvloeding van het
metabolisme in de cel een bepaald effect bewerkstelligt.
HO
HO
H H
C — C — N—CH
3
H
OH H
Adrenaline
HO CH — C – NH 2
Noradrenaline
Figuur 3.2.26: structuurformules van adrenaline en noradrenaline
De receptoren kunnen worden onderverdeeld in α- en β-receptoren, waarvan de laatste groep
opnieuw kan worden onderverdeeld in β1- en β2-receptoren. Naast de aanwezigheid van receptoren
in het centrale zenuwstelsel kan de volgende indeling van de receptoren in de verschillende weefsels
worden gegeven (Tabel 3.2.5):
HO
OH
H
H
H
134

Tabel 3.2.5. Locatie en effect van α- , β1- en β2-receptoren
Receptor Effect na stimulatie van de receptor
α vernauwing van de bloedvaten, vooral in huid en darmgebied
β1 verhoging frequentie hart, vergroting slagvolume en geleidingssnelheid hart, verkorting
refractaire periode hart, toename glycogenolyse en lipolyse
β2 ontspanning spieren bronchiën, ontspanning uterusspier (baarmoeder)
De ß-agonisten zijn aan (lichaamseigen) adrenaline en noradrenaline verwante verbindingen, waarbij
door chemische modificaties de ß2-werking is versterkt t.o.v. de ß1- en de α-effecten. De ß1-werking
blijft bij de meeste verbindingen aanwezig. Vooral bij hogere doseringen of een frequenter gebruik
kunnen bijwerkingen optreden die hierop zijn terug te voeren. Het betreft meestal effecten op het hart
(zie Tabel 3.2.5). Tevens is de werkingsduur verlengd door een veranderde, minder snelle,
metabolisering.
In tegenstelling tot anabolica zijn er over residuen van ß-agonisten acute toxische effecten
beschreven. In Frankrijk en in Spanje werden een aantal personen ziek na het eten van lever (van
dieren behandeld met clenbuterol). In Spanje betrof het in 1990, 125 personen in 43 families over 4
provincies. Eveneens werden "dealers" van clenbuterol het dodelijk slachtoffer van hun eigen
preparaten (Ierland). Clenbuterol werd dan ook soms "Angel Dust" (engelenstof) genoemd. In China
moesten meer dan 300 personen gehospitaliseerd worden na consumptie van varkensvlees,
afkomstig van met clenbuterol behandelde dieren (september 2006). De symptomen zijn uitgesproken
bevingen van handen en voeten, hartkloppingen, misselijkheid, hoofdpijn en duizeligheid.
3.2.5.3 Structuur en belangrijkste groepen
De ß-agonisten vertonen een gemeenschappelijke fenylethylamine-basisstructuur. Ze behoren tot de
groep van de arylethanolamines.
3.2.5.4 Analysemethoden
CH 2 – CH 2 – NH 2
β-Fenylethylamine Arylethanolamine
CH – CH 2 – NH – R
|
OH
Figuur 3.2.27: basisstructuur van fenylethylamine en arylethanolamine
Voor de analyse van ß-agonisten zijn talrijke methodes beschreven. Deze zijn voornamelijk gebaseerd
op immunologische en chemische methodes (HPTLC, HPLC, GC-MS en LC-MS). Ook zijn er
algemene methodes waarbij niet het residu maar het effect van ß-agonisten wordt nagegaan. Gezien
de grote variëteit aan ß-agonisten is het gebruik van screeningsmethoden aan te bevelen. Deze
135

methoden kunnen worden gebaseerd op immunochemische methoden (met een aspecifiek
antilichaam) of bijvoorbeeld fysiologische parameters.
3.2.5.4.1 Screeningmethodes
In het RIKILT-DLO werd ontdekt dat de concentraties aan creatinine en lactaat in kalverurine indicatief
zijn voor het gebruik van ß-agonisten.
Deze concentraties kunnen gemeten worden via enzymatische analysemethodes. Tientallen
monsteranalyses per uur zijn mogelijk met behulp van een auto-analyser. Het is ook mogelijk om een
"on-site" methode toepasbaar op de boerderij te ontwikkelen gebaseerd op enzymatische methodes.
3.2.5.4.2 Immunochemische methodes
Voor ß-agonisten kunnen immunochemische methodes (ELISA’s) worden gebruikt. De antilichamen
tegen ß-agonisten zijn vooral groepspecifiek en minder productspecifiek, zodat meerdere ß-agonisten
simultaan kunnen bepaald worden. Er zijn verschillende commerciële kits verkrijgbaar.
3.2.5.4.3 Chemische methodes
Opzuivering
Voor extractie en opzuivering zijn verschillende technieken beschreven.
Als gevolg van de aanwezigheid van zowel zure als basische groepen in de relatief polaire fenolen en
resorcinolen moeten in geval van vloeistof-vloeistof extracties polaire oplosmiddelen worden gebruikt
wat leidt tot co-extractie van veel storende verbindingen uit de matrix. Voor multimethodes is de keuze
van de pH belangrijk (enkel in zuur milieu zijn alle ß-agonisten positief geladen).
Ook ionpaar-extractie werd beschreven en er werd veelvuldig gebruik gemaakt van mixed-fase SPE
(C4, C8 en C18 gemengd met kationuitwisselaar). Ook immuno-affiniteitschromatografie is toegepast,
terwijl recenter vooral het gebruik van MIPs zeer interessant gebleken is voor een goede opzuivering.
HPLC-methoden
Voor de bepaling van clenbuterol in urine, weefsels, dierenvoeder en preparaten werden een aantal
HPLC-methoden beschreven. Het betreft voor het merendeel van de gevallen reversed-phase
ionpaar-chromatografie in combinatie met elektrochemische detectie of diode-array detectie.
Er werd eveneens selectieve post column derivatisering toegepast in de vorm van een Bratton
Marshall reactie (diazotering en vorming van een diazokleurstof). Bij deze reactie konden alleen
verbindingen van de groep der anilines bepaald worden. Nu kunnen HPLC-methoden uitsluitend nog
worden gebruikt als screening of als techniek voor de opzuivering van extracten van biologisch
materiaal. Voor het bevestigingsonderzoek moet een GC-MS of een LC-MS analyse worden
uitgevoerd.
136

Massaspectrometrische methoden
In de EU-lidstaten is voor bevestiging van de aanwezigheid van deze stoffen heden, net als voor de
andere verboden stoffen (Annex A verbindingen), massaspectrometrie verplicht volgens Beschikking
2002/657/EG.
Voor bepaling met GC-MS moeten de ß-agonisten door hun hoge polariteit gederivatiseerd worden tot
meer vluchtige verbindingen. Daarbij worden de hydroxy- en, afhankelijk van het gebruikte reagens,
ook de amino-groepen omgezet tot minder polaire derivaten. De silylering van de hydroxylgroepen tot
een O-TMS of een O-tertiair butyl dimethylsilyl ether (O-TBDMS) is veel toegepast. Verder zijn een
acylering van zowel de hydroxyl als de aminegroepen mogelijk (TFA, HFB of PFPA). Ook een
combinatie van silylering en acylering zijn toegepast (hierbij worden O-TMS/N-TFA derivaten
gevormd).
Interessant is de vorming van cyclische boorzuurderivaten (Leloux et al., 1989). De fragmentatie van
de zijketen wordt hierdoor bemoeilijkt zodat fragmenten met hogere massawaarden ontstaan. Naast
het verhogen van de vluchtigheid speelt de derivatisering een belangrijke rol bij de fragmentatie. Door
het inbouwen van verschillende groepen verandert het molecule zodanig, dat bij fragmentatie in de
massaspectrometer (vooral bij de "hardere" electron impact ionisatie) bepaalde brokstukken beter
worden gestabiliseerd en in een hogere intensiteit in het massaspectrum voorkomen. Dit biedt de
mogelijkheid de fragmentatie zodanig te beïnvloeden dat op massaspectrometers met uitsluitend EI
ionisatie meer specifieke ionfragmenten (met hogere massawaarden) te detecteren bij een voldoende
lage detectiegrens.
H 2 N
Cl
Cl
O
B
N
C 4 H 9
C(CH 3 ) 3
Figuur 3.2.32: cyclische boorzuurderivaten van clenbuterol
Bij de O-TMS etherderivaten van bv. clenbuterol treedt in electron-impact massaspectrometrie immers
een hoge mate van fragmentatie op. Zo vertoont het massaspectrum van clenbuterol 1 dominante
massa (m/e 86) door afbreken van de zijketen. Het andere brokstuk (m/e 262) en de overige
fragmenten met hogere massawaarden komen slechts met lage intensiteit voor. In Figuur 3.2.33 is het
massaspectrum van het TMS-derivaat van clenbuterol op een ion trap systeem weergegeven in EI
mode.
137

100% 86
SMP
-
BKG
Figuur 3.2.33: Massaspectrum van clenbuterol-O-TMS (in EI)
Tegenwoordig wordt vooral gebruik gemaakt van LC-MS (ook LC-MS n en LC-MS/MS) zodat
problemen met derivatisering tot het verleden behoren. Bij de massaspectrometrische methoden
worden de gedeutereerde analogen van de ß-agonisten toegepast als interne standaard, wat de
kwantificering sterk ten goede komt.
3.2.5.5 Matrices
116
Tal van matrices zijn beschreven voor de analyse van ß-agonisten. Bij levende dieren kan zowel op
urine als faeces gewerkt worden. Bij bemonstering op de boerderij moeten ook matrices als water,
voeders en kruidenmengsels kunnen ontleed worden. Bij geslachte dieren zijn nier en vooral lever
interessanter dan vlees omdat de concentraties aan residuen hoger zijn en ook langer aanwezig
blijven. Voor het aantonen tot lang na de stopzetting van een behandeling zijn haar (vooral donker
haar) en de retina uitermate geschikt.
3.2.6 Annex IV componenten
CLENBUTEROL
MSTFA/TMSI EI
182 210
100 150 200
227
250
262
300
300
De verbindingen vermeld in annex IV van verordening (EEG) Nr. 2377/90 van de Raad zijn
farmacologisch actieve stoffen waarvoor geen maximum toelaatbare niveaus kunnen worden
vastgelegd. Het gevaar aan het gebruik van deze stoffen is bekend, maar het risico bij behandeling is
onmogelijk te bepalen (bv carcinogeen) en een MRL kan dan ook niet vastgelegd worden. Deze
stoffen zijn niet toegelaten in de EU.
320
335
350 400
405 421
450 500
138

3.2.6.1 Chlooramfenicol
3.2.6.1.1 Structuur
3.2.6.1.2 Eigenschappen
Figuur 3.2.34: structuurformule van chlooramfenicol
Chlooramfenicol remt de eiwitsynthese ter hoogte van de ribosomen. Het is een bacteriostatisch
antibioticum en actief tegen de meeste GRAM+ en GRAM- organismen. Het is onoplosbaar in water
en zeer vetoplosbaar.
Chlooramfenicol werd oorspronkelijk afgeleid van de bacterie Streptomyces venzuelae. Het was het
eerste antibioticum dat op grote schaal bereid werd.
Chlooramfenicol wordt in de lever gemetaboliseerd tot chlooramfenicolglucuronaat. Het grootste
gedeelte van de toegediende chlooramfenicol wordt via de nieren uitgescheiden als de inactieve
metaboliet, chloroamfenicolglucuronaat.
3.2.6.1.3 Gebruik en toxiciteit
Chlooramfenicol veroorzaakt bij de mens irreversibele onderdrukking van het beenmerg, wat leidt tot
bloedarmoede (aplastische anemie). Het gebruik van chlooramfenicol werd in de Europese Unie dan
ook verboden. Het wordt in lage loonlanden echter nog regelmatig gebruikt omdat het zo goedkoop is.
3.2.6.1.4 Analysetechniek
ELISA voor screeningsdoeleinden en GC-MS(/MS) of GC-MS n en LC-MS/MS of LC-MS n voor
bevestiging.
139

3.2.6.2 Dapsone
3.2.6.2.1 Structuur
Dapsone is een antibioticum dat wat werking betreft sterk gelijkt op deze van de sulfonamiden (zie
verder).
3.2.6.2.2 Analysetechniek
LC-MS(/MS) en LC-MS n
3.2.6.3 Nitroimidazolen
3.2.6.3.1 Structuur
Figuur 3.2.35: structuurformule van dapsone
Nitroimidazolen zijn voornamelijk gebruikt bij de behandeling van infecties van parasitaire protozoa. Zo
werden deze middelen vaak gebruikt voor preventie en behandeling van blackhead (histomoniasis) bij
kalkoenen en ander pluimvee, voor preventie van trichomoniasis bij andere vogels en voor
behandeling van trichomoniasis bij vee. Deze synthetische verbindingen zijn verder belangrijk bij de
behandeling van anaërobe bacteriële infecties. Ze hebben als basis een imidazole-ring met een
nitrogroep (NO2). De meest gebruikte nitro-imidazolen waren dimetridazol, ronidazol, metronidazol en
ipronidazol.
3.2.6.3.2 Analysetechniek
dimetridazol ronidazol
Figuur 3.2.36: structuurformule van dimetridazol en ronidazol
ELISA, LC-MS/MS of LC-MS n en GC-MS/MS en GC-MS n
140

Naast dimetridazole, metronidazole en ronidazole dienen ook de hydroxymetabolieten HMMNI en
MNZOH bepaald te worden.
3.2.6.3.3 Toxiciteit voor mens en/of dier
Vooral hun metabolieten welke een nitrosostructuur bezitten zijn mogelijks carcinogeen en mutageen.
Het gebruik van nitroimidazolen is verboden bij dieren bestemd voor consumptie.
3.2.6.4 Nitrofuranen
3.2.6.4.1 Structuur
De werking van nitrofuranen berust op de inhibitie van een aantal microbiële enzymen, die betrokken
zijn bij het carbohydraat metabolisme. De nitrofuranen worden in vivo vlot gemetaboliseerd en hun
metabolieten binden gemakkelijk met de weefselproteinen.
Voorbeelden van nitrofuranen en hun metabolieten zijn:
• Furazolidone met als metaboliet het 3-amino-2-oxazolidinon (AOZ)
• Furaltadone met als metaboliet het 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinon (AMOZ)
• Nitrofurazone met als metaboliet het semicarbazide (SEM)
• Nitrofurantoin met als metaboliet het 1-aminohydantoin (AHD)
3.2.6.4.2 Effecten en toxiciteit
Figuur 3.2.37: chemische structuur van furazolidon
Nitrofuranen werden veel gebruikt voor de behandeling van gastro-intestinale infecties zoals E. coli
infecties bij gevogelte en salmonella infecties bij varkens en kalveren. In de EU werd in juni 1995 het
gebruik ervan verboden bij consumptiedieren. Dit gebeurde na groeiende bezorgdheid over mogelijke
carcinogeniciteit en mutageniciteit van nitrofuranen.
3.2.6.4.3 Analysetechniek
ELISA en LC-MS/MS of LC-MS n
O2N O
CH N
N O
O
141

3.2.6.5 Criteria
In EU beschikking 2002/657/EG worden de voorschriften vastgesteld voor de analysemethoden die
moeten worden gebruikt bij het onderzoeken van officiële monsters die genomen zijn zoals vastgelegd
in richtlijn 96/23/EG. De kwaliteit en vergelijkbaarheid van de analyses afkomstig van verschillende
laboratoria moet gegarandeerd zijn. Daarom is het noodzakelijk dat de toegepaste methoden
gevalideerd worden aan de hand van gemeenschappelijke procedures en prestatiecriteria. Deze
prestatiecriteria, alsook de criteria voor de interpretatie van analyseresultaten zijn vastgelegd in
beschikking 2002/657/EG.
3.3 Antibiotica
3.3.1 Inleiding
In de moderne veeteelt wordt een grote verscheidenheid aan antibiotica gebruikt. De legale toediening
van antibiotica aan dieren gebeurt om ziekten te bestrijden of om te voorkomen dat ziekten zich
verspreiden wanneer aan intensieve teelt wordt gedaan. Naast het legale gebruik van bepaalde
diergeneesmiddelen, worden sommige producten ook illegaal gebruikt als groeipromotor.
Een foutief gebruik of het niet respecteren van de wachttijden kan leiden tot de aanwezigheid van
residu’s in voedingsmiddelen van dierlijke oorsprong. Deze residu’s kunnen schadelijk zijn voor de
mens en bijvoorbeeld allergische reacties uitlokken. Om te vermijden dat schadelijke gehaltes in de
voedselketen terecht komen, werden door de Europese Unie Maximum Residu Limieten (MRL’s)
vastgelegd. Sommige antibiotica (zoals chlooramfenicol) zijn zelfs toxisch en het gebruik ervan werd
dan ook door de Europese Unie verboden (zie hierboven).
Antibiotica en chemotherapeutica
Het klassieke begrip antibioticum heeft betrekking op stoffen die zijn afgeleid van levend materiaal en
die ziekteverwekkers (voornamelijk bacteriën in het lichaam) bestrijden, dit naast
chemotherapeutica, die stoffen zijn die door de mens langs synthetische weg zijn bereid. Een
voorbeeld van deze laatste categorie is de groep van de sulfonamiden (ontdekking rond 1935).
Tegenwoordig wordt dit onderscheid niet meer strikt gehandhaafd en spreekt men bij alle stoffen die
aan mensen kunnen worden toegediend om bacteriële infecties te bestrijden over antibiotica.
Er zijn twee belangrijke groepen antibiotica: de bacteriocide of bacteriedodende, en de
bacteriostatische of bacterieremmende die de groei van bacteriën voorkomen. ß-Lactams,
fluoroquinolonen en de meeste aminoglycosiden zijn bacteriocide; penicilline maakt bijvoorbeeld de
celwand zwakker zodat de bacterie door zijn eigen osmotische druk explodeert. Tetracyclines,
chlooramfenicol, macroliden en sulfonamiden zijn bacteriostatisch: zij doden de bacteriën niet maar
beletten de groei.
142

3.3.2 Sulfonamiden en Trimethoprim
3.3.2.1 Structuur
Sulfonamiden zijn structurele analogen van p-aminobenzoëzuur (PABA) (Figuur 3.3.1) met
benzeensulfonamide (Figuur 3.3.2) als basisstructuur. De term sulfonamiden wordt dikwijls afgekort tot
sulfa’s.
3.3.2.2 Eigenschappen
Trimethoprim
Figuur 3.3.1: chemische structuur van para-aminobenzoëzuur (PABA)
Figuur 3.3.2: basistructuur sulfonamide
Trimethoprim, een diaminopyrimidine, is bacteriostatisch en inhibeert de synthese van foliumzuur. Het
enzymatisch aangrijpingspunt is verschillend van dit van de sulfonamiden. De activiteit is tegen
GRAM+ en GRAM-, maar niet tegen anaëroben.
Sulfonamiden geassocieerd met trimethoprim
Tegenwoordig worden sulfonamiden meestal gebruikt in combinatie met trimethoprim wegens het
synergistisch effect. Deze combinaties, gewoonlijk in een 5/1 verhouding, zijn meestal bactericide.
3.3.2.3 Gebruik
Sulfonamiden worden voornamelijk gebruikt bij de behandeling van coccidiose (pluimvee, herkauwers)
of bij urinaire of gastrointestinale infecties bij carnivoren. De meest gebruikte sulfonamiden in de
diergeneeskunde zijn sulfamethazine (sulfadimidine), sulfadimethoxine, sulfapyridine, sulfamerazine
en sulfadiazine.
143

Sulfonamiden worden niet alleen als therapeuticum gebruikt in de diergeneeskunde. Sinds 1950
worden ze ook aangewend ter voorkoming van infecties veroorzaakt door bacteriën of protozoa.
Daarbij werken sulfonamiden ook groeibevorderend.
3.3.2.4 Analysetechnieken
Five plate test (STAR), Premi test, ELISA, CHARM II, HPLC-DAD, HPLC-fluo, LC-MS n en LC-MS/MS
(MRL: Σ 100 µg/kg)
3.3.3 ß-lactam antibiotica
3.3.3.1 Structuur
Beta-lactam-antibiotica zijn chemisch gekenmerkt door een zgn. β-lactamring, die essentieel is voor
de antimicrobiële werking. Deze ring bestaat uit drie koolstofatomen en een stikstofatoom.
ß-lactam antibiotica worden onverdeeld in verschillende klassen zoals de penicillines, cefalosporines,
monobactams en carbapenems. De meest gebruikte ß-lactam antibiotica behoren tot de groepen van
de penicillines en de cefalosporines. Beide klassen bezitten zijketens ingeplant aan respectievelijk de
6-aminopenicilaanzuur of aan de 7-aminocefalosporaanzuur kern. De basisstructuur van penicillines
wordt weergegeven in Figuur 3.3.3. De bassisstructuur van cefalosporines wordt weergegeven in
Figuur 3.3.4.
Figuur 3.3.3: basisstructuur penicillines
Figuur 3.3.4: basisstructuur cefalosporines
144

3.3.3.2 Eigenschappen
3.3.3.2.1 Penicillines
Penicillines zijn de oudste en bekendste groep antibiotica. Benzylpenicilline was de eerste van de
penicillinefamilie. Alle andere penicillines werden hiervan afgeleid.
In de diergeneeskunde worden twee soorten penicillines gebruikt: benzylpenicillines waarvan het
spectrum beperkt is tot de GRAM+ kiemen (smal-spectrum antibiotica, bv. benzylpenicilline en
procaïne benzylpenicilline) en sommige anaëroben, en de aminopenicillines die ook werkzaam zijn
tegenover GRAM- kiemen (breed-spectrum antibiotica, bv. amoxicilline en ampicilline).
De belangrijkste penicillines zijn penicilline G (benzylpenicilline), penicilline V (phenoxymethylpenicilline),
amoxicilline, nafcilline, oxacilline, cloxacilline en dicloxacilline.
3.3.3.2.2 Cefalosporines
Cefalosporines bezitten op hun β--lactamring een dihydrothiazine-ring. Hierdoor bezitten ze een
hogere resistentie ten opzichte van β--lactamases. Hun werkingsmechanisme is gelijkaardig aan dit
van de penicillines. Klassiek werden de cefalosporines gerangschikt volgens “generaties”: van de
eerste tot de vierde generatie. Deze rangschikking stemt overeen met de periode waarop deze
substanties voor het eerst op de markt verschenen en in zekere mate ook met hun werkingsspectrum.
De eerste generatie cefalosporines zijn vooral werkzaam tegen GRAM+ micro-organismen zoals
staphylococcen en streptococcen. Voorbeelden van eerste generatie cefalosporines zijn cefacetrile,
cefalexine, cefalonium en cefazolin.
De tweede generatie cefalosporines (vb. cefaclor) hebben in principe hetzelfde werkingsspectrum als
die van de eerste generatie. Ze zijn vaak meer werkzaam tegen GRAM- micro-organismen dan
cefalosporines van de eerste generatie.
Derde generatie cefalosporines, zoals cefaperazone en ceftiofur, zijn doorgaans minder werkzaam
tegen staphylococcen dan die van de eerste en de tweede generatie. Ze zijn daarentegen werkzamer
tegen GRAM- micro-organismen dan cefalosporines van de eerste en de tweede generatie.
De vierde generatie cefalosporines zijn echt breed spectrum antibiotica, waarbij de activiteit tegen
GRAM+ micro-organismen vergelijkbaar is met de eerste generatie, terwijl de activiteit tegen GRAM-
bacteriën groter is dan deze van de derde generatie. Cefquinome is een voorbeeld van een vierde
generatie cefalosporine.
De belangrijkste cefalosporines zijn ceftiofur, cefquinome, cefapirine, cefazoline, cefacetrile
cefalonium, cefaperazone en cefalexine.
3.3.3.3 Gebruik
Penicillines zijn weinig toxisch, zelfs bij dosissen ver boven de therapeutische dosis. Toch worden
soms kruisreacties van overgevoeligheid, zoals shock en oedeem geobserveerd.
145

Penicilline kan geassocieerd worden met clavulaanzuur. Deze stof bevat ook een β-lactam groep,
maar wordt in tegenstelling tot de antibiotica niet afgebroken door β-lactamase, een enzym dat
sommige resistente bacteriën produceren, maar vormt er een stabiel complex mee, zodat het enzym
geen penicilline meer kan afbreken.
Penicillines en cefalosporines worden voornamelijk gebruikt tegen mastitisis (uierontsteking) bij
runderen, schapen en geiten. Hiervoor worden o.a. oxacilline, dicloxacilline, cefacetrile, cefalonium,
cefazolin, cefalexine en cefapirine gebruikt.
3.3.3.4 Analysetechnieken
Bioassays, receptor-assays, immuno-assays, HPLC-UV, HPLC-DAD, HPLC-fluorescentiedetectie,
LC-MS n , LC-MS/MS
3.3.4 Fluoroquinolonen
3.3.4.1 Structuur
Quinolonen en fluoroquinolonen zijn een groep relatief nieuwe synthetische antibacteriële
verbindingen. Ze worden afgeleid van naldixinezuur. Tot de eerste generatie quinolonen behoren
naldixinezuur en oxolinezuur. De meerderheid van de klinisch gebruikte quinolonen behoren echter tot
de quinolonen van de tweede generatie: de fluoroquinolonen (voorbeelden: iprofloxacine,
saraflocxacin, flumequine en enrofloxacine). Deze zijn gefluoreerd aan het centrale ringsysteem.
3.3.4.2 Gebruik
Figuur 3.3.5: chemische structuur van naldixinezuur en ciprofloxacine
Flumequine, wordt gebruikt in de behandeling van gastrointestinale en urinaire infecties bij nutsdieren.
De recentere fluorverbindingen zijn enrofloxacine, marbofloxacine, danofloxacine, difloxacine,
ibafloxacine en orbifloxacine.
Na orale toediening van deze stoffen aan nutsdieren kunnen resistentiefactoren van de bacteriële
darmflora van deze dieren overgebracht worden naar de darmflora van de mens. Zo zou het gebruik
van enrofloxacine bij gevogelte kunnen leiden tot de ontwikkeling van fluoroquinolone-resistente
Campylobacter, een pathogeen voor de mens.
3.3.4.3 Analysetechnieken
Bioassays, ELISA, HPLC-FLD, LC-MS n , LC-MS/MS
146

3.3.5 Macroliden
3.3.5.1 Structuur
Macroliden zijn een grote groep van antibiotica die gekenmerkt zijn door de aanwezigheid van een
macrolide ring, een grote lactonring waaraan één of meer amino- en deoxy suikers (meestal cladinose
en desosamine) zijn ingeplant.
Figuur 3.3.6: chemische structuur van erythromycine (de macrolide ring is de lactonstructuur in het
bovenste deel)
3.3.5.2 Analysetechnieken
Bioassays, Receptor-assay, Immuno-assays, LC-MS n , LC-MS/MS
147

3.3.6 Florfenicol en aanverwante stoffen
3.3.6.1 Structuur
Thiamfenicol is het methyl-sulfonyl analoog van chlooramfenicol, terwijl Florfenicol een gefluoreerd
synthetisch analoog is van thiamfenicol. Hieronder is de structuur van thiamfenicol voorgesteld.
3.3.6.2 Eigenschappen
Figuur 3.3.7: chemische structuur van thiamphenicol
Chlooramfenicol, florfenicol en thiamfenicol remmen de eiwitsynthese ter hoogte van de ribosomen.
Het zijn bacteriostatische antibiotica en actief tegen de meeste GRAM+ en GRAM- organismen. Ze
zijn onoplosbaar in water en zeer vetoplosbaar.
3.3.7 Tetracyclines
3.3.7.1 Structuur
Tetracyclines zijn opgebouwd uit een naftaceenskelet waarop een aantal polaire groepen ingeplant
staan. Chloortetracycline, oxytetracycline en tetracycline zijn natuurlijk voorkomende verbindingen die
uit bepaalde Streptomyces species geïsoleerd kunnen worden. Doxycycline is echter een semisynthetisch
derivaat.
3.3.7.2 Eigenschappen
Tetracyclines zijn een groep bacteriostatica gebaseerd op tetracycline. De belangrijkste tetracyclines
die in de diergeneeskunde worden gebruikt zijn tetracycline, chloortetracycline, oxytetracycline en
doxycycline.
Figuur 3.3.9 de structuur van tetracycline
148

3.3.7.3 Analysetechnieken
Bioassays, Receptor-assay, ELISA, HPLC-UV, HPLC-DAD, HPLC-FLD, LC-MS n , LC-MS/MS
(In de MRL zijn de tetracyclines en hun 4-epimeren begrepen)
3.3.8 Lincosamiden
3.3.8.1 Structuur
Tot deze groep behoren lincomycine en clindamycine. Lincomycine wordt geproduceerd door de
bacterie Streptomyces lincolnensis. Het werd structureel gemodificeerd tot het 7-chloro-7deoxyderivaat
clindamycine.
3.3.8.2 Eigenschappen
Lincosamiden zijn actief tegen GRAM+ bacteriën, anaëroben en mycoplasmen. Hun structuur en
werkingsmechanisme zijn gelijkaardig aan dat van macroliden.
3.3.8.3 Gebruik
Lincomycine wordt dikwijls gebruikt in combinatie met spectinomycine.
Als toxische bijwerking veroorzaken de lincosamiden voornamelijk ernstige diarree, met eventueel
dodelijk verloop bij de mens en herbivoren. Bij carnivoren worden lincosamiden goed getolereerd. Ze
zijn daarentegen te mijden bij konijn, cavia en hamster.
3.3.9 Aminoglycosiden
3.3.9.1 Structuur
Aminoglycosiden of aminosiden zijn polycyclische kationische verbindingen die een aminocyclitol
bevatten waaraan amino-suikers gekoppeld zijn door middel van glycosidische bindingen (Figuur
3.3.11).
149

3.3.9.2 Eigenschappen
Figuur 3.3.11: chemische structuur van neomycine
Aminoglycosiden zijn breed-spectrum antibiotica, die aangemaakt worden door Streptomyces sp.
(hebben suffix –mycin in de naamgeving) en Micromonospora sp. (hebben suffix –micin in de
naamgeving). Tot de aminoglycosiden behoren neomycine, streptomycine, gentamicine, kanamycine,
amikacine, netilmicine, paromomycine, tobramycine en apramycine. Ze zijn actief tegen zowel aërobe
GRAM- als enkele GRAM+ bacteriën.
Aminoglycosiden hebben een bactericide werking vanwege het vermogen de bacteriële
proteïnesynthese te inhiberen. Ze zijn in staat de bacteriewand te passeren en het messenger-RNA
zodanig te beïnvloeden, dat de polypeptidenketens uit verkeerde aminozuren worden opgebouwd
(misreading). Deze werking is niet alleen beperkt tot de groeifase, maar strekt zich ook uit tot nietdelende
bacteriën.
Aminoglycosiden worden vlug geabsorbeerd na het injecteren, maar worden vrijwel niet geabsorbeerd
na het oraal of rectaal aanbrengen. In het spijsverteringsstelsel blijven ze actief. Ze worden
kwantitatief terug uitgescheiden in de faeces.
Aminoglycosiden zijn vooral door ionische bindingen aan weefselproteïnen en macromoleculen
gebonden, maar de binding met plasma-eiwitten is gering. In weefsels worden ze meestal in lage
concentraties en ongebonden teruggevonden. Ze accumuleren vooral in de nieren en andere organen
zoals de lever.
3.3.9.3 Analysetechnieken
Bioassays, Receptor-assays,Immmuno-assays, LC-MS n , LC-MS/MS
150

3.3.10 Polypeptiden
3.3.10.1 Structuur
Bacitracin is een mengsel van verwante cyclische decapeptiden, geproduceerd door Bacillus subtilis
var. Tracy.
3.3.10.2 Eigenschappen
Bacitracine verhindert de vorming van de peptidoglycaanlaag van de bacteriële celwand.
Bacitracine is werkzaam tegen GRAM+ aëroben en anaëroben, maar is niet werkzaam tegen GRAM-
bacteriën.
De belangrijkste vertegenwoordigers van de polypeptiden zijn avoparcin, bacitracin, efromycin,
bambermycin (flavomycin, flavophospolipol) en virginimyacin.
3.3.11 Glycopeptiden
3.3.11.1 Structuur
Glycopeptiden bestaan uit een geglycosyleerd cyclisch of polycyclisch peptide. Het belangrijkste
glycopeptide is vancomycin.
3.3.11.2 Eigenschappen
Glycopeptiden verhinderen de vorming van de peptidoglycaanlaag van de bacteriële celwand. Het zijn
smal-spectrum antibiotica die actief zijn tegen GRAM+ micro-organismen.
3.3.11.3 Gebruik
Wegens hun toxiciteit is hun gebruik zeer beperkt.
Vancomycine is dikwijls het laatste redmiddel bij de bestrijding van multiresistente Staphylococcus
aureus (MRSA), een belangrijke bacteriële veroorzaker van ziekenhuisinfecties.
3.3.12 Nitrofuranen en Nitro-imidazolen
Zie hoger.
3.3.13 Herkomst van antibiotica residu’s in de voedselketen
De meest voor de hand liggende oorzaken van aanwezigheid van te hoge gehalten aan residu’s van
antibiotica in de voedselketen zijn verkeerd gebruik en het niet respecteren van de wachttijden.
151

De wachttijd is de tijd tussen de toediening van het antibioticum aan het dier en de oogst van zijn
producten (melk, eieren, vlees, honing, …). Wanneer de wachttijd te kort is, kan dit leiden tot residu’s
van het toegediende antibioticum in de dierlijke producten, waardoor het antibioticum in de
voedselketen kan terecht komen. Deze residu’s kunnen de toegelaten limieten overschrijden of
gewoonweg niet toegelaten zijn (zoals bv. chlooramfenicol). De oorzaak van te korte wachttijden kan
o.a. het gevolg zijn van het onnauwkeurig bijhouden van de behandelingsregisters of het onmogelijk
kunnen identificeren van de behandelde dieren.
Verkeerd gebruik van antibiotica kan verschillende oorzaken hebben; het overschrijden van de
voorgeschreven dosis van geregistreerde producten of de toediening aan diersoorten waarvoor het
antibioticum niet geregistreerd werd, leidt tot overtredingen. Het kan echter ook gaan om illegaal
gebruik van niet geregistreerde producten. Sommige antibiotica worden ook misbruikt als
groeipromotoren.
Antibiotica worden aan dieren toegediend via injectie (intraveneus, intramusculair of subcutaan), via
het voeder of het water, door rechtstreeks aan te brengen op de huid of via intramammaire en intrauteriene
infusies. Al deze toedieningsvormen kunnen leiden tot residu’s in dierlijke producten.
Subcutane en intramusculaire residu’s verhogen de kans op residu’s in spuitplaatsen, maar kunnen
ook aanleiding geven tot hoge residuconcentraties in plasma. Intra-mammaire toediening, bv. bij de
behandeling van mastitis met ß-lactams, geeft dan weer aanleiding tot residu’s in de melk.
Dikwijls worden ook antibiotica residu’s teruggevonden in zogenaamde “onbehandelde” dieren. Dit kan
verschillende oorzaken hebben.
• “Fecale recyclage” gebeurt wanneer antibioticaresidu’s uitgescheiden in feces van behandelde
dieren het voeder van onbehandelde dieren contamineren. Dit kan leiden tot de aanwezigheid
van antibioticaresidu’s in “onbehandelde” dieren. Ook als kalveren gevoed worden met melk
van behandelde koeien, kan dit aanleiding geven tot antibiotica residu’s in het vlees van deze
dieren.
• Daarnaast kunnen aan dieren ongewenst antibiotica toegediend worden door contaminatie
van het voeder. Wanneer bijvoorbeeld na de bereiding van gemedicineerde voeders de
productielijn niet voldoende wordt gereinigd, kan dit aanleiding geven tot opeenvolgende
batches van gecontamineerd voeder.
3.3.14 Schadelijke effecten van antibiotica residu’s
3.3.14.1 Resistentie
Residu’s van antibiotica vertegenwoordigen een mogelijk gevaar voor de volksgezondheid. Het
belangrijkste gevaar wat betreft antibacteriële middelen is het gevaar van toenemende bacteriële
resistentie. Resistentie is het verweer dat de bacteriën (ook schimmels en virussen) ontwikkelen tegen
de middelen die hen bestrijden.
152

Een micro-organisme kan van nature ongevoelig (= resistent) zijn voor bepaalde antimicrobiële
middelen. Een ander type resistentie is de verworven resistentie. Daarbij treden mutaties in het
genetisch materiaal op, waardoor bacteriën ontstaan die het antibioticum kunnen overleven. Juist
deze bacteriën zullen zich nu voortplanten. Bij herhaaldelijke toepassing van het antibioticum zullen
deze resistente bacteriën gaan overheersen en de niet-resistente verdringen. Antibiotica resistente
stammen die bekend staan als “foodborne” pathogenen zoals Salmonella spp., E. coli en
Campylobacter spp. werden geïsoleerd uit boerderijdieren. Deze resistente bacteriën zouden humane
infecties kunnen veroorzaken die moeilijk te behandelen zijn.
3.3.15 Risico-evaluatie en het vastleggen van MRL’s
3.3.15.1 Risico-evaluatie
Om de veiligheid van antimicrobiële residu’s aanwezig in voedingsmiddelen te garanderen ,werden
MRL’s vastgelegd. MRL staat voor Maximum Residu Limiet. Het is de norm die de maximale
hoeveelheid residu van een diergeneesmiddel vastlegt, die door de overheid wettelijk wordt
toegestaan in levensmiddelen. Een MRL wordt uitgedrukt in mg/kg of µg/kg op vers gewicht basis.
Een MRL wordt gebruikt om de voedselveiligheid voor de mens te garanderen.
Binnen Europa worden de MRL's geharmoniseerd om internationale handelsbelemmeringen te
voorkomen. MRL waarden voor de actieve stoffen in diergeneesmiddelen worden voor alle Europese
landen gezamenlijk bepaald door het CVMP (Committee for Veterinary Medicinal Products) van EMEA
(Eurpean Agency for the evaluation of Medical Products) in Londen. EMEA is het Europees bureau,
dat de bepaling van MRL’s coördineert.
De risico-evaluatie die gebruikt wordt voor residu’s van diergeneesmiddelen binnen de EU is
gelijkaardig aan deze gebruikt door het samenwerkingsverband WHO/FAO. Hier worden door JECFA
(Expert Commitee on Food Additives) risico-analyses uitgevoerd op residu’s van diergeneesmiddelen
volgens de Codex Alimentarius.
3.3.15.2 Vastleggen van MRL’s
MRL’s worden vastgelegd op basis van de Acceptable Daily Intake (ADI) of de Aanvaardbare
Dagelijkse Inname. Het is een schatting van de hoeveelheid van een residu, uitgedrukt op basis van
het lichaamsgewicht, die dagelijks mag worden ingenomen gedurende het hele leven, zonder
noemenswaardig gezondheidsrisico voor de consument (gebaseerd op een standaard persoon van 60
kg). De basis voor de berekening van de ADI is het no-observed effect level (NOEL). Dit wordt
vastgelegd op basis van in vitro en in vivo toxicologische studies bij verschillende diersoorten.
Hieruit wordt dan de dosis afgeleid die aan de meest gevoelige diersoort kan toegediend worden,
zonder dat enig nadelig effect wordt waargenomen (uitgedrukt in mg per kilogram lichaamsgewicht per
dag).
De NOEL wordt meestal gedeeld door honderd om tot de ADI te komen. Men neemt aan dat mensen
tien maal gevoeliger kunnen zijn dan dieren en dat de gevoeligheid van mens tot mens tien maal kan
verschillen. Om MRL’s af te leiden van de ADI wordt aangenomen dat de gemiddelde persoon op
dagelijkse basis, 500 g vlees, 1,5 liter melk en 100 g eieren of ei-producten consumeert.
153

3.3.16 Detectie van kiemgroeiremmende stoffen in dierlijke producten
3.3.16.1 Indeling van analysemethoden
Analysemethoden kunnen ingedeeld worden in verschillende klassen op basis van het gebruikte
principe:
3.3.16.1.1 Microbiologische methoden
Microbiologische methoden voor de bepaling van antimicrobiële residu's zijn vlugge screeningstesten.
In de VS worden vooral de Swab Test on Premises (STOP) en de Calf Antibiotic and Sulfa Test
(CAST) gebruikt. De Premi®test, de Europese vier-Platen Test (of een variant daarvan) en de
Belgische Niertest (BNT) zijn momenteel de meest gebruikte testen in Europa.
3.3.16.1.2 Receptortesten
Het principe van een receptortest is de binding van moleculen van de geviseerde antibiotica familie
met een breedspectrum receptor. Voorbeelden zijn SNAP, Bèta-star, Charm-ROSA, tetrasensor en
twinsensor kits, CHARM II testen, Biosensor en de Penzym test.
3.3.16.1.3 Immunochemische methoden
Deze kunnen onderverdeeld worden in twee groepen: immunoassay en immunoaffiniteit
chromatografie. Een voorbeeld van immunoassay is de Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent Assay
(ELISA).
3.3.16.1.4 Fysico-chemische methoden
Deze methoden zijn gebaseerd op chromatografische scheiding van residu's gevolgd door
spectroscopische kwantificatie zoals ultraviolet (UV), fluorescentie of massaspectrometrische (MS)
detectie. Het gebruik van LC-MS/MS of LC-MS n komt hierbij steeds vaker voor.
Fysico-chemische methoden zijn meestal zeer specifiek en kwantifitatief, maar vergen veel tijd indien
de identiteit van het residu niet gekend is. Daarom worden deze methoden meestal gebruikt als
bevestigingsmethoden en niet zo zeer als screeningsmethoden.
154

3.4 Acrylamide
3.4.1 Structuur en /of belangrijkste groepen
Acrylamide staat bekend als een synthetische stof die wordt gebruikt bij de fabricage van synthetische
polymeren (plastic). Onlangs werd aangetoond dat ook op een natuurlijke wijze acrylamide wordt
gevormd bij verhitting van voedsel dat rijk is aan koolhydraten.
3.4.2 Analysetechniek
LC-MS n en GC-MS n
3.4.3 Toxiciteit voor mens en/of dier
Figuur 3.4.1: structuurformule acrylamide
Hoe acrylamide precies ontstaat is nog niet bekend, maar alles wijst erop dat dit gebeurt bij het
klaarmaken en opwarmen van voedsel dat veel koolhydraten bevat (zetmeel, suikers). Dit proces doet
zich alleen voor bij droge bereidingswijzen (bakken in oven of roosteren, braden, frituren). Men treft
weinig of geen acrylamide aan in voedsel dat in water werd gekookt.
Acrylamide komt niet voor in onbereid voedsel.
Acrylamide is aanwezig in bereide levensmiddelen zoals chips, koffie, brood, koeken, frieten…
Acrylamide is kankerverwekkend.
155

3.5 Dioxines
3.5.1 Inleiding
Dioxinen, dioxine-achtige verbindingen en dioxine-achtige polychloorbifenylen (dioxine-like of dl-
PCB's) hebben een aantal grote voedselincidenten veroorzaakt die vaak werden ontdekt nadat
effecten op dieren werden vastgesteld. Bij een ontploffing in een chemische fabriek in Seveso, bij
Milaan, ontsnapte in 1976 een giftige wolk, waarbij 170 gram dioxine werd verspreid. Er vielen geen
rechtstreekse slachtoffers, maar wel werd bij de slachtoffers nadien meer kanker dan normaal
vastgesteld. Sindsdien werd dioxine een begrip en werd Seveso zelfs synoniem voor een belangrijk
hoofdstuk uit de Europese milieuwetgeving.
Bij dit incident met het 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxine (2,3,7,8-TCDD) werd ontdekt dat door
grootschalige afvalverbranding dioxines gevormd en uitgestoten werden en dat deze dioxines melk,
eieren en vet van dieren uit de nabijgelegen bedrijven verontreinigden. Op deze manier is het
bewustzijn voor deze stoffen in Europa groter geworden en werden bijvoorbeeld grote
verbrandingsinstallaties aangepast om de contaminatie te verminderen. Toch is verbranding van afval
nog steeds één van de grootste bronnen van dioxines en is het gedeeltelijk de oorzaak voor
besmetting in eieren van kippen met vrije uitloop.
In 1998 leidde het gebruik van besmette kalk in de Braziliaanse citruspulpindustrie tot hogere
dioxineniveaus in de melk van koeien die gevoederd werden met dit ingrediënt. Het heeft
verschillende jaren geduurd vooraleer citruspulppellets opnieuw naar Europa konden geëxporteerd
worden.
In 1999 gebeurde één van de grootste incidenten in Europa toen vet met 200 liter PCB-olie met dl-
PCB's en polychloordibenzofuranen werd gebruikt voor het produceren van kippen- en
varkensvoeders. Dit resulteerde in de wijdverbreide besmetting van voedingsmiddelen geproduceerd
in België. Het probleem werd verergerd door de laattijdige ontdekking van het incident, waardoor de
besmetting werd verspreid en problemen veroorzaakte bij het traceren van de bron van de
contaminatie.
In datzelfde jaar ontdekten Oostenrijkse wetenschappers dat sommige kaoliniethoudende kleien
gebruikt in voormengsels, een hoog gehalte aan dioxinen bevatten en dat hierdoor hoge
dioxineniveaus in varkens werden veroorzaakt. In 2004 veroorzaakte hetzelfde materiaal een incident
in Nederland toen het werd gebruikt bij aardappelselectie en het afval werd vervoederd aan
melkkoeien.
In 2003 veroorzaakte het gebruik van afvalhout om bakkerijafval te drogen een nieuw incident in
Duitsland en Nederland toen het gebruikt werd als diervoeder. Een vergelijkbaar incident betrof de
verontreiniging van cholinechloride, een voederingrediënt, door het gebruik van houtspaanders die
met pentachloorfenol behandeld waren.
Algemene problemen zijn de wijdverbreide besmetting van eieren van scharrelkippen en van paling
gevangen in vervuilde rivieren. Als antwoord op deze incidenten heeft de Europese Unie (EU) een
krachtig beleid ontwikkeld voor dioxinen en dl-PCB's, met inbegrip van tolerantie- en actiegrenzen
voor diervoeders en levensmiddelen
156

Dier
Grazen &
scharrelen
Bodem
90 tot 95%
Voedingspakket
3.5.2 Structuur en/of belangrijkste groepen
Veevoeder
Plant
Figuur 3.5.1 : verspreiding van dioxines en analogen
Lozingen,
contaminaties
verbranding
Water:
Vis
De basisstructuur van een dioxine bestaat uit 2 benzeenringen (dibenzo) die aan elkaar gekoppeld zijn
door 2 zuurstofatomen (diox). Op deze basisstructuur zijn een aantal chlooratomen variabel ingeplant
waarbij zowel het aantal chlooratomen als hun inplantingspositie kunnen variëren.
Op deze manier zijn er 75 varianten van het dibenzodioxinemolecule mogelijk, waarvan er een 17-tal
beschouwd worden als toxisch. Het meest toxische dioxine is het 2,3,7,8-tetrachloor-p-dibenzodioxine
(2,3,7,8-TCDD) of het Seveso-dioxine en de groep van de 17 toxische dioxines wordt beschreven als
de 2,3,7,8-dibenzodioxinegroep.
(C)
Visolie &
Vismeel
(C)= Contaminatie van plantaardig materiaal door
bijvoorbeeld verkleving met gecontamineerde bodemdeeltjes
of andere externe besmetting (bijvoorbeeld
het waslaagje op een appel)
157

Figuur 3.5.2 : de structuur van 2,3,7,8- TCDD
Concentraties van dioxines worden uitgedrukt in TEQ (toxisch equivalent), waarbij er in feite een
giftigheidscore wordt berekend die een sommatie is van de giftigheidbijdrage van de betrokken
congeneren, met het Seveso-dioxine als referentie :
met
TEQ = ∑ ci . TEFi
ci de concentratie van een congeneer i
TEFi een toxische (specifieke) equivalentiefactor voor het betrokken congeneer i (TEFi < 1)
Naast de dioxines zelf zijn er ook dioxine-like verbindingen zoals de meervoudig gechloreerde
dibenzofuranen, waarbij de koppeling van de benzeenringen gebeurt door één in plaats van twee
zuurstofatomen.
3.5.3 Analysemethodes
Figuur 3.5.3 : de structuur van 2,3,7,8- TCDF
De CALUX®-bioassay (Chemically Activated LUciferase eXpression) is op dit moment de meest
toegepaste screeningsmethode voor dioxinen, dioxine-achtige verbindingen en dl-PCB's in levensmiddelen
en diervoeders en dit zowel tijdens incidenten als voor routinecontrole. Deze bioassay is in
staat om monsters met een dioxinegehalte hoger dan de algemene achtergrond op te sporen en heeft
als voordeel zijn snelle uitvoerbaarheid (3 werkdagen) en zijn grote analysecapaciteit.
Met CALUX kunnen dioxines in monsters worden opgespoord, maar kan er geen exacte kwantificering
van de concentratie gebeuren. Er wordt immers bij CALUX een algemene respons gemeten omdat de
techniek niet in staat is de individuele componenten in het monster te identificeren. Bovendien is de
respons van de verschillende componenten niet altijd recht evenredig met zijn TEF-waarde en kan dus
een component met een lage TEF waarde een zeer hoge respons geven bij CALUX (Dit geldt dan
vooral voor monsters met een hoge bijdrage van mono-ortho-PCB’s zoals bijvoorbeeld wilde paling).
Indien er dus bij de CALUXtechniek verdachte monsters worden opgespoord moeten deze steeds
kwantitatief bevestigd worden met Hoge Resolutie MassaSpectrometrie (GC-HRMS), waarbij men wel
in staat is de verschillende componenten éénduidig te identificeren en te kwantificeren.
Wanneer dioxines of dioxine-achtige verbindingen in normale omstandigheden in aanraking komen
met cellen zullen ze binden met een zeer specifiek celreceptor, namelijk de arylkoolwaterstofreceptor
(ArylhydrocarbonReceptor of AhR). Hierdoor wordt er een AhR-afhankelijke genexpressie geactiveerd
158

die toxische effecten kan veroorzaken. De eerste stap in dit proces is de binding van dioxinen en
andere dioxineachtige verbindingen aan de AhR, waarna er een translocatie van het AhR-complex
naar de celkern optreedt. In de celkern bindt het AhR-complex aan een welbepaalde DNA-sequentie
die ook het Dioxin Responsive Element (DRE) genoemd wordt. Hierdoor treedt er een verstoring op in
de normale werking van een gen waardoor er fouten in transcriptie en translatie kunnen optreden, die
toxische effecten kunnen veroorzaken.
De CALUX-bioassay speelt in op dit natuurlijk mechanisme en maakt gebruik van genetisch
gemodificeerde cellen (muis, rat) die een reportergen bevatten dat in aanwezigheid van dioxineachtige
verbindingen codeert voor luciferase. (Een reportergen is een gen waarvan de expressie
kwalitatief/kwantitatief kan worden gedetecteerd, bijvoorbeeld door de productie van een bepaalde
stof, in dit geval luciferase). Bij CALUX wordt dus het luciferase-gen “aangeschakeld” doordat het
AhRcomplex gaat binden op het DRE.
De hoeveelheid luciferase die hierdoor wordt geproduceerd is hierbij een maat voor de concentratie
aan dioxine-achtige stoffen. Door toevoeging van luciferine aan de cellen kan de hoeveelheid
geproduceerd luciferase gemeten worden door meting van het geproduceerde licht (lichtreactie
‘luciferine + luciferase= reactieproduct + LICHT)
Dioxine
PCBs
PAKs
…
Ah-R
3.5.4 Toxiciteit voor mens en/of dier
DRE
gen
Cytochroom P450
eiwitten
Toxische effecten
DRE
Figuur 3.5.4 : Mechanisme CALUX
Luciferase-gen
luciferase
+ luciferine
Dioxines en dioxineachtige verbindingen accumuleren in vetweefsel en wordt hoofdzakelijk via dierlijk
vet (en olie) aan de mens doorgegeven. Uitscheiding gaat voornamelijk via de galblaas. Vrouwen
kunnen door borstvoeding hun baby in een vroeg stadium reeds besmetten.
Dioxines binden op een receptor in de cel waardoor bepaalde genen geactiveerd worden wat
aanleiding geeft tot vorming van specifieke polipeptiden die de oorzaak zijn van de uiteindelijke
toxische effecten die enkel bij zeer hoge concentraties acuut zijn (mechanisme toxiciteit zie hoger).
159

Het type van de blootstelling (acuut versus chronisch) en de blootstellingsconcentratie bepalen in
belangrijke mate de uiteindelijke toxische effecten van dioxineblootstelling.
Dioxines kunnen interfereren met lichaamshormonen en cellulaire receptoren. Daarom kunnen ze een
effect hebben op groei, reproductie en ontwikkeling en eveneens op het afweersysteem en op
neurologische functies. In hoge concentraties kunnen dioxines chlooracné (een huidaandoening),
kanker, lever-, maag- en darmstoornissen veroorzaken.
3.6 Zware metalen en arsenicum
3.6.1 Belangrijkste groepen
De belangrijkste zware metalen zijn : Pb, Cd, Hg, As
Figuur 3.6.1 : Mogelijke besmettingsroutes voor zware metalen. Dit schema pretendeert geen
volledigheid maar geeft enkel duiding aan de meest algemene besmettingsroutes (Hg kan
bijvoorbeeld ook via de luchtwegen opgenomen worden)
3.6.2 Analysetechniek
AAS, ICP-OES, ICP-MS, AMA e.a.
Bodem
ruwvoeder & gras
Dier Plant
vnl. in nier & lever
Voedingspakket
opname
Lozingen,
contaminaties
stofneerslag
Water:
Vis
160

3.6.3 Toxiciteit voor mens en/of dier
3.6.3.1 Lood
Lood komt de voedselketen binnen via loodhoudend stof dat op de planten neerdwarrelt. Planten
nemen nagenoeg geen lood op uit de bodem. Als het vee wordt gevoederd met door lood
gecontamineerde planten kan zo ook lood in vlees, melk en zuivelproducten terechtkomen.
Orgaanvlees bevat relatief meer lood dan spiervlees omdat lood zich vooral opstapelt in de lever. Het
loodgehalte in vis, schaal- en schelpdieren is laag tot zeer laag.
Plantaardige levensmiddelen en vooral (blad)groenten en fruit zijn de belangrijkste bron van lood in
onze voeding. De concentratie aan lood in alcoholische dranken en in het bijzonder in wijn kan wel
sterk oplopen. De oorzaak is voor een deel te vinden in het gebruik van loodbevattende capsules voor
het afsluiten van de flessen. Het bewaren van likeuren en aperitiefdranken in mooie kristallen karaffen
kan eveneens de hoeveelheid lood in de drank verhogen. Kristal bevat immers grote hoeveelheden
loodoxide dat in de drank kan migreren.
Slechts een klein deel van het ingenomen lood wordt ook effectief opgenomen door het lichaam. Het
grootste deel van het opgenomen lood wordt in het skelet opgestapeld. De rest komt in het bloed
terecht. Hoewel de schadelijke inwerking van te hoge concentraties lood in bijna alle weefsels kan
worden vastgesteld, zijn sommige organen en weefsels bijzonder gevoelig voor lood, zoals het bloed
en de bloedvormende organen (het beenmerg), het zenuwstelsel (de hersenen en het perifere
zenuwstelsel), de spieren en de nieren.
3.6.3.2 Cadmium
Cadmium zit in nagenoeg alle voedingsmiddelen en wordt in ongeveer gelijke mate aangebracht door
plantaardige en dierlijke producten. Vlees, fruit, melk en zuivelproducten bevatten relatief weinig
cadmium. Groenten en vooral bladgroenten nemen daarentegen vrij gemakkelijk cadmium op uit de
bodem. Vis en graangewassen (in het bijzonder rijst) dragen in belangrijke mate bij aan de opname
van cadmium via de voeding. Bij verwerking van de granen neemt de concentratie aan cadmium
evenwel sterk af. Schaal- en schelpdieren bevatten relatief veel cadmium. In de marge kan nog
worden opgemerkt dat roken verantwoordelijk is voor een aanzienlijke supplementaire opname van
cadmium.
Slechts een klein deel (5 à 6 %) van het cadmium in het voedsel wordt geresorbeerd. Het opgenomen
cadmium wordt gemakkelijk in het lichaam opgestapeld, in hoofdzaak in de cortex van de nier en in
mindere mate in de lever.
3.6.3.3 Arseen
Arseen is een natuurlijk bestanddeel van de aardkorst. Arseen is in al zijn verbindingen giftig,
anorganische arseenverbindingen zijn echter veel giftiger dan organische arseenverbindingen.
Bronnen van arseen zijn bronwater (in sommige landen met veel arseen in de bodem), vis, schaal- en
schelpdieren. De gebruikelijke concentratie van arseen in de voeding is van die grootteorde dat er
geen gevaar is voor de volksgezondheid.
161

Door andere bronnen dan levensmiddelen kan iemand wel een arseenvergiftiging oplopen (zelfmoord,
mijnontginning, pesticiden). Anorganische arseen stoort de biochemische processen (As 3+ bindt aan
lipoïnezuur in pyruvaat dehydrogenase en As 5+ stoort oxidatieve fosforylatie).
3.6.3.4 Kwik
In de natuur komt kwik voor als elementair kwik en in diverse anorganische en organische
verbindingen en complexen.
De anorganische vormen van kwik zijn minder toxisch dan de organische, maar de anorganische
vormen kunnen worden omgezet naar organische vormen door bacteriën. Van de organische vormen
is methylkwik de meest giftige.
Kwik heeft drie valenties: Hg 0 , Hg 1+ en Hg 2+ . Tot de species die toxisch zijn behoren de anorganisch
vormen: metallisch kwik (Hg 0 ), eenwaardig kwik (mercurokwik; Hg 2+ ), tweewaardig kwik (mercurikwik;
Hg 2+ ), en de organische vormen: o.a. ethylkwik en methylkwik (mono-methylkwik).
3.6.3.4.1 Absorptie
Hoe kwik wordt opgenomen door het lichaam hangt af van de vorm en de manier waarop het lichaam
ermee in aanraking komt. Tabellen 3.6.1 en 3.6.2 geven een overzicht van de voornaamste
blootstellingswegen en de toxiciteitskinetiek van kwikverbindingen in het menselijk lichaam.
Metallisch kwik wordt bij ingestie doorgaans niet goed opgenomen, maar de damp die bij inademen in
de longen komt, wordt voor 80 % geabsorbeerd en is erg giftig.
Van anorganische kwik wordt 10 tot 30 % opgenomen via het darmkanaal. De mate van opname en
toxiciteit van anorganisch kwik hangt sterk af van de wateroplosbaarheid. Hg 2+ -verbindingen worden
makkelijker opgenomen dan Hg + -verbindingen (European Food Safety Authority (EFSA), 2008).
Tabel 3.6.1. Bronnen van toxische kwikverbindingen voor de mens (ATSDR, 1999)
Kwikverbinding Bronnen van blootstelling voor de mens
Elementair kwik
(Hg 0 )
Mercuri-kwik
(Hg 2+ )
Methylkwik
(CH3Hg + )
Tandvullingen, blootstelling tijdens het uitvoeren van bepaalde
beroepen (labo, elektronica), fossiele brandstoffen,
verbrandingsinstallaties
Oxidatie van elementair kwik, demethylatie van methylkwik, bewuste
of accidentele vergiftiging met HgCl2
Vis, zeedieren, schaaldieren, dieren en gevogelte die gevoed
werden met vismeel
De opname van methylkwik en de zouten ervan via het spijsverteringsstelsel gaat sneller dan de
opname van anorganisch kwik en bedraagt meer dan 80 %. Aanwezigheid van organische liganden in
het voedsel zoals fytaten, eiwitten, aminozuren of micronutriënten zoals selenium kunnen de absorptie
beïnvloeden, maar andere factoren zoals de tijd dat het voedsel in de darm verblijft en fysiologie
hebben een groter effect op de biobeschikbaarheid van kwik.
162

Tabel 3.6.2. Absorptie van toxische kwikverbindingen in het menselijk lichaam (ATSDR, 1999)
Absorptie via
inhalatie
Elementair kwik (Hg 0 ) Mercuri-kwik (Hg 2+ ) Methylkwik (CH3Hg + )
Hg 0 - 80 % quasi
onmiddellijke absorptie
Absorptie oraal Nagenoeg geen
absorptie, Hg 0 -damp in
darm wordt omgezet
naar HgS en
uitgescheiden
Absorptie via
de huid
Gemiddelde
opnamesnelheid via de
huid = 0,024 ng/cm²
voor elke 1 mg/m² in de
lucht
3.6.3.4.2 Distributie en afzetting in weefsels
Aerosol van HgCl2 Methylkwikdamp –
100 % absorptie
Evenredig met
wateroplosbaarheid van
mercuri-kwikzouten ;
opname bij
pasgeborenen hoger
dan bij volwassenen
2 tot 3 % van de
toegepaste dosis HgCl2
onmiddellijk
Methylkwik in vis –
95 % absorptie
3 tot 5 % van de
toegepaste dosis na
5 uur
Geabsorbeerde damp van metallisch kwik wordt quasi onmiddellijk verspreid over het lichaam. Het
metallisch kwik gaat doorheen de bloed-hersenbarrière en de placenta en zo’n vijf procent van de
hoeveelheid metallisch kwik in het bloed van de moeder wordt in de moedermelk teruggevonden. Het
weinige metallisch kwik dat geabsorbeerd wordt in de darm, wordt geoxideerd tot Hg 2+ in de weefsels
waardoor er nagenoeg geen verdere verspreiding in het lichaam gebeurt (EFSA, 2008). Metallisch
kwik kan ernstige schade aanrichten in de hersenen en het zenuwstelsel, de lever en de nieren.
Anorganisch kwik kan moeilijk doorheen de bloed-hersenbarrière en doorheen de placenta. In de
hersenen wordt dan ook heel weinig anorganisch kwik aangetroffen. Het opgenomen anorganisch
kwik gaat voor het grootste deel naar de nieren en in mindere mate naar de lever en de beenderen.
Bij zwangere vrouwen komen slechts kleine hoeveelheden anorganisch kwik terecht bij de ongeboren
baby. In de foetus en in de pasgeborene is de bloed-hersenbarrière nog niet volledig gevormd
waardoor de concentratie aan mercuri-kwik in de hersenen hoger is dan deze in volwassenen. In
pasgeborenen wordt het mercuri-kwik niet geconcentreerd in de nieren, maar is het verspreid over de
andere weefsels.
Methylkwik kan doorheen de bloed-hersenbarrière, de placenta, de melkklieren en haarfollikels. Zo’n
16 % van het totaal kwikgehalte in moedermelk is methylkwik. Van kwik in het haar is 90 % methylkwik
(ATSDR, 1999).
Opgenomen methylkwik wordt naar alle weefsels verspreid, hoewel het grootste deel in de nieren
wordt afgezet. In het bloed wordt methylkwik voor het grootste deel teruggevonden in rode bloedcellen
waar het gebonden is aan hemoglobine. Een kleinere fractie is gebonden aan plasma-eiwitten en
thiolverbindingen, L-cysteïne en gereduceerd glutathion. Kwik in het bloed wijst op recente
blootstelling aan methylkwik en anorganisch kwik. Methylkwik komt via de bloedstroom van zwangere
vrouwen in het bloed van de foetus.
163

Tabel 3.6.3 Distributie van toxische kwikverbindingen in het menselijk lichaam (ATSDR, 1999)
Verdeling in
het lichaam
Elementair kwik (Hg 0 ) Mercuri-kwik (Hg 2+ ) Methylkwik (CH3Hg + )
Vetoplosbaar, daardoor
snelle verspreiding in
het lichaam
Accumulatie in de nier, Vetoplosbaar,
fractie die niet wordt daardoor over heel het
uitgescheiden via de lichaam verspreid,
urine hangt af van de waarvan 1-10 % in het
dosis
bloed, 90 % daarvan in
de rode bloedcellen
Bij herhaaldelijke blootstelling kan kwik zich ophopen in het lichaam. Afhankelijk van de verbinding
wordt een ander orgaan belast (Tabel 3.6.4).
Tabel 3.6.4 Doelwitorganen van toxische kwikverbindingen (ATSDR, 1999)
Kwikverbinding Doelwitorgaan
Elementair kwik (Hg 0 ) Hersenen en nieren
Mercuri-kwik (Hg 2+ ) Nieren
Methylkwik (CH3Hg + ) Hersenen, zowel bij volwassene als foetus
3.6.3.4.3 Metabolisme
Kwik en kwikverbindingen worden gemetaboliseerd via een oxidatiereductie cyclus. Metallisch kwik
kan in het bloed en in de weefsels worden geoxideerd door katalase en waterstofperoxide en kan
worden omgezet in de gevaarlijker geïoniseerde vorm Hg 2+ (Tabel 3.6.5). Zolang deze oxidatie nog
niet volledig is, kan het opgeloste kwik de hersen- en placentabarrière passeren. Als oxidatie
plaatsvindt in de hersenen of placenta is de weg terug naar de bloedbaan vrijwel afgesloten en stapelt
het kwik zich op in de hersenen of de foetus.
In de nieren bindt anorganisch kwik op thiolverbindingen en structurele eiwitten. Zo is
methylkwikcysteïne structureel analoog aan methionine. Bij langdurige kwikbelasting kan de capaciteit
van deze eiwitten overschreden worden waardoor kwik schade kan aanrichten in de nieren.
Tabel 3.6.5 Mechanisme van toxiciteit van toxische kwikverbindingen (ATSDR, 1999)
Kwikverbinding Mechanisme toxiciteit
Elementair kwik (Hg 0 ) Oxidatie naar Hg 2+
Mercuri-kwik (Hg 2+ )
Methylkwik (CH3Hg + )
Hg 2+ bindt op thiolverbindingen in kritische enzymen
(bvb. cysteïne) en structurele eiwitten
Demethylatie tot Hg 2+ en de intrinsieke toxiciteit van
methylkwik
Hg 2+ -kwik kan gemethyleerd worden in lichaamsweefsels of omgezet worden tot methylkwik door de
darmbacteriën.
164

Organisch kwik dat geabsorbeerd is, wordt omgezet naar Hg 2+ door splitsing van de C-Hg verbinding
en vervolgens verder gemetaboliseerd via de oxidatiereductiecyclus. Dit gebeurt in de darm door
darmbacteriën, maar ook in rode bloedcellen en in weefsels. De demethylatie gaat zeer traag.
Arylkwikverbindingen (bvb. fenylkwik) wordt sneller omgezet dan korteketen kwikverbindingen (bvb.
methylkwik).
Darmbacteriën blijken een resistentie te hebben tegen organisch kwik via een enzym (een lyase) dat
de demethylatie van methylkwik naar Hg 2+ katalyseert. Hg 2+ kan mogelijk verder gereduceerd worden
tot elementair kwik.
Selenium kan mogelijk de accumulatie van methylkwik in het lichaam beïnvloeden, maar het
mechanisme ervan is nog niet bewezen. Mogelijke mechanismen zijn: vorming van selenomethylkwikcomplexen,
selenium geïnduceerd vrijmaken van methylkwik uit zwavelverbindingen in
bloed en weefselspecifieke mechanismen die de intracellulaire opname van methylkwik beïnvloeden.
3.6.3.4.4 Excretie
De belangrijkste excretieroute van anorganisch kwik is via de urine en de faeces. Van het oraal
opgenomen anorganisch kwik wordt uiteindelijk zo’n 80 % via de faeces weer uitgescheiden. De
halfwaardetijd voor geabsorbeerd Hg 2+ is ongeveer 40 dagen (Clarkson et al., 1988).
Anorganisch kwik kan ook gereduceerd worden naar elementair kwik dat wordt uitgeademd of in de
moedermelk terechtkomt.
Excretie van ongewijzigd methylkwik gebeurt hoofdzakelijk in de faeces via excretie van gal. In de
lever wordt methylkwik omgezet naar methylkwikglutathioncomplex en via de gal in de darm
uitgescheiden. Het grootste deel van het methylkwik wordt vervolgens uitgescheiden via de faeces,
een klein deel wordt gedemethyleerd naar anorganisch kwik waarvan zo’n 10 % weer wordt
opgenomen.
Anderzijds wordt methylkwik traag gedemethyleerd naar Hg 2+ door weefselmacrofagen en
darmbacteriën. Demethylatie vindt ook plaats in de lever van de foetus.
Methylkwik wordt op een natuurlijke wijze uit het lichaam verwijderd aan een snelheid van 1 %
lichaamsbelasting per dag. Na 1,5 à 2 maanden is de helft van het aanwezige methylkwik uit het
lichaam verdwenen. Borstvoeding resulteert in snellere verwijdering van kwik uit het bloed.
Tabel 3.6.6 geeft de belangrijkste excretieroutes weer van de toxische kwikverbindingen.
Tabel 3.6.6 Excretie van toxische kwikverbindingen (ATSDR, 1999)
Kwikverbinding Excretie uit het menselijk lichaam
Elementair kwik (Hg 0 )
Mercuri-kwik (Hg 2+ )
Methylkwik (CH3Hg + )
Als Hg 0 uitgescheiden in adem, zweet, speeksel; als Hg 2+ in
faeces en urine uitgescheiden
In faeces en urine, ook in zweet, speeksel, gal, adem,
moedermelk
Voornaamste route: faeces en gal; 90 % in faeces als Hg 2+
uitgescheiden; 10 % in urine als Hg 2+ uitgescheiden
165

3.6.3.4.5 Toxische effecten van kwik in het menselijk lichaam
Kwik is erg toxisch voor de meeste levensvormen, maar de toxiciteit hangt af van de chemische vorm.
Elementair kwik is relatief inert en wordt niet gemakkelijk opgenomen via het gastro-intestinaal kanaal,
maar zijn damp is toxisch. Mercuri-zouten zijn erg toxisch, maar de door micro-organismen
gemethyleerde producten (methylkwik en dimethylkwik) ervan zijn nog het meest toxisch.
3.6.3.4.6 Toxische effecten van elementair kwik
In mensen blijkt het zenuwstelsel het meest gevoelig aan blootstelling aan elementair kwik.
Symptomen van neurotoxiciteit door elementair kwik zijn o.a. tremor, zenuwachtigheid, geïrriteerdheid,
overdreven verlegenheid, slapeloosheid, geheugenverlies en cognitieve problemen. Bij hogere dosis
worden de nieren beschadigd en kunnen problemen met de longen voorkomen. Ook auto-immuun
effecten zijn geassocieerd met elementair kwik.
3.6.3.4.7 Toxische effecten van anorganisch kwik
De nieren blijken het doelwitorgaan na ingestie van anorganische kwikzouten. Er is ook bewezen dat
blootstelling aan anorganisch kwik een auto-immuun respons teweegbrengt. Mercuri-kwik is door de
International Agency for Research on Cancer (IARC) geklasseerd in groep 3 (= niet carcinogeen voor
mensen).
3.6.3.4.8 Toxische effecten van methylkwik
Nagenoeg alle beschikbare toxiciteitstudies over organisch kwik, beperken zich tot methylkwik. Hier
wordt dan ook enkel de toxiciteit van methylkwik behandeld.
Het doelwitorgaan van methylkwik zijn de hersenen en dit zowel bij volwassenen als in de foetus.
Een waaier aan toxische effecten is verbonden aan de blootstelling aan methylkwik. Het belangrijkste
effect van langdurige blootstelling aan hoge concentratie methylkwik is neurotoxiciteit. Effecten op de
ontwikkeling van het zenuwstelsel werden waargenomen in kinderen die in hun prenatale fase werden
blootgesteld aan methylkwik. Dierstudies bevestigen deze bevindingen.
Neurotoxiciteit
Neurotoxische effecten konden worden vastgesteld in twee incidenten, waarbij personen aan zeer
hoge dosissen methylkwik werden blootgesteld: Japan (Minamata Bay en Niigata, 1956-1965) en Irak
(1956 en 1959-1960). Uit deze incidenten bleek dat de eerste symptomen van toxiciteit pas enkele
maanden na de blootstelling verschenen en dat de meest ernstige effecten gebeurden in de hersenen
en het zenuwstelsel van de foetus.
Personen die in Japan vergiftigd bleken door methylkwik uit vis vertoonden o.a. parenthese (=
verkeerde gevoelswaarneming veroorzaakt door inwendige prikkels), ataxie (= stoornis in de
samenwerking van de spieren), tremor, achteruitgang van het gehoor en moeilijkheden bij het lopen.
In Irak waar mensen vergiftigd werden door het eten van brood gemaakt uit granen behandeld met
een fungicide dat methylkwik bevatte, bleek parenthese het meest voorkomend symptoom. De meest
166

ernstig gecontamineerde personen vertoonden ataxie, wazig zicht, brabbelen, blindheid, doofheid en
dood. In zowel Japan als Irak bleken de effecten bij de kinderen die werden blootgesteld in de uterus
veel ernstiger en bij sommige kinderen werden reeds bij lagere dosis dan bij volwassenen effecten
waargenomen.
Uit epidemiologische studies werden gegevens gehaald over neurotoxische effecten door chronische,
langdurige blootstelling aan een lage dosis methylkwik. De studies vonden plaats in landen waar veel
vis en mariene dieren op het menu staan, nl. Nieuw-Zeeland, Faeröer eilanden en de Seychellen.
Het exacte mechanisme waarmee methylkwik neurotoxische effecten veroorzaakt, is nog niet bekend.
Methylkwik veroorzaakt mogelijk veranderingen in de normale ontwikkeling van de hersenen van
kinderen en bij hogere concentraties kan het neurologische veranderingen veroorzaken bij
volwassenen.
Prenatale blootstelling interfereert met de groei en migratie van neuronen en kan onomkeerbare
schade toebrengen aan het centraal zenuwstelsel. Bij blootstelling aan extreem hoge dosis in de
uterus zijn ernstige handicaps vastgesteld zoals mentale achterstand, epilepsie, blindheid en doofheid.
Carcinogeniteit
Bepaalde studies toonden een associatie tussen methylkwik en kanker, maar de bewijzen voor de
carcinogeniteit van methylkwik zijn strijdig. Er werd geen associatie gevonden tussen kwik en kanker
in epidemiologische studies, maar twee studies vonden wel een associatie tussen kwik en acute
leukemie. In dierproeven werd schade aan de nieren berokkend door hoge dosis kwik, maar geen
tumorgenerisch effect. Kwik blijkt in vitro wel in staat om schade toe te brengen aan chromosomen en
DNA van o.a. gisten, bacteriën, cellen van vissen, zoogdieren en in lymfocyten en hersencellen van
mensen. In vivo zijn de testresultaten echter niet overtuigend.
Methylkwik wordt daarom bestempeld als mogelijk kankerverwekkend voor de mens (groep 2B)
volgens het International Agency for Research on Cancer (IARC, 1993). De giftigheid hangt af van de
dosering.
Toxische effecten op het cardiovasculair systeem
Er zijn bewijzen van negatieve effecten van methylkwik op het ontwikkelende en volgroeide
cardiovasculair systeem (bloeddrukregulatie, hartslagvariabiliteit, hartziekten). Sommige onderzoeken
toonden negatieve effecten aan bij blootstelling aan gehalten aan methylkwik lager dan het niveau
waarbij neurotoxiciteit werd vastgesteld.
In 1995 vonden onderzoekers in Finland een correlatie tussen consumptie van met methylkwik
gecontamineerde vis en het risico op acuut myocardiaal infarct en dit mogelijk doordat kwik
peroxidatie van vet kan bevorderen.
Toxische effecten op de nieren
Organisch en anorganisch kwik zijn bekend om hun toxische effecten op de nieren. Mensen
blootgesteld aan organisch kwik krijgen polyurie (= sterk vermeerderde urineafscheiding) en
albuminurie (= aanwezigheid van eiwitten in de urine). Autopsies van mensen vergiftigd door alkylkwik
onthulden nefritis (= nierontsteking).
167

Toxisch effect op het immuunsysteem
Het immuunsysteem blijkt gevoelig te zijn voor kwik. Wetenschappers bestudeerden de effecten van
methylkwik op het immuunsysteem van muizen en zagen veranderingen in de thymus en in de
natuurlijke killer-cel activiteit na toedienen van methylkwik. Op mensen zijn nog geen testen
uitgevoerd, maar er zijn wel gevallen bekend van blootstelling aan elementair kwik en verandering in
CD4+ lymfocyten.
Toxisch effect op bloeddrukregulatie
Een verhoogde diastolische en systolische bloeddruk werd vastgesteld in kinderen van 7 jaar oud die
als foetus waren blootgesteld aan methylkwik.
3.6.3.4.9 Risico op kwikvergiftiging - Menselijke blootstelling via dieet
Hoewel inhalatie van gasvormig kwik uit de lucht, opname via drinkwater dat besmet is met kwik en
kwik in medicatie kunnen bijdragen tot de menselijke blootstelling aan kwik, wordt de opname via het
voedsel als de belangrijkste bron beschouwd van niet-accidentele blootstelling aan kwik.
Vis en aquacultuurproducten zijn de belangrijkste bron van kwikopname door de mens. De
gemiddelde concentratie aan kwik in vis in Europa wordt geschat op 62 tot 97 µg/kg volgens een
studie van 2005. Afhankelijk van de soort is het aandeel methylkwik 70 tot 100 % van het totaal
kwikgehalte in vis.
3.6.3.4.10 Aanbevelingen i.v.m. kwik in voeding
Nagenoeg alle vissen bevatten sporen van methylkwik, maar grotere vissen die langer geleefd
hebben, hebben de hoogste concentraties aan methylkwik omdat ze meer tijd hadden om het
methylkwik te accumuleren in hun lichaam. Het is daarom aanbevolen terughoudend te zijn met het
eten van roofvissen zoals zwaardvis, haai, koningsmakreel, tegelvis en (verse) tonijn (typische
concentraties 500 tot 1000 µg/kg). Dit geldt vooral voor vrouwen die zwanger zijn of willen worden,
voor kinderen en voor vrouwen die borstvoeding geven. Kinderen en ongeboren baby's zijn namelijk
het meest gevoelig voor de effecten van kwik.
Omwille van de goede eigenschappen van vis is het niet aangewezen vis te schrappen uit het menu,
maar wel om vis te eten met lage gehalten aan methylkwik. Vissen en aquacultuurproducten met
lagere gehaltes aan methylkwik zijn o.a. garnaal, ingeblikte lichte tonijn, zalm, koolvis, katvis, haring
en sardines (typische concentratie < 100 µg/kg).
Twee porties tonijn uit blik per week is geen probleem, omdat die afkomstig is van kleine (jonge)
vissen. De maximale concentratie kwik gevonden in gekweekte zalm is ongeveer vijf keer lager dan
de EG-norm voor kwik in vis (0,5 mg/kg voor zalmachtigen). Het is dus mogelijk om twee keer per
week vis op het menu te zetten, zoals wordt aanbevolen door diëtisten, zonder verhoogd risico voor
de gezondheid.
168

3.7 Coccidiostatica
3.7.1 Inleiding
Coccidiose is een zeer besmettelijke infectieziekte bij dieren die veroorzaakt wordt door parasitische
eencellige eukaryotische levensvormen (protozoa). Deze protozoa staan gekend onder de naam
coccidia en dan meer specifiek het genus Eimeria. Momenteel zijn er meer dan 600 soorten coccidia
gekend, maar slechts een aantal soorten infecteren pluimvee. De meest pathogene hiervan zijn E.
tenella, E. necatrix, E. maxima, E. acervulina, E.mitis, E.praecox en E. brunetti. Naast pluimvee,
kalkoenen en konijnen kunnen coccidia ook andere dieren zoals varkens en schapen infecteren, maar
deze dieren zijn minder gevoelig.
De levenscyclus van een Eimeria in een dier begint door opname van gesporuleerde oöcysten, die elk
4 sporocysten bevatten met 2 sporozoïeten. Bij lichaamstemperatuur verlaten de sporozoïeten hun
sporocyste, worden actief en dringen zeer snel binnen in de epitheelcellen van de darm van de
gastheer. De levenscyclus van een Eimeria binnenin de epitheelcellen omvat vervolgens 3 à 4
generaties van asexuele vermenigvuldiging (schizogonie of merogonie), gevolgd door de sexuele
vermenigvuldiging die men gametogonie noemt. Hieruit ontstaan uiteindelijk de oöcysten, die samen
met de mest in de omgeving worden uitgescheiden. Onder gunstige omstandigheden ontwikkelen
deze oöcysten zich binnen 24 uur tot gesporuleerde oöcysten, die terug kunnen opgenomen worden
door de gastheer, waarna de cyclus herbegint.
Coccidiose in zijn acute vorm is dodelijk en in subacute gevallen leidt het tot gewichtsverlies door
verminderde voederconversie en verminderde eierproductie bij pluimvee.
Figuur 3.7.1 Levenscyclus van een Eimeria
169

3.7.2 Structuur en/of belangrijkste groepen
De chemische verbindingen die gebruikt worden ter bestrijding van coccidiose hebben geen algemene
gemeenschappelijke noemer en kunnen hun effect op de coccidia uitoefenen tijdens verschillende
stadia van de levenscyclus van de parasiet.
Ze worden algemeen coccidiostatica genoemd, hoewel er een onderscheid gemaakt kan worden
tussen een anticoccidiale werking (afdoden van coccidia) en een coccidiostatische werking (remming
van ontwikkeling van coccidia). Meestal worden coccidiostatica toegediend via gemedicineerde
voeders, hoewel ook toevoegingen via het drinkwater en besproeiing voorkomen. Sommige
verbindingen bezitten bovenop hun coccidiostatische werking ook een antibiotische of antibacteriële
activiteit. Of een verbinding therapeutisch gebruikt wordt als antibioticum of als coccidiostaticum is
afhankelijk van de toegediende concentratie.
Globaal genomen kunnen de coccidiostatica worden in ingedeeld in twee groepen, namelijk de
ionofore en niet-ionofore coccidiostatica.
Ionofore coccidiostatica zijn stoffen die een polyethergroep bevatten en die geproduceerd worden
door gisting met behulp van een aantal Streptomyces en Actinomadura soorten. Het zijn vetoplosbare
molecules die ionen transporteren door de lipidendubbellaag van het celmembraan en zo de
levensnoodzakelijke regeling van ionengradiënten van micro-organismen verstoren.
Er zijn twee mechanismen waardoor ionoforen het transport van ionen doorheen hydrofobe structuren
kunnen regelen: een complexvorming tussen ion en ionofoor of de vorming van een ionenkanaal.
Bij de complexvorming is er een welbepaalde verhouding ion-ionofoor (meestal 1:1). Het ionofoor
plooit zich rond het ion zodat het ion zich bevindt in het polaire binnenste van het ionofoor, terwijl de
buitenzijde voornamelijk hydrofoob is en als zodanig oplosbaar is in niet-polaire media. Het ion wordt
in het ionofoor vastgehouden door zuurstofatomen via ion-dipool interacties. In feite treedt het ionofoor
op als solvent voor het ion.
Ionoforen die werken via de vorming van een ionkanaal maken een polair kanaal in het niet polaire
celmembraan waardoor kleine ionen zich in en uit de cel kunnen bewegen.
De biologische activiteit van ionoforen is te wijten aan hun mogelijkheid om ionenflows in en uit cellen
te verstoren. Normaal gezien is in de cel de hoeveelheid K + groter dan de hoeveelheid Na + , terwijl dit
extracellulair net omgekeerd is. Dit onevenwicht is noodzakelijk voor een normale celwerking en wordt
in stand gehouden door een specifiek transportproteïne dat natriumionen uit de cel pompt in ruil voor
kaliumionen (het natrium-kalium adenosine trifosfatase). Ionoforen verstoren dit ionisch “onevenwicht”
doordat ze ionen kunnen doorlaten naar de cel, met celschade en eventueel celsterfte tot gevolg.
Tot de ionofore coccidiostatica behoren semduramycine(natrium), lasalocid(natrium),
monensin(natrium), salinomycine(natrium), narasin en maduramicine(ammonium). De niet-ionofore
coccidiostatica hebben geen gemeenschappelijke chemische eigenschappen en zijn halofuginone,
nicarbazine, robenidine(hydrochloride), diclazuril en decoquinaat.
Momenteel zijn er 11 coccidiostatica vergund als diervoederadditief voor toepassing in kippen,
kalkoenen en konijnen. Elk product wordt wettelijk vergund onder een bepaalde merknaam voor
toepassing in een welbepaald doeldier en in een welbepaalde concentratie (zie bijlage 1 voor een
overzicht van de vergunningen). In elke vergunning wordt ook een verplichte wachttijd opgenomen, i.
e. de tijd die verplicht moet verstrijken tussen de laatste toediening van het coccdiostaticum aan het
170

dier en het slachten van het dier. De toepassing van deze wachttijd of “withdrawal time” heeft tot doel
te vermijden dat er residuen van de coccidostatica zouden kunnen voorkomen in levensmiddelen van
dierlijke oorsprong en zo mogelijk een risico kunnen vormen voor de consument. Verordening (EG) nr.
1831/2003 biedt de mogelijkheid om de vergunning voor een toevoegingsmiddel te wijzigen ingevolge
een verzoek van de vergunninghouder en een advies van de Europese Autoriteit voor voedselveiligheid
(EFSA).
3.7.2.1 Halofuginon
Halofuginon hydrobromide is een niet-ionofoor synthetisch afgeleide van een natuurlijk alkaloïde van
de plant Dichroa febrifuga Lour. Trans-halofuginon is het actieve ingrediënt, terwijl het cis-isomeer
aanwezig is als een onzuiverheid.
3.7.2.2 Robenidine
Robenidine hydrochloride (HCl) is een niet-ionofoor synthetisch coccidiostaticum dat is vergund in de
werkzame concentraties van 30 tot 36 mg/kg in voeder voor pluimvee en in concentraties van 50 tot
66 mg/kg in voeder voor konijnen (merknaam Cycostat®).
3.7.2.3 Nicarbazine
Het niet-ionofore synthetische nicarbazine is een equimoleculair complex van 4,4’- dinitrocarbanilide
(DNC) en 2-hydroxy-4,6-dimethylpyrimidine (HDP). Het is toegelaten als voederadditief in combinatie
met narasin (merknaam Maxiban®). De voorgestelde dosering voor mestkippen is 50 mg/kg
nicarbazine en 50 mg/kg narasin in volledig diervoerder.
3.7.2.4 Diclazuril
Diclazuril is een niet-ionofore synthetische verbinding dat vergund is als coccidiostaticum bij een
maximumconcentratie van 1 mg/kg volledig diervoeder voor mestkippen en –kalkoenen (maximum 12
en 16 weken oud respectievelijk) (merknaam Clinacox®).
3.7.2.5 Decoquinaat
Decoquinaat is een niet-ionofoor synthetisch coccidiostaticum dat reeds beschreven werd in 1968. Het
gebruik ervan is relatief beperkt gebleven, omdat er vermoedens waren van resistentie van coccidia
tegen het product wanneer het gedurende langere periode op hetzelfde bedrijf werd gebruikt.
Decoquinaat is vergund als voederadditief voor gebruik bij mestkippen in een minimummaximumdosering
van 20 tot 40 mg/kg volledig diervoeder (merknaam Deccox®).
171

3.7.2.6 Semduramicine
Semduramicine-natrium is een uniek chemisch gezuiverd polyether ionofoor dat door fermentatie
geproduceerd wordt door Actinomadura roseorufa. Het is vergund als coccidiostaticum voor
mestkippen met een maximumgehalte van 25 mg/kg volledig diervoerder (merknaam Aviax®).
3.7.2.7 Lasalocid
Lasalocid-natrium is een natuurlijk polyether ionofoor dat door fermentatie wordt geproduceerd door
Streptomyces lasaliensis subsp lasaliensis. Het wordt verwijderd uit het fermentatiemedium door
aanzuring en daarna gezuiverd. Het belangrijkste actieve bestanddeel van het gezuiverde product is
Lasalocid-natrium A dat 90% van het eindproduct vertegenwoordigt. De overige 10% van het
eindproduct bestaat uit de homologen B,C,D en E waarbij telkens één methylgroep vervangen wordt
door een ethylgroep op verschillende posities van het molecule.
Lasalocid-natrium is als coccidiostaticum vergund voor gebruik bij mestkippen en opfokleghennen (tot
16 weken), en voor kalkoenen tot 12 weken (merknaam Avatec®). Het maximumgehalte van het
actieve ingrediënt in dierenvoeder bedraagt 125 mg/kg.
3.7.2.8 Monensin
Monensin is een natuurlijk ionofoor dat ontstaat uit fermentatie door Streptomyces cinnamonensis. Het
is samengesteld uit verschillende analogen A, B, C and D waarbij monensin A de belangrijkste
component is (98%). In de praktijk wordt het voornamelijk toegepast als het natriumzout.
Monensin-natrium is vergund als coccidiostatisch voederadditief voor mestkippen in een
concentratierange van 100 tot 125 mg/kg volledig diervoeder. Het is ook vergund voor opfokleghennen
(maximumleeftijd 16 weken) in een concentratierange van 100 tot 120 mg/kg. Voor kalkoenen met
maximumleeftijd van 16 weken is het toegelaten in een range van 60 tot 100 mg/kg (merknamen
Coxidin® en Elancoban®).
3.7.2.9 Salinomycine
Salinomycine is een natuurlijk polyether ionofoor dat geïsoleerd wordt uit Streptomyces albus, en dat
zowel een antimicrobieel als een anticoccidiaal effect heeft. Het wordt voornamelijk gebruikt als het
natriumzout.
Salinomycine-natrium is toegelaten als coccidiostaticum voor mestkippen in een minimummaximumdosering
van 50-70 mg/kg dierenvoeder (merknaam Salinomax®). Onder de merknaam
Sacox® is het bovendien ook toegestaan in een dosering van 50 mg/kg voor opfokleghennen en voor
mestkonijnen in een dosering van 20-25 mg/kg.
172

3.7.2.10 Narasin
Narasin is een polyether ionofoor dat geproduceerd wordt door Streptomyces aureofaciens en heeft
zowel een anticoccidiaal als een antimicrobieel effect. Het belangrijkste bestanddeel van narasin is
narasin A (96%) maar het product bevat ook de structurele varianten B, D en I.
Narasin is als coccidiostaticum toegelaten voor gebruik bij mestkippen in een minimummaximumconcentratie
van 60-70 mg/kg (merknaam Monteban®). Zoals hoger reeds beschreven is
narasin ook toegestaan voor gebruik in combinatie met nicarbazine.
3.7.2.11 Maduramicine
Dit ionofoor product wordt bekomen als het ammoniumzout van een polyether monocarboxylzuur
geproduceerd door Actinomadura yumaensis en heeft zowel anticoccidiale als antimicrobiële effecten.
Het maduramicine-ammonium dat wordt gebruikt als voederadditief bestaat voor 90% uit het
ammoniumzout van een polyether monocarboxylzuur met een –OCH3 groep op de C5 positie van de A
ring (alfa-maduramicine) en voor 10% uit een structureel gelijkaardige verbinding met een –OH groep
op die positie (beta-maduramicine). Alfa-maduramicine heeft voornamelijk een affiniteit voor
monovalente kationen.
Maduramicine-ammonium is vergund als coccidiostaticum voor mestkippen en voor kalkoenen
(maximumleeftijd 16 weken), beide in een maximumdosering van 5 mg/kg (merknaam Cygro®).
3.7.2.12 Amprolium
Amprolium is geen antibioticum, maar een analoog van thiamine (= vitamine B1). Het gaat in
competitie met het actieve transport van thiamine door coccidiën die dit vitamine nodig hebben om
zich actief te kunnen vermeerderen in de darm van pluimvee. Het werd vaak gebruikt in combinatie
met ethopabaat of met ethopabaat in combinatie met sulfaquinoxaline. De normale dosis was 125
mg/kg amprolium + 8 mg/kg ethopabaat.
3.7.3 Analysetechnieken
Welke analysetechniek er gebruikt wordt voor de verschillende coccidiostatica is afhankelijk van het
doel van de analyse. Globaal genomen kunnen er twee types van analyse worden onderscheiden,
namelijk de controle van de doseringen van de gebruikte coccidiostatica in dierenvoeders en het
opsporen van residuen van coccidiostatica in dierenvoeders en levensmiddelen.
Zoals hoger beschreven zijn er momenteel 11 coccidiostatica vergund als diervoederadditief voor
toepassing in kippen, kalkoenen en konijnen en dit door middel van verschillende vergunningen. Elke
vergunning beschrijft het gebruik van een coccidiostaticum voor een welbepaald doeldier en in een
welbepaalde concentratie, dus met toegelaten minimum- en maximumdoseringen. De grootteorde van
deze concentraties is mg/kg en bijgevolg worden de controles van de doseringen voor doeldieren
uitgevoerd met “klassieke analysemethodes” zoals HPLC en microbiologie. In de regel wordt er één
coccidiostaticum kwantitatief bepaald per analysemethode. Bij HPLC worden de analysecondities
daarbij zo geoptimaliseerd dat ze ideaal zijn voor het te analyseren coccidiostaticum. Zo kan voor de
173

chemische coccidiostatica gebruikgemaakt worden van een UV-detectie, terwijl er bij de ionoforen
eerst een derivatisatie dient te gebeuren om ze geschikt te maken voor fluorescentiedetectie.
Voor coccidiostatica die ook een antimicrobiële werking hebben kan de controle worden uitgevoerd
door een microbiologische methode. Hierbij wordt een hoeveelheid van het coccidiostaticum
toegevoegd aan een vloeibare en met bacteriën geënte voedingsbodem, waardoor de groei van de
aanwezige bacteriën zal geremd worden. De mate van groeiremming is een maat voor de aanwezige
concentratie van het coccidiostaticum en wordt gemeten met behulp van een spectrofotometer. Men
spreekt in deze context van turbidimetrie omdat er in feite een turbiditeit of troebelheid van de
voedingsbodem wordt gemeten. Hoe troebeler de voedingsbodem hoe beter de bacteriën gegroeid
zijn dus hoe minder er van het coccidiostaticum in de voedingsbodem aanwezig is. Kwantificering van
de dosering van een coccidiostaticum in een voedermonster gebeurt door vergelijking van de
turbiditeit van de beënte voedingsbodem waaraan een monsterextract werd toegevoegd met de
turbiditeit van een standaardcurve waarbij gekende hoeveelheden van het zuivere te analyseren
coccidiostaticum worden toegevoegd aan eenzelfde met bacteriën geënte vloeibare voedingsbodem.
Vermits het gaat om een microbiologische analyse waarbij enkel een groeiremming wordt gemeten,
kan er geen identificatie van het aanwezige product gebeuren, maar kan enkel een kwantificering
gebeuren waarbij ervan uitgegaan wordt dat het product dat de gemeten groeiremming veroorzaakt
hetzelfde is als het product dat men wilde doseren.
Naast het toegelaten gebruik van coccidiostatica als voederadditief voor welbepaalde doeldieren zijn
er dus ook diersoorten waarvoor het gebruik van coccidiostatica verboden is. Om te controleren of er
geen coccidiostatica aanwezig zijn in het voeder bestemd voor deze diersoorten is er een analyse
nodig op residuniveau (µg/kg). Op basis van toxiciteitsstudies bij niet-doeldieren werden er
maximumlimieten vastgelegd voor de verschillende coccidiostatica in voeders voor niet-doeldieren.
Voor de controle van ongewenste residuen van coccidiostatica in voeders worden LC-MS en UPLC
gebruikt als analysetechniek.
Naast de controle in diervoeders zijn er ook maximumlimieten voor de coccidiostatica vastgelegd in
vlees en eieren (bijvoorbeeld de Maximum Residu Limieten of MRLs) vermits mogelijke residuen van
coccidiostatica in dierenvoeders ook zouden kunnen overgaan in dierlijke levensmiddelen. De
analyses waarbij gecontroleerd wordt of de maximumlimieten in levensmiddelen niet overschreden
worden, worden uitgevoerd met LC-MS.
Voor de verschillende coccidiostatica zijn de MRLs o.a. beschreven in Richtlijn 2009/8/EG (voeder) en
Verordening (EG) Nr. 124/2009 (vlees en eieren).
3.7.4 Toxiciteit voor mens en/of dier
3.7.4.1 Situatieschets
In de praktijk komt het voor dat exploitanten van diervoederbedrijven in één en dezelfde inrichting tal
van verschillende diervoeders produceren, waarbij er dus diverse producten na elkaar op dezelfde
productielijn moeten worden bereid. Het is bijgevolg bijna onvermijdelijk dat er sporen van één product
op de productielijn achterblijven op het moment dat met de productie van een ander diervoeder wordt
begonnen.
Deze overdracht van de ene productiecharge naar de andere wordt „versleping” of
„kruisverontreiniging” genoemd en kan bijvoorbeeld voorkomen bij het gebruik van coccidiostatica als
174

toegelaten toevoegingsmiddelen. Dit kan tot gevolg hebben dat er sporen van coccidiostatica
terechtkomen in het daarna geproduceerde niet-doeldiervoeder, zoals een voeder voor diersoorten of
diercategorieën die niet in de vergunning voor het toevoegingsmiddel worden genoemd. Deze niet te
voorkomen kruisverontreiniging kan in alle stadia van de productie en verwerking van diervoeders
optreden, maar ook tijdens de opslag en het vervoer daarvan.
Rekening houdend hiermee en met inachtneming van de toepassing van goede productiepraktijken
werden er om op een realistische manier met dit fenomeen om te gaan maximumwaarden voor deze
niet te voorkomen versleping van coccidiostatica naar niet-doeldiervoeders vastgesteld in
overeenstemming met het ALARA-beginsel (As Low As Reasonably Achievable: zo laag als
redelijkerwijs mogelijk).
3.7.4.2 Halofuginon
Uit de beperkte tolerantiestudies die uitgevoerd werden bij niet-doeldieren, blijkt dat toevallige inname
van een voeder met daarin de maximumhoeveelheid van 3 mg/kg een gezondheidsrisico inhoudt voor
konijnen, ganzen, patrijzen en kwartels. Bij patrijzen kan deze dosis zelfs de dood veroorzaken.
3.7.4.3 Robenidine
Door de producenten werden beperkte tolerantiestudies uitgevoerd op legkippen, varkens en
herkauwers. Hieruit bleek dat toevallige consumptie van voeders met daarin de maximaal toegelaten
dosissen van 36 en 66 mg/kg voeder geen gezondheidsrisico inhoudt voor deze diersoorten.
3.7.4.4 Nicarbazine
Uit de beperkte tolerantiestudies die uitgevoerd werden bij niet-doeldieren, blijkt dat toevallige inname
van een voeder met daarin de maximumhoeveelheid van 50 mg/kg geen gezondheidsrisico inhoudt
voor niet-doeldieren.
3.7.4.5 Diclazuril
Verschillende tolerantiestudies werden uitgevoerd op niet-doeldieren, maar er kon geen toxiciteit
worden aangetoond bij eenden, kwartels, varkens en herkauwers die werden blootgesteld aan het
maximum toegelaten gehalte voor doeldieren (1 mg/kg).
3.7.4.6 Decoquinaat
Verschillende tolerantiestudies werden uitgevoerd op niet-doeldieren, maar er kon geen toxiciteit
worden aangetoond bij varkens, herkauwers, paarden en konijnen die werden blootgesteld aan het
maximum toegelaten gehalte voor doeldieren (40 mg/kg). Honden blijken het gevoeligste niet-doeldier
te zijn met een maximuminname van 15 mg/kg lichaamsgewicht per dag.
175

3.7.4.7 Semduramicine
Semduramicine veroorzaakt bij honden de typische toxiciteit van ionoforen zoals schade aan
skeletspieren, maar bovendien induceert het bij honden ook retinale veranderingen die nog bij geen
andere diersoorten werden waargenomen.
3.7.4.8 Lasalocid
Bij verschillende niet-doeldieren veroorzaakt een toevallige inname van lasalocid verschillende
intoxicatieverschijnselen zoals neurologische symptomen (depressie, verlamming, spiertrillingen) en
hartproblemen. Deze toxiciteitsverschijnselen zijn eigen aan het werkingsmechanisme van ionofore
coccidiostatica en zijn vergelijkbaar met de symptomen die worden waargenomen bij doeldieren
wanneer ze een zeer hoge dosis van het coccidiostaticum krijgen toegediend (i.e. een grote
overschrijding van het maximum toegelaten gehalte). Van de niet-doeldieren zijn vooral honden,
kalveren, konijnen en paarden gevoelig voor vergiftiging met lasalocid. Deze soorten vertonen zelfs bij
eenmalige toevallige inname van een voeder met het hoogst toegelaten gehalte lasalocid (125 mg/kg
voeder) symptomen.
3.7.4.9 Monensin
Bij dieren zijn de tekenen van een intoxicatie met monensin te wijten aan de ionofore eigenschappen
van het molecule. Hartproblemen (o.a. verhoogde bloeddruk), afsterven van dwarsgestreepte
spiervezels en zenuwen werden reeds waargenomen bij niet-doeldieren. Andere tekenen van
intoxicatie zijn anorexia, diarree, depressie, spierverslapping en groeivertraging. Het meest gevoelig
zijn paarden, waarvoor een dosis van slechts 2 mg/kg monensin fataal is. Ook honden, kleine
herkauwers en eenden zijn zeer gevoelig voor polyether ionoforen.
3.7.4.10 Salinomycine
Ook bij salinomycine zijn de tekenen van een intoxicatie bij dieren te wijten aan zijn ionofore
eigenschappen. Hartproblemen (o.a. verhoogde bloeddruk), afsterven van dwarsgestreepte
spiervezels en verlamming werden reeds waargenomen bij niet-doeldieren en bij doeldieren die een
hoger dosis dan wettelijk toegelaten werden toegediend. Het meest gevoelig voor salinomycine zijn
kalkoenen, kalveren, paarden, katten en honden. Varkens blijken minder gevoelig te zijn.
3.7.4.11 Narasin
Bij verschillende doeldieren werden intoxicatieverschijnselen vastgesteld zoals anorexia, longoedeem,
necrose van de levercellen en schade aan spiervezels. Deze verschijnselen worden veroorzaakt door
de ionofore werking van narasin. De gevoeligste niet-doeldieren zijn honden, paarden en
waarschijnlijk ook kalkoenen en konijnen.
176

3.7.4.12 Maduramicine
Het effect van maduramicine op niet-doeldieren varieert zeer sterk van diersoort tot diersoort en ook
de concentraties waarbij negatieve effecten optreden kunnen zeer variëren. Zo werden bij konijnen en
schapen al intoxicatieverschijnselen vastgesteld bij een dosis van 5 mg/kg (bijvoorbeeld hartfalen en
laesis van spiercellen). Bij kalkoenen werden anorexieverschijnselen vastgesteld bij een dosis van 10
mg/kg en maduramicine bleek fataal voor varkens in een dosis van 37,5 mg/kg.
3.8 Mycotoxines
3.8.1 Aard en oorsprong
Mycotoxines zijn secundaire metabolieten geproduceerd door schimmels. In tegenstelling tot de
primaire metabolieten zijn de secundaire metabolieten niet noodzakelijk voor de groei van het
organisme. Ze hebben een zeer verscheiden biologische rol zoals een insecticide, antibiotische,
antifungale, antiprotozoaire,… functie. Hierdoor heeft het organisme een competitief voordeel
tegenover andere schimmels en bacteriën.
3.8.2 Risico’s van mycotoxines
De bezorgdheid voor chemische en toxische residu’s in de voedselketen is niet nieuw. Er is een grote
verscheidenheid aan mogelijk toxische stoffen die in voedingsmiddelen kunnen terechtkomen op
verschillende momenten tijdens de productie. Het is duidelijk dat een veilige voedselvoorziening
fundamenteel moet zijn voor elke moderne maatschappij. Het zou verkeerd zijn om te stellen dat
mycotoxines in onze voeding van geen belang zijn. Bekende en vaak voorkomende mycotoxines, in
het bijzonder die die een potentiële bedreiging voor de gezondheid vormen, worden constant
opgevolgd in voedingsproducten. Opname van mycotoxines in de mens kan gebeuren door
consumptie van besmette plantaardige voedingsmiddelen, maar kan ook gebeuren door consumptie
van dierlijke producten.
Omwille van deze redenen werd in de volgende hoofdstukken een samenvatting opgenomen van
onderzoek naar residu’s in landbouwdieren. Zijn de residu’s die teruggevonden worden schadelijk voor
de mens bij consumptie? In het algemeen lijkt de vraag naar het welzijn van de dieren van minder
belang. M.P. (1994) verwoordt het als volgt: Er wordt meestal weinig aandacht besteed aan ziekten die
door mycotoxines in dierenvoeders veroorzaakt worden. De symptomen zijn immers vaag en het is
moeilijk om een diagnose te stellen. Er is zelden verlies van dieren, maar er treden wel
productiestoornissen op en er kan een verminderde rendabiliteit vastgesteld worden. Men moet er
echter rekening mee houden dat (varkens)voeder voor een groot percentage uit granen kan bestaan
en het is niet denkbeeldig dat mycotoxines uit de granen, via het dier, terechtkomen in de
voedselketen van de mens.
3.8.3 Mycotoxicose
Het is niet eenvoudig een mycotoxine te beschouwen als mogelijke oorzaak van mycotoxicoses. Een
verband tussen mycotoxines en ziekten kon tot voor kort vaak niet gevonden worden om volgende
redenen:
177

• Mycotoxines komen vaak in kleine concentraties voor en kunnen moeilijk op te sporen zijn of
analyses zijn niet nauwkeurig genoeg of er zijn nog niet geïdentificeerde mycotoxines
aanwezig.
• Als een mycotoxicose verondersteld wordt, is de besmettingsbron vaak reeds verdwenen en
niet meer beschikbaar voor analyse.
• De klinische symptomen zijn vaag en chronisch. Slechts van enkele mycotoxines zijn de
symptomen gekend. Voor nieuwe mycotoxines is de impact op biologisch, geneeskundig en
diergeneeskundig vlak meestal niet gekend.
• Dierenartsen zijn vaak niet vertrouwd met de symptomen omdat mycotoxines sporadisch
voorkomen, geografisch verspreid en seizoensgebonden.
• Het is moeilijk het toxicologisch principe van dosisrespons toe te passen wegens de
chronische aard van mycotoxicoses.
• Vaak komen er verscheidene mycotoxines tegelijk voor waarvan het synergistisch effect nog
niet gekend is.
Volgende criteria voor de identificatie van een mycotoxicose werden voorgesteld:
• De ziekte moet veroorzaakt zijn door een voedingsmiddel.
• Er mogen geen ziekteverwekkende organismen geïsoleerd worden.
• De ziekte mag niet besmettelijk of overdraagbaar zijn.
• Nadat er geen besmet voedsel meer wordt opgenomen moeten duidelijke tekenen van
verbetering zichtbaar zijn.
• Het mycotoxine moet in het voedsel of dier geïdentificeerd zijn en in voldoende hoeveelheid
aanwezig zijn voor het induceren van toxiciteit.
• De geïsoleerde mycotoxines moeten gekend zijn voor het induceren van de vastgestelde
symptomen.
• Wanneer het voedsel verstrekt wordt aan gezonde dieren moet het dezelfde symptomen
induceren.
• Postmortemanalysen mogen enkel duiden op keelirritatie of weefselontsteking.
3.8.4 Condities voor de productie van mycotoxines
Er zijn vele factoren die invloed hebben op de mycotoxineproductie zoals de wateractiviteit,
temperatuur, tijd, zuurstof- en koolstofdioxideniveaus, samenstelling van het substraat, overvloedig
aanwezig zijn van schimmels, aanwezigheid van toxische stammen, hoeveelheid sporen, microbiële
interacties en aanwezigheid van insecten. Hoewel bederf, schimmelgroei en mycotoxinevorming
resulteren uit de complexe interactie tussen deze factoren, is het begrijpen van elke factor essentieel
om het algehele proces te vatten en kan dit de voorspelling en preventie van mycotoxine-ontwikkeling
vergemakkelijken.
178

3.8.4.1 Wateractiviteit
In gematigde klimaten kunnen schimmels die graan koloniseren in drie categorieën worden ingedeeld
volgens de hoeveelheden water die de schimmels nodig hebben: veldfungi, bewaarfungi en
schimmels die voorkomen bij gevorderd bederf. Lacey & Magan (1991) toonden aan dat mycotoxineproductie
gewoonlijk in een meer beperkt aw gebied plaatsheeft dan de schimmelgroei (zie Figuur
3.8.1).
3.8.4.2 Temperatuur
Figuur 3.8.1 : Relatie tussen schimmelgroei en toxineproductie
Temperatuur is ook een belangrijke factor die invloed heeft op de mycotoxinevorming. Zoals met water
hebben schimmels een minimale, optimale en maximale groeitemperatuur. De temperatuur heeft grote
invloed op de waterbehoeften omdat de minimale voorwaarden voor groei verschillend zijn bij
verschillende temperaturen en op verschillende substraten. De nodige aw is het laagst bij de optimale
groeitemperatuur en het hoogst bij de minimale en maximale groeitemperatuur. Norholt et al. (1979)
toonden dit patroon aan voor ochratoxineproductie bij P. cyclopium, P. viridicatum en A. ochraceus.
3.8.4.3 Substraat
Verschillen in schimmelgroei en toxineproductie hangen af van de fysische en chemische
eigenschappen van het substraat. Fysische parameters zijn de beschikbare hoeveelheid water,
mechanische weerstand ten gevolge van de pakking die de residuele hoeveelheid lucht en bijgevolg
de beschikbare hoeveelheid lucht bepaalt en thermische geleidbaarheid die de temperatuurmigratie in
de matrix beïnvloedt. Chemische eigenschappen zijn vet- en proteïnegehalte, spoorelementen,
aminozuren en vetzuren.
3.8.4.4 Zuurstof- en koolstofdioxideniveaus
De meeste schimmels die graanbederf veroorzaken hebben zuurstof nodig. Lagere O2-concentraties
(

3.8.4.5 Microbiële interacties
Aanwezigheid van andere micro-organismen, schimmels of bacteriën, kunnen schimmelgroei en
mycotoxineproductie wijzigen.
3.8.4.6 Mechanische schade en insecten
De relatie tussen bewaarschimmels en insecten is onvoorspelbaar. Sommige insecten verspreiden
schimmels, andere kunnen schimmelgroei verminderen. Zo kunnen mijten schimmelsporen
verspreiden op nog niet geïnfecteerd graan door ze op of in hun lichaam mee te dragen.
3.8.4.7 Tijd
Madhyasta et al. (1990) onderzochten de groei en toxinevorming van A. alutaceus en P. verrucosum
na 7,15 en 30 dagen incubatie. Ze observeerden weinig toxineproductie vóór dag 5. Na dag 7 werd er
wel een waarneembare groei en mycotoxineproductie vastgesteld. De auteurs concludeerden dat dit
logaritmisch gebeurd was. In alle substraten (tarwe, maïs, raapzaad, pinda’s) behalve sojabonen bleef
de toxineproductie stijgen tot dag 30 waarna geen metingen meer gedaan werden.
Aangezien mycotoxines zeer ongelijkmatig over een partij verspreid zijn, heeft de Europese wetgever
in verordening 401/2006 de bemonsteringswijzen voor mycotoxines in voedingsmiddelen vastgelegd.
3.8.5 Ochratoxine A
3.8.5.1 Structuur van ochratoxine A
Figuur 3.8.2 : chemische structuur van ochratoxine A
Ochratoxines zijn een groep van verscheidene chemisch gerelateerde moleculen die geïsoleerd zijn
uit een aantal Aspergillus- en Penicilliumsoorten. Hiertoe behoren o.a. ochratoxine A, B, C, methyl- en
ethylesters van deze verbindingen en ook ochratoxine α en β. Van deze verbindingen komt
ochratoxine A het meest voor en is ook het meest toxisch.
180

Ochratoxine A (MW = 403,8) is een kleurloze kristallijne component, oplosbaar in polaire organische
solventen en in verdunde waterige bicarbonaatoplossingen, licht oplosbaar in water en heeft een
smeltpunt van 90° C wanneer gekristalliseerd uit benzeen als solvent en van 169°C voor kristallen
verkregen uit xyleen.
Een belangrijke chemische reactie van OA is de esterificatie van de carboxylgroep. Het methylester
gevormd met BF3-methanol wordt in de vloeistofchromatografie gebruikt voor de bevestiging van de
identiteit van OA.
3.8.5.2 Risico's van ochratoxine A
Het voorkomen van OA in dierlijke weefsels na opname van OA hangt af van een aantal factoren zoals
de duur van het voederen, de dosis, de weg waarlangs OA opgenomen is, de mate van binding van
het serum, de halfwaardetijd en de duur van een OA-vrij dieet voor het slachten.
Een vergelijking van OA-waarden gevonden in de literatuur is vaak problematisch, want de
analysemethode is niet altijd gespecificeerd en de kwaliteit van de gebruikte methodes niet gekend.
Daarom is het gewenst dat studies uitgevoerd worden onder analytische kwaliteitsregimes met
gevalideerde methodes.
3.8.5.3 Effect op de mens
Biomerkers voor blootstelling
OA heeft een halfwaardetijd van ongeveer 35 dagen in mensen. Bloedconcentraties
vertegenwoordigen een geschikte biomerker voor recente blootstelling. Deze benadering voor de
dagelijkse inname van OA kan vergeleken worden met die berekend via de concentraties OA in het
voedsel.
181

3.8.5.4 Analysetechniek
3.8.5.4.1 Extractie
Figuur 3.8.3 Wegen van blootstelling aan mycotoxines
De extractie wordt meestal uitgevoerd met een mengsel van water en organische oplosmiddelen,
afhankelijk van het type matrix. Een IUPAC/AOAC methode voor de bepaling van OTA in gerst maakt
gebruik van een mengsel van CHCl3 en H3PO4; voor groene koffie wordt enkel CHCl3 gebruikt. Voor
de bepaling in tarwe, worden een aantal van extractiemiddelen gebruikt, met inbegrip van mengsels
van tolueen/HCl/MgCl2, CHCl3/ethanol/azijnzuur en dichloormethaan/H3PO4. Er is een verschuiving
naar niet-gechloreerde oplosmiddelen, vanwege de gevaren voor het milieu.
Burdaspal heeft methylbromide tert-butylether als extractievloeistof voorgesteld voor OTA in
babyvoeding. Andere niet-gechloreerde mengsels die worden gebruikt voor tarwe zijn methanol/water
en acetonitril/water. Twee methoden voor de bepaling van OTA in gerst en gebrande koffie zijn
onlangs gevalideerd: de extractie uit gerst werd uitgevoerd met acetonitrile/water, en het extract werd
verdund met PBS voor opzuivering met IAC. Bij een proficiency test voor OTA in gebrande
koffiemonsters werd voornamelijk een mengsel van methanol met een 3 % waterige
natriumbicarbonaatoplossing (50:50) voor de extractie gebruikt. Zimmerli en Dick hebben een
methode voor de bepaling van OTA in rode wijn met chloroformextractie gerapporteerd.
182

3.8.5.4.2 Opzuivering
IAC-kolommen zijn de state of the art voor de opzuivering van OTA. Het extract loopt door de kolom
en de ochratoxines binden met de antilichamen. Het analyt wordt geëlueerd met een geschikt
oplosmiddel (bij voorbeeld acetonitril). De immunologische reactie is specifiek voor OTA. Het analyt
wordt na een spoelstap uit de kolom geëlueerd.
3.8.5.4.3 Scheiding en detectie
Na de opzuivering over IAC-kolommen gebeurt de detectie meestal met HPLC-FLD. Determinatie is
mogelijk in het µg/kg-gebied. Gewoonlijk wordt RP-HPLC met een C-18 kolom gebruikt en een
aangezuurde bufferoplossing (azijnzuur). Recoveries van 70-100% werden gerapporteerd.
In verordening 401/2006 zijn de prestatiecriteria voor de analyse van ochratoxine A vastgelegd.
3.8.6 Deoxynivalenol (DON)
3.8.6.1 Inleiding
3.8.6.1.1 Voorkomen en belang van deoxynivalenol (DON) in dierenvoeders
Fusarium-toxines worden het meest teruggevonden in tarwe, maïs en gerst. Haver, rogge en triticale
kunnen ook Fusarium-toxines bevatten, maar over het algemeen zijn ze resistenter of ontsnappen ze
aan significante contaminatie.
3.8.6.1.2 Productie van DON door schimmels
Deoxynivalenol is een mycotoxine dat behoort tot de familie van de trichothecenen, die op grote
schaal voorkomen in graangewasssen. In Canada en de VS is het meest voorkomende trichotheceen
DON en in mindere hoeveelheden nivalenol, T-2 toxine, HT-2 toxine en, zeer weinig voorkomend,
diacetoxyscirpenol (DAS). Economisch gezien zijn in Canada en het Noorden van de VS zearalenon
(ZEA) en trichothecenen de belangrijkste mycotoxines. In andere landen hebben aflatoxine en
ochratoxine een grotere economische impact dan de Fusarium-toxines 3 .
3 Jammer dat de auteur van dit overzicht geen balans voor Europa opmaakt.
183

3.8.6.2 Structuur van DON
CH3
O
O
O
CH2 O H
CH3
O H
Figuur 3.8.5 : Deoxynivalenol
4-Deoxynivalenol (DON; vomitoxin, dehydronivalenol, RD-toxine) is de benaming voor 12,13-epoxy-
3,4,15-trihydroxytrichotec-9-en-8-one (MW: 296,32) (zie Figuur 3.8.5). DON is een witte kristallijne
stof met een smeltpunt van 151-153 °C. Het is een optisch actieve stof en oplosbaar in ethanol,
methanol, ethylacetaat, water en chloroform. Het is een stabiele component, zowel tijdens het
bewaren en malen als het verwerken en koken van het voedsel en het degradeert niet bij hoge
temperaturen.
3.8.6.3 Analysemethoden
3.8.6.3.1 Extractie
Extractie van DON gebeurt door schudden in een waterige acetonitrile oplossing, water of water met
polyethyleenglycol. Het is belangrijk dat een voldoend lange extractietijd voorzien wordt (2h) zoals
voorgesteld in de methoden van het productschap diervoeder.
3.8.6.3.2 Opzuivering
De opzuivering gebeurt meestal met IAC-kolommen.
3.8.6.3.3 Scheiding en detectie
De analyse kan zowel met RP-HPLC-UV als met GC na derivatisatie worden uitgevoerd. Bij HPLC-UV
wordt in het laag UV-gebied gewerkt (218 nm).
In verordening 401/2006 zijn de prestatiecriteria voor de analyse van DON vastgelegd:
OH
184

3.8.7 Fumonisines
3.8.7.1 Structuur van fumonisines
Fumonisines komen het meest voor in natuurlijk verontreinigde maïs en producten op basis van maïs.
Ze komen minder vaak voor in andere levensmiddelen zoals sorghum, rijst, bier en bonen. De meest
voorkomende fumonisines zijn fumonisine B1 en B2. Vandaar dat analysemethoden voornamelijk voor
deze twee toxines zijn ontwikkeld. In het algemeen bleken methoden ontwikkeld voor fumonisine B1
en B2 geldig te zijn voor fumonisine B3. Er zijn geen specifieke analysemethoden ontwikkeld voor
fumonisine B4 en er is weinig bekend over haar natuurlijk voorkomen.
Fumonisines zijn een groep van structureel verwante stoffen. Fumonisine B1 is de diester van
propaan-1,2,3-tricarboxylzuur en 2S-amino-12S,16R-dimethyl-3S,5R,10R,14S,15R-pentahydroxyeicosane
waarin de C-14 en de C-15 hydroxygroepen zijn veresterd. Fumonisine B2 is het C-10
deoxyanaloog van fumonisine B1. De volledige stereochemie van fumonisine B3 en B4 is onbekend,
maar het amino-uiteinde van fumonisine B3 heeft dezelfde configuratie als dat van fumonisine B1.
185

3.8.7.2 Schimmels die fumonisine produceren
Fumonisines worden geproduceerd door schimmels van het geslacht Fusarium. De enige soorten die
significante hoeveelheden fumonisines produceren zijn Fusarium verticillioides (Sacc.) Nirenberg (F.
moniliforme (Sheldon) =) en de daarmee verband houdende F. proliferatum (Matsushima) Nirenberg
die op het einde van de groeiperiode overheersen. Ten minste tien andere Fusarium-soorten
produceren ook deze toxines.
F. verticillioides en F. proliferatum behoren tot de meest gewone schimmels geassocieerd met maïs en
worden teruggevonden in zowel beschadigde als onbeschadigde korrels. Deze soorten veroorzaken
Fusarium-rot in maïs, een belangrijke ziekte in warme gebieden. Er bestaat ook een sterke relatie
tussen insectenschade en Fusarium-rot met andere soorten Fusarium, zoals F. graminearum.
Temperatuurstress kan ook een rol spelen, met name in cultivars geteeld buiten hun oorspronkelijk
gebied. F. verticillioides en F. proliferatum groeien over een brede temperatuurrange, maar alleen bij
relatief hoge wateractiviteit (meer dan 0,9), worden in maïs vóór de oogst of de vroege fase van het
drogen fumonisines gevormd. Behalve onder extreme omstandigheden nemen de concentraties van
fumonisines niet toe tijdens de graanopslag.
3.8.7.3 De mens
Bij de mens werden verschillende uitbraken vastgesteld met slokdarmkanker, leverkanker, neurale
problemen en 1 bevestigd geval van acute mycotoxicose in India.
3.8.7.4 Analysetechniek
3.8.7.4.1 Screening
TLC en immunochemische methoden zoals ELISA zijn de meest voorkomende screeningsmethoden.
Er zijn verschillende ELISA-kits die commercieel verkrijgbaar zijn.
3.8.7.4.2 Kwantitatieve methoden
Methoden die geschikt zijn voor de kwantificering omvatten meestal extractie en opzuivering
voorafgaand aan de bepaling van de analyt.
3.8.7.4.3 Extractie en opzuivering
Terwijl opzuiveren meestal niet nodig is voor immunoassays is dit wel nodig voor chromatografische
methoden. De gebruikte mengsels voor extractie zijn onder andere methanol/water (3:1) en
acetonitiril/water (1:1).
Voor de opzuivering worden meestal immunoaffiniteitskolommen gebruikt.
186

3.8.7.4.4 Scheiding en detectie
Reversed Phase (RP-) HPLC-scheiding en fluorescentiedetectie is de meest gebruikte techniek voor
het opsporen van fumonisines, vanwege hun polaire karakter. Meestal wordt een
prekolomderivatisiatie toegepast met o-phthaldialdehyde / mercaptoethanol (OPA), ondanks haar
beperkte stabiliteit waarna fluorescentiedetectie volgt. Er werden ook GC-methoden ontwikkeld.
In verordening 401/2006 zijn de prestatiecriteria voor de analyse van fumonsines vastgelegd.
3.8.8 Trichothecenen (T-2 en HT-2 toxine)
3.8.8.1 Structuur
Trichothecenen worden voornamelijk op het veld geproduceerd (Fusarium-schimmels) in
graanproducten. De belangrijkste zijn T-2 toxine, HT-2 toxine (type A) en DON (type B).
T-2- en HT-2 toxines zijn type A trichothecenen, die nauw verwant zijn aan de
epoxysesquiterpenoiden. Uit onderzoek is gebleken dat T-2- en HT-2 toxines aanwezig zijn in
producten als tarwe, maïs, haver, gerst, rijst, bonen en sojabonen. T-2- en HT-2 toxinen worden
geproduceerd door Fusarium sporotrichioides, F. poae, F. equiseti en F. acuminatum. De belangrijkste
producent is F. sporotrichioides, een saprophytische schimmel die groeit bij -2 tot 35°C en slechts bij
hoge wateractiviteit (boven 0,88). Bijgevolg, T-2- en HT-2 toxines worden normaal niet in korrels bij de
oogst teruggevonden maar zijn het gevolg van waterschade wanneer het graan lang op het veld blijft
gedurende of na de oogst, in het bijzonder bij koud weer of in graan dat nat wordt tijdens de bewaring.
187

T-2-toxine is de triviale naam voor 4β,15-diacetoxy-3α,dihydroxy-8α-[3-methylbutyryl-oxy]-12,13epoxytrichothec-9-ene
en wordt in afbeelding 1 weergegeven. De molecuulformule is C24H34O9 en de
relatieve moleculaire massa bedraagt 466.5 g/mol.
15-Acetoxy-3α,4β-dihydroxy-8α-[3-methylbutyryloxy]-12,13-epoxytrichothec-9-ene is de systematische
naam van de toxine HT-2. De molecuulformule is C22H32O8 is en de relatieve molecuulmassa is 424.5
g/mol. De structuren van T-2- en HT-2-toxine verschillen alleen in de functionele groep op de C-4positie.
Omdat T-2-toxine gemakkelijk tot HT-2-toxine wordt gemetaboliseerd, worden deze twee
mycotoxines samen geëvalueerd.
T-2-toxine vormt witte naalden, met een smeltpunt bij 151–152 °C, en haar specifieke draaiing is
bepaald als [alfa] 26 D = (c = 2,58, ethanol).
3.8.8.2 De mens
Accidentele voorvallen met T-2 toxine die in aanraking met de huid kwam, veroorzaakte ernstige
irritatie en gevoelloosheid.
3.8.8.3 Analysemethodes
3.8.8.3.1 Screening
Voor screening zijn enkel immunoassays beschikbaar voor analyse van T-2 en HT-2 toxine in granen.
De extractie wordt gewoonlijk uitgevoerd in acetonitrile/water, methanol of chloroform/ethanol. Er kan
gedetecteerd worden vanaf 200 µg/kg.
3.8.8.3.2 Kwantitatieve methoden
Er zijn verscheidene methodes uitgewerkt voor analyse van T-2 en HT-2 toxine. HPLC met UVdetectie
is niet toepasbaar aangezien de ketogroep op de C-8 positie ontbreekt. Evenwel blijkt uit de
praktijk dat het wel mogelijk is om HPLC-UV toe te passen.
Voor de extractie in granen, voeding en voeders wordt gewoonlijk gebruik gemaakt van
acetonitrile/water of methanol/water. De extractie wordt dan uitgevoerd met een ultra-turrax of
horizontale schudmachine. Voor de opzuivering zijn sinds kort IAC-kolommen beschikbaar.
De analyse kan zowel met HPLC-FLD als met GC uitgevoerd worden. Voor HPLC-FLD kan gebruik
gemaakt worden van 1-anthroylnitril en 4-dimethylaminopyridine. Voor GC-analyse wordt meestal
trimethylsilylatie of fluoroacylatie gebruikt om de vluchtigheid en gevoeligheid te verhogen.
In verordening 401/2006 zijn de prestatiecriteria voor de analyse van T-2 toxine en HT-2 toxine
vastgelegd.
188

3.8.9 Zearalenon
3.8.9.1 Inleiding
Zearalenon wordt tijdens de bewaring van maïs geproduceerd door Fusarium-schimmels en heeft een
oestrogene werking. Het is een niet-steroidaal mycotoxine geproduceerd door verscheidene Fusarium
spp. Het is bekend dat het betrokken is bij verscheidene mycotoxicoses bij landbouwdieren, in het
bijzonder bij varkens.
Zearalenon is warmtestabiel en wordt wereldwijd aangetroffen in een aantal graangewassen zoals
maïs, gerst, haver, tarwe, rijst en sorgho en ook in brood.
3.8.9.2 Inname bij de mens
De belangrijkste bronnen waren maïs (31 %) en tarwe (52 %) in het Midden-Oosten; rijst (62 %) in het
Verre Oosten, maïs (55 procent) en rijst (31 %) in Afrika; maïs (27 %), rijst (30 %) en tarwe (30 %) in
Latijns-Amerika en tarwe (67 %) in de Europa.
De concentratie van zearalenon in fruit, groenten en noten is niet significant.
De gemiddelde dagelijkse inname van zearalenon wordt geschat op 1,5 µg/dag in Europa en 3,5
µg/kg in het Midden-Oosten.
Op basis van de resultaten van de verschillende studies werd een PMTDI van 0,5 µg/kg bw per dag
vastgelegd.
189

3.8.9.3 Analysemethoden
3.8.9.3.1 Extractie
Solventen die gebruikt worden voor extractie zijn gewoonlijk mengsels van organische vloeistoffen
waaronder ethylacetaat, methanol, acetontrile en chloroform.
3.8.9.3.2 Opzuivering
Meestal worden IAC-kolommen gebruikt.
3.8.9.3.3 Scheiding en detectie
Meestal wordt RP-HPLC-FLD gebruikt.
In verordening 401/2006 zijn de prestatiecriteria voor de analyse van zearalenon vastgelegd.
3.8.10 Aflatoxine
3.8.10.1 Structuur
1. Aflatoxine B1
190

2. Aflatoxine B2
3. Aflatoxine G1
4. Aflatoxine G2
3.8.10.2 Analysemethoden
3.8.10.2.1 Extractie
Bij extractie van aflatoxines wordt in het algemeen gebruik gemaakt van klassieke solventen zoals
aceton, chloroform en methanol en hun mengsels. Uit de praktijk is gebleken dat kleine hoeveelheden
water het extractierendement beduidend verhogen.
3.8.10.2.2 Opzuivering
Voor de opzuivering wordt gebruik gemaakt van solid-phase extraction (SPE) met C18 cartridges en
florisil-kolommen, of immunoaffiniteitskolommen (IAC).
3.8.10.2.3 Scheiding en detectie
De meest gebruikte methoden voor vloeistofchromatografie zijn RP- HPLC met
postkolomderivatisatie. Derivatisatie kan gebeuren met Br2 of I2 (voor aflatoxine B1 en G1). De
excitatiegolflengte bedraagt 435 nm, de emissiegolflengte 365 nm. De kolom voor scheiding bestaat in
het algemeen uit C-18 materiaal. Er zijn steeds meer technieken beschikbaar voor LC/MS methoden.
191

In verordening 401/2006 zijn de prestatiecriteria voor de analyse van aflatoxines vastgelegd.
3.8.10.3 Eigenschappen
Van alle aflatoxines (B 1 , B 2 , G 1 en G 2 ) komt aflatoxine B 1 het meest voor en is het het meest toxisch,
zowel voor mensen als dieren, en is een krachtig carcinogeen. Het werd door het IARC geklasseerd in
groep 1 en is duidelijk genotoxisch. Het metaboliet van aflatoxine B1 verschijnt in de melk als
aflatoxine M1.
In geografische regio's met een hoge prevalentie is er een grotere kans op ontwikkeling van
leverkanker bij dragers van het hepatitis B serum antigen.
Aflatoxines worden voornamelijk door Aspergillus-schimmels geproduceerd: A. parasiticus en A.
flavus. A. parasiticus is aangepast aan een bodemmilieu. A. flavus is meer aangepast is aan planten
(bladeren, bloemen). Aflatoxines worden zowel voor als na de oogst geproduceerd onder bepaalde
temperatuursomstandigheden, wateractiviteit en beschikbaarheid van nutriënten.
Vroeger werd gedacht dat primaire verontreiniging van landbouwgewassen in Europa weinig
waarschijnlijk was, maar recent heeft men aflatoxines teruggevonden in maïs geteeld in Italië.
Er bleek dat kokos-, grondnoten-, zonnebloemschroot en maïsgluten de belangrijkste bron van
aflatoxines in diervoeder zijn. Aflatoxines zijn dus voornamelijk aanwezig in geïmporteerde
voedermiddelen.
192

3.8.10.4 Aflatoxine M1
3.8.10.4.1 Structuur
Aflatoxine M1 wordt bij runderen in vivo gemetaboliseerd uit aflatoxine B1 dat opgenomen wordt uit de
voeding. Het wordt uitgescheiden via de melk. Bij melkvee wordt 0,5 à 4% van het opgenomen
aflatoxine B1 teruggevonden onder de vorm van aflatoxine M1.
Gezien de aanwezigheid in melk stelt dit een groot risico voor kinderen en zuigelingen die grote
hoeveelheden melk consumeren.
Aflatoxine M1 is bijzonder resistent aan behandelingen van de melk zoals warmte, koude en
lyofilisatie. Gezien de affiniteit van aflatoxine M1 voor caseïne wordt aflatoxine M1 bijna in zijn totaliteit
teruggevonden in kazen, magere melk, yoghurt, plattekaas, maar zeer weinig in boter.
Moleculaire structuur
3.8.10.4.2 Toxiciteit
Aflatoxines behoren tot de sterkste carcinogene stoffen. Aflatoxine M1 heeft dezelfde toxicologische
eigenschappen als aflatoxine B1 maar met een minder sterke carcinogene activiteit. Een hevige
intoxicatie is vaak dodelijk met symptomen van depressie, anorexia, diarree, anemie, geelzucht. In de
lever evolueren cellen tot carcinomen.
3.8.10.4.3 Analysetechniek
• ELISA-screening
• Confirmatie door middel van opzuivering op immunoaffiniteitskolommen en HPLC-FLD
bepaling
193

3.8.11 Moederkoren
3.8.11.1 Inleiding
Moederkoren is een verzamelnaam voor alkaloïden (o.a. ergotamine en ergostine) die vooral in rogge
worden geproduceerd (Claviceps purpurea). Deze stoffen veroorzaken braken en diarree en hebben
een hallucinerend effect.
Zie ook analysetechnieken: ‘Microscopie’. Recent zijn er ook HPLC-technieken beschikbaar.
De term moederkoren verwijst naar de donkere sclerotiën gevormd door de verschillende soorten van
het geslacht Claviceps. Claviceps purpurea is de meest voorkomende soort en wordt voornamelijk op
rogge, triticale en tarwe, maar ook op andere granen en grassen gevonden. De hoeveelheid
alkaloïden die gevormd worden is zeer variabel. De huidige wetgeving is gebaseerd op het gewicht
van de sclerotiën. Hierbij dient opgemerkt te worden dat de toxiciteit wordt bepaald door het gehalte
aan en samenstelling van de alkaloïden.
De term moederkorenalkaloïden verwijst naar een veelzijdige groep van maximaal 40 toxines,
bestaande uit clavines, lyserginezuren en ergopeptines. Deze toxinen worden geproduceerd door
schimmels van de familie Clavicipitaceae waartoe onder andere Claviceps purpurea, C. paspaspali en
C. fusiformis behoren die overwegend op rogge, tarwe en gerst, maar ook op rijst, maïs, sorghum en
haver voorkomen.
Claviceps purpurea infecteert planten tijdens de bloei en al zijn in principe alle soorten van de
Poaceae potentiële gastheren voor Claviceps purpurea, infecties komen het meest voor meest in
rogge en triticale die open bloemen hebben. Bovendien kunnen verschillende grassen worden besmet
die een natuurlijk reservoir voor de schimmel vormen. Sclerotiën zijn resistent en blijven intact tijdens
de winter en tijdens de opslag van granen. Zij ontwikkelen onder gunstige omstandigheden in
perithetia die ascosporen kunnen produceren die op hun beurt bloeiende planten kunnen infecteren.
Na de infectie wordt een geel-wit mycelium geproduceerd dat honingdauw produceert en infectieuze
conidia bevat. Honingdauw trekt insecten aan die de conidia verspreiden, wat resulteert in secundaire
infecties. Het mycelium groeit verder uit, wordt donker en is uiteindelijk zichtbaar als het harde
sclerotium. Sclerotiën variëren in grootte van enkele millimeters tot meer dan 4 cm, afhankelijk van de
waardplant en variëren in gewicht van enkele grammen tot 25g per 100 sclerotiën.
Moederkorensclerotiën variëren ook in kleur van wit (C. tripsaci) tot bruin (C. glabra) tot geel (C.
hirtella) en paarsbruin (C. purpurea). Bovendien varieert aanzienlijk de totale alkaloid-inhoud in de
sclerotiën tussen 0,01 % en 0.21 %. Deze verschillen zijn afhankelijk van de stam, de geografische
regio en de waardplant. In Duitsland werd de laatste 10 jaar een toename van Claviceps purpurea
infecties vastgesteld. Bijgevolg is 40-50% van alle onderzochte roggemonsters geïnfecteerd.
Hiertussen kunnen ook sclerotiën van gras zitten dat tussen de oogst terechtkomt.
Intoxicaties veroorzaakt door Claviceps purpurea zijn reeds eeuwen bekend. Deze intoxicaties zijn uit
de Middeleeuwse literatuur bekend als Sint-Anthonisvuur of Heilig Vuur met symptomen als gangreen,
intense pijnen en neurotoxische symptomen. De laatste grote uitbraak van gangreenergotisme was in
Ethiopië in 1977-1978 bij 140 personen die tekenen van intoxicatie vertoonden met hoge mortaliteit
(34%).
Gebaseerd op deze biologische effecten werden moederkorenalkaloïden sinds het begin van de 19 de
eeuw gebruikt voor medische doeleinden.
194

Zo ageert ergotamine als een antagonist op α-adrenoceptors en veroorzaakt een stijging van de
bloeddruk, bromocriptine als een antagonist op dopaminereceptoren. Ergometrine wordt toegepast bij
bevallingen. Evenwel is het werkingsmechanisme niet gekend.
3.8.12 Patuline
3.8.12.1 Structuur
Patuline is een metaboliet geproduceerd door Penicillium-, Aspergillus- en Byssochlamys- schimmels.
Penicillium expansum is de meest voorkomende soort in deze groep.
Enkel Penicillium kan Pomacae (appels, peren en kweeperen) besmetten. De schimmel is een
parasiet op beschadigd fruit: geblutst fruit met beschadigde epidermis en insectensteken en wordt
vaak aangetroffen op vruchten met tekenen van uitwendige verrotting.
Deze schimmel die bestand is tegen temperatuur, vochtigheid en ongevoelig is voor licht , is overal
aanwezig in boomgaarden, fruitteeltstations en verwerkingsplaatsen.
Moleculaire structuur
Appel aangetast door Penicillium expansum
De aanwezigheid van patuline kan niet afgeleid worden uit de geur of smaak. Enkel analyse kan het
bewijs leveren. De gecontamineerde fruitsappen hebben geen bijzondere smaak en ook geen
gewijzigd uitzicht.
Het is reeds toxisch in lage dosis bij warmbloedige dieren en mensen. Sterke alcoholen bevatten geen
patuline meer. De transformatie van producten met een laag alcoholgehalte (vorming zuren) vernietigt
patuline maar het wordt niet vernietigd door pasteurisatie. Patuline is evenwel aanwezig in niet of
lichtgefermenteerde ciders.
Deze molecule met laag moleculair gewicht is moeilijk degradeerbaar en thermostabiel in waterig
milieu. Patuline kan zoals andere mycotoxines jaren aanwezig blijven in producten, zelfs na
verwijdering van de schimmels met een fungicide of mechanische behandeling.
3.8.12.2 Toxiciteit
Van een bepaalde dosis (laag) verschijnen de symptomen zich door congestieve lesies in de longen,
de nieren en de milt maar bijkomend veroorzaakt patuline een degeneratie van neuronen in de
celebrale cortex hetgeen resulteert in diverse zenuwsymptomen (waaronder verlamming).
195

3.8.12.3 Analysetechniek
• extractie met ethylacetaat
• SPE-opzuivering
• injectie en kwantificering met HPLC-UV
• bevestiging mogelijk met GC-MS
3.9 Allergenen
3.9.1 Voedselallergenen
3.9.1.1 Inleiding
Een allergie is een verhoogde reactie van ons lichaam op stoffen vreemd aan ons organisme,
antigenen genaamd. Op zich vormen deze stoffen geen gevaar, in tegenstelling tot sommige microben
of virussen. Maar om onduidelijke redenen beschouwt het afweersysteem (immuunsysteem) van
mensen die allergisch zijn aan een bepaalde stof deze ten onrechte als een vijandige stof. In dit geval
worden de antigenen allergenen genaamd. Een allergie kan optreden bij om het even welk allergeen
dat ons lichaam kan binnendringen.
Samengevat zijn er twee grote soorten allergieën: de voedselallergieën en de ademhalingsallergieën.
In beide gevallen is het mechanisme waarbij de allergie optreedt hetzelfde. Het eerste contact met het
allergeen veroorzaakt geen enkele reactie van het lichaam; dit is wat men noemt de
sensibiliseringsfase. De allergische reactie treedt slechts op bij het tweede contact van de allergische
persoon met het allergeen.
De ademhalingsallergieën treden op na een contact van het immuunsysteem van het
ademhalingsstelsel met een allergeen, zoals mijten, pollen, schimmels, dierenharen, enz. Een
ademhalingsallergie veroorzaakt hoofdzakelijk ademhalingsmoeilijkheden: rinitis, sinusitis, laryngitis,
astma, enz.
De voedselallergieën treden op na het innemen van allergenen die in contact komen met het
immuunsysteem van het verteringsstelsel. De symptomen van voedselallergieën zijn meer gevarieerd:
huiduitslag, oedeem (zwelling), netelroos, astma, anafylactische shock (ergste gevolg van de
allergische reactie), spijsverteringsstoornissen, rinitis. Voedselallergieën kunnen voorkomen bij
ongeveer 2 à 3 % van de Belgische bevolking, met een iets hoger percentage bij kinderen,
waarschijnlijk 8 %.
Momenteel telt men meer dan 160 voedselallergenen. De meest bekende allergene stoffen zijn te
vinden in aardnoten, eieren, vis en schaaldieren, granen die gluten bevatten (tarwe, gerst, haver en
rogge), soja, melk en zuivelproducten, dopvruchten en notenproducten, sesamzaadjes,
voedingsmiddelen die sulfiet (bewaarmiddel gebruikt in bepaalde voedingswaren) bevatten. De ergste
allergische reacties vindt men bij de consumptie van aardnoten (anafylactische shock die dodelijk kan
zijn indien niet tijdig behandeld).
196

Voedselallergieën hebben dus in eerste instantie te maken met gewone en normale bestanddelen van
ons voedsel waarvoor iemand allergisch is (bron: www.favv.be). Een voedselallergie is steeds een
reactie tegen een proteïne dat bijvoorbeeld aanwezig kan zijn in aardnoten, koeienmelk, vis,… Het is
bijgevolg onmogelijk allergisch te zijn aan een suiker of een vetstof. Daarentegen kan bijvoorbeeld wel
een intolerantie optreden tegen lactose, een suiker dat natuurlijk aanwezig is in melk. Een zeer kleine
hoeveelheid voedsel kan voldoende zijn om de symptomen van een allergie te doen optreden.
De enige oplossing voor de behandeling van een allergie is voedingswaren die het allergeen bevatten
volledig weren uit het dieet.
Allergische symptomen kunnen licht zijn, bijvoorbeeld kriebelende irritatie van de lippen, maar ze
kunnen ook zeer zwaar zijn, zoals ademhalingsproblemen, bewustzijnsverlies of zelfs aritmie in geval
van anafylactische shock.
3.9.1.2 Mechanisme van de allergische reactie
Bij een allergie reageert het immuunsysteem slechts tegen één of enkele specifieke substanties en
niet tegen alle ingrediënten van het voedingsmiddel. Het organisme beschouwt deze substanties als
gevaarlijk en stelt een mechanisme in werking om ze te elimineren. Via antilichamen (immunoglobulines,
Ig) beveelt het immuunsysteem het vrijmaken van pro-inflammatoire substanties, zoals
histamine. Deze veroorzaken effecten in het lichaam zoals rood worden, jeuk, rinitis, eczeem en
astma.
De symptomen van allergie treden pas op bij het tweede contact met het levensmiddel. Tijdens het
eerste contact met het allergene levensmiddel, maakt het immuunsysteem zich ermee « vertrouwd ».
Bij het volgende contact zal het immuunsysteem klaar zijn om te reageren. Een allergie ontwikkelt zich
dus in twee stappen.
3.9.1.3 Kruisallergieën
Dit zijn allergieën aan substanties die chemische gelijkenissen vertonen. Er is bijvoorbeeld een
verhoogd risico dat Iemand die allergische is aan koeienmelk eveneens allergisch is aan geitenmelk.
Dit omwille van de gelijkenis tussen de caseïnes.
Huidtesten maken het mogelijk kruisallergieën te ontdekken.
3.9.1.4 Symptomen
De tekenen van een allergie verschijnen gewoonlijk binnen enkele minuten volgend op de absorptie
van het levensmiddel (en tot na 2 uur).
De aard en de intensiteit verschillen van persoon tot persoon. Ze kunnen één of meer van de
volgende symptomen bevatten:
• Huidsymptomen: jeuk, huiduitslag, rood worden, zwelling van de lippen, het gezicht en
ledematen (netelroos, eczeem, angio-oedeem).
197

Figuur 3.9.1 Netelroos Figuur 3.9.2 Angio-oedeem
• ademhalingssymptomen: een ratelende ademhaling, gevoel van zwelling van de keel,
moeilijkheden om te ademen, een gevoel van verstikking (astma); een jeukende en lopende
neus, druk op de sinussen, rode en verkouden ogen.
• verteringssymptomen: abdominale krampen, diarree, kolieken, misselijkheid en braken.
• cardiovasculaire symptomen: bleek worden, zwakke polsslag, duizeligheid en
bewustzijnsverlies.
3.9.1.5 De reactie en anafylactische shock
De anafylactische reactie is een bruuske reactie die heel het organisme beïnvloedt. Indien niet snel
behandeld, leidt ze een anafylactische shock in. Deze vertaalt zich in afsluiten van arteriële druk,
verlies van het bewustzijn, en tenslotte overlijden binnen enkele minuten. Het is van vitaal belang
epinefrine (adrenaline) toe te dienen vanaf dat de eerste ernstige symptomen en
ademhalingsproblemen zichtbaar zijn.
Allergieën aan pinda’s, noten, vis en zeevruchten zijn het vaakst betrokken bij anafylactische
reacties ten gevolge van voedselallergenen.
• Opdat er sprake zou zijn van een anafylactische reactie, moeten de symptomen zeer
uitgesproken zijn. Gewoonlijk wordt meer dan één systeem geraakt (huid, ademhaling,
spijsvertering, cardiovasculair).
• Opdat er sprake zou zijn van een anafylactische shock, moet er een sterke daling van de
bloeddruk zijn. Dit kan bewustzijnsverlies veroorzaken, aritmie en zelfs de dood.
3.9.1.6 Risicopersonen
Voor een kind van wie één van de ouders lijdt aan een vorm van allergie, verhoogt het risico op een
voedselallergie met 20 tot 40 %. Dit stijgt naar 60 % tot 80 % indien beide ouders allergisch zijn.
198

3.9.1.7 Personen met een risico op een anafylactische reactie
• Personen die al een anafylactische reactie gehad hebben.
• Personen die bovenop één of meerdere voedselallergieën, eveneens een astmatische
aandoening hebben.
3.9.1.8 Gebruikte analyse technieken
• Massa spectrometrie
• PCR (polymerase chain reaction)
• Elisa (sandwich en /of competitieve)
Voordelen Nadelen
Massaspectrometrie Weinig vals positieven;
specificiteit
Gevoeligheid; duur
PCR Specificiteit; gevoeligheid DNA en niet het allergeen
3.9.2 Histamine
ELISA Snel, makkelijk,
gevoeligheid
Vals positieven en vals
negatieven mogelijk
Vergiftiging door histamine maakt deel uit van de voedselinfecties die het meest voorkomen bij
visserijproducten.
3.9.2.1 Vorming van histamine
Na de dood van de vis produceren bepaalde bacteriën een enzym dat verantwoordelijk is voor de
omzetting van een aminozuur (histidine is in grote hoeveelheden aanwezig) naar een biogeen amine:
histamine.
Figuur 3.9.3 : de vorming van histamine
199

Histidine kan voorkomen in vrije vorm, maar eveneens in gebonden vorm, aan pigmenten zoals
hemoglobine en myoglobine.
De bacteriën die verantwoordelijk zijn voor de omzetting van histidine naar histamine, ontwikkelen zich
in tussen 7 en 10°C in de kieuwen en de ingewanden van de vis.
3.9.2.2 Betrokken vissoorten
De 3 belangrijkste vissenfamilies rijk aan histidine zijn:
• Makreelachtigen: tonijn, makreel, …
• Haringachtigen: sardine, haring, …
• Ansjovisachtigen: ansjovis, …
3.9.2.3 Symptomen
Histaminevergiftiging wordt vaak verward met een allergische reactie: men spreekt van een
pseudovoedselallergie; de symptomen zijn dezelfde als die van een voedselallergie, maar de
onderliggende mechanismen zijn niet verbonden met het immuunsysteem. De symptomen duren
enkele uren, maar ze kunnen tot meerdere dagen aanhouden bij ernstige gevallen.
De reactie op histamine is verschillend van persoon tot persoon naargelang zijn gevoeligheid. De
reactie kan zich voordoen na enkele minuten of na enkele uren na de opname van de besmette vis en
volgens volgende gradatie:
• Initiële symptomen: rood worden in het gezicht en de nek, oedeem in het gezicht, jeuk,
prikkeling van de huid, een verbrand gevoel in keel en mond.
• Symptomen in de tweede fase: hoofdpijn, draaierigheid, hartkloppingen.
• Secundaire symptomen: van het gastro-intestinale type, zoals misselijkheid, braken en
diarree.
3.9.2.4 Hoe de vorming te vermijden?
• De vis doden en reinigen (het bloed bevat de vrije histidine),
• Ontwijden (de bacteriën zijn aanwezig in de ingewanden), snel afkoelen of invriezen,
• De koudeketen niet onderbreken,
• Goede hygiënische omstandigheden respecteren.
Opmerkingen:
• Histamine is resistent tegen koken, inblikken en invriezen,
200

• Zouten en roken remmen niet altijd de ontwikkeling van de bacteriën verantwoordelijk voor de
omzetting van histidine naar histamine,
• Eens het enzym (histidine decarboxylase) gevormd is, vermindert afkoeling zijn activiteit niet,
vandaar dat de koudeketen niet onderbroken mag worden.
3.9.2.5 Methodes voor dosering
• Referentiemethodes: HPLC-fluo met prekolom derivatisatie
• Alternatieve methodes: CCM, CPG, HPLC door ionparen met DAD detectie
• Immuno-enzymatische methodes: door Elisa-kits met voorafgaande derivatisatie.
3.10 Contactmaterialen
3.10.1 Inleiding
De voedingsindustrie is de belangrijkste verbruiker van verpakkingen en ze vertegenwoordigt 66%
van het zakencijfer van die sector. Ze is eveneens het meest geconfronteerd met een nood aan
reglementering, en dat in alle stadia van productie. Naast de verpakking bestaat er nog een hele
waaier aan voorwerpen of containers die in contact komen met levensmiddelen. Het risico op
overdracht van componenten tussen de objecten of materialen en de levensmiddelen kan niet
verwaarloosd worden.
Wanneer een object geschikt is voor het contact met levensmiddelen, betekent dit dat het materiaal
waaruit het vervaardigd is, beantwoordt aan de reglementaire vereisten. Deze houden in dat er geen
risico is op een gevaar voor de menselijke gezondheid wanneer levensmiddelen die in contact komen
met het object worden genuttigd. Deze geschiktheid wordt omlijnd in verordening EG 1935/2004 en
betreft materialen en objecten zoals:
• Verpakkingen en verpakkingsmaterialen,
• Recipiënten en keukengereedschap, machines en materialen gebruikt in de productie, opslag
of het transport van levensmiddelen,
• Fopspenen.
De verordening behandelt levensmiddelen en dranken, zowel de afgewerkte als de tussenstadia, die
bestemd zijn voor humane consumptie.
Naast de omkaderende verordening, bestaan er verschillende verordeningen en specifieke richtlijnen
die inertiecriteria van verschillende materialen (pastic, keramiek, cellulose omwikkelfolie) beschrijven,
en de manieren waarop de conformiteit moet worden gecontroleerd. De specifieke reglementering
definieert de inertiecriteria in functie van de aard van de materialen. Dit inertieprincipe wordt uitgedrukt
door termen als globale en specifieke migratielimiet. De globale migratie komt overeen met de som
van de migrerende componenten aanwezig in het materiaal of het object. Een specifieke migratielimiet
behandelt individuele componenten.
201

De Europese wetgeving is opgesteld aan de hand van positieve lijsten, namelijk lijsten van substanties
toegelaten door DG-Sanco. De Amerikaanse wetgeving werkt met negatieve lijsten, daar zijn dan alle
substanties die niet in die lijsten staan toegelaten.
Een aantal richtlijnen zijn omgezet ineen Belgische nationale wetgeving, per materiaal of type
materiaal.
Om een verhoogde veiligheid voor gezondheid en leven te garanderen, baseert de levensmiddelenwetgeving
zich op risicoanalyses. De Europese Unie vraagt aan elke lidstaat om een nationaal
controleplan te verschaffen dat de algemene informatie bevat over de structuur en organisatie van de
officiële controlesystemen.
3.10.2 Specifieke migraties
3.10.2.1 Algemeen
Specifieke migratie is de overgang van een substantie tussen twee middens die met elkaar in contact
staan, ten gevolge van de interactie recipiënt-inhoud. De migratie is vooral bestudeerd in het geval
van contact tussen vloeistof en vaste stof. Bijvoorbeeld: de verpakking van vloeibare levensmiddelen
(contact tussen de wand van het recipiënt en de vloeibare inhoud). De term migratie duidt op de
massa van hetgeen migreert en kan worden uitgedrukt in mg/kg van de inhoud of in mg/dm² van het
contactoppervlak.
De specifieke migraties kunnen worden bepaald, ofwel door de aanwezigheid in de levensmiddelen,
ofwel door het vertrek uit de materialen.
3.10.2.2 Migratie in levensmiddelen
Migratieanalyses in levensmiddelen zijn complex. Het matrixeffect is niet verwaarloosbaar en de
voorbereiding van de stalen vraagt verschillende clean up en/of concentratiestappen.
3.10.2.2.1 Migratie in simulanten
Simulanten
Zoals vastgelegd, worden de simulanten ingedeeld in 4 categorieën, al naargelang hun
eigenschappen overeenkomen met die van één of meerdere types levensmiddelen (Tabel 3.10.1).
Tabel 3.10.1: soorten voedingsmiddelen en simulanten voor specifieke migratietesten (K.B. van 18
september 2008).
Simulant voor voedingsmiddel Afkorting
Gedistilleerd water of water van gelijkwaardige
kwaliteit
Simulant A
Azijnzuur (3% m/v) Simulant B
Ethanol 10% in waterige oplossing. De
concentratie moet aangepast worden aan het reële
Simulant C
202

Simulant voor voedingsmiddel Afkorting
alcoholgehalte van het levensmiddel indien dit meer
dan 10 % (v/v) bedraagt.
Gerectificeerde olijfolie of andere vette
voedingsmiddelsimultanten
Keuze van de simulant
Simulant D
De testen worden uitgevoerd door gebruik te maken van de voedingsmiddelsimulanten zoals
weergegeven in Tabel 3.10.2. Deze worden als het meest nauwkeurig beschouwd in combinatie met
de testvoorwaarden die worden weergegeven in het volgende punt.
Tabel 3.10.2 : voedingsmiddelsimulanten die voor specifieke migratietesten worden gebruikt in functie
van de contact makende groepen van levensmiddelen (K.B. van 18 september 2008).
Voedingsmiddel Simulant
Uitsluitend waterige voedingsmiddelen Simulant A
Uitsluitend zure voedingsmiddelen Simulant B
Uitsluitend alcoholhoudende voedingsmiddelen Simulant C
Uitsluitend vette voedingsmiddelen Simulant D
Alle waterige en zure voedingsmiddelen Simulant B
Alle alcoholhoudende en waterige voedingsmiddelen Simulant C
Alle alcoholhoudende en zure voedingsmiddelen Simulant C en B
Alle vette en waterige voedingsmiddelen Simulant D en A
Alle vette en zure voedingsmiddelen Simulant D en B
Alle vette, alcoholhoudende en waterige
voedingsmiddelen
Simulant D en C
Alle vette, alcoholhoudende en zure voedingsmiddelen Simulant D,C en B
Omstandigheden voor de proeven : tijd – temperatuur
De combinatie tijd/temperatuur moet overeenkomen met de ongunstigste contactomstandigheden die
verwacht kunnen worden voor het materiaal of voorwerp. Er wordt rekening gehouden met een
eventueel op het etiket vermelde maximale gebruikstemperatuur
Tabel 3.10.3 : Standaardomstandigheden voor de combinatie tijd/temperatuur bij migratieproeven met
voedingsmiddelsimulanten volgens het K.B. van 18 september 2008).
Contactomstandigheden bij meest Proefomstandigheden
ongunstig te verwachten gebruik
t ≤ 5 min
Contacttijd proeftijd
5 min < t ≤ 30 min 30min
30 min < t ≤ 1 u 1u
1u < t ≤ 2u 2u
2u < t ≤ 4u 4u
4u < t ≤ 24u 24u
t > 24u 10 d
Contacttemperatuur proeftemperatuur
T ≤ 5°C 5°C
203

Contactomstandigheden bij meest
ongunstig te verwachten gebruik
5°C < T ≤ 20°C 20°C
20°C < T ≤ 40°C 40°C
40°C < T ≤ 70°C 70°C
Proefomstandigheden
70°C < T ≤ 100°C 100°C refluxtemperatuur
100°C < T ≤ 121°C 121°C (1)
121°C < T ≤ 130°C 130°C (1)
130°C < T ≤ 150°C 150°C (1)
T > 150°C 175°C (1)
(1) : deze temperatuur wordt enkel gebruikt voor simulant D. Voor simulanten A, B en C, wordt de test
vervangen door een test bij 100°C.
De parameters van de migratieproeven zijn:
• de combinatie tijd/temperatuur
• simulant
De tijdsduur van de migratieproeven ligt tussen de 30 minuten en 10 dagen. De temperatuur ligt
tussen 5°C en 175°C.
3.10.2.3 Analyses
3.10.2.3.1 Aluminium
Als derde meest aanwezige element in het aardoppervlak, is aluminium het meest gebruikte metaal in
de industrie. Dit meer bepaald in
• Transport
• bouw
• Automobiel
• keukengerei
• voedingsverpakkingen (opslag, bereiding)
Het ontwerp van richtlijnen van de Europese Raad behoudt heden een specifieke migratielimiet van
3,5 mg/l. De analyse wordt uitgevoerd met ICP-MS teneinde een voldoende lage LOQ te bekomen.
3.10.2.3.2 Isopropylthioxanthone in inkt
Isopropylthioxanthone is een bestanddeel (foto-initiatoren zorgen voor het verharden via
polymerisatie) van drukinkt voor tetra pak verpakkingen en kan onder bepaalde omstandigheden
migreren van de buitenkant van de verpakking naar de inhoud van de verpakking.
204

De meest gebruikte detectiemethode na extractie is een scheiding door HPLC in combinatie met
massaspectrometrie.
3.10.2.3.3 Semicarbazide (SEM)
De aanwezigheid van semicarbazide in voedingsmiddelen vindt zijn oorsprong in:
• de afbraak van azodiacarbonamide tijdens het verhittingsproces
• als afbraakproduct van nitrofuranen, wanneer deze als antibioticum gebruikt zijn geweest.
Azodiacarbonamide is een « opblaasmiddel » dat gebruikt wordt in polymeren afsluitstukken van
deksels van bepaalde verpakkingen, om lekken te voorkomen.
Bij de chromatografische analyse van deze component, is een derivatisatiestap vereist (2-NBA 2nitrobenzaldehyde)
omwille van de structuur van de molecule.
Figuur 3.10.4 : derivatisatie van semicarbazide
Verschillende studies hebben de aanwezigheid van SEM aangetoond, in concentraties tot 25 µg/kg, in
bereide sausen, gesteriliseerde conserven en babyvoeding.
Semicarbazide (SEM) behoort tot een familie van chemische substanties (de hydrazines) waarvan de
onschadelijkheid voor de gezondheid van mens en dier sterk in vraag wordt gesteld. Richtlijn 2004/1
verbiedt het gebruik sinds 2005.
LC-MS is de analysemethode bij voorkeur voor de controle op de migratie van semicarbazide.
3.10.2.3.4 Formaldehyde
Melamine of formaldehyde van melamine is een polymeer dat deel uitmaakt van de geamineerde
harsen. De goede hitteresistente eigenschappen van deze stof, hebben ervoor gezorgd dat ze
veelvuldig gebruikt is geweest voor de vervaardiging van voorwerpen die in contact komen met
levensmiddelen. Wanneer het polycondensatieproces tussen melamine en formaldehyde niet volledig
gebeurt, kan het gebeuren dat de monomeren migreren naar de levensmiddelen.
De specifieke migratielimiet van 15 mg/kg (Verordening EG/72/2002) voor deze monomeren wordt
bepaald door middel van gaschromatografie.
Een alternatieve analysemethode is vloeistofchromatografie met post-derivatisatie van formaldehyde.
Om de analyse via HPLC mogelijk te maken, moet inderdaad de formaldehyde eerst gederivatiseerd
worden in aanwezigheid van een oplossing van 2,4-dinitrophenylhydrazine(DNPH) :
205

Figuur 10.3.6 : schema van de post-derivatisatie van formaldehyde.
3.10.2.3.5 4,4-diaminodiphenylmethaan (DDM, MDA, DADP,DADPM)
Figure 3.10.7: chemische structuur van DDM
4,4-diaminodiphenylmethaan maakt deel uit van de groep primaire aromatische amines en kan
gebruikt worden om een zwarte kleur te geven aan keukenmateriaal uit nylon. Het kan eveneens
gebruikt worden als verharder voor epoxideharsen en als vulcanisator voor rubber.
De specifieke migratielimiet van deze aromatische amines is vastgelegd op 0,02 mg/kg (0,0033
mg/dm 2 ). De specifieke migratie wordt bekeken doormiddel van HPLC-UV na een concentratiestap of
na GC-MS.
206

3.10.2.3.6 Geëpoxideerde sojaolie (ESBO)
ESBO (C57H106O10)
• is een stabilisator van PVC-materiaal
• wordt gebruikt in de sluitstukken uit PVC in deksels van glazen bokalen.
Volgens verordening (EG) 372/2007, zijn de migratielimieten
• voor producten bestemd voor baby’s en kleine kinderen en eveneens producten op basis van
granen: SML =30 mg/kg voeding
• voor andere producten: SML = 60 mg/kg voeding of 10 mg/dm2
ESBO is op zich niet giftig, maar wanneer het gebruikt wordt als additief bij het productieproces van
plastic voor voedingsgebruik kan dit veranderen. Bij de hoge temperaturen gebruikt voor de fabricage
van PVC of voor het koken van het vernis van conserven (160°C-220°C), ontstaan door omzetting van
de geëpoxideerde soja (ESBO) niet geïdentificeerde stoffen. In de PVC-films voor voeding en in de
sluitstukken van de deksels van glazen potten, worden waarschijnlijk minder dan 10% van deze
omzettingsproducten gevormd. In het vernis van conserven daarentegen, is dit vaak meer dan 20%.
Vandaar dat bepaalde verpakkingen kunnen leiden tot de inname van milligrammen van dergelijke
stoffen. De toelating voor het gebruik van ESBO als additief voor plastic en vernis is vastgelegd
geweest zonder dat de toxiciteit van deze reactieproducten getest is geweest.
De analysemethode voor specifieke migratie van ESBO is gaschromatografie na een derivatisatiestap.
De GC-FID methode wordt aangeraden in talrijke publicaties. Maar een bevestiging van de analyses
op materialen die onderworpen zijn geweest aan een opwarming tijdens het productieproces, vereisen
gebruik van GC-MS.
Figuur 3.10.8 : Chromatogram van ESBO dat niet opgewarmd is geweest.
207

Figuur 3.10.9 : Chromatogram van ESBO dat opgewarmd is geweest in aanwezigheid van HCL.
3.10.2.3.7 Ftalaten
Ftalaten worden regelmatig gebruikt als additieven in een aantal plastic- en andere
verpakkingsmaterialen of in voorwerpen die in contact komen met levensmiddelen. Ze maken plastic
zoals PVC soepel en plooibaar. Ze vormen geen chemische bindingen met het plastic waaraan ze
worden toegevoegd. Vandaar dat ftalaten kunnen migreren naar de voedingsomgeving. Ftalaten
migreren hoofdzakelijk naar vette voedingsmiddelen, zoals kaas of vlees.
Er bestaat een algemene onzekerheid rond ftalaten betreffende hun veralgemeend gebruik en hun
mogelijke effecten op de gezondheid.
De vijf meest voorkomende ftalaten zijn:
• DEHP : Diethyhexylftalaat
• DBP : Dibutylftalaat
• DINP : Di-isonoylftalaat
• DIDP : Di-isodecylftalaat
• BBP : Benzylbutylftalaat
3.10.2.3.8 Bisfenol A
Reeds sinds meerdere jaren trekken endocriene disruptors, zoals alkylfenolen, fisfenol-A (BPA) en
bisfenol-B (BPB), de aandacht van de wetenschappelijke wereld omwille van hun negatieve effecten
op de menselijke gezondheid.
Recente rapporten wijzen uit dat blootstelling aan bisfenol-A onder de limiet van 0,05 mg/kg
lichaamsgewicht, zoals beschreven door de Europese gezondheidsautoriteiten, of 0,025 mg/kg
volgens de Canadese autoriteiten, reeds gevolgen kan hebben voor de menselijke gezondheid.
208

Polycarbonaat is een helder, doorzichtig, temperatuursbestendig plastic, dat vooral wordt gebruikt voor
de productie van voorwerpen die in contact komen met levensmiddelen. Het wordt vervaardigd
vertrekkend van een polymerisatiereactie van bisfenol-A (primaire monomeer) met carbonyl chloride in
de aanwezigheid van natriumhydroxide.
Bisfenol-A komt eveneens voor in de samenstelling van bepaalde epoxyharsen en als additief bij
bepaalde plasticsoorten.
Wanneer bij het productieproces de polymerisatiereactie niet volledig gebeurt, kan het resterende
bisfenol-A vrijkomen.
Door contact kan bisfenol migreren van het materiaal naar de levensmiddelen en een specifieke
migratielimiet werd vastgelegd. Europese richtlijn 2002/72 heeft de specifieke migratielimiet van
bisfenol-A teruggebracht van 3 mg/kg tot 0,6 mg/kg in voedingsmiddelen of simulanten.
3.10.2.3.9 Mercaptobenzothiazol (MBT)
Mercaptobenzothiazol is grotendeels verspreid in rubberen voorwerpen als een niet vluchtig
vulcaniseringscomponent. Het komt om deze reden ook voor in de samenstelling van bepaalde
fopspenen.
MBT veroorzaakt dermatologische problemen, irritatie van de huid. Controle op het voldoen aan de
specifieke migratielimiet van 25 mg/kg wordt uitgevoerd met HPLC-UV.
Figuur 3.10.12 : chromatogram van 2-mercaptobenzothiazol (HPLC-UV).
209

3.11 Vitamines
3.11.1 Inleiding
Mensen en dieren zijn afhankelijk van ongeveer 40 verschillende voedingsstoffen om de goede
werking van al hun fysiologische processen te garanderen. Als één van deze stoffen ontbreekt of
onvoldoende voorhanden is, zullen er deficiëntiesymptomen optreden die na verloop van tijd fataal
kunnen zijn. Deze essentiële voedingsstoffen worden ingedeeld in 6 groepen: koolhydraten, vetten,
eiwitten, mineralen, vitamines en spoorelementen. Vervolgens worden ze opgedeeld in
macronutriënten (koolhydraten, vetten en eiwitten) en micronutriënten (mineralen, vitamines en
spoorelementen).
Vitamines zijn essentiële voedingsstoffen, die in tegenstelling tot andere voedingsstoffen
(koolhydraten, vetten, eiwitten) geen energie of bouwstoffen leveren, maar die wel noodzakelijk zijn
voor een goed verloop van de stofwisseling. Het zijn micronutriënten, dit zijn voedingsstoffen waarvan
dagelijks slechts een kleine hoeveelheid (enkele mg of µg) dient te worden opgenomen via de voeding
omdat ze door het organisme niet of in onvoldoende mate gesynthetiseerd worden.
Voor elk vitamine bestaat er een Aanbevolen Dagelijkse Hoeveelheid (ADH). De werkelijk benodigde
hoeveelheid per individu wordt bepaald door verschillende factoren: leeftijd, geslacht,
omgevingsfactoren, gezondheidstoestand, stressfactoren, enz. Door de opkomst van de intensieve
veeteelt in de landbouwsector werd het natuurlijk voedsel vervangen of aangevuld met industriële
diervoeders. Om in de natuurlijke vitaminebehoefte te voorzien en de dierlijke productie te verhogen
worden vitamines toegevoegd aan industriële diervoeders. Een verhoogde vitaminetoevoer verbetert
de weerstand, de vruchtbaarheid en productiviteit van de veestapel.
De naam vitamine is afgeleid van het Latijnse woord ‘vita’ (leven) en ‘amine’ (een organische
stikstofverbinding). Deze naam werd voor het eerst gebruikt door Casimir Funk in 1912. Intussen is
gebleken dat slechts één of enkele van de vitamines werkelijk een amine is, terwijl alle andere tot
andere chemische groepen behoren. Het zijn echter allemaal organische verbindingen, in
tegenstelling tot spoorelementen zoals zink en ijzer.
Tot op heden zijn er 13 vitamines bekend, waarbij elk vitamine een groep van gelijkaardige organische
verbindingen met dezelfde activiteit vertegenwoordigt. Bij de naamgeving van vitamines werd
aanvankelijk uitgegaan van een eenvoudige 1-letter naamgeving, zoals vitamine A, B, C, enz. .
Naderhand zijn de vitamines ingedeeld op basis van hun structuur en functionele werking en zo
ontstonden er subgroepen, zoals vitamine B1, B2, B3, enz.. De meeste vitamines zijn gevoelige
verbindingen en worden snel afgebroken wanneer ze blootgesteld worden aan lucht en/of licht.
Vitamines zijn regulatoren van synthese- en degradatieprocessen en vormen de bouwstenen van coenzymen,
hormonen en andere stoffen. Ze spelen een rol bij de groei, het herstel en het goed
functioneren van het lichaam. Men onderscheidt twee groepen vitamines, namelijk de vetoplosbare en
de wateroplosbare vitamines. De meeste wateroplosbare vitamines worden in vivo omgezet in coenzymen
die in samenwerking met metabolische enzymen hun biochemische functies uitvoeren.
Sommige vitamines kunnen ook direct werkzaam zijn op bepaalde plaatsen in de stofwisseling.
Provitamines krijgen pas in het lichaam hun definitieve vorm. Enkele vitamines worden aangemaakt in
het lichaam (vitamine K door darmbacteriën en vitamine D in de huid onder invloed van zonlicht).
210

3.11.2 Vitamines, tekort en overmaat
3.11.2.1 Hypovitaminose
Vitamines vervullen allerlei sleutelfuncties tijdens de stofwisseling. Wanneer één of meerdere
vitamines onvoldoende of niet beschikbaar is, worden bepaalde metabolische processen verstoord en
dit leidt tot verschillende gebreken. Hoewel vitamines in alle levensvormen dezelfde rol vervullen,
hebben hogere organismen (zoals de mens) hun vermogen verloren om zelf alle vitamines aan te
maken. Hoeveel vitamines een individu precies nodig heeft, wordt door verschillende factoren
bepaald. Zwangerschap, verhoogde lichamelijke activiteit en bepaalde ziektes en medicijnen verhogen
de behoefte aan bepaalde vitamines. Vandaar dat het zeer moeilijk is om een algemene dagelijkse
vitaminebehoefte weer te geven. De minimale dagelijkse behoefte aan vitamines om gebreksziekten
te vermijden werd wel bepaald.
Bij gebrek aan een vitamine kunnen ziekten optreden, die meestal te verhelpen zijn door tijdig
toedienen van de ontbrekende vitamine. De ziekten die ontstaan door een totaal gebrek aan een
vitamine, noemt men avitaminosen, bij een tekort aan een vitamine noemt men ze hypovitaminosen.
De bekendere avitaminosen zoals beriberi, scheurbuik en rachitis treden respectievelijk op bij ernstige
gebreken aan vitamine B1, C en D (vooral in ontwikkelingslanden). Geringe tekorten aan vitamines
kunnen mildere klachten veroorzaken en zijn vaak niet duidelijk waarneembaar. Pas in een later
stadium of onder stressomstandigheden wordt men echt ziek.
Een vitaminetekort kan onder meer optreden door een onevenwichtige voeding:
• Aangezien vitamine B12 enkel in producten van dierlijke oorsprong voorkomt, leidt
vegetarisme of veganisme vaak tot een tekort aan vitamine B12.
• Allergieën of intoleranties leiden vaak tot een onbalans in het dieet en kunnen de opname van
vitamines en mineralen verslechteren. Mensen met een fruitallergie kunnen zo bijvoorbeeld
een gebrek aan vitamine C oplopen.
• Bij coeliakie-patiënten (intolerantie voor gluten) is het bekend dat er allerlei tekorten aan
vitamines en mineralen optreden. De ontstoken darmwand kan allerlei voedingstoffen slecht
uit het voedsel opnemen. De behandeling bestaat uit een glutenvrij dieet dat meestal niet alle
vitamines en mineralen bevat waardoor er wederom gebreken en klachten kunnen optreden.
Coeliakie-patiënten hebben bijvoorbeeld een verhoogde kans op osteoporose.
3.11.2.2 Hypervitaminose
Aan de andere kant kan een teveel aan vitamines zich opstapelen in het lichaam en dit kan schadelijk
zijn voor het organisme. Een teveel aan wateroplosbare vitamines komt zelden voor omdat deze met
de urine weer uitgescheiden worden. Vetoplosbare vitamines daarentegen worden moeilijker
uitgescheiden en een overmaat aan vitamine of hypervitaminose komt bijgevolg vrijwel alleen voor bij
vetoplosbare vitamines (vooral vitamine D).
Ieder mens is uniek en daarom is het belangrijk om rekening te houden met de individuele vitamines-
en mineralenbehoefte. De gangbare multivitamine-tabletten zijn over het algemeen het veiligst
wanneer men de individuele behoefte niet kent.
211

3.11.3 Soorten vitamines
De 13 vitamines worden ingedeeld in 2 groepen, namelijk de vetoplosbare en de wateroplosbare
vitamines. Tot de vetoplosbare vitamines behoren vitamine A, D, E en K (ezelsbruggetje: KADE). Deze
komen vooral in vetrijke levensmiddelen voor. De wateroplosbare vitamines B en C komen voor in
allerlei voedingsmiddelen.
De wateroplosbare vitamines, vooral de B-vitamines, hebben vooral een functie als co-factor bij tal van
enzymatische reacties in het koolhydraat-, eiwit- en vetmetabolisme en zijn daarmee onder andere
van belang voor het vrijmaken van energie uit de voeding en de vorming van bouwstenen voor
lichaamsweefsel.
De vetoplosbare vitamines hebben een groot aantal uiteenlopende functies variërend van een rol bij
het gezichtsvermogen (vitamine A) tot de regulatie van de calciumbalans (vitamine D).
De meeste vitamines bestaan uit meerdere (verwante) verbindingen die een bepaalde biologische
activiteit gemeen hebben en die worden aangeduid met een zogenaamde generieke naam.
3.11.3.1 Vetoplosbare vitamines
Vetoplosbare vitamines zijn: vitamine A, vitamine D, vitamine E en vitamine K. Deze vitamines zitten
voornamelijk in het vet van voedingsmiddelen en kunnen in het vetweefsel en de lever worden
opgeslagen. In ongunstige omstandigheden worden deze voorraden aangesproken.
3.11.3.1.1 Vitamine A
Vitamine A is een vetoplosbaar vitamine, dat ook all-trans-retinol of simpelweg retinol genoemd wordt.
De synthetische derivaten retinylacetaat en retinylpalmitaat worden toegevoegd aan diervoeders en
levensmiddelen om het gehalte aan vitamine A te verhogen.
Figuur 3.11.1 : Structuurformule vitamine A
• Chemische benaming: Vitamine A, retinol of all-trans-retinol
• Molecuulformule: C20H30O
• Molecuulmassa: 286,46 g/mol
212

Retinol kan door een oxidatieve splitsing van bèta-caroteen (carotenoïde) in de dunne darm worden
gevormd. Daarom wordt bèta-caroteen ook wel provitamine A genoemd.
Functie
Figuur 3.11.2 : Structuurformule bèta-caroteen
• Chemische benaming: bèta-caroteen of provitamine A
• Molecuulformule: C40H56
• Molecuulmassa: 536,9 g/mol
Vitamine A:
• heeft een beschermende werking ten opzichte van epitheel
• is essentieel voor de vorming van bloedcapillairen en draagt daardoor bij tot de
voedselvoorziening van alle organen
• voorkomt en behandelt huidproblemen en veroudering van de huid
• verbetert het zicht en voorkomt nachtblindheid
• verbetert het herstellend vermogen van het lichaam
• stimuleert de groei van sterke botten, haar, tanden, huid en tandvlees
• helpt bij een te snel werkende schildklier
Bèta-caroteen, het voorproduct van vitamine A is een antioxidant (maakt vrije radicalen onschadelijk)
en heeft tevens kankerbestrijdende eigenschappen (mits men niet rookt).
Hypovitaminose
Symptomen bij een tekort aan vitamine A zijn nachtblindheid, aanhoudende hoofdpijnen, verminderde
weerstand tegen infecties (vooral van de luchtwegen), huidproblemen, droog en breekbaar haar en
nierstenen. Er zijn geen specifieke effecten van een tekort aan bèta-caroteen bekend.
Daar waar de meeste cellen afgebroken en voortdurend vervangen worden (zoals in de huid), komt
een gebrek aan vitamine A het eerst aan het licht. Bij een onvoldoende aanmaak en functioneren van
capillairen ontstaat een ophoping van afbraakproducten die tot voedsel dienen voor binnendringende
bacteriën. Zo ontstaan ernstige, vaak dodelijke letsels. Tengevolge van een netvliesstoornis van het
oog kan nachtblindheid ontstaan.
213

Bij dieren leidt een tekort aan vitamine A tot een verminderde eetlust, verstoorde groei, gewichtsverlies
en uiteindelijk sterfte. Daarnaast kunnen er ook problemen ontstaan met de huid, ogen, zenuwstelsel,
urinewegen en voortplanting.
Hypervitaminose
Een teveel aan vitamine A als retinol is giftig, vooral voor zwangere vrouwen (gevaar voor de foetus).
Symptomen zijn onder meer gebrek aan eetlust, verminderd gezichtsvermogen, hoofdpijn,
misselijkheid, vermoeidheid, duizeligheid, spierpijn, oogafwijkingen, haarverlies en/of roodheid en
schilferen van de huid.
Bèta-caroteen wordt niet als giftig beschouwd. Rokers gebruiken best geen hoge dosissen vitamine A
of bèta-caroteen, aangezien dit de kans op longkanker kan verhogen.
Dosering en natuurlijke bronnen
De aanbevolen dagelijkse hoeveelheid aan vitamine A is 0,8 mg (= 800 microgram). Mensen met
specifieke behoeften (na ziekte, bij infecties of diabetes) hebben een hogere hoeveelheid nodig. De
maximale veilige dosis per dag is 3 mg (= 3000 microgram).
Belangrijke bronnen van vitamine A zijn vooral dierlijke producten waaronder lever, visolie, levertraan,
melk, boter, margarine, kaas en eidooier.
De aanbevolen dagelijks benodigde hoeveelheid bèta-caroteen is 2 tot 6 mg en meer tijdens de
zwangerschap. De maximale veilige dosis per dag is 25 mg.
Belangrijke bronnen van bèta-caroteen zijn plantaardige producten, waaronder groene bladgroenten,
wortelen, zoete aardappelen, geel of oranje gekleurde vruchten en groene tuinkruiden.
214

3.11.3.1.2 Vitamine D
Vitamine D is een vetoplosbaar vitamine. Er bestaan twee vormen van vitamine D, namelijk vitamine
D3 en D2.
Figuur 3.11.3. Formule vitamine D3 Figuur 3.11.4 Formule vitamine D2
• Chemische benaming: Vitamine D3 of cholecalciferol
• Molecuulformule: C27H44O
• Molecuulmassa: 384,2 g/mol
• Chemische benaming: Vitamine D2 of ergocalciferol
• Molecuulformule: C28H44O
• Molecuulmassa: 396,6 g/mol
Vitamine D2 verschilt slechts van vitamine D3 door een dubbele binding en een methylgroep. Vitamine
D3 wordt in het lichaam gevormd uit cholesterol onder invloed van ultraviolet licht. Vitamine D2 wordt
ook uit cholesterol gevormd, maar via een andere route en het is plantaardig. Vitamine D2 en D3
hebben dezelfde biologische werking. Daarom wordt vitamine D2 ook vaak gebruikt als
voedingssupplement.
Functie
Vitamine D is noodzakelijk voor de ontwikkeling van het skelet, vooral voor de fosfaat- en
calciumstofwisseling. De werking van vitamine D is afhankelijk van de aanwezigheid van het
pantotheenzuur-complex.
Vitamine D:
• beschermt tegen osteoporose,
215

• kan helpen bij de behandeling van psoriasis,
• versterkt het immuunsysteem,
• kan helpen kanker te voorkomen,
• is noodzakelijk voor sterke tanden en botten,
• zorgt voor een goede werking van de spieren.
Hypovitaminose
Symptomen bij een tekort aan vitamine D zijn rachitis (Engelse ziekte), botverweking, pijn in de botten,
spierslapte, spierkramp en osteoporose. Vitamine D bevordert de opname van calcium en de opbouw
van de botten. Wanneer vitamine D ontbreekt, verlopen deze processen trager, hetgeen resulteert in
rachitis (Engelse ziekte, een skeletafwijking) bij kinderen en verweking van de botten (osteomalacie)
bij volwassenen. Bij kinderen verstoort rachitis de ontwikkeling van de botten en raken deze vervormd
door een onvoldoende afzetting van calcium en fosfor,bij volwassenen mineraliseert de pas gevormde
beendermatrix onvoldoende waardoor de beenderen broos worden.
Bij dieren leidt een tekort aan vitamine D tot rachitis, osteomalacie, verminderde eetlust, verstoorde
groei en gewichtsverlies. Daarnaast kan het ook verhoogde prikkelbaarheid veroorzaken, problemen
met de beenderen en reproductie.
Hypervitaminose
Een langdurige te hoge inneming van vitamine D kan schade aan hart, nieren en bloedvaten
veroorzaken. Daarnaast kan het ook leiden tot misselijkheid, braken, hoofdpijn, slaperigheid,
depressiviteit, verminderde eetlust, obstipatie en andere symptomen. Nadelige effecten als gevolg van
een overmaat aan vitamine D zijn echter zeer zeldzaam.
Dosering en natuurlijke bronnen
De aanbevolen dagelijkse hoeveelheid van vitamine D is 0,005 mg (= 5 microgram). De maximale
veilige dosis is 0,05 mg (= 50 microgram) per dag. Een gezonde voeding voorziet in principe in
voldoende vitamine D voor personen die een lichte huidskleur hebben en voldoende buiten komen.
Alle andere groepen hebben extra vitamine D nodig.
Belangrijke bronnen van vitamine D zijn dierlijke producten zoals vis(olie), levertraan, lever, eieren en
zuivelproducten.
Specifieke biochemische werking
De vorming van vitamine D3 uit cholesterol in de huid vindt plaats onder invloed van ultraviolet licht.
Cholesterol wordt omgezet in 7-dehydrocholesterol door waterstof te verwijderen op positie 7 en 8,
deze reactie wordt gekatalyseerd door 7-dehydrocholesterol reductase. Uit dit 7-dehydrocholesterol
wordt onder invloed van UV licht vitamine D3 (cholecalciferol) gemaakt.
216

Figuur 3.11.5. Aanmaak van cholecalciferol
Vitamine D2 wordt eveneens uit cholesterol gevormd, maar via een andere route in fungi, gisten en
planten. Cholesterol wordt omgezet in plantaardig ergosterol, dit ergosterol wordt onder invloed van
UV licht omgezet in ergocalciferol (vitamine D2).
Vitamine D op zich is biologisch inactief, het wordt geactiveerd door verdere metabolische processen,
eerst hydroxylatie op positie 25 in de lever en vervolgens hydroxylatie op positie 1 in de nieren. Het nu
ontstane hormoon heet 1,25-dihydroxycholecalciferol of 1,25(OH)2D en is werkzaam in de calcium- en
fosfaatstofwisseling en de groei en differentiatie van verschillende celtypes.
Figuur 3.11.6. Aanmaak van 1,25-dihydroxycholecalciferol
Dit hormoon stimuleert de intestinale opname van calcium en fosfaat en het transport van calcium- en
fosfaationen. Het is essentieel voor de ontwikkeling, groei, behoud en herstel van beenderen.
Hormonen en ook 1,25-dihydroxycholecalciferol komen in lage concentraties voor in het bloed, dit
verklaart waarom we maar weinig (5 µg) vitamine D nodig hebben in onze dagelijkse voeding.
217

3.11.3.1.3 Vitamine E
Vitamine E of alfa-tocoferol is een vetoplosbaar vitamine. Het wordt vaak aan levensmiddelen en
diervoeders toegevoegd onder de vorm van alfa-tocoferolacetaat.
Functie
Figuur 3.11.7 Structuurformule vitamine E
• Chemische benaming: Vitamine E of alfa-tocoferol
• Molecuulformule: C29H50O2
• Molecuulmassa: 430,7 g/mol
Tocoferol heeft een preventieve werking op veroudering en welvaartsziekten omwille van zijn sterke
antioxidant eigenschappen. Vanaf 40 jaar neemt de natuurlijke weerstand tegen vrije radicalen
geleidelijk af en gebruiken steeds meer mensen extra vitamine E. Het is ook noodzakelijk voor de
vorming van rode bloedcellen en de opbouw, het herstel en de instandhouding van spier- en andere
weefsels. Ook beschermt het meervoudige onverzadigde vetzuren die een essentiële bouwstof voor
het lichaam zijn.
Vitamine E:
• is een antioxidant (bescherming celmembranen),
• beschermt tegen zenuwaandoeningen,
• vergroot de weerstand,
• beschermt tegen hart- en vaatziekten,
• vermindert PMS-symptomen,
• behandelt huidproblemen en kaalheid,
• helpt miskramen voorkomen,
• werkt als natuurlijke vochtafdrijver,
• voorkomt verdikt littekenweefsel.
Hypovitaminose
Ernstige verschijnselen als gevolg van een gebrek aan vitamine E zijn zeer zeldzaam bij mensen en
komen bijna alleen voor als gevolg van een ernstige stoornis in de opname van voedingsstoffen.
218

Eventuele symptomen van een tekort aan vitamine E zijn bloedarmoede en schade aan de hersenen
(hersenverweking). Bij kinderen kan een tekort leiden tot bloedarmoede, oedeem, problemen met het
verteringsstelsel en groeistoornissen.
Bij dieren resulteert een gebrek aan vitamine E in verschillende ziektes die het spier-,
cardiovasculaire, reproductie- en centraal zenuwstelsel aantasten, net als het vetweefsel, de lever,
nieren en rode bloedcellen.
Hypervitaminose
Vitamine E stapelt zich voornamelijk op in de lever en pancreas, maar tot nu toe zijn er nog geen
toxische effecten bekend.
Dosering en natuurlijke bronnen
De aanbevolen dagelijkse hoeveelheid van vitamine E is 10 mg. Dagelijkse doseringen bij
gezondheidsklachten zijn 250 tot 280 mg, maar in sommige gevallen kan een hogere dosering
geadviseerd worden. De maximale veilige dosis is 350 mg per dag.
Belangrijke bronnen van vitamine E zijn plantaardige oliën, sojabonen, broccoli, spinazie, noten,
volkorenproducten, vis, vlees, eieren en zuivelproducten.
3.11.3.1.4 Vitamine K
Er zijn drie vormen van vitamine K, namelijk K1, K2 en K3. Alle vormen hebben dezelfde
basisstructuur. Vitamine K1 en K2 zijn natuurlijke vetoplosbare vitamines, de synthetische vorm K3 is
wateroplosbaar.
Figuur 3.11.8 Structuurformule vitamine K1
• Chemische benaming: Vitamine K1 of fyllochinon
• Molecuulformule: C31H46O2
• Molecuulmassa: 450,7 g/mol
219

Functie
Figuur 3.11.9 Formule vitamine K2 Figuur 3.11.10 Formule vitamine K3
• Chemische benaming: Vitamine K2 of menaquinone
• Chemische benaming: Vitamine K3 of menadione
Vitamine K is onmisbaar bij de vorming van verschillende bloedstollingscomponenten en dus ook voor
de bloedstolling bij verwondingen.
Tot ongeveer 3 maanden na de geboorte van een baby is het noodzakelijk dat dit vitamine extra in de
voeding voorkomt, omdat er dan nog onvoldoende darmbacteriën in de darm aanwezig zijn.
Tegenwoordig wordt vitamine K aan babyvoeding toegevoegd of krijgen pasgeborenen een injectie
met vitamine K om hersenbloedingen te voorkomen.
Hypovitaminose
Een tekort aan vitamine K leidt tot een vertraagde bloedstolling en kan bloedingen tot gevolg hebben.
Een vitamine K-tekort is zeldzaam en komt voornamelijk voor bij pasgeboren baby’s, mensen met een
ernstige opnamestoornis en patiënten die langdurig antibiotica hebben geslikt. Antibiotica kunnen de
darmbacteriën die vitamine K aanmaken namelijk vernietigen. Pasgeboren baby’s hebben altijd een
vitamine K-tekort, omdat deze vitamine de placenta niet kan passeren.
Bij dieren resulteert een gebrek aan vitamine K tevens in bloedingen en een vertraagde bloedstolling.
Hypervitaminose
Er zijn geen berichten over schadelijkheid bekend. In de praktijk komt een teveel aan vitamine K niet
voor.
Dosering en natuurlijke bronnen
De aanbevolen dagelijkse hoeveelheid vitamine K is 0,08 mg (= 80 microgram). De maximaal veilige
dosis wordt als 50 maal de ADH, dus 4 mg (= 4000 microgram) beschouwd.
Vitamine K1 komt van nature voor in plantaardig voedsel (groene bladgroenten). In de darmen wordt
het aangemaakt door darmbacteriën als vitamine K2. Synthetisch vitamine K wordt vitamine K3
genoemd, ons lichaam zet dit om in actief vitamine K.
220

Belangrijke bronnen van natuurlijk vitamine K zijn onder andere: bloemkool, broccoli, boerenkool,
spinazie, erwten, volkorenproducten, raapzaadolie, melk, zuivelproducten, eieren en mager vlees.
Specifieke biochemische werking
Vitamine K is onmisbaar voor de vorming van trombine of trombinogeen en andere
bloedstollingscomponenten in de lever. Wanneer vitamine K ontbreekt of wanneer er een competitieve
inhibitor aanwezig is zoals warfarin (rattengif), dan wordt er abnormaal trombine gevormd, dat slechts
1 % tot 2 % van de normale activiteit bezit. Vitamine K werkt als cofactor bij de post-translationele
processen voor de vorming van trombine door glutaminezuur (glu) om te zetten in gammacarboxyglutamaat
(gla). Vitamine K wordt tijdens deze reactieweg steeds opnieuw gebruikt. Dit
verklaart waarom we maar weinig (80 microgram) van dit vitamine nodig hebben in onze dagelijkse
voeding.
3.11.3.2 Wateroplosbare vitamines
Wateroplosbare vitamines zijn: vitamine B1, B2, B3, B5, B6, B11 en B12, C en vitamine H. Deze
vitamines zitten in het vocht dat in voedingsmiddelen zit. Het lichaam kan deze wateroplosbare
vitamines (met uitzondering van vitamine B12) niet goed opslaan, een teveel verlaat het lichaam via
de urine of zweet. Deze vitamines uit het B-complex die samen zorgen voor de stofwisseling in het
lichaam, zijn allemaal voorlopers van co-enzymen. Wanneer een tekort aan één bepaalde B-vitamine
ontstaat, volgt vaak een tekort aan overige B-vitamines. De inname van één bepaalde B-vitamine
zorgt er bovendien voor dat de behoefte aan andere B-vitamines toeneemt.
3.11.3.2.1 Vitamine B1 (Thiamine)
Vitamine B1 is een in water oplosbaar vitamine en maakt deel uit van het vitamine B-complex. Het is
een zwavelhoudend vitamine en wordt ook thiamine genoemd. Het wordt vooral aan levensmiddelen
en diervoeders toegevoegd als thiamine hydrochloride.
Figuur 3.11.11 Structuurformule vitamine B1
• Chemische benaming: Vitamine B1 of thiamine
• Molecuulformule: C12H17N4OS
• Molecuulmassa: 265,3 g/mol
221

Functie
Vitamine B1 is onmisbaar voor de energievoorziening van het lichaam omdat het vooral de
koolhydratenafbraak regelt waarbij energie wordt vrijgezet. Vitamine B1 is ook noodzakelijk voor een
goede werking van het hart en zenuwstelsel en speelt een rol in het aminozuurmetabolisme.
Vitamine B1:
• beschermt tegen de gevolgen van alcoholgebruik,
• kan helpen bij de behandeling van zenuwstoornissen,
• kan helpen bij de behandeling van bloedarmoede,
• kan de geestelijke flexibiliteit verbeteren,
• kan diabetes helpen reguleren indien dit verband houdt met B1-tekort,
• helpt bij de behandeling van herpes infecties,
• helpt koolhydraten omzetten in energie in de spieren.
Hypovitaminose
Symptomen bij een tekort aan vitamine B1 zijn vermoeidheid, spierslapte, verlies van eetlust,
prikkelbaarheid, depressiviteit, slecht geheugen, tintelend gevoel in de tenen en op de voetzolen,
spijsverteringsklachten en misselijkheid. Wanneer vitamine B1 ontbreekt en er een overdaad aan
koolhydraten (suikers) aanwezig is, ontstaat beriberi. Een relatief gebrek komt zeer vaak voor.
Bij dieren resulteert een gebrek aan vitamine B1 in verminderde eetlust en groei, verzwakking, lagere
lichaamstemperatuur en talloze problemen met de huid, het zenuw-, hart- en bloedvaten- en
verteringsstelsel en de reproductie.
Hypervitaminose
Thiamine is niet giftig maar geadviseerd wordt niet meer dan 400 mg per dag in te nemen.
Dosering en natuurlijke bronnen
De aanbevolen dagelijkse benodigde hoeveelheid van dit vitamine is 1,1-1,4 mg. De maximale veilige
dosis per dag is 400 mg. Het gebruik van alcohol, drugs, koffie, nicotine en suiker vraagt om extra
hoeveelheden B1, tot 100-300 mg per dag.
Voedingsmiddelen die rijk zijn aan vitamine B1 zijn gist, (varkens)vlees, erwten, bonen, aardappelen,
brood, graanproducten, melk en melkproducten en pinda’s.
Specifieke biochemische werking
Vitamine B1 komt in het lichaam voor als een co-enzym dat thiamine difosfaat of thiamine pyrofosfaat
wordt genoemd. Dit co-enzym is een thiamine-molecule waaraan twee fosfaatgroepen werden
toegevoegd in plaats van waterstof. Dit co-enzym speelt een belangrijke rol in de citroenzuurcyclus, op
die manier regelt het vooral de koolhydraatafbraak waarbij energie wordt verkregen.
222

3.11.3.2.2 Vitamine B2 (Riboflavine)
Figuur 3.11.12 Vorming van thiamine difosfaat
Vitamine B2 is net als B1 een in water oplosbaar vitamine en wordt ook riboflavine genoemd. Het
behoort tevens tot het vitamine B-complex. Aangezien riboflavine slecht oplosbaar is in water, wordt
dikwijls natriumriboflavine-5-fosfaat gebruikt in levensmiddelen en diervoeders.
Functie
Figuur 3.11.13 Structuurformule vitamine B2
• Chemische benaming: Vitamine B2 of riboflavine
• Molecuulformule: C17H20O6N4
• Molecuulmassa: 376,4 g/mol
Vitamine B2 is onmisbaar voor de energievoorziening van het lichaam, voornamelijk voor het
vrijmaken van energie uit koolhydraten, eiwitten en vetten die het lichaam via de voeding binnenkrijgt.
Het is dus een belangrijke vitamine voor de stofwisseling en het speelt een rol bij de instandhouding
van het zenuwstelsel. Daarnaast is het van belang voor een gezonde huid en gezond haar.
Vitamine B2:
• helpt bij de stofwisseling van vetten, eiwitten en koolhydraten,
223

• bevordert het gezichtsvermogen,
• bevordert het goed functioneren van het voortplantingsmechanisme,
• bevordert atletische prestaties,
• biedt bescherming tegen bloedarmoede.
Hypovitaminose
Symptomen bij een tekort aan vitamine B2 zijn gebarsten huid en slijmvlies, rood worden van de tong,
eczeem op de huid en de geslachtsdelen, brandend gevoel op de huid, vermoeidheid, soms
moeilijkheden bij de bloedvorming. Bij ontbreken van vitamines B2 ontstaat ook een gedeeltelijke
beschadiging van de weefselademhaling en als gevolg daarvan een stilstand van de groei,
buikafwijkingen, afwijkingen aan de lippen, krom groeien van de vingernagels en maagdarmziekten.
Bij dieren resulteert een gebrek aan vitamine B2 in verstoorde groei, verminderde eetlust, verlaagde
lichaamstemperatuur, problemen met de huid, ogen, zenuw- en verteringsstelsel en reproductie.
Hypervitaminose
Riboflavine is enkel giftig in zeer hoge dosissen. Zelden voorkomende symptomen zijn jeuk en een
brandend gevoel op de huid.
Dosering en natuurlijke bronnen
De aanbevolen dagelijks benodigde hoeveelheid van riboflavine is 1,1-1,6 mg. Een verhoogde
dosering is nodig bij stress, zwangerschap, borstvoeding, pilgebruik en zwaar drankgebruik. De
maximale veilige dosis per dag is vastgesteld op 400 mg.
Rijk aan vitamines B2 zijn lever, nier, eieren, kaas, gist, melk, kiemen, broccoli, champignons, vis, fruit,
brood, volkorenproducten en vlees.
Specifieke biochemische werking
Vitamine B2 is werkzaam bij de koolhydraat-, eiwit en vetafbraak. In het lichaam komt riboflavine voor
in de co-enzymen flavine adenine dinucleotide (FAD) en flavine mononucleotide (FMN). FAD is
werkzaam als redoxpotentiaal, dit betekent dat hierin als het ware energie kan worden opgeslagen.
Het is onder andere werkzaam in de citroenzuurcyclus.
3.11.3.2.3 Vitamine B3 (Niacine)
Vitamine B3 is wateroplosbaar, maakt onderdeel uit van het vitamine B-complex en bestaat in twee
vormen, namelijk nicotinezuur en nicotinamide. Vitamine B3 wordt ook niacine of vitamine PP
(Pellagra Preventing factor) genoemd.
224

Functie
Figuur 3.11.14 Structuurformule vitamine B3 (Nicotinezuur)
• Chemische benaming: Vitamine B3, nicotinezuur of niacine
• Molecuulformule: C6H5NO2
• Molecuulmassa: 123,1 g/mol
Figuur 3.11.15 Structuurformule vitamine B3 (Nicotinamide)
• Chemische naam: Vitamine B3, nicotinamide of niacine
• Molecuulformule: C6H6N2O
• Molecuulmassa: 122,1 g/mol
Vitamine B3 helpt bij de energievoorziening van cellen door de afbraak van vetzuren, koolhydraten en
aminozuren en bevordert de werking van het zenuwstelsel. Nicotinamide is de actieve groep van
nicotinamide-adenine-dinucleotide (NAD) en nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat (NADP).
Nicotinezuur wordt in het lichaam omgezet in nicotinamide. NAD en NADP spelen een belangrijke rol
in verschillende afbraakprocessen en het vrijzetten van energie en essentiële bouwstoffen.
Vitamine B3:
• voorkomt en behandeld schizofrenie,
• bevordert de celademhaling,
• haalt energie uit suiker, vet en eiwit,
• houd de huid schoon en de zenuwen, de tong en de spijsvertering gezond,
• kan het cholesterolniveau verlagen en zo bescherming bieden tegen hartkwalen,
225

• wordt beschouwd als antioxidant,
• kan migraine voorkomen,
• verlaagt de bloeddruk.
Hypovitaminose
Een tekort komt zelden voor maar eventuele symptomen bij een tekort aan vitamine B3 zijn dermatitis,
rood worden van de tong, slapeloosheid, diaree, dementie en pellagra (kwam zestig jaar geleden veel
voor in Zuid-Amerika).
Bij dieren resulteert een tekort aan vitamine B3 in verminderde groei en eetlust, dermatitis, problemen
met het zenuw- en verteringsstelsel, beenderen en anemie.
Hypervitaminose
Symptomen bij hoge dosissen zijn onder andere huid- en membraanproblemen, depressiviteit, een
slecht functionerende lever en hoofdpijn.
Dosering en natuurlijke bronnen
De aanbevolen dagelijkse hoeveelheid van dit vitamine is vastgesteld op 15 tot 18 mg. Doseringen
van 20 tot 100 mg per dag kunnen een gunstig effect hebben. De maximale veilige dosis voor dit
vitamine is voor de twee verschillende vormen verschillend. Voor nicotinezuur is deze 120 mg en voor
nicotinamide is deze 300 mg per dag.
Belangrijke bronnen aan vitamine B3 zijn onder andere volkoren- en graanproducten, zilvervliesrijst,
melk, kaas, vlees, vis en cashewnoten.
Specifieke biochemische werking
In het lichaam komt niacine voor in een co-enzym dat nicotineamine adenine dinucleotide (NAD) wordt
genoemd. Dit co-enzym is werkzaam als redoxpotentiaal, dit betekent dat hierin als het ware energie
kan worden opgeslagen en er weer uit kan worden gehaald. Omdat NAD steeds wordt gerecycled
door het "op te laden" (in het katabolisme) en weer wordt gebruikt (bij het anabolisme), is er maar
weinig (18 mg) van dit vitamine nodig in onze dagelijkse voeding. Het co-enzym is onder andere
werkzaam in de citroenzuurcyclus en de glycolyse.
3.11.3.2.4 Vitamine B5 (Pantotheenzuur)
Vitamine B5 is, net als alle vitamine uit het vitamine B-complex, wateroplosbaar en wordt ook
pantotheenzuur genoemd. Commercieel wordt het meestal toegevoegd als calciumpantothenaat.
226

Functie
Figuur 3.11.16 Structuurformule vitamine B5
• Chemische benaming: Vitamine B5 of pantotheenzuur
• Molecuulformule: C9H16O5N
• Molecuulmassa: 218,2 g/mol
Vitamine B5 is onmisbaar voor de energievoorziening van het lichaam, vooral door het vrijmaken van
energie uit vetzuren. Ook speelt deze vitamine een belangrijke rol bij de afbraak van eiwitten en
koolhydraten. In het lichaam maakt pantotheenzuur deel uit van co-enzym A (CoA). Dit co-enzym
breekt het eiwit uit ons voedsel af tot aminozuren. Het stelt uit deze bouwstoffen vervolgens ook weer
menselijk eiwit samen. Co-enzym A is ook werkzaam in het omzetten van koolhydraten in
lichaamsenergie, onder andere in het begin van de citroenzuurcyclus. Daarnaast is het van belang bij
de vorming en regulering van een aantal hormonen.
Vitamine B5:
• bevordert de genezing van wonden,
• helpt het lichaam bij het produceren van energie,
• vermindert stress,
• reguleert de weerstand,
• voorkomt vermoeidheid,
• verlaagt cholesterol en biedt zo bescherming tegen hartkwalen,
• helpt artritis voorkomen en behandelen,
• kan kaalheid en grijsheid voorkomen,
• is essentieel voor de aanmaak van bepaalde hormonen.
Hypovitaminose
Een tekort komt zelden voor maar eventuele symptomen bij een tekort aan vitamine B5 zijn braken,
krampen, vermoeidheid, slapeloosheid, verminderde weerstand voor infecties en buikpijn.
Bij dieren komt een tekort aan vitamine B5 vaker voor en dit kan leiden tot verminderde groei en
eetlust, depigmentatie, haarverlies, prikkelbaarheid, verstoorde bewegingen, anemie, problemen met
verteringsstelsel en reproductie.
227

Hypervitaminose
Er zijn geen schadelijke effecten bekend van vitamine B5. Sommige mensen krijgen maagklachten bij
dosissen hoger dan 10 g.
Dosering en natuurlijke bronnen
De aanbevolen dagelijkse hoeveelheid (ADH) van dit vitamine is 6 mg per dag. Voor een
geneeskundige toepassing kan het vitamine het best ingenomen worden in een vitamine B-complex
preparaat tot 300 mg per dag. Een normale dosering die ziekte moet helpen voorkomen is ongeveer
100 mg per dag. De maximale veilige dosis per dag is op 1000 mg vastgesteld.
Vitamine B5 komt onder andere voor in de volgende voedingsstoffen: gist, volkorenproducten, stroop,
broccoli, spinazie, groene paprika’s, paddenstoelen, vlees, lever, zilvervliesrijst, eieren en noten.
3.11.3.2.5 Vitamine B6 (Pyridoxine)
Vitamine B6 is evenals alle vitamines uit het vitamine B-complex wateroplosbaar en wordt ook
pyridoxine genoemd. Commercieel komt het bijna uitsluitend voor als pyridoxine hydrochloride.
Functie
Figuur 3.11.17 Structuurformule vitamine B6
• Chemische naam: Vitamine B6 of pyridoxine
• Molecuulformule: C8H11NO3
• Molecuulmassa: 169,18 g/mol
Vitamine B6 speelt een belangrijke rol bij de stofwisseling en de weerstand. Het reguleert de werking
van bepaalde hormonen in het lichaam en is het een onmisbare stof bij de afweer en de groei.
Pyridoxine zorgt samen met vitamine B11 (foliumzuur) en vitamine B12 voor de opname van ijzer door
het lichaam en het is betrokken bij de vorming van rode bloedcellen. Deze drie vitamines zorgen ook
voor een goede werking van het zenuwstelsel en zijn betrokken bij het aminozuurmetabolisme.
228

In het lichaam wordt dit vitamine omgezet in het co-enzym dat PLP (pyridoxaal-5-fosofaat). Dit coenzym
is van belang voor meer dan 100 enzymen en speelt een rol in bijna alle biochemische reacties
(glycogeen-, vetzuur- en aminozuurmetabolisme).
Vitamine B6:
• verhoogt de weerstand
• helpt suikerziekte reguleren,
• zorgt voor de opname van eiwitten en vetten,
• verlicht misselijkheid,
• helpt huid- en zenuwstoornissen voorkomen,
• behandelt symptomen van het premenstrueel syndroom (PMS) en de menopauze,
• vermindert spierspanningen,
• werkt als een natuurlijk urine drijvend middel,
• helpt tegen kanker te beschermen.
Hypovitaminose
Symptomen bij een tekort aan vitamine B6 zijn bloedarmoede, zenuwziekte en huidproblemen.
Bij dieren resulteert een gebrek aan vitamine B6 in verminderde eetlust, trage groei, huidproblemen,
verstoord zicht, bloedarmoede, zenuwziekte, dalende reproductie en ascites.
Hypervitaminose
Langdurig gebruik van hoge dosissen kan leiden tot ernstige afwijkingen aan het zenuwstelsel.
Daarnaast kan lichtgevoeligheid of een verslechtering van de geheugen- en denkprocessen optreden.
Dosering en natuurlijke bronnen
De aanbevolen dagelijkse hoeveelheid van dit vitamine is 1,6 tot 2 mg. Gebruik dit vitamine niet
langdurig in hoge concentratie (25-50 mg). De maximale veilige dosis is 200 mg per dag.
Voedingstoffen rijk aan vitamine B6 zijn prei, witte kool, broccoli, aardappelen, bananen,
volkorenproducten, melk, eieren, peulvruchten, noten, vis en vlees.
3.11.3.2.6 Vitamine B11 (Foliumzuur)
Vitamine B11 is evenals alle vitamines uit het vitamine B-complex wateroplosbaar en wordt ook
foliumzuur genoemd.
229

Functie
Figuur 3.11.18 Structuurformule vitamine B11
• Chemische benaming: Vitamine B11, B9 of foliumzuur
• Molecuulformule: C19H19N7O6
• Molecuulmassa: 441,4 g/mol
Foliumzuur stimuleert de vorming van maagzuur en is belangrijk voor een goede leverwerking. Dit
vitamine is betrokken bij de stofwisseling van eiwitten en vetten, het is noodzakelijk bij de vorming van
rode bloedlichaampjes en het helpt bij de hersenstofwisseling. Verder is foliumzuur nodig voor de
stofwisseling van DNA en RNA. Dit vitamine is ook onmisbaar bij de celdelingprocessen van het
lichaam en ook daarom wordt aan vrouwen die zwanger zijn of worden aangeraden extra foliumzuur te
gebruiken. Foliumzuur kan in het lichaam worden omgevormd tot een co-enzym dat tetrahydrofolaat
(THF) wordt genoemd. Tijdens de stofwisseling werkt foliumzuur nauw samen met vitamine B12 (en
B6).
Vitamine B11:
• verbetert de melkafscheiding,
• kan helpen beschermen tegen kanker,
• verbetert de huid,
• is een natuurlijke pijnstiller,
• verbetert de eetlust,
• geeft baby's en kinderen weerstand tegen infecties,
• is nodig bij de productie van DNA en RNA (de erfelijkheidsmoleculen),
• helpt een open rug voorkomen.
Hypovitaminose
Symptomen bij een tekort aan vitamine B11 zijn een slap gevoel, lusteloosheid, vermoeidheid,
verminderde eetlust, slapeloosheid, prikkelbaarheid, dementie en een open ruggetje (foetus).
230

Bij dieren resulteert een gebrek aan vitamine B11 in vertraagde groei, verminderde eetlust, dermatitis,
depigmentatie, haarverlies, verlamming, anemie, diaree en vruchtbaarheidsproblemen.
Hypervitaminose
Geen nadelige effecten bekend door opname uit de voeding. De synthetische vorm is giftig in grote
hoeveelheden en kan ernstige neurologische problemen en slapeloosheid veroorzaken en de opname
van zink in het lichaam belemmeren.
Dosering en natuurlijke bronnen
De aanbevolen dagelijkse hoeveelheid van dit vitamine is 0,2-0,36 mg. Stevige drinkers, zwangere
vrouwen, oudere en mensen op een verlaagd vetdieet hebben kans op een tekort. De maximale
veilige dosis van foliumzuur is 1 mg per dag.
Belangrijke bronnen van vitamine B11 zijn onder andere bladgroenten, spruitjes, broccoli, eieren,
linzen, rijst, brood, tarwekiemen, lever, niertjes, bananen, sinaasappelen en perziken.
3.11.3.2.7 Vitamine B12 (Cobalamine)
Vitamine B12 is de enige wateroplosbare vitamine die in het lichaam wordt opgeslagen. Vitamine B12
maakt onderdeel uit van het vitamine B-complex en wordt ook cobalamine genoemd.
Cyanocobalamine is de synthetisch stabiele vorm die aan levensmiddelen en diervoeders wordt
toegevoegd.
Figuur 3.11.19 Structuurformule vitamine B12
231

Functie
• Chemische benaming: Vitamine B12 of cobalamine
• Molecuulformule: C63H88CoN14O14P
• Molecuulmassa: 1355,4 g/mol
Cobalamine zorgt samen met vitamine B6 (pyridoxine) en B11 (foliumzuur) voor de opname van ijzer
door het lichaam en het is betrokken bij de vorming van rode bloedcellen. Een tekort aan deze
vitamines kan leiden tot bloedarmoede. Deze drie vitamines zorgen ook voor een goede werking van
het zenuwstelsel en zijn betrokken bij het aminozuurmetabolisme.
Vitamine B12:
• noodzakelijk voor het in stand houden van het zenuwstelsel,
• verbetert geheugen en concentratie,
• nodig om vetten koolhydraten en eiwitten te kunnen gebruiken,
• geeft meer energie,
• bevordert gezonde groei bij kinderen,
• kan bescherming geven tegen kanker,
• beschermt tegen allergenen en giftige elementen.
Hypovitaminose
Symptomen bij een tekort aan vitamine B12 zijn pernicieuze anemie, menstruatieklachten, geestelijke
aftakeling en trillen.
Bij dieren kan een tekort aan vitamine B12 leiden tot verminderde groei, verminderd voedselopname,
dermatitis, prikkelbaarheid, ongecoördineerde bewegingen, anemie, verminderde eetlust, diaree,
verlaagde reproductie, enz. .
Hypervitaminose
Vitamine B12 wordt niet als giftig beschouwd.
Dosering en natuurlijke bronnen
De aanbevolen dagelijkse hoeveelheid van vitamine B12 is 0,001 mg (= 1 microgram). Doseringen
van 5-50 microgram zijn meestal voldoende. De maximale veilige dosis is 200 mg per dag.
Voedingsstoffen rijk aan vitamine B12 zijn uitsluitend dierlijke producten: eieren, kaas, kwark, melk, vis
en vlees.
Specifieke biochemische werking
Vitamine B12 kan in het lichaam worden omgezet in co-enzym B12, dat essentieel is voor 2 enzymen.
Ten eerste bij een enzym dat betrokken is bij het vetzuurmetabolisme, namelijk methylmalonyl-CoA
232

mutase. Dit enzym maakt mede de afbraak van vetzuren met een oneven aantal koolstofatomen
mogelijk. Ten tweede is co-enzym B12 nodig bij de biosynthese van het aminozuur methionine, en wel
bij het enzym homocysteine methyltransferase. Dit enzym zet een methylgroep aan homocysteine
waardoor methionine ontstaat.
3.11.3.2.8 Vitamine C (L-Ascorbinezuur)
Vitamine C is een wateroplosbaar vitamine en wordt ook ascorbinezuur genoemd.
Functie
Figuur 3.11.20 Formule vitamine C
Figuur 3.11.21 Formule dehydroascorbinezuur
• Chemische benaming: Vitamine C of L-Ascorbinezuur
• Molecuulformule: C6H8O6
• Molecuulmassa: 176,1 g/mol
Vitamine C is één van de belangrijkste vitaminen voor het immuunsysteem, het bevordert de activiteit
van de witte bloedlichaampjes en zorgt zo voor een betere weerstand tegen infecties en ziektes.
Daarnaast is het een sterke antioxidant (maakt vrije radicalen onschadelijk). Vitamine C is gericht op
groei en regeneratie en zorgt ook voor de afvoer van afbraakproducten. Vitamine C wordt snel
aangetast door zuurstof (bij warmte) en is één van de gevoeligste vitamines. Gebrek aan vitamine C is
mede de oorzaak van voorjaarsmoeheid.
Vitamine C:
• is een antioxidant,
• versnelt de genezing van wonden,
• houdt botten, tanden en bloedvaten gezond,
• werkt als een natuurlijk antihistaminicum,
• helpt bij de opname van ijzer,
• kan helpen om onvruchtbaarheid bij de man te bestrijden,
• vermindert de duur van verkoudheden en andere virussen.
233

Hypovitaminose
Symptomen bij een tekort aan vitamine C zijn scheurbuik, gevoel van slapte, verstoorde
wondgenezing, prikkelbaarheid, bloedend tandvlees, bloeduitstortingen en blauwe plekken, loszittende
tanden, gewrichtspijn, gebrek aan eetlust en hartklachten.
De meeste dieren maken zelf vitamine C aan. Een gebrek is zeer zeldzaam en leidt soms tot
scheurbuik bij jonge dieren en dieren onder stress.
Hypervitaminose
Teveel vitamine C kan nierstenen en jicht veroorzaken. Bij hoge dosissen hebben sommige mensen
last van diaree en maagkrampen, hoewel dit vitamine zelfs bij zeer hoge dosissen niet schadelijk
wordt geacht. Zeer grote dosissen vitamine C doen het cholesterolgehalte in het bloed stijgen,
waardoor de kans op hartziekten groter wordt.
Dosering en natuurlijke bronnen
De aanbevolen dagelijkse hoeveelheid vitamine C is 70 mg. Rokers hebben meer vitamine C nodig,
net als bij stress, antibioticagebruik, infecties, hoog alcoholgebruik of een blessure. De maximale
veilige dosis is vastgesteld op 1000 mg per dag.
L-Ascorbinezuur komt veel voor in citrusvruchten, groene bladgroenten, tomaten, asperges,
aubergines, prei, radijsjes, aardappelen, melk en lever.
3.11.3.2.9 Vitamine H (Biotine)
Hoewel biotine vitamine H wordt genoemd, behoort deze stof toch tot de B-familie en wordt ook wel
vitamine B8 genoemd. Biotine is een wateroplosbaar vitamine en maakt onderdeel uit van het vitamine
B-complex.
Figuur 3.11.22 Structuurformule vitamine H
• Chemische benaming: Vitamine H, B8 of d-Biotine
• Molecuulformule: C10H16N2O3S
• Molecuulmassa: 244,3 g/mol
234

Functie
Biotine speelt een belangrijke rol bij de opbouw en afbraak van koolhydraten en eiwitten. Het kan in
het lichaam worden omgezet in het co-enzym biocytine. Biotine helpt bij het vrijmaken van energie uit
de voeding en bij de vorming van antilichamen. Daarnaast is het belangrijk voor de vorming van
vetzuren en verantwoordelijk voor een goede conditie van de huid en de haren.
Vitamine H:
• voorkomt grijze haren,
• verlicht diverse vormen van spierpijn,
• helpt tegen eczeem, dermatitis en andere huidproblemen,
• helpt tegen kaalheid.
Hypovitaminose
Een tekort is zeldzaam, maar symptomen bij een tekort aan vitamine H zijn eczeem, vermoeidheid,
tongontsteking, spierpijn, bloedarmoede, depressie en verslechtering van de vetstofwisseling.
Een gebrek aan dit vitamine komt wel eens voor bij baby’s onder de vorm van dermatitis (ontstoken en
schilferige huid). In de darmen van volwassenen wordt biotine meestal in voldoende hoeveelheden
gemaakt door de darmbacteriën.
Bij dieren resulteert een tekort aan vitamine H in verminderde groei en eetlust, dermatitis,
depigmentatie en donker worden van de huid, haarverlies, verlamming en verlaagde reproductie.
Hypervitaminose
Er zijn geen schadelijke effecten bekend.
Dosering en natuurlijke bronnen
De aanbevolen dagelijkse hoeveelheid is vastgesteld op 0,03-0,15 mg (= 30-150 microgram)
De maximale veilige dosis is 300 mg per dag.
Belangrijke bronnen van biotine zijn onder andere eieren, melk, fruit, noten, sojabonen, biergist,
zilvervliesrijst, vlees en vis.
3.11.4 Technieken voor de analyse van vitamines
De matrices die hoofdzakelijk geanalyseerd worden op de afdeling vitaminen zijn diervoeders
(volledige diervoeders, aanvullende diervoeders en voormengsels), voedingssupplementen en
babyvoeding. Over het algemeen bestaat een analyseprocedure uit de volgende stappen: extractie,
opzuivering (indien nodig) en kwantificatie via HPLC of turbidimetrie.
235

De gekozen methode voor extractie is afhankelijk van het vereiste resultaat, de matrix, de natuurlijke
of synthetische vorm van de vitamines, interfererende bestanddelen, bestandheid tegen warmte en
extreme pH-waarden.
3.11.4.1 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
De vetoplosbare vitaminen A, D en E worden bepaald met behulp van reversed-phase HPLC na
extractie door alkalische hydrolyse (verzeping) en opzuivering over een kolom. Vitamine A, E en D
worden kwantitatief bepaald met behulp van HPLC en een UV-detector. Daarnaast worden vitamine
B1, B2, B6, C en K3 kwantitatief bepaald met behulp van HPLC en een fluorescentie-detector.
3.11.4.2 Microbiologie (Turbidimetrie)
Vitamine B3, B5, B11, B12 en H worden momenteel gekwantificeerd aan de hand van turbidimetrische
methoden. Hierbij wordt een specifieke stam van een testorganisme gebruikt waarvan de groei
bepaald wordt door de aanwezigheid van één bepaald vitamine. Een standaardreeks (met gekende
concentraties van de vitamine) en een reeks van het monsterextract wordt geënt met het specifieke
organisme en geïncubeerd totdat het organisme voldoende gegroeid is en het medium troebel wordt.
Door het meten van de turbiditeit (maat voor de troebelheid) met een spectrofotometer en de
monstercurve te vergelijken met de standaardcurve verkrijgt men een kwantitatief resultaat. Deze
methode is gevoelig genoeg om de natuurlijke voorkomende gehaltes van de B-vitamines waar te
nemen en meet meestal de totale vitamineactiviteit, dit in tegenstelling tot sommige HPLC-methodes.
3.11.4.3 Nieuwe ontwikkelingen
In de toekomst zullen de methoden aangepast worden aan de verschillende matrices en indien nodig
zal er voor bepaalde matrices een specifieke methode ontwikkeld worden. De microbiologische
methoden zullen op termijn zoveel mogelijk vervangen worden door HPLC-methoden of door een
snellere microbiologische methode in de vorm van commercieel beschikbare kits (met
microtiterplaten). Aparte methodes voor de analyse van 1 vitamine van het B-complex zullen
gecombineerd worden tot methodes waarbij meerdere B-vitamines tegelijk kunnen geanalyseerd
worden.
236

Tabel 3.11.1 : Overzichtstabel ‘Essentiële vitamines voor de mens’
Stof Synoniemen Eigenschappen Hypovitaminose
Vitamine A All-trans-retinol
Provitamine
A
Vitamine
D3
Vitamine
D2
Bèta-caroteen
Cholecalciferol
Ergocalciferol
Vitamine E Alfa-tocoferol
Vitamine K1
Vitamine K2
Vitamine K3
Fyllochinon
Menaquinone
Menadione
Vitamine B1 Thiamine
Verbetert zicht en weerstand, voorkomt
nachtblindheid en huidveroudering, rol in
celvernieuwingsproces, voor een gezonde huid,
tanden, tandvlees en haar
Antioxidant, zelfde eigenschappen als vitamine
A
Bevordert resorptie en afzetting van calcium,
vooral in beenderen en gebit. Beschermt tegen
osteoporose, versterkt immuunsysteem, zorgt
voor sterke tanden en botten
Antioxidant, beschermt celmembranen,
beschermt tegen zenuwaandoeningen en hart-
en vaatziekten, vermindert PMS, voor een
gezonde huid en haren
Voorkomt bloedingen, essentieel voor aanmaak
trombine en botopbouw, toegevoegd aan
babyvoeding
Co-enzym betrokken bij celstofwisseling,
behandeling van bloedarmoede, regulatie
diabetes, koolhydraten- en vetzurenafbraak
voor energie, essentieel voor het functioneren
van zenuwcellen en hart
Nachtblindheid, huid- en
haarproblemen
Idem vitamine A
Rachitis, pijn in de botten,
spierslapte en spierkramp,
osteoporose
Zelden: bloedarmoede,
oedeem
Problemen met
bloedstolling
Vermoeidheid, spierslapte,
geen eetlust,
prikkelbaarheid,
depressiviteit, slecht
geheugen, misselijkheid,
beriberi
Hypervitaminose
Zwangere
vrouwen
moeten opletten
Misselijkheid,
braken,
hoofdpijn,
depressiviteit,
hart en
nierziekten
/
/
/
Voorkomen ADH
Melk, boter, kaas, margarine,
eieren, lever, levertraan, vis,
appels, groene bladgroenten,
wortelen, maïs, abrikozen
Koolsoorten, donkergroene
bladgroenten, wortelen, oranje
en gele groenten en fruit
Vis(olie), levertraan, gist,
bladgroenten, vlees en
zuivelproducten
Plantaardige oliën, soja, bonen,
noten, volkorenproducten, eieren
en margarine, bladgroenten
(K1) Tomaten, tarwe, eieren,
lever, vis, bloemkool, broccoli,
boerenkool, spinazie, erwten,
volkorenproducten, raapzaadolie
en mager vlees
Vlees, brood, gist, erwten,
bonen, aardappelen en
melkproducten
237
0,8 mg
2-6 mg
0,005 mg
10 mg
0,08 mg
1,1-1,4
mg

Stof Synoniemen Eigenschappen Hypovitaminose
Vitamine B2 Riboflavine
Vitamine B3 Niacine, PP
Vitamine B5 Pantotheenzuur
Vitamine B6 Pyridoxine
Vitamine
B11
Foliumzuur
(Vitamine B9 of
M)
Co-enzym betrokken bij celstofwisseling
(koolhydraat-, eiwit- en vetafbraak), voor een
gezonde huid en haren, bescherming tegen
bloedarmoede
Onderdeel van co-enzym A betrokken bij de
citroenzuurcyclus, bevordert celademhaling en
werking zenuwstelsel, energieproductie,
cholesterol verlagend, antioxidant, verlaagt
bloeddruk, voorkomt migraine
Onderdeel van co-enzym A, metabolisme van
vetten en suikers, genezing van wonden,
energieproductie, vermindert stress, reguleert
weerstand, voorkomt vermoeidheid, verlaagt
cholesterol, tegen artritis, kaalheid en grijsheid
Betrokken bij celstofwisseling (eiwitten en
hormonen), opname van ijzer, vorming rode
bloedcellen, werking zenuwstelsel,
aminozuurmetabolisme, verhoogt weerstand,
regulatie suikerziekte, opname eiwitten en
vetten, tegen PMS en menopauze
Co-enzym betrokken bij stofwisseling, vorming
van maagzuur, werking van de lever, opname
eiwitten en vetten, vorming rode bloedcellen,
hersen- en DNA/RNA-metabolisme, en
celdelingprocessen (zwangerschap)
Gebarsten huid en
slijmvlies, rood worden
van tong, eczeem,
vermoeidheid
Dermatitis, diaree,
dementie, slapeloosheid,
pellagra
Braken, krampen,
vermoeidheid,
slapeloosheid,
verminderde weerstand,
buikpijn, cardiovasculaire
afwijkingen,
zenuwafwijkingen
Bloedarmoede,
zenuwziekte,
huidproblemen
Slap gevoel,
lusteloosheid,
vermoeidheid,
slapeloosheid,
prikkelbaarheid, dementie,
open ruggetje, anemie
Hypervitaminose
Enkel bij zeer
hoge dosissen:
jeuk en
brandend
gevoel
Bij hoge
dosissen:
depressiviteit,
huid-
problemen en
hoofdpijn
Bij hoge
dosissen:
diarree
Bij hoge
dosissen:
zenuwbeschadi
ging
Bij hoge
dosissen:
slapeloosheid,
slechte opname
van zink
Voorkomen ADH
Nier, eigeel, kaas, gist, melk,
kiemen, brood, bladgroenten en
vlees
Volkorengraan, ongeslepen rijst,
melk, kaas, vlees, vis en
cashewnoten, brood, groenten,
gist
Gist, volkorenproducten, stroop,
groene groenten, paddenstoelen,
vlees, orgaanvlees,
zilvervliesrijst, eieren en noten,
peulvruchten, melkproducten en
fruit
Groenten, aardappelen,
bananen, kaas, soja,
volkorenproducten, melk, eieren,
noten, vis en vlees
Bladgroenten, eieren, linzen,
rijst, brood, tarwekiemen, lever,
niertjes, bananen, sinaasappelen
en perziken
vlees, melk, gist
238
1,1-1,6
mg
15-18 mg
6 mg
1,6-2 mg
0,2-0,36
mg

Stof Synoniemen Eigenschappen Hypovitaminose
Vitamine
B12
Cobalamine
Vitamine C Ascorbinezuur
Vitamine H
Biotine
(Vitamine B8)
ADH = Aanbevolen Dagelijkse Hoeveelheid
mg = milligram
Co-enzym, opname van ijzer, DNA synthese,
vorming rode bloedcellen, werking
zenuwstelsel, aminozuurmetabolisme, verbetert
geheugen en concentratie, opname vetten en
koolhydraten, bevordert groei, bescherming
allergenen
Antioxidant, genezing van wonden, natuurlijk
antihistaminicum, gezonde tanden en
tandvlees, botten en geslachtsorganen,
vruchtbaarheid bij man, activiteit witte
bloedlichaampjes, tegen verkoudheid en
andere virussen
Co-enzym betrokken bij stofwisseling,
energieproductie, vorming antilichamen, voor
gezonde huid, haren en nagels, verlicht
spierpijn, tegen eczeem, dermatitis, kaalheid,
diabetes
Bloedarmoede,
menstruatieklachten,
geestelijke aftakeling,
trillen
Scheurbuik, slap gevoel,
prikkelbaarheid, bloedend
tandvlees,
bloeduitstortingen,
gewrichtspijn,
hartklachten,
verstoorde wondgenezing
Schilferige huid bij baby’s,
eczeem, vermoeidheid,
slechte vetstofwisseling,
spierpijn, bloedarmoede,
depressie
Hypervitaminose
/
Bij zeer hoge
dosissen:
Nierstenen,
jicht, diarree,
maagkrampen
/
Voorkomen ADH
Alleen dierlijke producten zoals
eieren, kaas, kwark, melk, vis en
vlees
Vruchten, groene bladgroenten,
aardappelen, melk en lever,
paprika en spruitjes
Eieren, melk, fruit, noten,
sojabonen, biergist, ongepelde
rijst, vlees en vis
239
0,001-
0,002 mg
70 mg
0,03- 0,15
mg

Tabel 3.11.2 Aanbevolen dagelijkse hoeveelheid per leeftijdscategorie
ADH
Kinderen Volwassenen Senioren
Vitamine a
Baby
(0-5 m)
A (µg) 450 b
Baby
(6-11 m)
Peuter
(1-4 j)
Kinderen
(5-12 j)
Tieners
(13-18 j)
Man
(19-50 j)
Vrouw
(19-50 j)
Vrouw
(zwanger)
Vrouw
(borstvoeding)
400 400 500-1000 800-1000 1000 800 1000 1250
240
51-70 j 70 j +
D (µg) 5-10 5-10 5-10 d
2,5-5,0 d
2,5-5 d 2,5 d 2,5 d 7,5-10 d 7,5 d -10 5-10 d
E (mg) 2,6 e
3,3 5 6,5-9,2 9,6-12,1 10,7-11,8 8,5-9 9 10,9 7,9-9,7 7,5-8,5
K (µg) 25 25 30 50 80 80 80 80 80 80 80
B1 (mg) 0,2 0,2 0,3 0,5-0,8 1,1 1,1 1,1 1,4 1,7 1,1 1,1
800-
1000
800-
1000
12,5-15 d
B2 (mg) 0,4 0,4 0,5 0,7-1,0 1,1-1,5 1,5 1,1 1,4 1,7 1,1-1,5 1,1-1,5
B3 (mg) 2 b
2 4 7-11 13-17 17 13 17 20 13-17 13-17
B5 (mg) 2 2 2 3-4 5 5 5 5 7 5 5
B6 (mg) 0,12-0,20 c
0,2 c
0,4 0,7-1,1 1,5 1,5 1,5 1,9 1,9 1,5-1,8 1,5-1,8
B11 (µg) 50 60 85 150-225 300 300 300 400 400 300 300
B12 (µg) 0,4 0,5 0,7 1,3-2,0 2,8 2,8 2,8 3,2 3,8 2,8 2,8
C (mg) 35 35 40 45-55 65-70 70 70 90 110 70 70
H (µg) 4 4 8 20 30 30 30 30 35 30 30
a
Eenheden weergegeven in milligram (mg) of microgram (µg)
b
Uitgaande van volledige borstvoeding
c
Bij volledige borstvoeding 0,12 mg/dag; bij flesvoeding (i.v.m. hogere eiwitgehalte) 0,20 mg/dag
d
Geldt voor mensen met een lichte huidskleur die dagelijks ten minste 15 minuten buiten zijn met in elk geval de handen en het gezicht onbedekt,
e Wanneer niet gevoed met borstvoeding

4 ANALYSETECHNIEKEN
4.1 Vloeistofchromatografie
4.1.1 Algemene principes
Chromatografie is een techniek om componenten in een mengsel van elkaar te scheiden. De techniek
is uitgegroeid tot een analytische methode om de verbindingen in een homogene vloeibare of gasfase
te identificeren en te kwantificeren. Het basisprincipe berust op de instelling van een concentratieevenwicht
van de componenten tussen 2 niet-mengbare fasen, waarvan één – de stationaire fase –
ingebed zit in een kolom of gefixeerd is op een drager en waarvan de tweede – de mobiele fase – zich
verplaatst in contact met de eerste. Iedere component verplaatst zich met een specifieke snelheid die
bepaald wordt door zijn oplosbaarheid in de mobiele fase en zijn affiniteit voor de stationaire fase die
deze wil vasthouden. Dit resulteert uiteindelijk in een scheiding van de componenten die aanwezig
waren in het mengsel.
De verschillende types chromatografie kunnen ingedeeld worden in verschillende groepen volgens de
aard van de gebruikte fasen of de mechanismen waarmee de componenten van elkaar gescheiden
worden.
4.1.2 Indeling op basis van de aard van de fase
De mobiele fase is een fluïdum, dit kan zowel een vloeistof als een gas of een superkritisch fluïdum
zijn.
De stationaire fase kan zowel een vaste stof als een vloeistof (geabsorbeerd op een vaste stof) zijn.
Een combinatie hiervan leidt tot meerdere mogelijkheden :
• Vloeistof-vast chromatografie (LSC)
• Vloeistof-vloeistof chromatografie (LLC)
• Gas-vast chromatografie (GSC of GC)
• Gas-vloeistof chromatografie (GLC of GC)
• Superkritische chromatografie (SFC)
Superkritische chromatografie (SFC) situeert zich tussen vloeistof- en gaschromatografie omdat
superkritische vloeistoffen eigenschappen bezitten tussen die van een vloeistof en die van een gas.
4.1.3 Indeling op basis van het chromatografisch principe
Deze indeling is afhankelijk van de aard en de structuur van de stationaire fase. Men maakt een
onderscheid tussen:
• Adsorptiechromatografie wanneer de stationaire fase vast is (LSC, GSC); dit kan uitgebreid
worden naar de affiniteitschromatografie indien de adsorptie-eigenschappen van de
stationaire fase specifiek zijn voor één of andere groep verbindingen.
241

• Verdelingschromatografie (LLC, GLC) wanneer de stationaire fase een vloeistof is die niet
mengbaar is met de mobiele fase (optreden van verdelingscoëfficiënten).
• Ionenuitwisselingschromatografie (IEC) waarbij de stationaire fase functionele zure of
basische groepen bevat om geïoniseerde componenten van elkaar te scheiden.
• Exclusiechromatografie waarbij de poreuze stationaire fase zich gedraagt als een zeef en
de componenten van elkaar scheidt op basis van hun grootte. Een andere benaming hiervoor
is gel-permeatiechromatografie (GPC).
4.1.4 Indeling op basis van de uitvoering
Op basis van de conditionering van de stationaire fase onderscheidt men :
• Kolomchromatografie,
• Papierchromatografie,
• Dunnelaagchromatografie.
Op basis van de migratiewijze van de mobiele fase onderscheidt men:
• Chromatografie met plaatselijke detectie (de bestanddelen van het monster blijven op de
stationaire fase),
• Elutiechromatografie (de componenten worden meegevoerd tot buiten de stationaire fase).
4.1.5 Indeling op basis van de fysico-chemische processen die tijdens de scheiding optreden
De fysico-chemische parameters verantwoordelijk voor de scheiding zijn :
• de polariteit en/of de hydrofobiciteit : polariteit bij normale fase (normal phase chromatografie)
of de hydrofobiciteit bij omgekeerde fase (reversed phase chromatografie),
• de elektrische lading: uitwisseling van ionen,
• de grootte en de vorm: exclusie of gelpermeatie,
• de aanwezigheid van specifieke structuren die een specifieke binding toelaten: affiniteitschromatografie.
4.1.6 Stationaire fasen bij HPLC
De componenten die oorspronkelijk in de mobiele fase (MF) opgelost zijn, zullen ook interacties
aangaan met het tweede medium : de stationaire fase (SF). Deze fase staat in contact met de mobiele
fase (MF) maar is hierin onoplosbaar. Voor elke verbinding in het mengsel grijpt er een specifieke
interactie plaats tussen de drie elementen MF, component en SF.
242

4.1.6.1 Silicagel
Silicagel is het basismateriaal van de tegenwoordig gebruikte vaste fasen. Het is een amorfe en rigide
vaste stof met als chemische formule SiO2•(H2O)n (waarbij n een waarde heeft dicht bij 0). Dit
basismateriaal, dat sterk verschilt van de natuurlijke silica (SiO2) die kan gebruikt worden als grondstof
voor de synthese ervan, wordt geproduceerd onder vorm van microsferische deeltjes met een vrij
constante diameter die kan variëren tussen 2 à 5 µm. De diameter moet gelijk zijn voor alle partikels
en moet een compacte vulling van de kolommen verzekeren om te vermijden dat er preferentiële
vloeistofstromen gecreëerd worden
Deze microsferische deeltjes worden verkregen door agglutinatie van micropartikels (een ‘sol-gel’) in
aanwezigheid van een organisch bindmiddel (ureum/formol). Deze micropartikels worden op hun beurt
verkregen door polymerisatie van tetra-ethoxysilaan, gevolgd door een gecontroleerde basische
hydrolyse. Tot slot wordt hierop een pyrolyse uitgevoerd die leidt tot de vorming van microsfeertjes
van silicagel die gebruikt worden voor de pakking van de kolommen (zie Figuur 2.1.1).
Silicagel is een zeer polair materiaal dat bestaat uit een driedimensioneel netwerk. Het heeft niet de
geordende structuur van kristallijn silica, maar is ook opgebouwd op basis van de tetraëdrische
structuur van de vier bindingen van het siliciumatoom. Het is een anorganisch polymeer dat een
variabel aantal silanolgroepen bevat die overgebleven zijn na de verhittingsfase.
Figuur 2.1.1
Opmerking : Silicagel is stabiel binnen een uitgebreid pH-gebied, maar verdraagt geen al te extreme
pH-condities. Er bestaat een gevaar tot oplossing bij te zure of te basische pH-waarden; men beperkt
het pH-werkgebied daarom tot 2 < pH < 12.
Onderstaande Figuur 2.1.2 toont een vergroting van een microsferisch deeltje en daarbij kan men
vaststellen dat de korrels in werkelijkheid heterogeen en onregelmatig zijn met openingen (poriën).
Deze poriën spelen een belangrijke rol want het zijn de plaatsen waar de adsorptie bij voorkeur
optreedt.
243

Figuur 2.1.2
Het oppervlak van de microsferische silicageldeeltjes bestaat uit silanolgroepen Si-OH (zie Figuur
2.1.3). Deze zijn verantwoordelijk voor het optreden van de adsorptie omdat ze de vorming van
waterstofbindingen toelaten en aldus verantwoordelijk zijn voor de polariteit en de zure eigenschappen
van de silicagel. Wanneer deze silanolgroepen in overmaat aanwezig zijn, veroorzaken zij té
uitgesproken adsorpties; hun aantal dient dan ook zorgvuldig onder controle gehouden te worden.
De figuren in de cursus dienen enkel als informatie.
4.1.6.2 Gemodificeerde silicagel
Figuur 2.1.3
Ondanks zijn hoge adsorptiecapaciteit wordt silicagel minder en minder als dusdanig gebruikt voor de
uitvoering van analyses. De eigenschappen ervan veranderen in de loop van de tijd, wat resulteert in
een slechte reproduceerbaarheid van de scheidingen; daarom wordt voor veel toepassingen de
silicagel gedeeltelijk gerehydrateerd (3-8 % water) om deze te desactiveren.
Om deze overmatige polariteit te verminderen, bindt men organische moleculen covalent op de
silanolgroepen. De gemodificeerde silicagel krijgt daardoor meer vloeistofeigenschappen, waardoor
de scheiding niet meer bepaald wordt door de adsorptiecoëfficienten (vast – vloeistof), maar door de
verdelingscoëfficienten (vloeistof – vloeistof). Deze gemodificeerde fasen, waarvan de polariteit
gemakkelijk kan aangepast worden, liggen aan de basis van de reversed phase chromatografie. Het
244

schema hieronder illustreert het verschil tussen adsorptie en verdeling : adsorptie is een
oppervlakteverschijnsel in tegenstelling tot absorptie. Als men bijvoorbeeld op het oppervlak van de
silicagel een enkele laag van een koolwaterstof bindt, dan zullen moleculen met zowel een lipofiel als
een hydrofiel gedeelte zich aan dat oppervlak oriënteren (met de lipofiele zijde naar de silicagel toe).
Adsorptie treedt op wanneer een verbinding zich ophoopt aan de interface tussen 2 fasen (gas-vast,
gas-vloeistof, vloeistof-vast, vloeistof-vloeistof, vast-vloeistof).
Bij reversed phase chromatografie worden de sterk polaire silanolgroepen geëlimineerd wegens hun
grote affiniteit voor de opgeloste polaire componenten die daardoor vertraagd worden.
Om dit probleem op te lossen gebruikt men het procédé van “end-capping” waarbij de gemodificeerde
fase behandeld wordt met een silaanverbinding waarop methylgroepen gebonden zijn. De polariteit
van de gel wordt op die manier aanzienlijk verminderd (zie Figuur 2.1.4) :
Figuur 2.1.4
De kwaliteit van een silicagel voor chromatografische doeleinden hangt af van meerdere parameters
zoals de interne structuur, de grootte van de partikels, de porositeit (afmetingen en verdeling van de
poriën), het specifiek oppervlak, de weerstand tegen mechanische beschadiging en de polariteit.
De huidige gels voor HPLC hebben volgende specificaties : diameter van 2 to 5 µm met 5
silanolgroepen/µm²; specifiek oppervlak variërend van 4 tot 350 m²/g afhankelijk of het een al dan niet
poreuze silicagel betreft en met poriën van 10 nm.
245

4.1.6.3 Verdelingschromatografie
Figuur 2.1.5
Deze variant is gebaseerd op het verschil in oplosbaarheid van een component in twee vloeistoffen
die onderling niet mengbaar zijn; het betreft hier een verdelingsevenwicht.
Vroeger waren de stationaire fases samengesteld uit een poreuze vaste stof die doordrenkt was met
een vloeistof. Alhoewel deze techniek nog steeds wordt gebruikt in de gaschromatografie, is men
hiervan afgestapt voor de vloeistofchromatografie. De oorzaak hiervan is het uitlogen door het eluent
van de vloeistof waarin de vaste stof is gedrenkt is.
Tegenwoordig is het de silicagel waaraan men met covalente bindingen een chemische functie
koppelt. Deze gekoppelde functie gedraagt zich als een gefixeerde vloeistof op de vaste stationaire
fase.
Er worden twee types van verdelingschromatografie onderscheiden op basis van de polariteit van de
mobiele en de stationaire fase.
4.1.6.3.1 Normale fase chromatografie
Hierbij is de stationaire fase sterk polair terwijl de mobiele fase (organische solventen) weinig polair is.
Weinig polaire componenten hebben hier een grotere affiniteit voor de mobiele fase en zullen dus snel
geëlueerd worden. Omgekeerd zullen polaire componenten een grotere affiniteit hebben voor de
stationaire fase en daardoor traag geëlueerd worden. De opgeloste stoffen worden dus geëlueerd
volgens hun polariteit met de minst polaire eerst.
246

Modificaties bij normale fase:
Stationaire fasen van zuivere silicagel worden minder toegepast wegens enkele ongunstige
eigenschappen :
• ze zijn gevoelig voor vocht : water in de kolom moet ten allen prijze vermeden worden,
• tendens tot ‘tailing’ (asymmetrische pieken met een staart) wat tot een verkeerde interpretatie
van de piek kan leiden,
• tendens tot ‘bleeding’ waarbij de stationaire fase loskomt van de kolom,
• gradiëntelutie is niet mogelijk.
Wegens deze ongunstige kenmerken geeft men de voorkeur aan modificaties van silicagel met polaire
functies :
• Amine : NH2
• Nitrile :CN
• Diol : CH2-CHOH-CH2OH
4.1.6.3.2 Reversed phase chromatografie
De stationaire fase is hierbij weinig polair of is apolair terwijl de mobiele fase meestal polair is
(waterige en organische oplosmiddelen). De polaire verbindingen hebben dan een grotere affiniteit
voor de mobiele fase en worden dan ook snel geëlueerd. Omgekeerd zullen weinig polaire
verbindingen een grotere affiniteit vertonen voor de stationaire fase en zullen traag geëlueerd worden.
De opgeloste verbindingen worden dus geëlueerd volgens hun polariteit : de meest polaire eerst.
Modificaties bij reversed phase chromatografie betreffen apolaire functionele groepen:
• Dimethylsilyl : C2
• Octylsilyl : C8
• Octadecylsilyl : C18
• Fenylsilyl : cyclische C6
4.1.6.3.3 Synthese van gemodificeerde silicagel
Men onderscheidt twee soorten synthese die leiden tot de vorming van een monomeer of polymeer
gemodificeerd oppervlak (zie figuur hieronder) :
• monomere fasen (10 – 15 µm dik) : men laat een monochlorosilaan van het type ClSiMe2R
(methylchlorosilaan) reageren met de silanols aan het oppervlak.
247

• polymere fasen (25 µm dik) : men gebruikt hierbij een di- of trichlorosilaan (Cl2SiMeR) in
aanwezigheid van waterdamp, wat leidt tot een vernette polymerisatie waarin de
oorspronkelijke silanolgroepen gedeeltelijk met elkaar verbonden zijn.
Men krijgt aldus na modificatie van de bereikbare silanolgroepen 4 tot 5% koolstof in de silicagel, wat
overeenkomt met een modificatie van 40 tot 50% van het volledige oppervlak.
De zijketen R stelt de aangebrachte modificatie voor : NH2, CN, CH2CHOHCH, OH, CH3 bij normale
fase en C8H17, C8H37, C6H5 bij reversed phase.
Figuur 2.1.6 : Vorming van gemodificeerde organosilaanverbindingen bij silicagel. Voorstelling van
enkele monomere of polymere groepen aan het oppervlak. De koppeling Si-O-Si-C is meer stabiel dan
Si-O-C. Men krijgt een koolstofgehalte van 4 tot 5% na modificatie van de bereikbare silanolgroepen.
4.1.6.3.4 Mechanisme van de vloeistof - vloeistofverdeling
De gemodificeerde fasen zijn geen echte vloeistoffen omdat de monomere of polymere laag zeer dun
is en eerder kan vergeleken worden met een vloeistoffilm. Bij de verdeling tussen de vaste fase en de
vloeibare fase speelt de adsorptie van de opgeloste stoffen en van het organische solvent op de
monomoleculaire laag een rol.
Ter herinnering : bij reversed phase chromatografie worden als mobiele fase een organisch solvent
(meestal methanol of acetonitrile) en water gebruikt. Het minst polaire organische solvent vertoont een
affiniteit voor de gemodificeerde fase die apolair is. De opgeloste verbindingen die gescheiden moeten
worden zijn in principe apolair en vertonen affiniteit voor de apolaire modificatie. Het organische
solvent S en de opgeloste verbindingen V zullen dus beide geadsorbeerd worden aan het oppervlak
van de stationaire fase. Er zal zich dus een verdelingsevenwicht instellen tussen de geadsorbeerde
componenten en de componenten die zich vrij in de mobiele fase bevinden :
248

Mgeadsorbeerd + Vmobiel = Mmobiel + Vgeadsorbeerd (zie Figuur 2.1.7)
Figuur 2.1.7
Er stellen zich een reeks opeenvolgende evenwichten in tussen de adsorberende vloeistoflaag en de
mobiele fase. De meest polaire verbindingen, die een grotere affiniteit hebben voor de mobiele fase,
zullen sneller elueren dan de meer apolaire verbindingen met een grotere affiniteit voor de stationaire
fase.
4.1.6.3.5 Hydrofobe interacties
De opgeloste stoffen hebben meestal een hydrofiele en een hydrofobe kant. De hydrofobe zijde zal
zich naar de stationaire fase richten (bij reversed phase) en de hydrofiele zijde naar de polaire
(waterige) mobiele fase. In werkelijkheid zal de opgeloste verbinding wegens de afstoting van de
hydrofobe zijde door de polaire mobiele fase gedwongen worden om min of meer diep in de
adsorptielaag te dringen, wat de retentietijd van die verbinding zal vergroten (zie figuur). De vorm van
het hydrofobe gedeelte speelt ook een rol: hoe groter het hydrofobe oppervlak van de molecule is, des
te meer zal deze opgehouden worden en des te langer zal de retentietijd zijn.
Figuur 2.1.8
4.1.6.3.6 Invloed van het gehalte aan organisch solvent in de mobiele fase
Naarmate de oppervlaktespanning van het eluens groter is, zal de retentietijd van een verbinding
toenemen.
Omdat water een van de solventen is met de grootste oppervlaktespanning, zullen de componenten
op de stationaire fase meer vertraagd worden naarmate het watergehalte in de mobiele fase groter is.
249

Daaruit volgt dat men, om de analysetijd te verkleinen, het aandeel organisch solvent kan verhogen;
dit gaat echter vaak ten koste van de resolutie van de analyse.
4.1.6.3.7 Invloed van het gehalte aan organisch solvent in de mobiele fase
De polariteit van de componenten speelt eveneens een belangrijke rol in de chromatografie. Het is
dan ook belangrijk om de organische groepen te rangschikken volgens hun polariteit (hier in volgorde
van toenemende polariteit) :
Alkyl < fluoro < chloro < nitro < aldehyde < acetyl < hydroxyl < keton < amine < carboxyl < amide
R < F < Cl < NO2 < CHO < O-CO-CH3 < OH < CO-R < NH2 < COOH < CO-NH2
Bij de alkylgroepen is de polariteit afhankelijk van de ketenlengte; bij cyclische is de polariteit
afhankelijk van het oppervlak : naarmate de lengte of het oppervlak groter is zal de polariteit lager zijn
(hydrofobe interactive).
Wanneer een verbinding meerdere groepen bezit is het de meest polaire groep die in beschouwing
moet genomen worden.
4.1.6.3.8 Vereenvoudigde theorie van de verdelingschromatografie
De retentiefactor k
We beschouwen een opgeloste stof A die in een evenwichtstoestand verkeert tussen de mobiele (m)
en de stationaire (s) fase :
A(m) A(s)
Als de polariteit van de mobiele fase verandert, dan heeft dit een direct effect op de verdelingscoëfficiënt
K = (CS/CM) die de verdeling hierboven bepaalt. In de formule is CS de concentratie aan de
opgeloste stof in de stationaire fase en CM de concentratie in de mobiele fase.
De verdelingscoëfficiënt K (ook constante van Nernst genoemd) is de fysico-chemische basisparameter
van de chromatografie en bepaalt de concentratieverhouding van elke component tussen
de twee fasen. Voor een opgeloste stof is K alleen afhankelijk van de temperatuur en is dus
onafhankelijk van het vloeistofdebiet of de lengte van de kolom. Deze factor bepaalt de mogelijkheid
van de kolom om een component te vertragen.
In de chromatografie gebruikt men meestal de parameter k, de retentiefactor, die aan K gerelateerd is
als
k = K*VS/VM
VS is het volume aan stationaire fase in de kolom en VM is het dode volume van de kolom, het volume
dat de mobiele fase inneemt tijdens het gebruik.
De porositeit van een kolom wordt gedefinieerd als p = VM/VS.
250

Figuur 2.1.9
Uit deze relaties leidt men af dat, naarmate een component meer affiniteit heeft voor de stationaire
fase, K en k groter zullen zijn en de component meer zal vertraagd worden en dus een grotere
retentietijd zal hebben.
Analoog zullen, naarmate een component een grotere affiniteit vertoont voor de mobiele fase, k en K
kleiner zijn en zal de component minder vertraagd worden zodat de retentietijd ervan kleiner wordt.
Bij reversed phase is het solvent polair en waterig :
• polaire en/of weinig hydrofobe componenten zullen snel elueren,
• apolaire en/of zeer hydrofobe componenten zullen traag elueren.
Daardoor kan men, om de retentietijd van de componenten te veranderen en om de scheiding te
optimaliseren, spelen met het gehalte aan organisch solvent in de mobiele fase.
Men observeert vaak een lineair verband tussen de logaritme van de retentiefactoren k en het
logaritme van het gehalte aan organisch solvent X :
log(k) = a* log(X) + b (de vergelijking van Everett)
Een toename van het gehalte aan organisch solvent X (= minder polair dan water) laat vaak toe om de
retentietijden te verminderen en dus de analyseduur in te korten. Nochtans zullen in een dergelijk
geval de verbindingen minder goed gescheiden worden omdat de waarden van k van de verschillende
componenten dichter bij elkaar komen te liggen. Vaak ziet men ook een omkering van de volgorde
waarin de componenten de kolom verlaten, wat voorgesteld wordt door het snijden van de twee lijnen
voor de componenten A en B in Figuur 2.1.10.
251

Figuur 2.1.10
De scheidingsfactor (selectiviteit) van twee componenten in oplossing
Men definieert de selectiviteit van een scheiding α als de verhouding k2/k1 van de retentiefactoren van
de twee componenten. Hoe groter α, hoe beter de scheiding. De scheidingsfactor α duidt de relatieve
posities aan van de twee naast elkaar gelegen pieken 1 en 2 (zie Figuur 2.1.11). Per definitie kan α
niet kleiner zijn dan 1.
Als we weten dat tR, de retentietijd van een component, gelijk is aan tR = tM + tS, dan kan de waarde
van k afgeleid worden uit het chromatogram (tS = t’R). Hierbij is tM de retentietijd van een component
die niet vertraagd wordt in de kolom.
t
k =
t
'
R
M
'
R(
2)
'
R(
1)
t
=
R
− t
t
M
M
t
k
α = of α =
t
k
Figuur 2.1.11
2
1
252

De resolutiefactor van twee pieken
Om een meer of minder goede scheiding van twee componenten numeriek te kunnen uitdrukken,
gebruikt men de resolutiefactor R die berekend wordt op basis van het onderstaande chromatogram
(Figuur 2.1.12).
Figuur 2.1.12
t R(
2)
− t R
R = 2
w + w
met:
− tR de retentietijd van de respectievelijke componenten, uitgedrukt in seconden,
− W de piekbreedte op halve hoogte van de overeenkomstige component, uitgedrukt in
seconden.
Onderstaande formule toont de invloed op de resolutie van de efficiëntie, van de capaciteitsfactor en
van de selectiviteitsfactor :
R =
1
( 1)
N ⎛α −1⎞
⎛ k ⎞ 2
* ⎜ ⎟*
⎜
⎟
4 ⎝ α ⎠ ⎝1+
k2
⎠
met:
− N het theoretisch plaatgetal dat een maat is voor de efficiëntie van de kolom; hoe meer platen,
hoe beter de scheiding (zie volgende paragraaf),
− α de selectiviteitsfactor die afhankelijk is van de sterkte van de gebruikte solventen en van de
temperatuur waarbij de scheiding plaats vindt,
2
253

− k de capaciteitsfactor die de doorstroomsnelheid van de componenten in de kolom beschrijft
en die ook afhankelijk is van de sterkte van de gebruikte solventen
Onderstaande Figuur 2.1.13 toont het effect van een verandering van R tussen 2 aangrenzende
pieken. Vanaf R = 1,5 beschouwt men de pieken als gescheiden.
De efficiëntie N van een kolom
Figuur 2.1.13
Men definieert de efficiëntie N van een kolom aan de hand van het aantal platen. Het plaatgetal N kan
berekend worden aan de hand van de volgende formule:
⎛ t
= 5,
54
⎜
⎝W1
N R
De efficiëntie van een kolom hangt af van drie factoren :
• de vorm: hoe langer de kolom en/of hoe groter de interne diameter, hoe efficiënter de kolom.
• de vulling: hoe kleiner de silicagel-deeltjes van de stationaire fase, hoe efficiënter de kolom.
• de flow van het eluent : er bestaat een optimale flow waarbij de efficiëntie van de kolom het
grootste is (de Van Deemtervergelijking).
Uitgaande van het plaatgetal N en de lengte van de analytische kolom L, wordt de HETP (Hoogte
Equivalent van een Theoretisch Plaat, ook kortweg H) berekend :
H =
H wordt bepaald door 3 termen die piekverbreding veroorzaken:
µ
µ C
B
H = A + + (de Van Deemtervergelijking)
met
− A de Eddy Diffusie : de pakking (stationaire fase) in de analytische kolom kan de afgelegde
weg van de componenten verlengen en preferentiële wegen veroorzaken waardoor de pieken
breder worden dan gewenst,
L
N
/ 2
⎞
⎟
⎠
2
254

− B de Longitudinale Diffusie : verbreding van de pieken doordat de componenten in de
analytische kolom niet enkel met de stroomrichting van de mobiele fase mee bewegen,
− C de Massatransfert : in de kolom treedt er een weerstand op tegen de overgang van de
componenten tussen de twee fasen; deze evenwichtsinstelling heeft tijd nodig.
Omdat de bewegende mobiele fase de instelling van het evenwicht stoort kan er
piekverbreding optreden. Bij gebruik van kleinere deeltjes wordt het evenwicht sneller bereikt
en is er minder massatransfert waardoor men smallere pieken krijgt.
− µ de flow of stroomsnelheid van de mobiele fase
Als deze 3 termen worden uitgezet in een grafiek, kan hieruit de optimale flow bepaald worden waarbij
het plaatgetal N het grootste is.
Toch is het belangrijk te weten dat er niet altijd met een optimale flow moet worden gewerkt. Soms
kan men sneller werken met een hogere flow terwijl men nog steeds een goede scheiding van het
mengsel krijgt.
H
4.1.6.3.9 Extra piekverbreding
Dit wordt veroorzaakt door:
Figuur 2.1.14
• het staalvolume : bij injectie van teveel staal kan er geen goede scheiding optreden in de
kolom en zullen de pieken te breed zijn op het chromatogram.
µ
255

• een slechte koppeling tussen het uiteinde van de kolom en de ingang van de detector. Als de
leiding tussen de kolom en de detector te lang is of een te grote diameter heeft, bestaat de
kans dat de pieken die in de kolom werden gescheiden, weer zullen samenvloeien en men
dus bredere pieken zal detecteren.
• het detectievolume : Men kan de detectorcel groter maken met de bedoeling de gevoeligheid
te vergroten. Nadeel is dat hierdoor de resolutie kan verkleinen door verbreden van de pieken.
• de reactietijd van de detector : de snelheid waarmee de detector datapunten meet, ligt soms
te laag om 2 pieken van elkaar te onderscheiden, waardoor men zou denken dat er maar 1
piek is.
4.1.7 Keuze van de HPLC-methode
Buiten de klassieke chromatografie met normale fase of met reversed phase worden er soms ook nog
andere technieken toegepast, zoals :
4.1.7.1 Ionenparenchromatografie (ion pair chromatography)
Deze techniek heeft als voordeel om een betere scheiding te geven bij ionen of zeer polaire
componenten met een zwakke affiniteit voor de (apolaire) stationaire fase.
In de praktijk voegt men aan de mobiele fase een verbinding toe die enerzijds een weinig polaire
koolstofketen bevat en anderzijds een groep met een lading die tegengesteld is aan deze van de te
scheiden component. Daardoor ontstaat een ionenpaar dat in zijn geheel een neutrale lading heeft,
vrij stabiel is en interactie zal aangaan met de stationaire fase. Het is op die manier zelfs mogelijk om
anorganische kationen en anionen te scheiden op een klassieke reversed phase kolom.
• scheiding van zure componenten : hierbij wordt een tegenion gebruikt met een hydrofobe
keten en een basische functionele groep (vb. triethylamine). De mobiele fase heeft een pH 7-8
wat toelaat dat zowel het tegenion als de zure component geïoniseerd zijn.
• scheiding van basische componenten : hierbij wordt een tegenion gebruikt met een hydrofobe
keten en een zure functionele groep (vb. hexaansulfonaat). De mobiele fase heeft een pH van
3 – 4 wat toelaat dat zowel het tegenion als de basische component geïoniseerd zijn.
Figuur 2.1.15
256

Een praktisch voorbeeld is de bepaling van histamine op een klassieke C18-kolom waarbij de
histaminemolecule (basisch) gekoppeld wordt aan een tegenion met een zure groep (oktaansulfonaat)
waardoor een langdurige, moeilijke en delicate derivatisatiestap vermeden wordt.
4.1.7.2 Ionenuitwisselingschromatografie
Toepassing: het scheiden van mengsels van ionen waaronder ook anorganische ionen.
Stationaire fase: heeft aan het oppervlak ionaire functionele groepen die interacties aangaan met de
analytionen met een tegengestelde lading.
Mobiele fase: een waterige oplossing die het tegenion bevat; soms worden ook buffers gebruikt.
Deze techniek wordt verder besproken in het deel ionenchromatografie.
4.1.7.3 Exclusiechromatografie (Size exclusion chromatography)
Dit type chromatografie staat ook bekend als gelfiltratie (bij een waterige mobiele fase) of
gelpermeatie (bij een organische mobiele fase).
Deze techniek maakt het mogelijk om moleculen te scheiden op basis van hun vorm en grootte.
Daarvoor worden poreuze gelgranules gebruikt als pakkingsmateriaal.
Bij de analyse kunnen de grote moleculen waarvan de diameter groter is dan die van de poriën, niet in
de poriën dringen en worden dus met de mobiele fase als eerste geëlueerd. De middelgrote en kleine
moleculen elueren later want doordat ze wel in de poriën van de gel kunnen dringen, worden ze
afgeremd.
De opgeloste componenten elueren dus in omgekeerde volgorde van hun massa zoals voorgesteld in
Figuur 2.1.16.
Figuur 2.1.16 : het principe van gelpermeatie.
Stap 1 : Opbrengen van een mengsel van twee componenten (een grote en een kleine) op een kolom
gepakt met een gel.
Stap 2 : De kleine moleculen kunnen in de granules van de gel binnendringen omdat hun diameter
kleiner is dan de poriën van de gel. De grote moleculen kunnen dit niet wegens hun afmetingen : ze
worden buitengesloten (excluded – exclusion, vandaar de naam) uit de gel.
Stap 3 : De grote moleculen moeten daardoor een veel korter traject doorlopen om de kolom te
verlaten : ze worden als eerste geëlueerd.
257

Stap 4 : De kleine moleculen worden later geëlueerd omdat ze, wegens hun verblijf in de granules,
een langer traject moeten doorlopen om de kolom te verlaten.
Resultaat in het chromatogram (Figuur 2.1.17).
Figuur 2.1.17
Deze methode wordt toegepast voor de scheiding van componenten met een hoge moleculaire massa
of polymeren zoals epoxiden, polystyrenen, siliconen, PVC of lipiden (met gelpermeatie), of peptiden,
proteïnen, enzymen, nucleïnezuren, oligo- en polysacchariden (met gelfiltratie).
Stationaire fase : mag niet reageren met de mobiele fase, er worden cross-linked gels gebruikt met
een bepaalde poriëngrootte. Bij gelfiltratie is de drager hydrofiel, bij gelpermeatie is de drager
hydrofoob.
Mobiele fase : mag niet reageren met de stationaire fase; voor gelfiltratie worden waterige oplossingen
gebruikt, voor gelpermeatie worden organische oplossingen gebruikt.
Deze techniek wordt vaak gebruikt voor het bepalen van de gemiddelde moleculaire massa van
polymeren, voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van biologische moleculen en als
scheidingsmethode voor kleine moleculen.
Gelpermeatie wordt bijvoorbeeld toegepast om de componenten in vet te scheiden in vetzuren,
diglyceriden, triglyceriden en polymeren van triglyceriden om het gehalte aan gepolymeriseerde
triglyceriden in vet en olie te bepalen. De stationaire fase is een styreen-divinylbenzeengel en de
mobiele fase is zuivere THF.
4.1.7.4 Hydrofobe interactiechromatografie
Met deze techniek kan de scheiding van biomoleculen zoals wateroplosbare eiwitten, verbeterd
worden.
258

In een eerste stap wordt het te scheiden eiwit gefixeerd op een chromatografische drager in
aanwezigheid van een hoge zoutconcentratie :
• in een milieu met hoge ionensterkte worden de watermoleculen van de hydratatiemantel van
de eiwitten gemobiliseerd om de anionen en kationen van het zout te hydrateren. Dit staat ook
bekend als uitzouten of ‘salting out’.
• als gevolg daarvan treedt er een wijziging op in de organisatie van de watermoleculen rond de
eiwitten en deze verandering is thermodynamisch gunstig voor het vormen van hydrofobe
bindingen tussen de hydrofobe domeinen aan het oppervlak van de eiwitten en de hydrofobe
groepen op de stationaire fase.
In een tweede stap wordt eerst de gel gespoeld om de niet-geadsorbeerde eiwitten te verwijderen
waarna de gefixeerde eiwitten worden geëlueerd :
• men elueert eerst met een buffer met afnemende ionensterkte waardoor de ionen van het zout
geleidelijk verwijderd worden,
• de geladen of polaire aminozuren aan het oppervlak van de eiwitten kunnen opnieuw
waterstofverbindingen aangaan met de mobiele fase, m.a.w. de oplosbaarheid van de eiwitten
in de mobiele fase wordt maximaal waarbij ze geëlueerd worden.
Het gevolg is dat de moleculen geëlueerd worden in afnemende volgorde van hun hydrofiel karakter.
Figuur 2.1.18
Toepassing : voor het scheiden van eiwitten en peptiden zonder denaturatie,
Stationaire fase: reversed phase kolommen met een klein aantal C-atomen, korte groepen gebonden
op silica,
Mobiele fase: zuiver water met zouten.
259

4.1.8 Instrumentele aspecten
4.1.8.1 Solventen
Figuur 2.1.19 : Algemeen schema van een vloeistofchromatorgaaf.
De keuze van het solvent is zeer belangrijk bij HPLC omdat er zeer veel vloeistof door het systeem
wordt gepompt. Solventen moeten zeer zuiver zijn en bestaan in verschillende gradaties naargelang
de toepassing. Vaak wordt het loopmiddel nog eens extra gefiltreerd voor gebruik.
Om te voorkomen dat eventuele kleine deeltjes worden opgezogen in het systeem, wordt op de
ingang van de kolom meestal een filter aangebracht.
Een HPLC – toestel kan uitgerust zijn met een ontgasser. Toch wordt aangeraden om zowel voor
toestellen met als zonder ontgasser, het loopmiddel toch nog te ontgassen voor gebruik. Dit kan door
het loopmiddel in een ultrasoonbad te plaatsen, door helium door de oplossing te laten borrelen of
door vacuüm te zuigen. Gasbellen moeten vermeden worden omdat die zorgen voor ruis in de
detector.
Bij de keuze van het solvent moet men ook rekening houden met het absorbtiespectrum van elk
solvent. De UV-cutoff (terug te vinden op de solventfles) moet zo laag mogelijk zijn om zo weinig
mogelijk extra storing te geven. De UV-cutoff waarde van acetonitrile en water is 190 nm, terwijl ze
210 nm bedraagt voor methanol, wat soms dicht bij de absorbtiepiek van de gezochte componenten
kan liggen.
4.1.8.2 Pompen
De pomp van een HPLC-toestel bestaat meestal uit een pistonpomp met een klein cilindrisch reservoir
dat zich vult met het loopmiddel wanneer de piston naar achteren beweegt en, wanneer de piston
naar voren beweegt, het loopmiddel in het systeem injecteert. Terugvloeiing van de vloeistof is niet
mogelijk omdat de in- en uitgang van de pomp worden afgesloten door een klep.
Om een gelijkmatige flow te krijgen, wordt er gebruik gemaakt van een dubbele pistonpomp, waarvan
het volume van de ene pomp het dubbele is van de andere (zie Figuur 2.1.20).
260

Figuur 2.1.20 : werking van een pistonpomp
Als het solventreservoir op het systeem is aangesloten, zal men met de pomp ‘primen’. Dit betekent
dat vloeistof van elk reservoir afzonderlijk opgepompt wordt maar dat het solvent niet door de kolom
gestuurd wordt; het doel is om zo veel mogelijk lucht uit de leidingen te laten. Men kan ook ‘purgeren’
waarbij de vloeistoffen in de verhouding van het loopmiddel door de leidingen gepompt worden maar
niet door de kolom.
‘Primen’ laat toe om gemakkelijk van solventsamenstelling te veranderen.
Wanneer de lucht zoveel mogelijk uit de leidingen verwijderd is, mag het loopmiddel door de kolom
gestuurd worden. Meestal zijn 15 minuten voldoende om het evenwicht te bereiken, tenzij er bufferoplossingen
worden gebruikt. Die hebben vaak meer dan 30 minuten nodig om te stabiliseren. Op een
chromatogram is duidelijk zichtbaar dat een kolom nog niet lang genoeg is gestabiliseerd wanneer de
retentietijden gaan verschuiven tussen de verschillende injecties, of wanneer de basislijn tijdens een
injectie geleidelijk aan gaat stijgen. (Dit geldt enkel voor isocratische elutie - constante samenstelling
van de loopvloeistof - daar het bij gradiëntelutie noodzakelijk is dat het systeem vóór het begin van
een volgende injectie weer in evenwicht komt met de beginsamenstelling van het loopmiddel).
261

De pompen moeten aan de volgende eisen voldoen :
• een hoge druk leveren tot 400 bar,
• een stabiel debiet geven, zonder pulsen en regelbaar van 0,1 tot 10 ml/min met een controle
beter dan 0.5%,
• weerstand bieden tegen corrosie, welke ook het solvent is dat wordt gebruikt.
Er bestaan 2 mogelijke werkwijzen :
• isocratisch, waarbij de samenstelling van de mobiele fase niet varieert,
• gradiënt-elutie waarbij de samenstelling van de loopvloeistof wijzigt in de loop van de analyse
om de scheiding te optimaliseren en de analysetijd te verminderen.
Figuur 2.1.21 : gradiëntelutie
Figuur 2.1.22: Effect gradiëntelutie op de chromatografische pieken.
In praktijk werkt men via “trial and error” om het meest optimale resultaat te bekomen. De pompen
kunnen tegenwoordig tot 4 solventen tegelijkertijd mengen, waarbij elk ervan al een mengsel van
solventen kan zijn. Voor eluenten die samengesteld zijn uit meerdere solventen verdient het de
voorkeur om de samenstelling van de solventen door de pomp te laten gebeuren eerder dan deze zelf
te gaan mengen, dit om fouten te vermijden. De meeste HPLC-systemen zijn voorzien van een mengkamer
bij lage druk; er is dan slechts een enkele pomp nodig voor alle solventen. Bij pompen met een
262

mengkamer onder hoge druk is er een pomp voorzien voor elk solvent; dit laatste systeem is
aanzienlijk duurder in aankoop.
Figuur 2.1.23 toont de twee configuraties.
Figuur 2.1.23 : Configuraties voor lage druk menging (a) en voor hoge druk menging (b)
4.1.8.3 Injector
Voor de injectie wordt een zeswegkraan gebruikt, die in een laad- en een injectpositie kan staan
(Figuur 2.1.24).
Figuur 2.1.24 : werking van een zeswegkraan.
In de laadpositie wordt de loop in de injectorpositie 4 gevuld met het gewenste volume staal; het
overtollige volume staal komt via positie 6 in de waste (effluent) terecht; ondertussen wordt er door de
kolom loopvloeistof gepompt.
Als de loop gevuld is, wordt de kraan gedraaid naar de injectiepositie zodat de gevulde loop nu deel
uitmaakt van de leiding van de pomp naar de ingang van de analytische kolom; dit is de injectie van
het staal.
263

4.1.8.4 De kolom
Dit is het deel van het systeem dat instaat voor de scheiding van het mengsel.
Het is een gekalibreerde cilinder uit roestvrij staal, soms ook uit een inert materiaal (glas of kunststof)
waarvan de diameter meestal varieert van 0,5 to 5 mm en de lengte van 10 tot 30 cm. De
binnendiameter van de kolom bedraagt meestal 4 tot 10 mm. De stationaire fase zit vast tussen 2
gesinterde schijfjes; de deeltjesgrootte ervan ligt tussen 5 en 10 µm voor een efficiëntie van een
grootte-orde van 50 000 platen/m.
Er bestaan ook microkolommen met een lengte van 3 tot 7 cm, een interne diameter tussen 1 tot 5
mm en een deeltjesgrootte van 3 tot 5 µm. Hun efficiëntie ligt in de grootte-orde van 100 000 platen/m.
De voordelen van deze kolommen zijn de kortere analysetijd en de besparing op solvent, maar bij
dergelijke systemen moeten krachtiger pompen gebruikt worden met een groter debiet.
Naast de analytische kolom waarin de scheiding van de componenten in het mengsel optreedt,
kunnen ook beschermingskolommen (guard-kolommen, pre-kolommen van 0,5-1 cm lang) gebruikt
worden die met dezelfde stationaire fase gevuld zijn.
Guard-kolommen plaatst men tussen de injector en de analytische kolom en moeten bij hardnekkig
‘vuile’ stalen, de grootste vervuiling opvangen zodat die niet op het begin van de analytische kolom
terecht komt. Zodra men in de chromatogrammen tailing ziet optreden, moet de guard-kolom
vervangen worden. Een dergelijke pre-kolom houdt de componenten vast waarvan de affiniteit voor de
stationaire fase zo groot is dat ze bij de gebruikte condities niet door de kolom migreren. Prekolommen
moeten regelmatig vervangen worden.
Filtratie van het monster:
Figuur 2.1.25 : kolom en pre-kolom
Bij HPLC wordt aangeraden om het extract te filtreren vooraleer het monsterflesje te vullen. Met
behulp van een naald wordt het monster gefiltreerd over een membraanfilter met een porositeit van
0,2 of 0,45 µm; het membraan moet compatibel zijn met het gebruikte solvent. Het filtraat wordt
opgevangen in de injectievial; op die manier wordt de injector beschermd tegen onoplosbare partikels.
264

Figuur 2.1.26 : Filtratie van het monster
Voor een langere optimale werking van de analytische kolom zijn volgende punten van belang:
• wanneer er buffers als loopmiddel worden gebruikt, moet de kolom na analyse goed gespoeld
worden met zuiver water om uitkristallisatie van de buffer te voorkomen,
• als een kolom niet gebruikt wordt, kan men deze best afgesloten bewaren,
• kolommen mogen niet droog bewaard worden of in zuiver water, maar wel in bv. acetonitrile,
• let er op dat het loopmiddel niet te zuur of te basisch is daar dit de stationaire fase in de kolom
zou kunnen afbreken,
• vermijd grote drukwisselingen; laat de druk eerst zakken alvorens een kolom af te koppelen,
daar een snelle drukverandering de structuur van de kolompakking kan veranderen waardoor
er dode volumes ontstaan die tot een foute interpretatie van de chromatogrammen kunnen
leiden,
• laat kolommen niet vallen, ook hierdoor kunnen dode volumes ontstaan,
• let er op dat kolommen steeds in de juiste flowrichting worden aangekoppeld.
4.1.8.5 Detectoren
4.1.8.5.1 RI detectie
Ongeveer 10 % van alle detecties bij HPLC gebeurt door meting van de brekingsindex (RI, refractive
index) van de loopvloeistof die de kolom verlaat. Het gebruik is universeel, maar omdat bij de meting
het loopmiddel zelf ook wordt gedetecteerd, moet de concentratie van de gezochte verbinding vrij
hoog zijn.
Deze detectoren zijn temperatuurgevoelig (aandacht voor tocht en airco !).
265

De detectiegrens (LOD, Limit Of Detection) ligt rond 1 µg, terwijl voor andere detectiesystemen deze
grens veel lager ligt.
Deze detector is niet bruikbaar bij gradiënten, tenzij de brekingsindex van de gebruikte solventen zeer
dicht bij elkaar liggen. De verkregen pieken kunnen positief of negatief zijn afhankelijk van de
verhoogde of verlaagde brekingsindex van de loopvloeistof bij aanwezigheid van een component.
Bij RI-detectie zit er in de detector een cel die langs één kant gevuld wordt met solvent A (referentie)
en aan de andere met solvent B (het loopmiddel met of zonder analyt). Indien B enkel loopmiddel
bevat, zal dit dezelfde brekingsindex hebben als solvent A. Als er in B analyt aanwezig is, zal het licht
onder een andere brekingshoek de cel verlaten en wordt een piek gedetecteerd.
4.1.8.5.2 UV-detectie
UV/VIS–detectie gebeurt in ongeveer 2/3 van de gevallen. In tegenstelling tot RI-detectie is hier maar
een kleine achtergronddetectie van het loopmiddel. Elke component in het loopmiddel absorbeert hier
het UV-licht, waardoor deze detectie veel gevoeliger is. Hoe hoger de concentratie van de aanwezige
component, hoe meer licht er geabsorbeerd wordt. De LOD ligt hier rond 10 ng.
Een belangrijke voorwaarde om met UV-detectie te kunnen werken, is dat er in de analyt chromoforen
(zoals dubbele bindingen) aanwezig zijn.
Voor UV-detectie bestaan er verschillende detectoren:
Detectie bij vaste golflengte en bij variabele golflengte
Bij detectie bij vaste golflengte kan de LOD tot 1 ng bedragen.
Voor detectie bij variabele golflengte wordt voor elke component de optimale golflengte (grootste
absorptie) ingesteld al naargelang de retentietijd. Bij vaste golflengte detectie wordt er steeds bij
dezelfde golflengte gemeten.
Om bij variabele-golflengtedetectie verschillende golflengtes te verkrijgen, is er in de detector een
monochromator ingebouwd die de gewenste golflengte door de flow cel kan sturen.
Figuur 2.1.27 : Klassieke UV/VIS detector met een enkelvoudig detector-element.
266

Diode array detector (DAD)
Deze detectiemethode is zeer interessant bij HPLC omdat, alhoewel het aantal platen bij HPLC veel
lager ligt dan bij GC, met deze methode de zuiverheid van een piek kan bepaald worden indien 2
pieken elkaar gedeeltelijk overlappen of wanneer een piek een andere bedekt.
Deze methode maakt het eveneens mogelijk om een gescheiden component te identificeren en kan
aldus als een bevestigingsmethode beschouwd worden.
De diode array detector maakt gebruik van een deuteriumlamp die een breed UV-spectrum uitzendt.
De polychromatische lichtbundel gaat door het monster en wordt dan door een monochromator
gesplitst in verschillende golflengten om tenslotte terecht te komen op een rij diodes (de diode-array).
Elke diode ontvangt licht van een nauwe spectrale band. Absorpties kunnen nu bij verschillende
golflengten worden gemeten en een continu spectrum van de component opleveren.
Figuur 2.1.28 : UV/VIS detector met een diode-array als detector.
Hieronder (Figuur 2.1.29) wordt als voorbeeld een DAD detectie in het VIS (300-600 nm) van bixine
en norbixine gegeven, natuurlijke kleurstoffen die verboden zijn in sommige specerijen :
267

Chromatogram bij 480 nm
268

Norbixine Bixine
Figuur 2.1.29 : Bovenaan: chromatogram, midden : DAD-spectrum van de twee moleculen met de
specifieke absorptiemaxima, onderaan : 3D-voorstelling van het spectrum.
4.1.8.5.3 Fluorescentie-detectie
Deze detectiemethode wordt maar in ongeveer 10 % van de detecties gebruikt en is gevoeliger dan
UV-detectie, de LOD bedraagt 10 – 50 pg.
Het principe is dat het analyt bestraald wordt met licht met een bepaalde golflengte en die straling
absorbeert. De analyt straalt de opgenomen energie vervolgens geheel of gedeeltelijk weer uit bij een
hogere golflengte, waardoor de emissie of uitstraling door de analyt moet gemeten worden bij een
hogere golflengte dan die van het ingestraalde licht.
Deze methode is beperkt bruikbaar, tenzij men de analyt gaat derivatiseren door binding met een
fluorescerende groep. De methode kan ook gebruikt worden bij gradiëntelutie. Deze detectie wordt
veel gebruikt voor het bepalen van vitaminen, mycotoxines, aminozuren, drugs en voor het
controleren van de kwaliteit van farmaceutische producten.
4.1.8.5.4 Elektrochemische detectie
Door het gebruik van elektrodes zijn deze detectoren zeer gevoelig voor vervuiling. In deze detector
meet een potentiometer het verschil op tussen een referentie-elektrode en een werkelektrode die zich
eerst in de (zuivere) mobile fase bevinden en later (bij de elutie van een component) in het opgeloste
staal. Door een oxidatie of reductie is er een elektronentransfer van de analyt naar de elektrode of
omgekeerd. Bij oxidatie is de elektrode de katode, bij reductie de anode.
Afhankelijk van het metaal waarmee het elektrode-oppervlak gecoat is, kan men andere groepen
bepalen.
269

Deze detectiemethode wordt in ongeveer 10 % van de detecties gebruikt - vooral bij ionenchromatografie
- en heeft een gevoeligheid van ongeveer 100 pg.
4.1.8.6 Gekoppelde technieken (HPLC-MS)
Massaspectrometrie (MS- zie verder) wordt gebruikt voor het bepalen van het moleculair gewicht (de
brutoformule), voor het ophelderen van molecuulstructuren door fragmentatie van de molecule in
herkenbare typische brokstukken, en als detectiesysteem bij chromatografie. Massaspectrometrie is
een detectiemethode waarvan het principe berust op het feit dat moleculen geïoniseerd en eventueel
gefragmenteerd worden, waarna de fragmenten gescheiden worden op basis van de verhouding
massa/lading. Geen enkele massaspectrometer kan de massa van een ongeladen atoom of molecule
meten. De ongeladen stukken moeten eerst geïoniseerd worden vooraleer ze kunnen afgestoten of
aangetrokken worden door de magnetische velden in de massaspectrometer. Een massaspectrometer
bepaalt de verhouding massa/lading van een ion, uitgedrukt als m/z.
4.1.8.7 Pre- en post-kolomderivatisatie
Zoals al eerder vermeld werd bij fluorescentiedetectie, kan men een analyt uit het staal laten reageren
met een fluorescerende groep.
De derivatisatie kan gebeuren voordat het mengsel door de analytische kolom gaat (pre-kolom
derivatisatie) of nadat het mengsel de analytische kolom verlaten heeft (post-kolom derivatisatie).
Pre-kolom derivatisatie houdt in dat staal en derivatisatiereagens in de mengkamer worden gemengd.
• Voordelen: men kan zelf de reactiecondities kiezen, derivatisatie kan als een opzuiveringsstap
gelden, een overmaat aan derivatisatiereagens kan verwijderd worden.
• Nadelen: residuen van de derivatisatiereactie kunnen pieken veroorzaken, de reactie moet
reproduceerbaar zijn, de scheiding achteraf kan moeilijk zijn.
Post-kolom derivatisatie
• Voordelen: er kunnen meerdere detectoren tegelijk gebruikt worden, minder vorming van
residuen, geen scheiding meer nodig achteraf.
• Nadelen: reactie moet snel gebeuren, bijkomende dispersie is mogelijk, de reactie moet
gebeuren in de mobiele fase, het derivatisatiereagens kan extra signalen geven.
4.1.9 Praktische toepassing
Voorbeeld: de bepaling van Aflatoxines B1, B2, G1 en G2
Bij de klassieke HPLC-analyse voor aflatoxines worden de 4 soorten aflatoxine (B1, B2, G1 en G2) uit
het staal geëxtraheerd (chloroform) en opgezuiverd d.m.v. SPE (Solid Phase Extraction); het extract
wordt in de HPLC geïnjecteerd. Het HPLC-systeem werkt met post-kolom derivatisatie, d.w.z. dat er
eerst een scheiding gebeurt van de 4 componenten over een normale HPLC-kolom en dat pas daarna
270

(=’post’) een derivatisatie gebeurt van de aflatoxines met jodium (in een reactiekolom NA de HPLCkolom).
Deze derivatisatie is nodig om de vier de aflatoxines ‘zichtbaar’ te maken met fluorescentie.
Bij deze opstelling wordt gebruik gemaakt van een HPLC-pomp en een pomp voor het
derivatisatiereagens omdat de jodium-oplossing na de primaire scheidingskring in het systeem moet
worden gepompt.
Onderstaande Figuur 2.1.30 werd overgenomen uit de officiële Europese norm.
Figuur 2.1.30
Een alternatief voor deze opstelling is een zogenaamde Kobracel; deze cel staat na de
scheidingskolom en is een elektrolytisch systeem dat derivatisatie met broom geeft. Ook hier gebeurt
de eindmeting met fluorescentie. Het voordeel van de Kobracel is dat er geen tweede pomp nodig is.
In de toekomst zal er ook steeds meer gebruik worden gemaakt van zogenaamde immunoaffiniteitskolommen
om de klassieke chloroformextractie en de opzuivering te vervangen. Voordeel is
dat het giftige chloroform uit de procedure verdwijnt, dat de procedure eenvoudiger wordt en dat de
bepaalbaarheidsgrens kan worden verlaagd doordat het makkelijker wordt om met grotere
hoeveelheden extract te werken t.o.v. de klassieke methode.
271

Voorbeeld : de bepaling van avermectines in lever.
De avermectines worden uit een lever-monster geëxtraheerd met acetonitrile. De opzuivering van het
extract gebeurt d.m.v. SPE (Solid Phase Extraction) in twee stappen : eerst op een aluminakolom en
vervolgens op een C18-kolom.
Het opgezuiverd extract wordt ingedampt bij ongeveer 65 °C en vervolgens gederivatiseerd (prekolom)
met TFAA (trifluorazijnzuuranhydride) en MMI (methylimidazol) tot een sterk fluorescerend
derivaat dat geanalyseerd wordt met HPLC-fluorimetrie (excitatie bij 361 nm en emissie bij 465 nm).
De scheiding van de componenten gebeurt met een klassieke C18-kolom, waarbij gebruik wordt
gemaakt van een gradiënt van water en methanol/acetonitrile. Bij deze methode worden de gevonden
concentraties van de componenten gecorrigeerd door de toevoeging van een interne standaard
(nemadectine), die de extractie, de opzuivering en de derivatisatie controleert.
Met deze methode is het mogelijk om in één run 5 componenten en de interne standaard te scheiden
en te kwantificeren. De LOQ is < 4 ng/g. In onderstaande Figuur 2.1.31 wordt een chromatogram
gegeven van een “blanco” lever gespiked met 4 ng/g.
Figuur 2.1.31 : analyse van avermectines
272

4.2 Ionenchromatografie
4.2.1 Principe
Deze chromatografische techniek is gericht op de scheiding van ionen en polaire verbindingen.
Hiervoor gebruikt men een stationaire fase met op haar oppervlak geladen functionele groepen, die
dipolaire interacties aangaan met de verschillende componenten van het monster. Hoe groter de
lading van een opgeloste stof, hoe meer deze wordt tegen gehouden door de stationaire fase.
Figuur 2.2.1 : Illustratie van wat er gebeurt tussen een anion A - en een tegen-anion E - in de mobiele
fase bij contact met een stationaire fase (ammoniumfase) voor anionen. In een eerste stap wordt het
ion E - , dat zich op de stationaire fase bevindt, uitgewisseld met het anion A - in de mobiele fase. In een
volgende stap veroorzaakt de elutie een omkering van de reactierichting door de stationaire fase te
regenereren met ionen E - . OH - kan een eenvoudige keuze zijn voor E - maar men geeft de voorkeur
- - -
aan mengsels van carbonaat en waterstofcarbonaat (CO3 en HCO3 bij 0,003 M) die efficiënter zijn in
het verdringen van de anionen die gescheiden moeten worden.
4.2.2 Toepassingen
Bepaling van anorganische anionen: Cl - - - 2-
, NO3 , Br , SO4 , …
Bepaling van organische zuren: propionaat, formiaat, acetaat, …
Bepaling van chelaten (een metaalcomplex van een chelaatvormer, vb. EDTA, met een metaalion via
een reversibele binding): EDTA
4.2.3 Keuze van het eluent
Het eluent is een waterige oplossing die ionen van zouten (tegenionen) of organische ionen bevat,
eventueel met een weinig methanol of aceton om het oplossen van bepaalde monsters te
vergemakkelijken. Afhankelijk van het type kolompakking, zijn de ionen in de loopvloeistof ofwel
afkomstig van minerale of organische zuren, ofwel van basen (kalium, carbonaat). Er wordt een
generator gebruikt voor de aanmaak van het eluent (basisch of zuur) die geplaatst is tussen de pomp
en de injector. De pH wordt ingesteld in functie van de te verwezenlijken scheiding. Wanneer het
waterdebiet en de stroomsterkte van de elektrolyse gekend is, kan de concentratie van het eluent
nauwkeurig bepaald worden en is het zelfs mogelijk om te werken met een concentratiegradiënt.
273

Figuur 2.2.2 : Ionenchromatograaf met eluentgenerator. Deze figuur toont de plaats van de generator
tussen de pomp en de chromatograaf. De capillaire ontgasser zorgt voor de verwijdering van het gas
dat ontstaat aan de contactzone van de elektrode in het eluens. Merk op dat de pomp gevoed wordt
met zuiver water en dus niet onderhevig is aan de corrosie veroorzaakt door de gebruikte zuren of
basen. De detailfiguur toont het actieve deel van de generator in het geval van de vorming van kalium
door de elektrolysecel (naar Dionex).
4.2.4 Monstervoorbereiding
De gemalen monsters (levensmiddelen of meststoffen) worden afgewogen en geëxtraheerd in Milli-Q
water gedurende 15 minuten in een ultasoonbad. Vervolgens wordt gefiltreerd (20 µm) en eventueel
verdund. Het filtraat wordt in een vial bewaard en geïnjecteerd.
4.2.5 Kolommen
Als men kationen wenst te scheiden kiest men een ‘kationische’ kolom waarvan de stationaire fase
plaatsen bevat die geschikt zijn om ionen uit te wisselen (vb. een polymeer met sulfonaatanionen).
Omgekeerd, om anionen te scheiden kiest men een ‘anionische’ kolom (vb. een polymeer met
ammoniumgroepen).
De scheiding steunt op het ionuitwisselingsproces aan het hars in de kolom. De scheiding is
afhankelijk van de diameter en de lading van het ion (ionen met een kleinere diameter of een kleinere
lading verlaten de kolom het eerst). De pH van het eluent beïnvloedt de evenwichtsverdeling van
ionen die verschillende valenties of meerdere functionele groepen kunnen hebben (de valentie van het
ion is afhankelijk van de pH van het eluent). Vóór de kolom bevindt zich meestal een in-line filter die
deeltjes tot 5 µm uit het eluent verwijdert vóór het op de kolom komt.
274

4.2.6 Detectie
4.2.6.1 Geleidbaarheidsdetector
Het werkingsprincipe is gebaseerd op de eigenschap van elektrolytoplossingen om een elektrische
stroom te geleiden. Men meet tussen 2 elektroden de geleiding (= omgekeerde van de weerstand) van
de mobiele fase aan de uitgang van de kolom. Door de aanwezigheid van de ionen in de oplossing
kan de stroom van de ene naar de andere elektrode lopen. De stroomsterkte is dan een maat voor de
concentratie.
4.2.6.2 Absorptiedetector
Dit is een dual-beam variabele-golflengte fotometer. De straling worden verkegen door twee
lichtbronnen: een deuteriumlamp voor UV-detectie en een wolframlamp voor het zichtbaar
golflengtegebied. De absorptie is een maat voor de concentratie.
4.2.7 Ionensuppressie van elektrolytionen
Omwille van het sterk ionisch karakter van het eluent is het soms moeilijk om bij lage concentraties
aan ionen van het analyt het signaal te detecteren. Om de gevoeligheid van de detectie te verbeteren
wordt tussen de kolom en de detector een toestel geplaatst om de ionen afkomstig van het electrolyt
te verwijderen, de suppressor. De bedoeling is om de initiële ionen in het eluent te vervangen door
andere ionen met een lagere geleidbaarheid.
De meest eenvoudige suppressor is een ionenuitwisselingskolom.
275

4.3 Gaschromatografie
4.3.1 Inleiding
De gaschromatografische scheiding berust, zoals de andere chromatografiche technieken, op een
tweefaseverdeling tussen een mobiele en een stationaire fase (Figuur 2.3.1).
Figuur 2.3.1: schema van een gaschromatograaf
Tegenwoordig wordt bij GC bijna uitsluitend GLC (Gas Liquid Chromatography) toegepast, waarbij de
mobiele fase een gas is en de stationaire fase een niet vluchtige vloeistof.
Vroeger werd gebruik gemaakt van gepakte kolommen, een dikke glazen buis met daarin korrels met
stationaire fase. Deze hebben een veel lager scheidend vermogen dan capillaire kolommen.
Capillaire kolommen hebben een zeer hoog scheidend vermogen. Capillaire kolommen zijn gemaakt
van fused silica, dit is aan de buitenkant gecoat glas, waardoor de kolom niet breekt. Ze zijn zeer
soepel, in tegenstelling tot de wel zeer breekbare glazen kolommen van vroeger. De lengte is meestel
10 m tot 50 m, de diameter varieert tussen 0,1 mm en 0,53 mm en de filmdikte tussen 0,1 µm en 3
µm. De stationaire fase zit op de binnenwand van de kolom en is dikwijls apolair en gecrosslinked 4 om
bleeding 5 te voorkomen en om hoge temperaturen te kunnen verdragen.
4.3.2 Derivatisatie
Gaschromatografie vereist dat de te scheiden stoffen zich in de gasfase bevinden. Dus moet de
temperatuur voldoende hoog zijn of moeten de verbindingen voldoende vluchtig zijn. Vele
verbindingen zijn niet vluchtig genoeg om bij verhoogde temperatuur met gaschromatografie
gescheiden te worden, zelfs niet met kolommen met “gecrosslinkte” stationaire fase die verhoogde
4 cross-links zijn covalente bindingen die polymeerketens met elkaar verbinden
5 bleed: bij hoge temperaturen kan de stationaire fase vervluchtigen in het draaggas en storen bij de
detectie
276

temperaturen kunnen verdragen en die ook minder “columnbleeding” vertonen. Daarnaast zijn een
reeks stoffen thermolabiel, zodat ze niet te chromatograferen zijn bij hoge temperatuur.
Het hoge kookpunt van vele verbindingen wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van hydroxylgroepen
waardoor intermoleculaire waterstofbruggen ontstaan.
Door deze groepen te verwijderen of te vervangen door andere groepen, elimineert men deze
waterstofbruggen en wordt de vluchtigheid verhoogd. Dit noemt men derivatisatie. Derivatisatie
verhoogt niet enkel de vluchtigheid, maar heeft ook enkele andere voordelen. Door te derivatiseren
kan men thermolabiele stoffen een grotere thermostabiliteit geven, zodat ze gemakkelijker
gechromatografeerd kunnen worden.
Een GC-kolom is zelden perfect. Een apolaire kolom vertoont dikwijls actieve plaatsen.
Chromatografie van niet-gederivatiseerde componenten geeft aanleiding tot piektailing door adsorptie
aan deze actieve plaatsen. Ook kan adsorptie aan de injector plaatsvinden. Daarnaast kan men
speciale derivaten maken om de detectie te vergemakkelijken of te verbeteren. Zo verbetert de
derivatisering met polyfluorverbindingen zowel Electron Capture detectie als massaspectrometrische
detectie.
Een derivatisatie moet gemakkelijk, herhaalbaar, zonder nevenreacties en zo volledig mogelijk zijn.
Dikwijls worden hydroxylgroepen omgezet in esters of ethers. Estervorming gebeurt dikwijls met
azijnzuuranhydride of met polyfluorverbindingen die meer vluchtige derivaten geven. Carboxylgroepen
worden meestal gemethyleerd tot methylesters. Een veelgebruikte methode is de omzetting van
alcoholen, fenolen, amines, ketonen of zuren tot trimethylsilylethers. Deze derivatisering kan gebeuren
met verschillende stoffen, die elk hun eigen reactiekracht hebben, of een mengsel ervan, al dan niet
vergezeld van een katalysator.
Bij de keuze van een derivatiseringsreactie moet men dus rekening houden met verschillende
factoren, zoals de te bepalen producten, de gebruikte detector, GC-parameters en kostprijs.
4.3.3 Monsterinjectie
4.3.3.1 Algemeen
Een goede monsterintroductie op een capillaire GC-kolom is cruciaal voor een goede chromatografie.
Omwille van de grote variabiliteit in kolomeigenschappen, zoals diameter, filmdikte, monstercapaciteit,
draaggas, gassnelheid en de verscheidenheid van monsters, bv. wat betreft samenstelling, zuiverheid,
vluchtigheid van de bestanddelen en thermische stabiliteit, werden verschillende injectoren ontwikkeld
die elk hun voor- en nadelen hebben.
Het doel van de injectie is om het monster op kolom te brengen, en dit als een zo smal mogelijk
bandje, dat “dezelfde” samenstelling heeft als het monster. Het opbrengen gebeurt ofwel rechtstreeks
(on-column injectie) ofwel door het monster te verdampen waarna het door het draaggas op de kolom
gebracht wordt.
De samenstelling van het monster kan veranderen door “discriminatieve” effecten, dat wil zeggen dat
sommige componenten niet kwantitatief op de kolom gebracht worden. Deze discriminatie kan op
verschillende manieren veroorzaakt worden. Bij injectie in een hete injector kunnen minder vluchtige
stoffen op de koude injectienaald blijven hangen. Daarom wordt voor manuele injectie de “hot needle”
277

techniek aangeraden, waarbij pas geïnjecteerd wordt nadat de naald enkele seconden in de injector
opgewarmd is. Discriminatie is ook mogelijk door degradatie van componenten door de hoge
temperatuur, door adsorptie of door katalytische reactie van stoffen aan actieve oppervlakken. Er dient
wel opgemerkt te worden dat de kolom zelf ook discriminatie kan vertonen door reversibele of
irreversibele adsorptie.
Het monster moet in een zo klein mogelijk bandje op de kolom gebracht worden, zodanig dat de
initiële breedte verwaarloosbaar is tegenover de piekverbreding ten gevolge van het chromatisch
proces. Anders ontstaat piekverbreding of zelfs gesplitte pieken. Een kleine initiële bandbreedte kan
op twee manieren verkregen worden:
• ofwel worden slechts zeer kleine hoeveelheden op de kolom gebracht, zoals gebeurt bij een
split injectie,
• ofwel wordt het volledige monster op de kolom gebracht en wordt daar gereconcentreerd door
solvent focussing, thermal focussing en stationaire fase focussing (door middel van een
retention gap). Dit gebeurt bij splitless en on-column injectie.
Figuur 2.3.2
278

4.3.3.2 Split/Splitless injector
De gecombineerde split/splitless injector is een veel gebruikte injector voor capillaire gaschromatografie.
Hij is geschikt voor de meeste toepassingen omdat hij zowel in split als in splitless
mode bruikbaar is. Het monster wordt in de hete injector ingebracht door middel van een spuit en
verdampt ogenblikkelijk. Daarvoor moet de temperatuur voldoende hoog zijn. Bij te hoge temperatuur
treedt echter monsterdegradatie op. Om backflush van het monster tegen te gaan dient rekening
gehouden worden met het volume dat het geïnjecteerde monster zal innemen na verdamping bij de
heersende temperatuur en druk. Tevens moet een aangepaste liner gekozen worden. De overdracht
van het monster van de liner naar de kolom via de gasfase heeft het voordeel dat de niet-vluchtige
componenten niet op de kolom terechtkomen, maar blijven hangen op de liner, die gemakkelijk
vervangen kan worden.
4.3.3.2.1 Split-injectie
Figuur 2.3.3
Dit was de eerste injector voor capillaire GC. De gasstroom wordt in twee gesplitst. Het grootste
gedeelte vloeit na passage door de liner weg en een kleine fractie komt op de kolom terecht. Hierdoor
ontstaat een smal bandje en reconcentratie is niet nodig. De piekverbreding ten gevolge van de
injectie is minimaal. De kolom kan op hoge temperatuur blijven zodat de chromatografische scheiding
direct kan beginnen. Omdat slechts een kleine fractie van het monster op de kolom terecht komt, is
deze injectietechniek minder geschikt voor residu-analyse.
4.3.3.2.2 Splitless injectie
Bij een splitless injectie wordt een klep, splitklep, vlak voor de injectie gesloten. De gasstroom door de
liner wordt gereduceerd tot de gasstroom door de kolom. Het verdampte monster wordt met de
snelheid van de gasstroom door de liner op de kolom gebracht, waar het condenseert tot een smal
279

andje. Bijna de volledige hoeveelheid monster is nu op de kolom gebracht, zodat de gevoeligheid
sterk verhoogd wordt. Daarna wordt de splitklep geopend zodat de resterende dampen in de liner
weggespoeld worden. Dit voorkomt tailing van pieken. De tijd waarna de klep wordt geopend is een
functie van solventkarakteristieken, linervolume, monstervolume, temperatuur en gasdebiet.
4.3.3.3 PTV-injector
Een PTV-injector (Programmed Temperature Vaporisation) is een type injector, afgeleid van een
split/splitless injector, die geschikt is voor injectie van grote volumes. Dit komt doordat de injector snel
kan opwarmen en afkoelen. Bij lage temperatuur wordt een grote hoeveelheid vloeistof geïnjecteerd.
Het solvent wordt door het draaggas vervluchtigd en via de splitleiding afgevoerd. De analyten blijven
in de injector achter. Na vervluchtiging van het solvent wordt de splitleiding afgesloten en de injector
zeer snel opgewarmd. De analyten komen in de gasfase en worden met het draaggas op de kolom
gebracht waar ze aan het begin weer in een smal bandje condenseren. Een PTV-injector is zeer
geschikt voor residu-analyse omdat een groot gedeelte van het opgezuiverde monster op de kolom
gebracht wordt.
4.3.3.4 On-column injector
Figuur 2.3.4
On-column injectie is de meest accurate en precieze injectietechniek voor kleine volumes. Bij oncolumn
injectie wordt, zoals uit de term kan afgeleid worden, het monster rechtstreeks op de kolom
gebracht, en verdamping van het monster is niet nodig. Op deze wijze kunnen volumes tot 2µl op de
kolom gebracht worden.
280

Figuur 2.3.5
De temperatuur van de injector moet lager zijn dan het kookpunt van het solvent, zodat geen
verdamping optreedt, maar moet steeds hoger zijn dan de oventemperatuur. De oventemperatuur mag
hoger zijn dan bij een splitless injectie, omdat het monster niet gerecondenseerd hoeft te worden.
Het monster wordt door het draaggas over de kolomwand uitgespreid tot een stabiele film. Om de
componenten in een smalle band te concentreren kan gebruik gemaakt worden van een “retention
gap”, een stuk kolom zonder stationaire fase die geen retentie geeft. Bovendien vangt een retention
gap alle niet-vluchtige componenten op, die anders op de kolom zouden terechtkomen en de
chromatografische scheiding beïnvloeden.
On-column injectie gebeurt bij lage temperatuur, zodat er geen monsterdegradatie of omzettingsreacties
door de hoge temperatuur plaatsvinden. Hierdoor kan chromatografie van thermolabiele
stoffen plaatsvinden. Ook discriminatie wordt geminimaliseerd: door de lage temperatuur is
discriminatie aan de naald te verwaarlozen en discriminatie te wijten aan de injector is onbestaande
omdat het monster direct op de kolom gebracht wordt. Om deze redenen is on-column injectie de
meest accurate en precieze injectie.
Naast de duidelijke voordelen heeft on-column injectie ook enkele nadelen. De kolom wordt
gemakkelijker overladen en er kan dus minder monster op de kolom gebracht worden als met andere
injectietechnieken. Dit kan gedeeltelijk opgevangen worden met een retention gap. Het monster moet
relatief proper zijn omdat alles op de kolom terecht komt. Niet-vluchtig materiaal wordt aan het begin
van de kolom geaccumuleerd, verstoort de scheidingsefficiëntie en creëert actieve plaatsen op de
kolom. Een verder doorgedreven clean-up van het monster is dus noodzakelijk. Ook dit kan echter
opgevangen worden door het gebruik van een retention gap. Tenslotte behoeft de keuze van
parameters zoals solvent, initiële temperatuur enz. meer optimalisatie.
281

4.3.3.5 Headspace injector
Een headspace injector wordt gebruikt voor de analyse van zeer vluchtige componenten. Hierbij wordt
het gas uit een – eventueel verwarmd - afgesloten flesje met monster geïnjecteerd. Dat gas bevat
vluchtige componenten die in evenwicht zijn met de onderstaande vloeistof. Het gas wordt via een
loop in de GC gebracht. Deze techniek is niet zeer gevoelig, maar heeft zeer weinig monstervoorbereiding
nodig.
4.3.3.6 Purge-and-trap injector
Deze injectietechniek wordt gebruikt voor de analyse van vluchtige stoffen die echter minder vluchtig
zijn dan bij een headspace injector. Door een waterig monster wordt een inert gas (vb. stikstof)
geblazen die vluchtige stoffen meeneemt (purge). Deze stoffen worden ‘getrapt’ op een adsorptiekolom
(vb. Tenax®). Zeer vluchtige stoffen kunnen niet getrapt worden, in tegenstelling tot een
headspace injector waar deze wel gemeten kunnen worden. Daarna wordt de adsorptiekolom
verwarmd zodat de stoffen weer verdampen en op de GC kolom gebracht worden via een
split/splitless injector. Door deze ‘concentratie’ is de gevoeligheid veel groter dan bij een headspace
injector.
4.3.3.7 SPME (Solid Phase Micro Extraction)
Figuur 2.3.6 : Purge-and-trap injector
Deze techniek maakt gebruik van een vezel die gecoat is met een vaste of vloeibare fase. Deze wordt
in het monster gebracht (vloeistof of gas) zodat er een evenwicht ontstaat tussen analyten (vluchtige
en niet-vluchtige) in het monster en op de vezelcoating. Daarna wordt deze vezel in een split/splitless
injector gebracht waarna de geadsorbeerde analyten verdampen en gechromatografeerd worden
282

(Figuur 2.3.7). Deze techniek is eenvoudig, snel en kan ook gebruikt worden als monstervoorbereiding.
Daarenboven kan ze rechtstreeks gebruikt worden voor monstername, zodat ze na
bewaring en transport naar het labo daar geanalyseerd kunnen worden.
4.3.3.8 Pyrolyse
Figuur 2.3.7
Bij deze techniek wordt het monster zo hoog verhit (>600 °C) dat grote moleculen dissociëren in
kleinere, meer vluchtige fragmenten. Dit kan gebeuren door contact met een verhitte platinadraad of in
een kwartskroesje. Meer recent werden PTV-injectoren aangepast om deze temperaturen te bereiken.
Deze techniek is zeer geschikt voor polymeeranalyse.
4.3.4 De scheiding
Voor de scheiding bij gaschromatografie zijn dezelfde principes en parameters van toepassing als
voor HPLC (zie 2.1), zoals retentie, resolutie, plaatgetal, selectiviteitsfactor, capaciteitsfactor en HETP.
Het grote verschil met HPLC is dat de mobiele fase een gas is, en de stationaire fase meestal een
vloeistof (die ‘vast’ op de kolomwand zit).
De gradiënt is bij gaschromatografie een temperatuurgradiënt in plaats van een gradiënt van
solventsterkte bij HPLC. De druk die nodig is om een bepaalde hoeveelheid gas door de kolom te
duwen hangt af van de oventemperatuur. Hoe hoger de oventemperatuur, hoe hoger de kinetische
energie van de gasmoleculen, dus hoe meer druk er nodig is om het gas in de juiste richting te duwen.
Om het debiet constant te houden bij een temperatuursgradiënt kan de gasdruk elektronisch
aangepast worden.
Toch zijn er enkele verschillen tegenover HPLC. Tegenwoordig gebeurt GC bijna altijd met capillaire
kolommen, waardoor de A-term uit de Van Deemtervergelijking (zie 2.1.6.3.8) wegvalt. Deze Van
Deemtervergelijking kan voor GC voorgesteld worden voor verschillende gassen.
283

Figuur 2.3.8 : De Van Deemtervergelijking voor verschillende gassen
Uit Figuur 2.3.8 blijkt dat waterstof de beste chromatografische resultaten geeft. Wegens het
ontploffingsgevaar van waterstof (lekken!) wordt dikwijls geopteerd voor helium. Het ontploffingsgevaar
kan geëlimineerd worden door het gebruik van een waterstofgenerator. Deze produceert juist
de benodigde hoeveelheid en druk.
4.3.5 Detectoren
De drie belangrijke karakteristieken van detectoren zijn de gevoeligheid (sensitivity), de selectiviteit en
het dynamisch bereik (dynamic range). Verder zijn stabiliteit en herhaalbaarheid noodzakelijk.
Gevoeligheid is de respons van de detector per hoeveelheid monster. De gevoeligheid wordt
beïnvloed door de monstervoorbereiding, de injectie, de chromatografie, de integratie en de systeemruis.
De minimale aantoonbare hoeveelheid bij een GC-analyse is die hoeveelheid die een signaal/ruis
verhouding van 2 of 3 geeft.
Het dynamisch bereik is het concentratiebereik dat correct gekwantificeerd kan worden.
Sommige detectietechnieken steunen op vernietiging van de molecules, vb. door verbranding of door
beschieting met elektronen, de zogenaamde destructieve detectoren. Deze eigenschap is belangrijk
voor de koppeling van verschillende detectoren. Niet-destructieve detectoren kunnen in serie
gekoppeld worden. TCD (thermische conductiviteitsdetector) en PID (foto-ionisatie detector) zijn nietdestructieve
detectoren.
284

4.3.5.1 Indeling detectoren
Detectoren kunnen ingedeeld worden in universele, selectieve of specifieke detectoren :
• Universele detectoren geven een respons op alle producten die van de kolom elueren. Een
TCD is bijvoorbeeld een universele detector, aangezien alle stoffen een verandering in
thermische geleidbaarheid geven. Een massaspectrometer, in de scan-mode, is ook een
universele detector. Universele detectie heeft ook nadelen. Door slechte chromatografische
scheiding kunnen andere componenten interferentie geven met de te bepalen component.
Detectoren kunnen gevoelig zijn voor column bleeding en fluctuaties in gasdruk en
gastemperatuur.
• Selectieve detectoren zijn selectief voor een element, een structuur, een functionele groep of
voor een andere eigenschap. Voorbeelden zijn Electron Capture Detector (ECD), de Stikstof
Phosphor Detector (NPD) of de Photo Ionisation Detector (PID).
• Specifieke detectoren zijn detectoren die zo selectief zijn dat ze bepaalde structuren of
elementen met grote zekerheid kunnen detecteren. Voorbeelden zijn FPD (vlam fotometrische
detector, MS (massaspectrometer) in SIM-mode 6 en AED (atoom emissie detector).
Spectrale detectoren zoals een massaspectrometer, zijn in staat moleculaire of elektronische transities
teweeg te brengen, waardoor structurele informatie verkregen wordt over de eluerende component.
Voor bevestigingsdoeleinden is dit van uiterst groot belang.
4.3.5.2 FID (Vlam Ionisatie Detector)
Een FID is de meest verspreide detector. De eluerende stoffen worden in de detector verbrand en
door de hoge temperatuur worden er ionen gevormd die aanleiding geven tot een elektrisch stroompje
dat versterkt wordt. Deze detector is niet selectief. Als gevolg hiervan is hij weinig bruikbaar voor
residu-analyse.
Selectiviteit: alle stoffen die ioniseren in een H2 /lucht-vlam.
6 SIM: selected ion monitoring
285

4.3.5.3 ECD (Electron Capture Detector)
Figuur 2.3.9 Principe van een FID-detector
In de ECD detector wordt het eluaat in een elektrisch veld bestraald met een β-straler (Ni 63 ). Het
draaggas wordt geïoniseerd en de vrijgestelde elektronen veroorzaken een permanente stroom.
Sommige verbindingen vangen bij elutie deze elektronen op, waardoor de gemeten stroom kleiner
wordt. De detector is zeer gevoelig en is selectief voor verbindingen die gemakkelijk elektronen
opnemen, zoals vb. halogeenverbindingen of –derivaten. Bovendien kunnen de moleculen
gederivatiseerd worden met gehalogeneerde verbindingen, vb. heptafluorboterzuur, die de molecule
zeer geschikt maakt voor detectie. Deze detector geeft echter geen structuurinformatie, waardoor hij
niet geschikt is voor bevestigingen.
Selectiviteit: is afhankelijk van de elektronenaffiniteit. De respons op polychloorverbindingen is een
miljoen maal groter dan die op koolwaterstoffen.
286

4.3.5.4 TCD (Thermische Conductiviteits Detector)
Figuur 2.3.10 Principe van de ECD-detector
Dit is een universele, niet destructieve detector, die gebaseerd is op verandering van de thermische
geleidbaarheid van het draaggas door eluerende analyten.
4.3.5.5 NPD (Stikstof-fosfor Detector)
Figuur 2.3.11 Principe van de TCD-detector
Dit is een destructieve detector, selectief voor N- en P-atomen. Het signaal ontstaat door een stroom
opgewekt na ionisatie van de analyten in een plasma.
287

4.3.5.6 FPD (Vlam Fotometrische Detector)
Figuur 2.3.12 Principe van de NPD-detector
Dit is een destructieve detector, selectief voor S- en P-atomen. Het eluaat wordt verbrand waarbij
zwavel of fosforatomen (naargelang de filter) worden geëxciteerd.
Figuur 2.3.13 Principe van de FPD-detector
288

4.3.5.7 PID (Foto Ionisatie Detector)
De eluenten worden geïoniseerd door UV-straling. Deze detector is selectief of universeel, afhankelijk
van de lampenergie.
4.3.5.8 AED (Atomic Emission Detector)
Figuur 2.3.14 Principe van de PID-detector
Dit is een universele en selectieve element analysator, en is dus gevoelig voor de aanwezigheid van
de verschillende atomen in het monster. Het eluaat komt in een plasma terecht, dat geïnduceerd wordt
met behulp van microgolven. In het plasma worden de moleculen geatomiseerd, waarna de atomen
worden aangeslagen. Als de elektronen terugkeren naar de grondtoestand, zenden ze licht uit met
welbepaalde golflengten specifiek voor elk atoom, die worden gemeten door middel van een
photodiode-array (PDA).
Figuur 2.3.15 Principe van de AED-detector
289

4.3.5.9 MS (Massaspectrometer)
Dit type detector wordt uitgebreid besproken in een afzonderlijk deel van deze syllabus.
290

4.4 Massaspectrometrie
4.4.1 Inleiding
Massaspectrometrie (MS) is een veelzijdige analytische techniek, gebaseerd op de atomaire of
moleculaire massa’s van de bestanddelen in een monster en die gebruikt kan worden voor de
identificatie, kwantificatie en profilering van isotopen, moleculen en molecuulcomplexen in zeer kleine
hoeveelheden van chemische en biologische mengsels.
MS is een techniek met de volgende kenmerken:
• een hoge gevoeligheid,
• een hoge specificiteit,
• een hoge flexibiliteit.
Een massaspectrum weerspiegelt de statistische abundantie van de gevormde ionen als functie van
hun m/z(m= massa,z= lading) verhouding in stijgende lijn, met andere woorden is een
massaspectrum een grafiek waarbij de (relatieve) intensiteit van de ionen wordt weergegeven van
lage naar hoge massa. Onder dezelfde werkvoorwaarden is een MS spectrum reproduceerbaar en
karakteristiek voor een analyt (Figuur 2.4.1).
4.4.2 Principe
Figuur 2.4.1. : het massaspectrum van tolueen
Ongeacht het type van instrument bestaat een MS uit drie delen (Figuur 2.4.2.):
• een ionenbron
• een massa analysator
291

• een detector
Via de inlaat komt het monster in de ionenbron. In de bron worden de analyten omgezet in ionen.
Deze ionen kunnen in de analysator gescheiden worden op basis van hun verhouding massa/lading
(m/z). De detector meet de hoeveelheid aan ionen met een bepaalde m/z, waarna de gegevens
worden omgezet in een massaspectrum. Als de MS gekoppeld is aan een chromatograaf, is er voor
iedere tijd in het chromatogram een massaspectrum aanwezig.
4.4.3 Monsterintroductie
Figuur 2.4.2.: Bouw van een massaspectrometer
De manier waarop een monster in de MS gebracht wordt, hangt af van de ionisatiemethode en het
type staal. Een monster kan direct in de bron gebracht worden, of kan in de bron gebracht worden na
chromatografische scheiding, vb. gaschromatografie (GC-MS) of vloeistofchromatografie (LC-MS). Bij
GC-MS gebeurt de monsterintroductie (en ionisatie) onder vacuüm, bij LC-MS onder atmosferische
druk (Figuur 2.4.3).
292

Figuur 2.4.3 : monsterintroductie voor GC-MS en LC-MS
Er zijn veel verschillende ionisatietechnieken, elk met hun voor- en nadelen. De ionenbron zet de
moleculen die aanwezig zijn om in ionen. Er worden positieve en negatieve ionen gevormd,
afhankelijk van de protonaffiniteit van het analyt. Daarna worden de positieve of de negatieve ionen
gemeten, of afwisselend, afhankelijk van de ingestelde polariteit van het toestel.
Negatieve ionen worden veel minder vaak gevormd dan positieve, maar er is ook minder chemische
ruis, zodat meting in negatieve mode een grote winst in gevoeligheid kan geven voor analyten die
gemakkelijk negatieve ionen vormen.
Afhankelijk van de toegepaste energie ontstaat een (pseudo-)moleculair ion of treedt er fragmentatie
op. Hoe zachter de ionisatietechniek, hoe minder fragmentatie er zal optreden. In tabel 2.4.1 worden
de belangrijkste types besproken. Ze kunnen ingedeeld worden volgens onderstaande tabel en
toepassingsgebied.
Tabel 2.4.1. De belangrijkste types monsterintroductie bij MS
Methode Techniek
Ionisatie onder vacuüm (GC) EI
Ionisatie onder atmosferische druk na
verneveling (LC)
CI
ESI
APCI
APPI
Energie transfer op monster MALDI
In Figuur 2.4.4 wordt het werkingsgebied van de verschillende types weergegeven.
293

Figuur 2.4.4: het werkingsgebied van de verschillende types interfaces
294

4.5 ICP - OES
4.5.1 Principe
ICP-OES of Inductive Coupled Plasma - Optical Emission Spectrometry is een techniek waarbij
simultaan concentraties aan verschillende elementen kunnen gemeten worden.
4.5.2 Emissie
Emissie of straling is een proces waarbij een systeem (atoom, ion) dat zich in een aangeslagen
toestand bevindt, zijn overtollige energie kwijtraakt door het uitzenden van elektromagnetische
straling, of anders gezegd, emissie is het uitzenden van een foton met energie hν01 door het
terugvallen van een elektron in een atoom vanuit een hoger energieniveau E1 naar de grondtoestand
E0.
Welke kleur (golflengte, frequentie) de uitgezonden fotonen hebben, hangt af van de aard van het
materiaal (welk atoom, ion..) en van de temperatuur.
De verhouding van het aantal deeltjes in de hogere energietoestand en de grondtoestand wordt
volgens Boltzmann gegeven door:
N
N
s
0
g
=
g
s
0
⋅e
−(
Es
−E0
)
kT
Met NS en N0 respectievelijk het aantal deeltjes in de hogere energietoestand met energie ES en het
aantal in de grondtoestand met energie E0; gS en g0 de gewichtsfactoren van beide energieniveaus; k
de constante van Boltzmann en T de absolute temperatuur (in Kelvin).
Bij kamertemperatuur bevinden de elektronen in een atoom zich allemaal in de grondtoestand. Bij
kamertemperatuur zullen voorwerpen dan ook geen zichtbare straling (400 – 800 nm) uitzenden. Pas
bij verhitting in een vlam (2500 K) of in een inductief gekoppeld plasma (4000 – 10.000 K) neemt de
bezetting van de hogere energieniveaus zover toe dat spontane emissie van straling meetbaar wordt.
Atomen zenden fotonen met een vast aantal golflengten uit. Zo heeft ieder element een discreet
lijnenspectrum. Een mogelijke verklaring voor deze spectra werd in 1913 gegeven door Bohr die
stelde dat de gemiddelde afstand van een elektron tot de positieve kern van het atoom niet willekeurig
is, maar gebonden is aan bepaalde vaste waarden. In navolging van Bohr zegt met dat het elektron
bepaalde ‘banen’ (orbitalen) om de kern beschrijft. Elke ‘baan’ correspondeert met een bepaalde
waarde van de potentiële energie van het atoom. Straling kan alleen worden uitgezonden indien het
elektron van een verre ‘baan’ van hoge energie overgaat naar een dichter bij de kern gelegen ‘baan’
van lagere energie. De vrijkomende energie wordt in de vorm van een foton afgegeven.
De intensiteit van de verschillende lijnen van eenzelfde element verschilt van lijn tot lijn. Overgangen
waarbij de grondtoestand betrokken is, zijn meestal het sterkst. Dit zijn de resonantielijnen. De
resonantielijnen van natrium bijvoorbeeld zijn de lijnen bij 589,0 en 589,6 nm. Deze veroorzaken de
feloranje kleur wanneer een natriumzout in een vlam wordt gebracht.
295

Voor natrium en andere alkalimetalen (K, Li,..) zijn er weinig overgangen en dus weinig lijnen in het
spectrum omdat deze elementen maar 1 valentie-elektron in de buitenste schil bezitten. Bevinden zich
meer elektronen in de buitenste schil zoals bij de aardalkalimetalen (Mg, Ca, Sr, Ba,..) en vooral bij de
overgangs- of transitiemetalen zoals Fe, W, Ni, Cr, Mn,.. en bij de zeldzame aarden (Sc, Y, Ce, Th..)
dan is het aantal spectraallijnen dat deze elementen uitzenden ook bijzonder groot. Tot het spectrum
behoren zowel atoomlijnen als ionlijnen (lijnen uitgezonden door de geïoniseerde atomen).
Het overgrote deel van de elementen vertoont emissielijnen met een golflengte tussen 190 en 380 nm,
dit is het ultraviolette deel van het elektromagnetisch spectrum.
Grotere golflengtes (> 380 nm, dit is in het zichtbare gebied) komen minder vaak voor. Kleinere
golflengtes (< 190 nm, het vacuüm-ultraviolet) vertonen bijvoorbeeld de elementen aluminium, zwavel,
fosfor en koolstof.
Voorbeelden van golflengten gebruikt bij de bepaling van de elementen en totaal aantal spectraallijnen
per element:
Aluminium: 167 nm, 237 nm, 308 nm, 396 nm (40 lijnen)
Arseen: 188 nm, 193 nm, 228 nm (19 lijnen)
Broom: 700 nm (1 lijn)
Cadmium: 214 nm, 226 nm, 228 nm, 361 nm (50 lijnen)
Calcium: 227 nm, 317 nm, 422 nm, 610 nm (72 lijnen)
Cerium: 401 nm, 413 nm, 418 nm, 456 nm (520 lijnen)
Fosfor: 177 nm, 213 nm, 214 nm (39 lijnen)
Goud: 208 nm, 242 nm, 267 nm (44 lijnen)
Ijzer: 234 nm, 238 nm, 259 nm (413 lijnen)
Iodium: 178 nm, 206 nm (8 lijnen)
Kalium: 766 nm (10 lijnen)
Koper: 213 nm, 221 nm, 224 nm, 324 nm (78 lijnen)
Lood: 220 nm, 283 nm (35 lijnen)
Nikkel: 221 nm, 231 nm, 341 nm (102 lijnen)
Zwavel: 178 nm (23 lijnen)
Niet alle lijnen van een element zijn bruikbaar voor de bepaling van de concentratie aan het element in
een staal. Vele lijnen hebben onvoldoende intensiteit. In een staal zijn verschillende elementen
aanwezig en de spectra van deze elementen overlappen elkaar. De overlappingen worden spectrale
interferenties genoemd. Om een goede kwantitatieve bepaling te doen, moet een selectie worden
gemaakt van geschikte lijnen, dit zijn lijnen die voldoende intensiteit en zo min mogelijk spectrale
interferenties vertonen. Om tot deze selectie te komen zijn golflengtetabellen beschikbaar. In de
software van instrumenten zijn deze tabellen aanwezig en wordt reeds een selectie gemaakt van
geschikte atoom- en ionlijnen.
In de praktijk wordt voor een bepalingsmethode gezocht naar minstens 2 geschikte lijnen. Zo kunnen
eventuele storende pieken in het spectrum gemakkelijker opgespoord worden. De interfererende lijn
van een bepaald storend element zal niet exact de twee lijnen van het te bepalen element overlappen
en dus zal het resultaat van de twee lijnen verschillen.
296

4.5.3 Het ontstaan van het plasma
Een plasma is een wolk geïoniseerd gas van hoge temperatuur. In ICP wordt het inert gas argon en
een elektrische ontlading gebruikt om het plasma op te wekken.
Het plasma in een ICP ontstaat ter hoogte van de ‘toorts’, een stelsel van drie buizen waar argon
doorheen wordt geblazen (zie Figuur 2.5.1). Omheen de toorts is een koperen radiofrequente spoel
gewonden. De spoel is aangesloten op een hoogfrequent generator. Door een snel van fase
wisselende stroom doorheen de spoel te sturen, ontstaan binnen de spoel snel fluctuerende
magnetische velden. Wanneer dan argon in de toorts wordt geblazen, zijn er aanvankelijk alleen
atomen in het gas aanwezig die ongevoelig zijn voor het magnetisch veld. Voor het ontstaan van een
plasma zijn elektronen en ionen nodig die opgewekt worden d.m.v. Tesla vonkjes. De vonkjes zorgen
voor elektrische ontladingen die het gas geleidbaar maken en zo ontstaat het plasma.
Radiale kijkrichting
Axiale kijkrichting
Figuur 2.5.1 : Schema toorts en plasma
Het aldus gevormde plasma wordt verder onderhouden door inductief verhitten van het stromende
argongas.
297

Bij ICP zijn er drie verschillende argongas stromen :
• 1- Door de binnenste buis van de toorts stroomt een geringe argongasstroom (0 - 2 l/min)
waarin zich het monster als aërosol bevindt. Deze gasstroom wordt de nebulizer of monsterdraaggasstroom
genoemd. De nebulizer stroom is één van de drie belangrijkste parameters
die cruciaal zijn bij de optimalisatie van ICP-methoden. Een tweede parameter is RF
vermogen (zie verder). Een derde parameter is observatiehoogte in het plasma (zie verder).
Kleine aanpassingen van de nebulizerstroom resulteren in een verschil in snelheid van
aanvoer van monster en dus in een verschil in opgewekte emissie intensiteit. Als de
nebulizerstroom te zwak is, geraakt de monstergasstroom niet doorheen de ‘muur’ van het
plasma. Een deel van het monster komt niet in het plasma en zal geen emissie geven met
bijgevolg een onderschatting van de concentratie. Bij een te hoge nebulizer flow verkort de tijd
dat het monster in het plasma is en dus zal ook minder emissie kunnen gedetecteerd worden,
tenzij de ‘leestijd’ wordt verlengd in combinatie met langere tijd monster opzuigen (maar dan
heb je meer monsteroplossing nodig).Het gemiddelde debiet voor de nebulizer stroom is 0,7
l/min.
• 2- Door de middelste buis van de toorts stroomt een auxiliary gas of tussengas (0 – 2 l/min)
dat dient om het plasma te vormen en om het plasma wat weg te duwen van de bovenste tip
van de binnenste buis van de toorts. Als tussengas wordt argon gebruikt. Het gemiddeld
hulpgasdebiet bedraagt 1 l/min.
• 3- Door de buitenste buis wordt een koelgasstroom gestuurd. Dit koelgas kan stikstof of argon
zijn en dient om smelten van de toorts te voorkomen. De buitenste gasstroom vormt een dun
laagje betrekkelijk koud gas dat ervoor zorgt dat het plasma niet tegen de wand van de buis
komt.
In totaal wordt een debiet van 7 tot 20 l/min aan argon gebruikt, waarvan het grootste deel door het
koelgas wordt ingenomen.
4.5.4 Het omzettingsproces van monster tot stralende deeltjes
De monsteroplossing wordt met behulp van monsterdraaggas (nebulizer gas) doorheen een verstuiver
gebracht die de oplossing verstuift tot een aërosol. Dit is een fijne nevel bestaande uit kleine
druppeltjes van verschillende diameter. Deze aërosol wordt in de aërosoltunnel midden in het plasma
gebracht waar de temperatuur ongeveer 4000-5000 K is. Doordat de temperatuur in het plasma zeer
hoog is, zijn enkele milliseconden voldoende om een monster te verdampen en te atomiseren
gedurende het verblijf in het plasma.
De verschillende stappen in dit proces zijn:
• desolvatatie: het solvent (water) verdampt, er ontstaat een zoutdeeltje,
• verdamping: het zoutdeeltje valt uiteen in moleculen,
• dissociatie: de moleculen vallen uiteen in atomen,
• ionisatie: de atomen ioniseren,
298

• excitatie: atomen en ionen exciteren,
• emissie: als de geëxciteerde atomen/ionen vanuit een hoger energieniveau terugvallen, wordt
de vrijgekomen energie omgezet in straling met een golflengte karakteristiek aan het
element/ion.
4.5.5 RF generator en vermogen
Figuur 2.5.2 : Processen in het plasma
De monsterstroom die in het plasma wordt gebracht, zal energie van het plasma opslorpen om tot
emissie te komen. Om het plasma te onderhouden en stabiel te houden terwijl monsteroplossingen in
het plasma worden gebracht, is een stabiele en krachtige RF generator nodig.
De stabiliteit van het plasma kan worden gemeten aan de hand van de verhouding van lijnen van
magnesium: een plasma is robuust als de verhouding Mg II (280,270 nm ionlijn) / Mg I (285,213,
atoomlijn) groter is dan 8. Een robuust plasma is ongevoelig voor veranderingen in de samenstelling
van de matrix, of ook een robuust plasma geeft eenzelfde intensiteit voor een element in verschillende
matrices.
Een hogere waarde voor de verhouding Mg II / Mg I kan bijvoorbeeld worden verkregen door een
vermogen van 1400 Watt of meer toe te passen. (Andere manieren zijn optimalisatie van nebulizer
flow en van kijkhoogte: zie verder).
Zeker voor zwaardere matrices met veel organisch materiaal is een RF generator nodig die een
voldoende hoog vermogen kan opwekken ter hoogte van de koperen spoel om aldus te compenseren
voor het energieverlies als gevolg van de introductie van het monster in het plasma. Dit vermogen
moet ervoor zorgen dat de matrix volledig gedissocieerd is zodat geen matrixinterferenties worden
gecreëerd (zoals storende koolstoflijnen die het spectrum verstoren).
Het toegepaste RF vermogen varieert van 750 tot 1600 Watt.
Een voldoende hoog vermogen is tevens van belang als ‘gevoelige’ elementen (vb. As, Se, S, Sn) op
een laag niveau moeten gemeten worden. Gevoelige elementen hebben een hogere ionisatie-
299

potentiaal. De intensiteit van de uitgezonden straling van deze elementen kan worden verhoogd door
het opdrijven van het vermogen en dit terwijl de emissie van de achtergrond veel minder zal
toenemen. Door opdrijven van het RF vermogen zal voor deze elementen de detectielimiet verlaagd
worden.
Voor monsters met veel gemakkelijk te ioniseren elementen (vb. aardalkali elementen Ca, Mg, Sr) zal
opdrijven van het vermogen nauwelijks effect hebben op de intensiteit van de emissie van deze
elementen, terwijl er wel een verhoogde emissie zal zijn van andere elementen die tot de matrix
behoren. Het achtergrondsignaal zal verhogen en bijgevolg zal de detectielimiet juist verlagen bij
opdrijven van het vermogen.
Onder andere om deze reden zal de ICP die een simultane techniek is, toch geoptimaliseerd worden
om gelijkaardig reagerende elementen te groeperen in één methode.
4.5.6 Axiaal en radiaal plasma
De vorm van het plasma is toroïdaal, wat betekent dat de axiale zone midden in het plasma
betrekkelijk koel is vergeleken met de omgeving. De toroïdale vorm van het plasma hangt o.a. samen
met het ‘skin-effect’ van de radiofrequente stroom. De koppeling van energie uit het radiofrequent veld
vindt voornamelijk plaats in de buitenste zone van het plasma, de ‘skin diepte’. Er is een zogenaamde
‘zwakke plek’ in het plasma en juist daar wordt met een geringe argonstroom een gat in het plasma
geboord om het monster aërosol in het hete plasma te brengen zonder de stabiliteit van het plasma te
verstoren.
In een ICP-OES toestel kan de toorts verticaal of horizontaal worden gemonteerd.
In een radiale ICP-OES wordt de toorts verticaal gemonteerd en wordt op een hoogte van 10 tot 20
mm boven de spoel radiaal, d.w.z. vanaf de zijkant, de straling waargenomen over een
observatiezone (het ‘kijkvenster’) van zo’n 5 mm. De parameter kijkhoogte is van belang om
matrixinterferenties tot een minimum te beperken als er makkelijk te ioniseren elementen in het
monster aanwezig zijn.
Bij een kijkhoogte van 20 mm wordt de emissie gedetecteerd van een relatief kouder deel van het
plasma (± 6000 K) dan bij 10 mm (± 6200 K). In de koudere zone zullen alle elementen minder
ionisatie vertonen en vermindert ook het matrixeffect.
De verklaring hiervan kan gegeven worden aan de hand van een voorbeeld:
• de concentratie aan K in een waterige oplossing met 2 mg/l K wordt radiaal gemeten op 10
mm en op 20 mm: resultaat is voor beide kijkhoogten ± 2 mg/l
• de concentratie aan K in een waterige oplossing van 2 mg/l K met daarin opgelost 2 % Ca
wordt radiaal gemeten: resultaat op 10 mm is 4 mg/l en resultaat op 20 mm is 2,2 mg/l.
• Het gemakkelijk te ioniseren Ca heeft in het warme plasma op 10 mm een grote hoeveelheid
elektronen in het plasma gebracht. Deze elektronen verhinderen K om te ioniseren (evenwicht
K ↔ K + + e - ) in dezelfde mate als in de waterige oplossing waar geen Ca aanwezig was,
waardoor er een hogere intensiteit aan K atoomlijnen wordt gemeten t.o.v. de intensiteit van
de K atoomlijn in een waterige standaard zonder Ca. Dit effect is minder groot op 20 mm
omdat daar een lagere temperatuur heerst en Ca minder ioniseert. Een alternatief voor het
wijzigen van de kijkhoogte is het aanpassen van de standaardoplossing waarmee wordt
300

gekalibreerd aan de monsteroplossing. Deze techniek van matrix-matching is echter enkel
mogelijk als de samenstelling van het monster gekend is.
Een radiaal plasma is geschikt voor hogere concentraties aan elementen (0,1 mg/l en meer in de
monsteroplossing) en om zwaardere matrices te analyseren.
In een axiale ICP-OES wordt de toorts horizontaal gemonteerd en wordt de emissie axiaal over het
gehele centrale kanaal waargenomen, wat in principe een hogere intensiteit en dus lagere
detectielimieten geeft. Bij axiaal plasma is van belang dat in het centrum wordt gemeten. Dit kan ook
door de verhouding Mg II / Mg I worden gecontroleerd: als naast het centrum van het plasma wordt
gemeten, is de temperatuur hoger en zullen meer ionlijnen dan atoomlijnen worden gemeten.
Axiaal zijn er meer interferenties. Om deze te verminderen, wordt de zogenaamde axiale pluim (dit is
het bovenste deel van het plasma) verwijderd. Systemen hiervoor zijn gebruik van perslucht om de
pluim weg te blazen, gebruik van een keramische cone op het plasma af te toppen. Doel is de emissie
te detecteren in het warmere deel van het plasma. Axiaal meten is dus geschikt om gevoelig te gaan
meten, maar niet geschikt om hogere concentraties aan makkelijk te ioniseren elementen te bepalen
(deze worden enkel correct gekwantificeerd radiaal in een kouder deel van het plasma of na matrixmatching,
cfr. hoger).
Er zijn ook ICP-OES toestellen met horizontale toorts waarmee zowel axiaal als radiaal emissie kan
worden waargenomen.
4.5.7 Detectie
In ICP-OES wordt gebruik gemaakt van solid state detectoren, waarin wordt gemeten volgens het
principe van verplaatsing van lading. Een dergelijke detector is een vierkante chip (1 cm²) waarop tot
2000x2000 fotodetectoren aanwezig zijn. De verandering van de spanning is een maat voor de
ingevallen fotonen en dus voor de concentratie aan een element.
De positie van de elementjes op de chip is zo dat elk elementje de straling van een bepaalde
golflengte kan opvangen. Doordat er straling van verschillende golflengten tegelijk kan opgevangen
worden, is de techniek een simultane techniek.
Figuur 2.5.3
301

4.6 Dosering van zware metalen met AMA, GFAAS en ICP-MS
4.6.1 Welke metalen
Voedsel wordt gecontroleerd op Cd, Pb, As en Hg. De gehalten van Cd, Pb en Hg worden vergeleken
met normen vastgelegd in Europese regelgeving. Voor As zijn er nog geen normen vastgelegd. De
analyseresultaten zijn een hulp om te komen tot een normering.
4.6.2 De aard van de matrices
Voedingsmiddelen zijn zowel van plantaardige als van dierlijke aard. De stalen zijn vers, ingevroren,
geconserveerd of verwerkt.
Plantaardige voedingsmiddelen zijn zeer divers : zaden, groenten, fruit, dranken.
Ook bij de dierlijke voedingsmiddelen wordt er een onderscheid gemaakt : vlees, organen, wild,
gevogelte, vis en aquacultuurproducten.
Voor elk gelden er verschillende normen die naargelang de aard van het voedingsmiddel sterk uiteen
kunnen liggen (vb. max. 0,05 mg/kg Cd in rundvlees t.o.v. 1 mg/kg Cd in nieren).
4.6.3 Monstervoorbereiding
Voor elke bepaling worden de stalen eerst gehomogeniseerd door van de vaste stalen (groenten,
vlees, vis, zaden) het eetbaar gedeelte fijn te malen. Een deel daarvan wordt gebruikt voor de verdere
analyse.
Voor de analyse van kwik is er geen verdere behandeling van het staal vereist.
Cadmium en lood worden gemeten in oplossing en daarvoor wordt het staal volledig gedestrueerd met
salpeterzuur en waterstofperoxide in een microgolfoven. Door gebruik te maken van gesloten
recipiënten bereikt men een hogere temperatuur (180 °C) dan met open recipiënten, wat de snelheid
en de efficiëntie van de destructie ten goede komt.
Figuur 2.6.1 : Foto microgolfdestructieapparaat
302

4.6.4 Detectie van kwik met AMA
Kwik wordt direct op het gehomogeniseerde staal bepaald met de AMA (Advanced Mercury Analyser).
De detectielimiet voor kwik bedraagt 0,01 mg/kg.
Figuur 2.6.2 Schema werking AMA
Figuur 2.6.2 illustreert het analyseproces. Een staal met gekende massa of gekend volume wordt in
een nikkelschuitje afgewogen en in de AMA gebracht. Het schuitje wordt in het voorste deel van
katalysatorbuis met decompositieoven gebracht. Het staal wordt daar eerst gedroogd en vervolgens
thermisch afgebroken of verast.
De decompositieproducten worden vervolgens door de zuurstofstroom naar het tweede deel van de
katalysatorbuis gebracht. In dit deel van de katalysatorbuis wordt de oxidatie vervolledigd en worden
halogenen, stikstofoxiden en zwaveloxiden gebonden op filtermateriaal. Vervolgens worden de
decompositieproducten naar de amalgamator gebracht waar kwik selectief wordt gebonden op het
goud. De rest, dus alles wat niet kwik is, wordt doorheen de meetcellen naar de uitlaat van het toestel
afgevoerd. De amalgamator wordt steeds op 120 °C gehouden teneinde condensatie van water te
vermijden.
Teneinde de hoeveelheid kwik die gevangen werd op de amalgamator te kunnen meten, wordt de
amalgamator kortstondig opgewarmd waardoor de kwik vrijkomt in de vorm van een wolk. De
kwikwolk wordt door de zuurstofstroom naar de meetcellen gebracht. De kwik wordt eerst verzameld
in de vertragingscel en vanuit deze cel gaat de kwik naar een tweede, kortere meetcel. De
hoeveelheid kwik wordt in elk van de cellen gemeten bij 254 nm met de holle kathode lamp voor kwik.
Doordat de hoeveelheid kwik twee keer wordt gemeten met verschillende gevoeligheden, heeft de
AMA een dynamisch meetbereik van 0,05 – 600 ng Hg.
Voordelen van de techniek zijn de korte analysetijden (ongeveer 6 minuten voor één run), de lage
bepaalbaarheidsgrens en de hoge precisie.
Nadelen zijn verbonden aan de capaciteit van het nikkelschuitje: er kan maximaal gewerkt worden met
een massa van 100 mg staal. Voor stalen die veel organisch materiaal, vet of suiker bevatten, is de
massa inweeg beperkt tot 50 mg. Voor heterogene matrices is een doorgedreven homogenisatie
noodzakelijk om juiste resultaten te kunnen bekomen.
303

Als het verwachte kwikgehalte laag is, kan de bepaalbaarheidsgrens toch nog verhoogd worden via
accumulatie, dit is het na elkaar meten van kleinere substalen waarbij de resultaten worden
gecombineerd tot één resultaat.
4.6.5 Detectie van metalen met AAS Grafietoven
Cadmium en lood worden gedoseerd met de grafietoven (GFAAS : Graphite Furnace Atomic
Absorption Spectroscopy). De oplossing wordt in een grafietoventje gebracht. Door een voor elk
element specifiek temperatuurprogramma toe te passen, komt het te doseren element in vrije toestand
in gasfase.
Er wordt licht van een voor het betrokken element karakteristieke golflengte door het oventje gestuurd
en de absorptie is een maat voor de hoeveelheid van dit element (Wet van Lambert-Beer) dat aldus
gedoseerd wordt.
Elk element wordt telkens in een apart programma gemeten.
Voor cadmium en lood bedragen de detectielimieten resp. 0,010 mg/kg en 0,020 mg/kg.
4.6.6 Detectie van metalen met ICP-MS
Bij ICP-MS (Inductively Coupled Plasma – Mass Spectrometry) worden de te doseren elementen
eveneens in opgeloste toestand in een met een zeer hoge frequentie alternerend magnetisch veld
gebracht. Dit creëert een plasma waarin de elementen als vrije ionen voorkomen. Deze worden met
een inert dragergas getransporteerd in een magnetisch veld dat loodrecht staat op de richting van
verplaatsing. Bij een gelijke veldsterkte worden ionen met een verschillende massa en een zelfde
lading anders afgebogen en dus gescheiden. Door het variëren van de veldsterkte worden dan de
ionen sequentieel naar de detector gestuurd en gedoseerd. Dit gebeurt evenwel zodanig snel dat dit
zo goed als een simultane detectie kan beschouwd worden.
Met deze techniek liggen de detectielimieten 10-100 X lager dan bij de grafietoven.
304

4.7 Immunoassays
4.7.1 Inleiding
We weten dat tijdens een infectieziekte nieuwe weerstandsfactoren ontstaan die na de ziekte als
immuniteit kunnen blijven voortbestaan gedurende een zekere (korte of lange) periode. Deze
immuniteit is meestal specifiek, dus gericht tegen dezelfde ziekteverwekker en niet tegen andere
ziekteverwekkers.
In het serum vond men eiwitten die met de ziekteverwekker of zijn producten reageerden (agglutinatie
van bacteriën of neutralisatie van toxinen). Deze eiwitten noemde men antilichamen. Het antilichaambegrip
leidde tot de definitie van het begrip antigeen : een antigeen is een stof die, bij een bepaalde
diersoort, antilichamen kan opwekken en daarmee specifiek kan reageren.
Vooral stoffen met een grote molecuulmassa bleken goede antigenen te zijn, op voorwaarde dat zij
vreemd waren aan het lichaam dat de antistoffen moest produceren. De gastheer bezit dus de
merkwaardige eigenschap om een onderscheid te kunnen maken tussen lichaamseigen en
lichaamsvreemde stoffen.
De belangrijkste antigenen zijn lichaamsvreemde eiwitten, bacteriën en virussen, maar ook
koolhydraten en nucleïnezuren kunnen goede antigenen zijn.
Een antilichaam reageert specifiek met zijn bijhorend antigeen. Zo zal een antilichaam tegen
serumalbumine niet met hemoglobine reageren. Wij krijgen een soort sleutel-slot reactie, zoals we dit
kennen tussen enzym en substraat, maar ook hier is die specificiteit niet absoluut. Er is altijd
kruisreactie mogelijk met verwante antigenen.
4.7.2 Algemeen principe
Het principe van immunologische testen berust op de competitie tussen de component en een andere
gelabelde component voor de bezetting van een aantal plaatsen. Het label van het component kan
een radio-isotoop zijn (RIA), een enzym (EIA), een fluorescerende (FIA) of luminescerende molecule.
4.7.3 RIA
Labeling van antigenen en antilichamen met radio-isotopen heeft geleid tot de ontwikkeling van radioimmunoassays
(RIA). RIAs hebben een groot toepassingsgebied, zijn gevoelig, specifiek en
gemakkelijk uitvoerbaar. Daartegenover staat dat de stabiliteit van radio gelabelde moleculen laag is
door de korte halfwaardetijd van de radio-isotopen en dat de straling schade veroorzaakt aan de
gelabelde moleculen. Meer nog, door de gevaren voor de gezondheid en de afvalproblemen die
gepaard gaan met het gebruik van radio-isotopen, worden RIA’s meer en meer vervangen door nietradioactieve
immunologische methoden.
305

4.7.4 ELISA
Van het grootste belang in de ontwikkeling van niet-radioactieve immunoassays was de techniek
waarbij antigenen en antilichamen gelabeld kunnen worden met enzymen: het is een immunoenzymatische
bepaling die bekend staat als ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay.
Men kan verschillende reactieprincipes toepassen. De belangrijkste zijn de competitieve ELISA en de
sandwich methode:
4.7.4.1 Competitieve ELISA
Bij competitieve ELISA worden de wanden van de wells van een microtiterplaat gecoat met een
antilichaam dat specifiek is voor de te bepalen component. In elke well wordt het monster met het te
bepalen antigeen gebracht evenals bepaalde hoeveelheid met enzym gemerkt antigeen. Zowel het
antigeen in het monster als het met enzym gemerkt antigeen treden in competitie met elkaar, want ze
kunnen beide binden op de antilichamen die aan de wand van de wells gefixeerd zijn.
Wanneer het evenwicht is bereikt, worden de niet-gebonden antigenen via een wasstap verwijderd.
Wat overblijft op de wand van de wells zijn de antigenen die gefixeerd zijn onder de vorm van
antigeen-antilichaamcomplexen.
Na de wasstap wordt een chromogeen substraat toegevoegd dat specifiek is voor het enzym en dat
tijdens de incubatie wordt omgezet tot een gekleurd product. De gemeten absorptie is recht evenredig
met de hoeveelheid enzym in de well, en dus omgekeerd evenredig met de antigeenconcentratie in
het monster.
Het principe wordt hieronder schematisch weergegeven:
Figuur 2.7.1
306

4.7.4.2 Sandwich-methode
Bij deze techniek laat men antigenen van het monster reageren met een overmaat van aan de wand
gefixeerde antilichamen. Na een wasstap voor het verwijderen van niet-gebonden antigenen, wordt
een overmaat met enzym gemerkt antilichaam toegevoegd. Deze gemerkte antilichamen reageren
met de vrije plaatsen van de gebonden antigenen. Hoe meer antigeen er gebonden was op gefixeerde
antilichamen, des te meer gemerkte antilichamen er ook gebonden achterblijven op de wand. Er
bestaat een lineair verband tussen gemeten absorptie en antigeenconcentratie in het monster.
Schematisch:
4.7.4.3 Voor- en nadelen
Voordelen:
Figuur 2.7.2
• ELISA is een snelle en eenvoudige techniek: kant en klare kits zijn beschikbaar op de markt
en de voorbereiding van de monsters vraagt geen ingewikkelde opzuivering. Bovendien kan
een groot aantal monsters tegelijkertijd geanalyseerd worden en bestaat de mogelijkheid tot
automatisering.
• De techniek is veilig en relatief goedkoop: naast een microplaatlezer is geen aanschaf van
dure apparatuur nodig.
• ELISA is bovendien een zeer gevoelige techniek: bruikbaar op ppb en zelfs op ppt niveau.
• De methode is selectief: ze biedt de mogelijkheid om uit een mengsel van verschillende
stoffen, een specifieke stof (bv.chlooramfenicol) of een specifieke groep (bv. ß-agonisten) te
detecteren.
Nadelen:
• Er zijn altijd kruisreacties mogelijk met verwante antigenen, wat kan leiden tot valse nietconforme
resultaten (vals positief). Een bevestiging van verdachte monsters is noodzakelijk.
• Voor elke te bepalen stof of groep van stoffen is een specifieke ELISA kit vereist.
307

• Soms is er onvoldoende kruisreactie voor alle stoffen behorende tot een bepaalde groep.
4.8 Microscopie
4.8.1 Algemeen
Historisch gezien loopt de ontwikkeling van de microscopie voornamelijk via de uitbouw van de
samengestelde lichtmicroscoop, dat een instrument is met een samengesteld lenzenstelsel. Deze
ontwikkelingsgeschiedenis 7 begint omstreeks 1590.
Subtechnieken binnen de klassieke lichtmicroscopie zijn o.a. fasecontrast-, donkerveld-, fluorescentie-
en polarisatiemicroscopie.
Bij gebruik van een ander soort van golven, die ook gefocust kunnen worden, krijgt men elektronen-
en akoestische microscopie. Scanning tunneling en atomic force microscopie zijn recentere
ontwikkelingen die gebaseerd zijn op de aftasting van materiaal, soms tot op atomair niveau. De
bespreking van deze technieken valt evenwel buiten het bestek van deze syllabus.
4.8.2 Lichtmicroscopie
In deze korte bespreking beperken we ons uitsluitend tot de klassieke lichtmicroscopie met
doorvallend licht van onderen af.
Grofweg onderscheiden we in een lichtmicroscoop, van boven naar onder, de volgende belangrijke
onderdelen:
• het oculair: de lensconstructie nabij het oog van de waarnemer, die tot taak heeft om het door
het objectief) gevormde beeld verder te vergroten.
• het objectief : de lensconstructie nabij het object,
• het object: het object dat bekeken wordt zit meestal verwerkt in een preparaat,
• de condensor (met irisdiafragma),
• de lichtbron (ingebouwd) of spiegel.
De totale vergroting = vergroting Objectief x vergroting Oculair.
Theoretisch kan een maximale vergroting bereikt worden van ongeveer 1500x. De reden voor de
beperking van de vergroting ligt bij een (empirisch mathematisch) verband tussen de golflengte van
gewoon licht en de brekingsindex van het medium waardoor men kijkt, in combinatie met de sterkte en
kwaliteit van de gebruikte lenzen.
7 1590 Hans & Zacharias Janssen, 1660 Malpighi, 1665 Hooke, 1673 Van Leeuwenhoek
308

4.8.3 Praktische toepassing : Dierenmelen
4.8.3.1 Definities
• Dierenmeel: product verkregen door het verhitten, drogen en malen van kadavers van
warmbloedige landdieren of delen daarvan.
• Vismeel: product verkregen door de bewerking van vissen of delen van vissen.
4.8.3.2 Toxiciteit voor mens en/of dier
Dierenmeel en vismeel werden vroeger veel gebruikt als bron van eiwitten in diervoeders. Ze zijn
goedkoper dan plantaardige bronnen van eiwit zoals soja.
Nadat vastgesteld werd dat er een verband was tussen het gebruik van dierenmeel dat prionen bevat
en het aantreffen van de dollekoeienziekte en de ziekte van Creutzveld-Jacob bij de mens, werd het
gebruik hiervan sterk beperkt.
In 1994 werden eiwitten van zoogdieren verboden in diervoeders voor herkauwers. In 1997 werden de
condities vastgelegd voor de verwerking van dierlijke eiwitten: na de verkleining worden de dierlijke
bijproducten met verzadigde stoom ononderbroken verhit gedurende ten minste 20 minuten bij een
(absolute) druk van ten minste 3 bar en tot een kerntemperatuur van 133 °C.
In 2001 werd de “feed ban” uitgebreid naar een bijna totaalverbod voor het voederen van verwerkte
eiwitten van zoogdieren, vogels en vissen aan dieren gekweekt voor de voedselproductie. Enkele
uitzonderingen worden gemaakt, bijvoorbeeld voor het voederen van vismeel aan niet-herkauwers of
het gebruik van dierenmeel voor gezelschapsdieren of andere toepassingen zoals in biogasinstallaties
of verwerking tot biologische meststoffen of bodemverbeteraars onder strikte condities.
De wetgeving met betrekking op het verbod van dierlijke eiwitten is beschreven in Europese
verordeningen 999/2001 en 1774/2002 (antikannibalisme). De interactie tussen beide verordeningen
is weergegeven in onderstaande tabel.
309

Voor de productie van dierenmeel mag enkel gebruik gemaakt worden van materiaal van categorie 3
(dierlijke bijproducten die geen ernstig gevaar opleveren voor de verspreiding van op mens of dier
overdraagbare ziekten zoals afval van voor menselijke consumptie goedgekeurde dieren) zoals
gespecificeerd in de wetgeving in verband met dierlijke bijproducten. Categorie 1 en 2 omvatten de
producten die gevaar inhouden voor de gezondheid van mens en dier zoals met BSE besmette dieren
en dienen verwijderd te worden bijvoorbeeld door verbranding.
Gezien het dalend aantal gevallen van gekke koeienziekte (zie Figuur 2.8.1) heeft de Europese
Commissie een plan uitgewerkt dat in de toekomst de mogelijkheid biedt om het gebruik van
bestanddelen van dierlijke oorsprong onder strikte condities opnieuw toe te laten. Dit document wordt
de TSE roadmap genoemd. Het is een stappenplan waarin beschreven staat onder welke condities
bepaalde dierlijke eiwitten opnieuw kunnen worden toegelaten.
Er is reeds toelating tot het gebruik van bietenpulp met aanwezigheid van botfragmenten uit de bodem
na een gunstige risico-evaluatie die het frauduleus gebruik van dierlijke eiwitten uitsluit.
Het gebruik van vismeel is momenteel verboden bij herkauwers en er zijn strikte voorwaarden voor
gebruik bij niet-herkauwers.
Er kan een tolerantieniveau van 1% worden ingevoerd nadat aangetoond is dat een kwantificering
voldoende betrouwbaar kan worden uitgevoerd. Een volgende stap is dan toelaten van het gebruik
van dierlijke eiwitten voor niet-herkauwers, rekening houdend met de principes van antikannibalisme.
Figuur 2.8.1 : De evolutie van het aantal BSE-gevallen in België (Bron: jaarverslag 2009 FAVV)
310

4.8.3.3 Analysemethode
De officiële analysemethode voor dierlijke eiwitten is een microscopische methode en is gepubliceerd
in de Europese verordening 152/2009.
4.8.3.4 Uitvoering
4.8.3.4.1 Staalvoorbereiding
Figuur 2.8.2
Principe: het dierenmeel wordt door bezinking in een geschikte vloeistof (densiteitverschil met ander
materiaal) zoveel mogelijk afgescheiden en geïsoleerd.
Een bepaalde hoeveelheid vermalen diervoeder wordt in een afgemeten volume tetrachloorethyleen
ingebracht en intensief geschud. Vervolgens laat men alles een zekere tijd bezinken.
De eerste bezinkingsfractie wordt dan afgescheiden en het staal-tetrachloorethyleen mengsel wordt
opnieuw opgeschud. Na een tweede bezinkingsperiode wordt de tweede bezinkingsfractie ook
afgescheiden en met de eerste samengevoegd. Vervolgens wordt deze bezinkingsfractie via een
aantal spoelingen, decantaties, en een specifieke kleuring, gedroogd en gewogen.
4.8.3.4.2 Microscopische analyse & interpretatie
Dit residu wordt dan microscopisch onderzocht bij een vergroting van ongeveer 40x tot 600x op de
aanwezigheid van bot. De botstructuur geeft, afhankelijk van zijn afkomst (vis of landdier), een
specifiek beeld (kleur & structuur).
311

Indien de aanwezigheid van bot vastgesteld wordt, dan moet er bepaald worden of dit kwantitatief
boven de LOQ ligt. Dit gebeurt door eerst het relatieve (beeld)percentage van de botdeeltjes t.o.v. de
andere deeltjes te bepalen door telling, waarbij ook rekening gehouden wordt met de deeltjesgrootte.
Vervolgens kan er door terugrekening van dit percentage in combinatie met het oorspronkelijk gewicht
van het staal, het gewicht van de bezinkingsfractie en specifieke bezinkingsfactoren (volgens
herkomst van het bot) een geschat (gewichts)percentage gegeven worden voor het dierenmeel in het
voeder.
Opmerking: Microscopie, en zeker de kwantitatieve bepalingen, zijn zeer sterk afhankelijk van de
ervaring van de operator en kunnen dan ook gemakkelijk aanleiding geven tot een relatief hoge
herhaalbaarheid (tot rond 50%). Historisch zijn er ook redelijk grote verschillen in methodiek tussen
landen onderling zodat er nog een grote nood aan harmonisatie bestaat.
4.8.3.5 Microscopische structuren
4.8.3.5.1 Spiervezels
Figuur 2.8.3 Spiervezels
Spierbundels zijn georganiseerd in fascles die op hun beurt weer uit myofibrillen bestaan. We
onderscheiden 3 soorten spiervezels: gladde spiervezels, gestreepte spiervezels en hartspierweefsel.
Door de behandeling op hoge temperatuur en druk, is de gestreepte structuur van de spiervezels niet
altijd te zien (zie figuur).
312

Figuur 2.8.4: Gestreepte spiervezel
Spiervezels worden teruggevonden in de ruwe zeeffractie en zijn herkenbaar als cilindrische bundels
(zie Figuur 2.8.5)
Figuur 2.8.5 : spiervezels in ruwe zeeffractie
In de fijne zeeffractie zijn spiervezels herkenbaar als rechthoekige structuren (zie Figuur 2.8.6).
313

4.8.3.5.2 Botfragmenten & visgraten
Figuur 2.8.6
Figuur 2.8.7
Botten zijn georganiseerd in oseons die bestaan uit Haverse kanelen met bloedvaten, lacunae met
osteocyten en canaliculae. Microscopisch kunnen botfragmenten van landdieren en vissen van elkaar
onderscheiden worden.
Figuur 2.8.8 : visgraat Figuur 2.8.9 : bot van landdieren
314

Een eerste basis voor herkenning is de vorm van de fragmenten. Bij visgraten zijn deze eerder
langwerpig, terwijl botten van landdieren eerder afgerond zijn. Een ander belangrijk verschil zijn de
lacunae. Bij visgraten zijn deze zeer uitgerekt en afgeplat. De lacunae bij botten van landdieren zijn
eerder ovaal of rond.
4.8.3.5.3 Andere structuren
Andere structuren in het sediment die een aanwijzing zijn voor de identiteit van het dierlijk materiaal
zijn de aanwezigheid van tanden, eierschalen en visschubbben.
Figuur 2.8.10 : tand Figuur 2.8.11 : eierschaal
Figuur 2.8.12 : schub
315

Andere structuren die we in de zeeffracties terugvinden zijn haren en veren:
Figuur 2.8.13 : haar Figuur 2.8.14 : veer
316

5 KWALITEIT
5.1 Kwaliteitsmanagementsysteem
Kwaliteitsmanagement = de gecoördineerde activiteiten om een organisatie te sturen en te beheersen
met betrekking tot kwaliteit.
Kwaliteitsmanagement houdt in:
• het opstellen van een kwaliteitsbeleid (algemene bedoelingen en richting van de organisatie
met betrekking tot kwaliteit, zoals formeel door het management kenbaar gemaakt.);
• het opstellen van de kwaliteitsobjectieven (meer concreet wat wordt beoogd of waarnaar wordt
gestreefd);
• de kwaliteitsplanning opmaken (specifiëren welke de noodzakelijke processen zijn);
• de kwaliteitsbeheersing (gericht op het voldoen aan de kwaliteitseisen);
• de kwaliteitsborging (met als doel vertrouwen te geven m.b.t. de gestelde eisen);
• de kwaliteitsverbetering via een PDCA-cyclus (Plan Do Check Act cyclus) bestaande uit:
planning, uitvoering, controle en bijsturen. (zie figuren hieronder)
317

5.1.1 ISO 9001 / ISO 17025
5.1.1.1 Essentie van de 9001-norm
De ISO 9001 specifieert vereisten voor organisaties die:
• hun bekwaamheid moeten aantonen m.b.t. het verlenen van producten en diensten die
tegemoet komen aan de behoeften van de klanten en regelgevende vereisen, en
• die ertoe leiden dat de klantentevredenheid toeneemt.
De vereisten zijn generiek en van toepassing binnen organisaties in om het even welke industrie of
economische sector.
Essentiële kenmerken:
• resultaatgerichtheid;
• klantgerichtheid;
• leiderschap en leidinggeven;
• management door gebruik te maken van processen en feiten;
• betrokkenheid en ontwikkeling van medewerkers;
• continu leren, innoveren en verbeteren;
• ontwikkelen van partnerschappen;
• maatschappelijke verantwoordelijkheid.
Kenmerkend binnen deze filosofie is een evenwichtige aandacht voor alle belanghebbenden:
• klanten en leveranciers;
• medewerkers en managers (de organisatie);
• financierders;
• de maatschappij.
5.1.1.2 ISO 17025 t.o.v. ISO 9001
ISO 17025 bevat alle vereisten waaraan test- en kalibratielaboratoria moeten voldoen als zij wensen
aan te tonen dat:
• zij beschikken over een operationeel beheerssysteem;
• zij technisch bekwaam zijn
• zij technisch geldige resultaten kunnen produceren.
In ISO 17025 zijn ook bepaalde clausules gewijzigd of toegevoegd t.o.v. 9001 welke eerder op dit vlak
gesitueerd zijn. Daarom is ervoor gezorgd alle vereisten van ISO 9001 op te nemen in ISO 17025
318

welke relevant zijn voor het werkingsgebied van test- en kalibratielaboratoria. ISO 17025 is geen
sectorspecifieke toepassing van ISO 9001.
ISO 17025 legt de nadruk op het behoud van de technische bekwaamheid.
Met het voldoen van het kwaliteitsmanagementsysteem van het laboratorium aan de eisen van ISO
9001 wordt op zichzelf niet de bekwaamheid van het laboratorium aangetoond om technisch valide
gegevens en resultaten te produceren.
Test – en kalibratielaboratoria die voldoen aan de eisen van ISO 17025 zullen wel overeenkomstig
ISO 9001 werken voor die desbetreffende clausules welke in beide normen voorkomen.
5.1.1.3 ISO 17025 - Clausules
De ISO 17025 is opgebouwd uit:
• Eisen aan het management
• Technische eisen
Eisen aan het management:
• Organistie
• Managementsysteem
• Beheer van documentatie
• Beoordeling van aanvragen, offertes en contracten
• Uitbesteding van beproevingen en kalibraties
• Inkoop van diensten en goederen
• Dienstverlening aan de klant
• Klachten
• Beheer van afwijkingen in beproevingen en/of kalibraties
• Verbetering
• Corrigerende maatregelen
• Preventieve maatregelen
• Beheer van registraties
• Interne audits
• Directiebeoordeling
Technische eisen:
• Personeel
• Technische voorzieningen en omgevingsomstandigheden
• Beproevings- en kalibratiemethoden en validatie van methoden
319

• Uitrusting
• Herleidbaarheid van metingen
• Monsterneming
• Behandeling van te beproeven en/of te kalibreren objecten
• Waarborg van de kwaliteit van de beproevings- en kalibratieresultaten
• Rapportering van de resultaten
5.1.2 Accreditatie
5.1.2.1 Wat is een accreditatie?
Een accreditatie is een attest uitgegeven door een derde partij met betrekking tot een instelling die de
conformiteit van producten of diensten beoordeelt. Dit attest laat de instelling toe haar competenties,
onafhankelijkheid en onpartijdigheid te bewijzen.
Ze heeft betrekking op de:
• laboratoria,
• keuringsinstellingen,
• certificatie-instellingen.
De accreditatie versterkt het vertrouwen van de economische actoren en van de overheden belast met
de marktcontrole ten aanzien van de documenten uitgegeven door de geaccrediteerde instellingen:
rapporten van laboratoria of keuringsinstellingen, certificaten.
BELAC is de Belgische accreditatie-instelling. Ze is opgericht binnen een wettelijk kader en geplaatst
onder de verantwoordelijkheid van de FOD Economie.
5.1.2.2 Accreditatieprocedure
Een laboratorium dat zich wil laten accrediteren volgens ISO 17025 moet de volgende stappen
ondernemen (de chronologie kan naargelang de situatie verschillen):
• Onderzoeken of het bezit van een accreditatie nuttig of noodzakelijk is en zich verzekeren van
het engagement van het management.
• Beslissen welke activiteiten men onder accreditatie wil uitvoeren (scope vastleggen).
• Er voor zorgen dat men de norm volledig begrijpt teneinde bestaande of nieuwe
managementtools op de juiste wijze te implementeren, aan te passen of te creëren.
• Zorgen voor de vereiste personeelsleden, infrastructuur en apparatuur.
• Een gedocumenteerd managementsysteem uitwerken.
• Een sensibiliseringscampagne doorvoeren bij alle personeelsleden.
• Het gedocumenteerd managementsysteem implementeren.
320

• Communicatie verzekeren.
Na de voorbereidingen worden volgende stappen doorlopen in de accreditatieprocedure:
• Indienen van een aanvraag bij bvb. BELAC tot het laten uitvoeren van een pre-audit.
• Pre-audit wordt uitgevoerd.
• Opmerkingen van de pre-audit verwerken in het managementsysteem.
• Aanvraag indienen bij BELAC voor het uitvoeren van de initiële audit.
• Initiële audit wordt uitgevoerd.
• Voorlopig rapportering door de auditoren
• Non-conformiteiten van het type A moeten rechtgezet worden alvorens accreditatie kan
toegekend worden, voor non-conformiteiten van het type B moet een degelijk actieplan
opgesteld worden.
• Na rechtzetting van de non-conformiteiten type A en aanvaarding van het plan van aanpak
voor de non-conformiteiten type B wordt een definitief rapport opgemaakt en een positief
advies overgemaakt naar het Accreditatiebureau voor toekennen van de accreditatie.
• Het accreditatiebureau doet uitspraak en de accreditatie wordt toegekend.
• De accreditatiecyclus is gestart.
5.1.3 Kwaliteitscontrole
ISO/IEC 17025 (criterium 5.9) eist van laboratoria kwaliteitsbeheersing om de validiteit van de
uitgevoerde testen te bewaken. In de regel worden hierbij verschillende niveaus van controles
gehanteerd.
De controle gebeurt door de uitvoerende zelf. De procedure die hiervoor toegepast wordt, beschrijft:
• de frequentie van de kwaliteitscontrole;
• de acceptatiecriteria;
• welke stappen genomen moeten worden bij overschrijding van de acceptatiecriteria.
Mogelijkheden zijn:
• het analyseren van al dan niet gecertificeerde referentiematerialen;
• het analyseren van een controlemonster;
• het analyseren van een blanco;
• het analyseren van een duplo monster;
• controle op standaarden;
• controle op gespiked controlemateriaal.
321

Er wordt onderscheid gemaakt tussen verschillende soorten controles om de kwaliteit van de
beproevings- of kalibratieresultaten te waarborgen. In feite zijn er 3 niveaus van kwaliteitscontroles:
• 1 e -lijnscontrole: controle door de analist zelf;
• 2 e -lijnscontrole: controle onafhankelijk van de analisten, beheer door het laboratorium zelf;
• 3 e -lijnscontrole: ringtesten, interlaboratoriumtesten, e.d.
5.1.3.1 De 1 e -lijnscontrole
5.1.3.1.1 Algemeen
1 e lijnscontrole = beheersing van het analyseproces.
Kenmerken van 1 e -lijnscontrole:
• regelmatig met vaste frequentie
• uitvoering door de analist zelf
• controle door gebruik te maken van referentiematerialen en/of interne standaarden
• grafische weergave a.d.h.v. controlekaarten
• vooraf vastgelegde acceptatiecriteria voor elke parameter en voor elk analytisch systeem
Het controlemateriaal moet aan volgende punten beantwoorden:
• dezelfde matrix als de routinestalen;
• voldoende homogeniteit en stabiliteit;
• referentiewaarde gelegen in de buurt van de routinestalen;
• verschillend van de standaard gebruikt voor kalibratie van het toestel
5.1.3.1.2 Shewart controlekaarten
Doel
Het doel van een controlekaart is de natuurlijke variabiliteit van het analytisch proces te monitoren en
hierdoor het proces onder controle te houden. Dit gebeurt juist door de gebeurtenissen buiten
controle te ontdekken en zelfs te anticiperen aan de hand van statistisch onderbouwde beslissingen.
Men baseert zich op de berekening van het gemiddelde en de standaardafwijking (of de range) welke
in functie van de tijd gevolgd wordt op een Shewart controlekaart.
X-kaart
De individuele resultaten worden vergeleken met de referentiewaarde van het controlemateriaal of het
gemiddelde van de analyses van het controlemateriaal.
322

R-kaart
De resultaten worden vergeleken ten opzichte van de reproduceerbaarheid van de parameter in
kwestie.
In geval van duplo’s dient de R-kaart om de herhaalbaarheid van het proces te evalueren.
Interpretatie van de individuele resultaten
De grenzen zijn vastgesteld op:
o ± 3 maal de standaardafwijking = actiegrens (Control level (CL) in het engels): analytisch
proces is buiten controle
bovenste actiegrens = UCL
onderste actiegrens = LCL
o ± 2 maal de standaardafwijking = waarschuwingsgrens (Warning level (WL) in het engels): de
analist moet bedacht zijn op mogelijke bedreiging van de kwaliteitsbeheersing
bovenste waarschuwingsgrens (UWL)
onderste waarschuwingsgrens (LWL)
Voorbeelden van controlekaarten:
323

Voor de identificatie van toevallige of systematische veranderingen worden controleregels gehanteerd,
welke door het laboratorium zelf worden bepaald.
Hieronder een aantal van de meest gebruikte regels die erop kunnen wijzen dat een analyse buiten
controle valt:
• 1 individueel resultaat buiten de actiegrenzen;
• 3 opeenvolgende resultaten tussen de actiegrens en de waarschuwingsgrens;
• trendanalyse:
o opeenvolgende resultaten langs dezelfde kant van de referentiewaarde of het
gemiddelde (8e punt wordt beschouwd als “buiten controle”;
o 6 opeenvolgende stijgende of dalende resultaten (6 e punt wordt beschouwd als
“buiten controle”;
o 14 opeenvolgende resultaten alternerend stijgend en dalend;
o 4 opeenvolgende resultaten die meer dan 1 standaard deviatie van de referentiewaarde
of het gemiddelde verwijderd zijn;
324

Voorbeelden van processen “buiten controle”:
concentratie (ppb)
concentratie (ppb)
85
75
65
55
45
35
25
15
5
85
75
65
55
45
35
25
15
5
1
1
3
3
5
1 waarde overschrijdt de actielimiet
7
9
11
13
15
17
19
21
concentratie (ppb) -3s
-2s GEM
+2s +3s
23
25
3 opeenvolgende waarden gelegen tussen de
waarschuwingslimiet en de actielimiet
5
7
9
11
13
15
17
19
21
concentratie (ppb) -3s
-2s GEM
+2s +3s
23
25
27
27
29
29
325

concentratie (ppb)
85
)
b 75
p
(p 65
55
tie
45
tra
n 35
e
c
n
25
o
c 15
5
85
75
65
55
45
35
25
15
5
een opwaartse of neerwaartse trend van 6 opeenvolgende
punten waarbij het 6e punt als abnormaal wordt beschouwd
1 3 5 7 9
1
3
1
5
1
7
1
9
1
1
2
concentratie (ppb) -3s
-2s GEM
+2s +3s
8 opeenvolgende waarden boven of onder het gemiddelde
waarbij het 8ste punt als abnormaal wordt beschouwd
1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
concentratie (ppb) -3s
-2s GEM
+2s +3s
Een controlekaart moet herstart worden indien er zich een ingrijpende verandering voordoet aan de
methode.
Interpretatie op lange termijn
Periodiek moeten de resultaten van de controlekaarten, het gemiddelde en de standaard-afwijking,
beoordeeld worden (bvb. na 30 punten) en indien nodig moeten de controlegrenzen en het
gemiddelde aangepast worden. Dit gebeurt via een test voor het gemiddelde en een F-test voor de
standaardafwijking.
23
3
2
25
5
2
27
7
2
29
9
2
326

Vergelijking van de standaardafwijking van twee shewartkaarten (F-test)
Voor de vergelijking van de standaardafwijking van 2 controlekaarten wordt gebruik gemaakt van de Ftest:
2
F = s / s 1
s1 en s2 zijn respectievelijk de standaardafwijkingen van de voorgaande en de laatste volle
controlekaart
De bekomen F-waarde wordt vergeleken met de F-waarde voor 5% éénzijdige overschrijdingskans
voor n1 -1 en n2 -1 vrijheidsgraden, waar n1 en n2 het aantal waarnemingen in respectievelijk de
voorgaande en laatste volle controlekaart zijn. Deze waarden kunnen opgezocht worden in de tabellen
van bijvoorbeeld het boek “Use of Statistics to Develop and Evaluate Analytical Methods” van Grant T.
Wernimont; Edited by William Spendley.
Indien F-berekend > F-tabel voor 5%, dan zijn de standaardafwijkingen significant verschillend.
De uitvoering van de noodzakelijke berekeningen voor de F-test kan ook gebeuren via een
programma, Statgraphics. Hier wordt de nulhypothese (H0), waarbij de gelijkheid van beide
standaardafwijkingen gesteld wordt, getest t.o.v. de alternatieve hypothese (H1) waarbij deze niet gelijk
zijn. Indien de bekomen P-waarde groter of gelijk is aan 0,05, dan kan men de nulhypothese
aanvaarden.
Vergelijking van de gemiddelden van twee shewartkaarten (t-test)
Voor de vergelijking van de gemiddelden van 2 controlekaarten wordt gebruik gemaakt van de t-test.
Vooraleer de t-test uit te voeren mag de F-test geen significante verschillen aantonen tussen de
standaardafwijking van beide kaarten:
s
2
2
2
( n −1)
s + ( n −1)
s
1
1
2
2
=
( n + n − 2)
1
• s1 en s2 zijn respectievelijk de standaardafwijkingen van de voorgaande en de laatste volle
controlekaart
• n1 en n2 zijn het aantal waarnemingen in respectievelijk de voorgaande en laatste volle
controlekaart
t =
s
x − x 2 1
( 1/
n + 1/
n )
1
2
2
2
2
327

•
x en
1
controlekaart
x zijn de gemiddelden van respectievelijk de voorgaande de laatste volle
2
• s = standaardfout van het verschil tussen de gemiddelden
De bekomen t-waarde wordt vergeleken met de t-waarde voor 5% overschrijdingskans met (n1 + n2 -
2) vrijheidsgraden. Deze waarden kunnen opgezocht worden in de tabellen van bijvoorbeeld het boek
“Use of Statistics to Develop and Evaluate Analytical Methods” van Grant T. Wernimont; Edited by
William Spendley.
Indien t-berekend > t-tabel voor 5%, dan zijn de gemiddelden significant verschillend.
De uitvoering van de noodzakelijke berekeningen voor de t-test kan ook gebeuren via Statgraphics.
Hier wordt de nulhypothese (H0), waarbij de gelijkheid van beide gemiddelden gesteld wordt, getest
t.o.v. de alternatieve hypothese (H1) waarbij deze niet gelijk zijn. Indien de bekomen P-waarde groter
of gelijk is aan 0,05, dan kan men de nulhypothese aanvaarden.
5.1.3.2 De 2e-lijnscontrole
De controle wordt uitgevoerd bij voorkeur zonder medeweten van de analist waarbij een staal anoniem
in het analyseproces wordt gebracht.
Dit wordt vaak beschouwd als een aanvulling van een derdelijnscontrole.
Vaak wordt gebruik gemaakt van gespiked materiaal, van submonsters of van duplo’s.
De resultaten van de 2 e -lijnscontroles worden aanvaard indien het verschil lager blijft dan de
reproduceerbaarheidslimiet of de herhaalbaarheidslimiet, al dan niet afhankelijk van de
omstandigheden onder dewelke de controle is uitgevoerd.
5.1.3.3 De 3e-lijnscontrole (ringonderzoeken)
5.1.3.3.1 Principe
Ringonderzoeken zijn een middel om de technische bekwaamheid en de operationaliteit van het
kwaliteitsmanagementsysteem aan te tonen.
BELAC gaat ervan uit dat minstens eenmaal per 3 jaar elke test of type van test aan bod komt. Bij
belangrijke wijzigingen aan de methode moet de frequentie aan deelname herbekeken worden.
328

5.1.3.3.2 Organisatoren van ringonderzoeken
De organisator van ringonderzoeken is een leverancier van diensten en de selectie van de organisator
moet gesteund zijn op een evaluatie van de geschiktheid van de voorstelde diensten met betrekking
tot de noden. Deze leverancier van diensten moet geëvalueerd worden overeenkomstig de eisen van
de clausule 4.6.4 van de norm NBN EN ISO/IEC 17025.
In het algemeen zal de evaluatie betrekking hebben op volgende elementen:
• De competentie van de organisator van geschiktheidsbeproevingen: deze kan aangetoond
worden door het bezitten van een accreditatie die rekening houdt met de eisen van de Gids
ISO/IEC 43. Doet een labo echter beroep op een niet-geaccrediteerde organisator, moet het
labo een eigen evaluatie uitvoeren en documenteren.
• Het type materiaal/matrix moet zo goed mogelijk overeenstemmen met de in het laboratorium
onderzochte materialen of matrices.
• De gevraagde parameters moet een zo groot aantal parameters omvatten van de parameters
die door het laboratorium onderzocht worden.
• Het meetbereik moet zo dicht mogelijk aansluiten bij de werkelijke situatie van het
laboratorium.
• De frequentie moet toelaten om tegemoet te komen aan de noden van het laboratorium. De
deelname aan ringonderzoeken moet een efficiënt middel zijn voor het beheer van de
kwaliteit.
• Het gebruikte protocol voor de statistische analyse van de resultaten moet duidelijk
omschreven zijn.
5.1.3.3.3 De z-score
Formule
z-score = (xlab - xref) / s
met: xlab: gemiddelde resultaat van het laboratorium
xref: gecertificeerde waarde/consensuswaarde
s : gepaste schatting van de spreiding, welke zo gekozen wordt dat ze beantwoordt aan
de doelstellingen van het ringonderzoek en betrouwbaar is, wat wil zeggen gebaseerd
op een voldoende aantal observaties.
Voor de berekening van s worden vaak 2 methodes gebruikt:
• s wordt berekend als de standaardafwijking voor elk ringonderzoek en voor elke combinatie
“matrix/analyt”, op basis van de resultaten van de deelnemers na de eliminatie van de outliers
of door gebruik te maken van wat men noemt robuuste statistiek;
• aan s wordt een vast waarde opgelegd. Deze laatste keuze wordt het meest gebruikt omdat zij
het mogelijk maakt om de z-scores van een bepaald laboratorium voor verschillende
ringonderzoeken te vergelijken.
329

• Verschillende mogelijkheden bestaan om deze waarde te bepalen:
o door “aanvaarding” (op arbitraire basis, in overeenkomst tussen de organisator en de
deelnemers);
o een voorgeschreven spreiding (in functie van de vereiste precisie voor een goede
interpretatie van de gegevens in functie van de concentratie);
o door vergelijk met een gevalideerde methode. Wanneer een referentiemethode dient
gebruikt te worden bij het ringonderzoek, kan de interlaboratorium
reproduceerbaarheid van deze methode gebruikt worden;
o bij gebrek aan de vorige, door vergelijking met een algemeen model zoals de Horwitz
curve welke per concentratieniveau een typische reproduceerbaarheid oplevert.
Evaluatie van de z-score
• z-score ≤ 2 : gunstig
• 2 < z-score ≤ 3 : twijfelachtig resultaat
• z-score > 3 : ongunstig
5.1.3.3.4 De zeta-score
Om de consistentie van de meetonzekerheid met ringtestresultaten te evalueren, dus om na te gaan
of de berekende meetonzekerheid realistisch is, worden zeta-scores gebruikt.
Formule
zeta = (xlab - xref) / [√ (uref ² + ulab ²)]
met: uref: standaard meetonzekerheid van de referentiewaarde
ulab: standaard meetonzekerheid van het laboratorium
xlab: gemiddelde resultaat van het laboratorium
xref: gecertificeerde waarde/consensuswaarde
Evaluatie van de zeta-score
• |zeta| ≤ 2 : gunstig
• 2 < |zeta| ≤ 3 : twijfelachtig resultaat
• |zeta| > 3 : ongunstig
330

5.1.4 Validatie van methoden
5.1.4.1 Onderwerp en toepassingsgebied
Deze validatieprocedure geeft de algemene richtlijnen aan met betrekking tot het beheerst toepassen
van genormaliseerde analysemethoden en tot het valideren van eigen ontwikkelde analysemethodes
die in routinematig en wetenschappelijk onderzoek worden uitgevoerd.
• Voor eigen ontwikkelde analysemethoden worden validatieplannen opgesteld met een
beschrijving van de validatieparameters die moeten onderzocht worden in het kader van de
van toepassing zijnde nationale en internationale normen, in functie van de eisen van de klant
of in functie van de vooropgestelde doelstelling.
• Voor genormaliseerde analyse methode wordt een procedure opgesteld waarbij de operatoren
aantonen dat ze de analysemethode kunnen toepassen en beheersen.
5.1.4.2 Definities en afkortingen van een aantal begrippen
Het is belangrijk te vermelden dat er geen consensus bestaat voor het definiëren van de
validatieparameters die tijdens de validatie gebruikt worden. Met kan zich baseren op volgende
documenten: ISO 5725 (1 – 6), ISO 17025, ISO 3534-1, Europese beschikking 2002/657/EC
(SANCO), pharmacopee, AOAC/IUPAC, ….
Begrip / Afkorting Beschrijving
Kwalitatieve methode Is een analysemethode waarmee een stof wordt geïdentificeerd
aan de hand van zijn chemische, biologische of fysische
eigenschappen.
Kwantitatieve methode Is een analysemethode waarmee de hoeveelheid of massafractie
van een stof wordt bepaald zodat die als numerieke waarde in de
juiste eenheid kan worden uitgedrukt.
Screeningsmethode Een methode die wordt gebruikt om een stof of een klasse van
stoffen op het betrokken concentratieniveau vast te stellen. Indien
met deze methode een vermoedelijk niet-conform resultaat wordt
bekomen dan moet het resultaat bevestigd worden door een
bevestigingsmethode.
Bevestigingsmethode Een methode die volledige of aanvullende informatie levert voor de
ondubbelzinnige identificatie en zo nodig de kwantificering van de
stof op het betrokken concentratieniveau.
Flexibele scope De mogelijkheid om een nieuwe eigenschap (vb nieuwe analyt
en/of een nieuwe matrix) aan de scope toe te voegen mits een
aangepaste validatie en zonder dat er een externe audit wordt
uitgevoerd.
Valideren Geheel van activiteiten noodzakelijk om aan te tonen dat de
beschreven analysemethode betrouwbare en exacte resultaten
oplevert die voldoen aan de vooropgestelde doelstelling.
Juistheid (Eng.:Trueness) De mate van overeenstemming tussen de gemiddelde waarde
331

Begrip / Afkorting Beschrijving
verkregen uit een reeks meetwaarden en de ware waarde (ISO
3534-1). Deze parameter is van toepassing als gecertificeerd
referentiemateriaal (CRM) kan gebruikt worden.
De gebruikelijke maat voor de juistheid is de bias die dus
overeenkomt met de positieve of negatieve systematische fout.
Rendement (Eng.:Recovery) Het percentage van de werkelijke concentratie van een stof dat in
de analyse wordt teruggevonden.
Deze parameter is van toepassing indien geen CRM ter
beschikking is.
Herhaalbaarheid
(Eng.:Repeatability)
Intra-reproduceerbaarheid
(Eng: Intra-reproducibility)
Inter-reproduceerbaarheid
(Eng: Inter-reproducibility)
Aantoonbaarheidsgrens
(Eng: Limit of detection of
LOD)
Bepaalbaarheidsgrens (Eng:
Limit of quantification of
LOQ)
Een maat voor de spreiding tussen de meetresultaten verkregen
door een analyse op hetzelfde monster herhaalde malen uit te
voeren met dezelfde methode, door dezelfde analist, met dezelfde
meetapparatuur en op zo dicht mogelijk bij elkaar gelegen
tijdstippen (ISO 3534-1).
De gebruikelijke maat is de herhaalbaarheidsstandaardafwijking sr
of de herhaalbaarheids-variatiecoëfficiënt (CVr).
Een maat voor de spreiding tussen meetresultaten verkregen door
hetzelfde laboratorium, met dezelfde methode, op identiek
materiaal onder verschillende omstandigheden, d.w.z. in
verschillende laboratoriumruimten, door verschillende analisten,
met verschillende apparaten en batches reagentia/standaarden, op
verschillende tijdstippen met grotere tussenpozen (ISO 3534-1).
De gebruikelijke maat is de intrareproduceerbaarheidsstandaardafwijking
(sL) of de intrareproduceerbaarheidsvariatiecoëfficiënt
(CVL).
Een maat voor de spreiding tussen meetresultaten verkregen in
verschillende laboratoria (ringtesten), met dezelfde methode, op
identiek materiaal onder verschillende omstandigheden, d.w.z.
door verschillende analisten, met verschillende apparaten en
batches reagentia/standaarden, op verschillende tijdstippen met
grotere tussenpozen (ISO 3534-1).
De gebruikelijke maat is de interreproduceerbaarheidsstandaardafwijking
sR of de interreproduceerbaarheidsvariatiecoëfficiënt
(CVR).
De laagst, gemeten concentratie van een component die in het
analysemonster met een bepaalde statistische waarschijnlijkheid
met de analysemethode kan aangetoond worden. Het is een
kwalitatief criterium dat resulteert in een signaal/ruis verhouding
van 3.
De laagst, gemeten concentratie van een component die in het
analysemonster met een bepaalde precisie en juistheid met de
analysemethode gekwantificeerd kan worden. Het is een
kwantitatief criterium dat resulteert in een signaal/ruis verhouding
van 6.
Lineariteit (Eng: Linearity) Lineariteit van een analysemethode kan gedefinieerd worden als
de mogelijkheid om binnen een gegeven range meetresultaten te
verkrijgen welke rechtstreeks evenredig zijn met de concentratie
(hoeveelheid) te meten bestanddeel in het te analyseren staal.
332

Begrip / Afkorting Beschrijving
Werkgebied of bereik (Eng:
Range, Measuring range,
Working range)
De regressieparameters welke door lineaire regressie bepaald
worden zijn de richtingscoëfficiënt (slope) en het intercept of
snijpunt van de rechte met de y-as.
Er kunnen betrouwbaarheids- of confidentie-intervallen van beide
regressieparameters, alsook van de ganse regressielijn en van
waarden van x of y, voorspeld uit de regressielijn, berekend
worden.
Alvorens een regressieanalyse uit te voeren moet vooraf
onderzocht of de calibratielijn een rechte is. Wanneer nietlineariteit
zich voordoet kan dit te wijten zijn aan een probleem bij
één van de extreme concentratieniveaus van de range en wordt
deze validatie uitgevoerd over een kortere concentratie range.
Het interval tussen de kleinste en grootste hoeveelheid
(concentratie) van de te bepalen component waarvoor de
analysemethode gevalideerd is, m.a.w. waarbinnen de
prestatiekenmerken aan gedefinieerde eisen voldoen.
Selectiviteit (Eng: selectivity) Een analysemethode is selectief als de methode met gedefinieerde
waarschijnlijkheid en meetfout de te bepalen component kan
onderscheiden van andere producten.
De mate waarin een methode de te bepalen component in een
mengsel of matrix kan onderscheiden van andere bestanddelen.
De potentiële bijdragen betreffen zowel interferenties als matrices.
Specificiteit (Eng: Specificity) Een analysemethode is specifiek als de methode alleen de
eigenschap (vb. component) meet die men wenst te meten.
Robuustheid (Eng:
Ruggedness, Robustness)
Meetonzekerheid (Eng:
Expanded uncertainty)
5.1.4.3 Doel van validatie
De ongevoeligheid van een methode voor kleine variaties die aan
de uitvoeringomstandigheden van de analytische procedure
worden aangebracht.
De meetonzekerheid (U) wordt gedefinieerd als de halve lengte
van een interval waarbinnen de ware waarde wordt verwacht te
liggen, en dit bij een bepaald betrouwbaarheidsniveau. (U = [b] + 2
CVtot).
Bij het valideren van een analysemethode stelt men zich tot doel informatie te bekomen over het
toepassingsgebied van de methode en over de meetonzekerheid van de analyseresultaten zodat kan
worden vastgesteld of de methode beantwoordt aan de vooropgestelde analytische doelstelling.
Hierbij moeten de analyseverantwoordelijke en de uitvoerders een antwoord trachten te geven op de
volgende vragen:
• Is de analysemethode adequaat? (geschikt voor het gedefinieerde toepassingsgebied en de te
meten eigenschap)
• Is de analysemethode robuust? (in welke mate hebben de tijd, de uitvoerder, het type
apparaat, de omgevingsomstandigheden, de methodevariabelen, e.a., een invloed op het
analyseresultaat?)
• Wat is de meetonzekerheid van de analysemethode?
333

5.1.4.4 Types van methoden
Er worden 4 categorieën van methoden onderscheiden :
• de kwalitatieve methode;
• de kwantitatieve methode;
• de screeningsmethode;
• de bevestigingsmethode.
Onder de vermelde methoden dient verder een onderscheid te worden gemaakt tussen :
• nieuwe methoden;
• genormaliseerde, gevalideerde of equivalent (referentie- of standaardmethoden);
• gewijzigde methoden;
• flexibele scope.
5.1.4.4.1 Nieuwe methode
Een methode die door het laboratorium zelf is ontwikkeld en waarvan de validatieparameters nog niet
eerder werden bepaald. In dit geval moet de uitvoerder een validatieplan opstellen met vermelding van
de validatieparameters die zullen onderzocht worden overeenkomstig de criteria van de van
toepassing zijnde nationale en internationale normen (vb. Beschikking 2002/657/EG ter uitvoering van
de Richtlijn 96/23/EG), de eisen van de klant of aan de vooropgestelde analytische doelstelling.
Voor kwalitatieve methoden is het aangewezen, maar zonder beperking, de volgende
validatieparameters te onderzoeken:
• selectiviteit/specificiteit;
• juistheid/recovery;
• bepalingslimiet .
Voor kwantitatieve methoden is het aangewezen, maar zonder beperking, de volgende
validatieparameters te onderzoeken:
• juistheid/recovery;
• werkgebied;
• precisie (herhaalbaarheid en intra-reproduceerbaarheid);
• selectiviteit;
• robuustheid;
• bepalingsgrens;
• lineariteit.
334

5.1.4.4.2 Genormaliseerde, gevalideerde methode of equivalent (Referentie- of
standaardmethoden)
Een methode die door een nationaal of internationaal erkende organisatie (ISO, CEN, AFNOR, e.a.) is
aanvaard en/of waarvan de validatieparameters geheel of gedeeltelijk bekend zijn voor het
beschreven toepassingsgebied. De uitvoerder moet aantonen dat hij de in de norm beschreven
specificaties (vb.: criteria voor herhaalbaarheid) kan bekomen.
Voor een genormaliseerde, gevalideerde methode of equivalent (vb commerciële kits) volstaat het
meestal aan te tonen dat men de analysemethode beheerst. Bijgevolg zal het validatieonderzoek
meestal beperkt zijn tot het bepalen van:
• juistheid/recovery;
• herhaalbaarheid;
• intra-reproduceerbaarheid.
5.1.4.4.3 Gewijzigde methode
Een genormaliseerde, gevalideerde methode waarin ten gevolge van omstandigheden wijzigingen
werden aangebracht. Het laboratorium moet kunnen aantonen dat de aangebrachte wijzigingen geen
invloed hebben op de in de genormaliseerde beschreven specificaties. Voor kwantitatieve methoden
moet bepaald worden:
• juistheid/recovery;
• herhaalbaarheid;
• intra-reproduceerbaarheid.
5.1.4.4.4 Flexibele scope
Analyses ter uitvoering van de richtlijn 96/23/EG overeenkomstig beschikking 2002/657/EG: na het
bekomen van de flexibele scope kan een nieuwe analyt en/of nieuwe matrix aan de lijst worden
toegevoegd zonder dat er een audit wordt uitgevoerd mits een volledige of secundaire validatie. In het
laboratorium wordt een lijst bijgehouden met de analyten, het niveau en de individuele matrices,
waarop de (secundaire) validatie is uitgevoerd met een vermelding van de datum van deze validatie.
Wanneer bv. de methode onveranderd of met kleine (minor) (vb. lichtjes gewijzigde opzuiveringsmethode)
aanpassingen kan toegepast worden op een nieuwe matrix of nieuwe submatrix, mag onder
flexibele scope overgegaan worden tot deze submatrix mits een secundaire validatie.
Bij belangrijke (major) aanpassingen moet een volledige validatie worden uitgevoerd. De uitbreiding
van de scope mag slechts worden uitgevoerd wanneer aan de specifieke criteria is voldaan.
335

5.1.4.5 Monsterkeuze
Als algemene regel geldt dat monsters zoveel mogelijk representatief moeten zijn voor het
toepassingsgebied (of deelgebied). In een verzameling monsters moeten dus de meest voorkomende
matrices vertegenwoordigd zijn.
Reproduceerbaarheid, herhaalbaarheid, selectiviteit en robuustheid worden in principe bepaald op
praktijkmonsters of monsters die hierop zoveel mogelijk gelijken.
Voor evaluatie van de lineariteit gebruikt men dezelfde matrix als bij de kalibratie.
Voor validatie van de juistheid (of rendement; cf definities) gebruikt men, in volgorde van voorkeur
maar steeds de gelijkenis met praktijkmonsters voor ogen houdend:
• gecertificeerd referentiemateriaal;
• rondzendmonster met een consensuswaarde;
• geaddeerde praktijkmonsters;
• net-gecertificeerd referentiemateriaal met een waarde die onafhankelijk is van het te valideren
systeem.
5.1.4.6 Validatieplan
5.1.4.6.1 Stappenplan
Voer achtereenvolgens onderstaande stappen uit :
• Bepaal op basis van het doel en het statuut van de analysemethode (genormaliseerde,
afgeleide van de genormaliseerde, eigen ontwikkelde) welke validatieparameters bepaald
moeten worden.
• Bepaal het toepassingsbied (matrices en werkgebied) waarvoor de analysemethode
gevalideerd moet worden met inbegrip van de hoofdgroepen en hun secundaire groepen.
• Verifieer of er externe eisen gelden voor bepaalde validatieparameters.
• Bepaal welke monsters er nodig zijn voor het validatieonderzoek.
• Voer het validatieonderzoek uit.
• Beoordeel het meetresultaat in functie van eventuele externe eisen of rechtstreeks ten
opzichte van het gebruiksdoel.
• Rapporteer de resultaten in het validatierapport.
336

5.1.4.6.2 Validatieonderzoek
Om het validatieonderzoek te kunnen reconstrueren moet men over de volgende informatie
beschikken:
• Wie is verantwoordelijk voor het validatieproces?
• Wie voert het validatieproces uit?
• Wanneer wordt het validatieproces uitgevoerd?
• Welke validatieparameters worden er onderzocht?
• Welke middelen (apparatuur, materialen, referentiestoffen, e.a.) worden er gebruikt?
• Hoe worden de validatiegegevens geregistreerd?
• Hoe worden de validatiegegevens statistisch behandeld ? (bv.: welke methode wordt er
gebruikt, hoeveel metingen worden er uitgevoerd om validatieparameters statistisch te
evalueren, e.a.)
• Hoe worden de gegevens geïnterpreteerd (bv.: vastleggen van criteria en
meetonzekerheden)?
• Wie keurt de methode goed ?
5.1.4.7 Validatierapport
Het validatierapport kan een afzonderlijk document, een validatiedossier of een onderdeel van een
analyseprocedure zijn. Het rapport moet ten minste de volgende elementen bevatten:
• de identificatie (bv.: titel, code) van het validatieproces;
• de naam van het laboratorium (afdeling);
• de naam van de verantwoordelijke van het validatieproject;
• de naam van de uitvoerder(s) van de validatie;
• de titel van de analysemethode;
• het doel en het toepassingsgebied van de gevalideerde analysemethode;
• een gedetailleerde beschrijving van de analysemethode;
• de periode waarbinnen de validatie werd uitgevoerd;
• alle ruwe gegevens;
• de besluiten, met inbegrip van de specificaties van de diverse validatieparameters.
Alle documenten die betrekking hebben op de validatie van een methode (validatieproces, ruwe
gegevens, rapport, correspondentie) moeten bewaard blijven ten einde een totale reconstructie van de
validatie te kunnen uitvoeren.
Alle documenten betreffende de uitgevoerde validatie moeten in het laboratorium gearchiveerd
worden zolang als de methode wordt toegepast.
337

5.1.5 Meetonzekerheid voor kwantitatieve chemische analyses
5.1.5.1 Definities en afkortingen
Afkorting Beschrijving
b en %b bias / relatieve bias
Cbelast
Ccons
de waarde waarop een proefmonster belast (gespiked) werd
de consensuswaarde bij een ringtest
Cref
de referentiewaarde
CRM gecertificeerd referentiemateriaal (certified reference material)
%d relatief duploverschil
K dekkingsfactor om over te gaan van de relatieve meetonzekerheid %u
naar de uitgebreide relatieve meetonzekerheid %U
%MSbias de gemiddelde relatieve kwadratensom (Mean Square) van de bias
R de reproduceerbaarheid (= 2,8 sR)
%Rgem
de relatieve gemiddelde range (voor duplo’s : het gemiddelde van de
relatieve duploverschillen %d tussen twee gepaarde waarden)
RSD de relatieve standaardafwijking, berekend als RSD = 100 * s/X met s
de standaardafwijking en X de meetwaarde. RSD wordt uitgedrukt
in %.
RSDbias
de relatieve standaardafwijking van de bias
RSDCC
de relatieve standaardafwijking afgeleid uit een controlekaart
S de standaardafwijking
sCRM en RSDCRM de (relatieve) standaardafwijking afgeleid uit de controlekaart van een
sr en RSDr
sR en RSDR
ubias en %ubias
uc
uRw en %uRw
uCref en %uCref
CRM
de (relatieve) standaardafwijking onder herhaalbaarheidsomstandigheden
de (relatieve) standaardafwijking onder reproduceerbaarheidsomstandigheden
de (relatieve) meetonzekerheid op de bias
de gecombineerde meetonzekerheid
de (relatieve) meetonzekerheid op de intra-lab reproduceerbaarheid
de (relatieve) meetonzekerheid verbonden met de referentiewaarde
van een CRM
%u de relatieve meetonzekerheid, %u = 100 * u/X met X de meetwaarde.
%u wordt uitgedrukt in %.
%ubelast de relatieve meetonzekerheid op de belaste waarde (spike) bij een
terugvindings(recovery)experiment
%uCref, belast
%uCons
%uref
%up
%uv
de relatieve meetonzekerheid op de standaardoplossing die gebruikt
werd bij een terugvindings(recovery)experiment
de relatieve meetonzekerheid van de consensuswaarde bij een
ringonderzoek
de relatieve meetonzekerheid van alle consensuswaarden bij
meerdere ringonderzoekingen
de relatieve bias van het pipetvolume zoals gebruikt bij een
terugvindings(recovery)experiment
de relatieve meetonzekerheid van het pipetteren bij een
338

Afkorting Beschrijving
terugvindings(recovery)experiment
U en %U de (relatieve) uitgebreide meetonzekerheid
5.1.5.2 Algemeen
Bij het berekenen van de meetonzekerheid op een analyseresultaat kan men in principe twee
benaderingen toepassen: de ‘Bottom-up’ benadering, waarbij alle mogelijke bronnen van variatie op
het resultaat afzonderlijk opgelijst worden en de bijdrage tot de meetonzekerheid van elke bron
bepaald wordt, en de ‘Top-down’ benadering waarbij men uitgaat van een statistische evaluatie van
analyseresultaten die de volledige analysegang doorlopen hebben.
Wegens de moeilijkheid om bij een ‘Bottom-up’ benadering van een chemische analyse alle mogelijke
bronnen van variatie vast te leggen, werd er in dit document gekozen voor een ‘Top-down’ benadering.
De uitgebreide meetonzekerheid U wordt gedefinieerd als 2 maal de gecombineerde meetonzekerheid
uc. De veronderstelling hierbij is dat de gecombineerde meetonzekerheid voldoende vrijheidsgraden
bezit (= afgeleid is uit een voldoende aantal meetwaarden) zodat bij het bepalen van het 95% interval
de afgeronde waarde van 2,0 van de t-verdeling mag gebruikt worden.
De berekeningen worden uitgevoerd met een voldoende aantal significante cijfers; afronden gebeurt
slechts op het einde van de berekening van de uitgebreide meetonzekerheid U.
5.1.5.3 Top-down benadering via juistheid en reproduceerbaarheid
Bij het berekenen van de uitgebreide meetonzekerheid U kunnen verschillende benaderingen
toegepast worden afhankelijk van de beschikbare gegevens. De drie belangrijkste benaderingen zijn :
• uitgaan van de gegevens die verkregen werden bij de originele validatie van de toegepaste
genormaliseerde methode,
• uitgaan van gegevens die verkregen werden bij deelname aan ringonderzoekingen en
• uitgaan van gegevens die verkregen werden in het eigen laboratorium bij het routinematig
uitvoeren van de methode.
De eerste benadering heeft als voordeel dat de uitgebreide meetonzekerheid U kan afgeleid worden
uit de resultaten van het ringonderzoek waarmee de genormaliseerde methode oorspronkelijk
gevalideerd werd. Dan geldt dat U = 2sR, met sR de standaardafwijking van de reproduceerbaarheid.
Het aandeel van de spreiding tussen laboratoria is op die manier al in sR inbegrepen. De nadelen van
deze benadering zijn dat dit alleen geldt indien de methode exact uitgevoerd wordt zoals beschreven
in de norm, dat men moet kunnen aantonen dat de eigen bias verwaarloosbaar is en dat bij routineanalyses
de gegevens op de controlekaarten steeds binnen de waarden voor de herhaalbaarheid r
(spreiding van de duplobepalingen) en reproduceerbaarheid R (spreiding over langere termijn) moeten
vallen. Een bijkomend nadeel is dat de eigen meetonzekerheid beter kan zijn dan die afgeleid uit het
ringonderzoek voor de validatie en men dus de eigen meetonzekerheid overschat. En natuurlijk kan
dit alleen maar toegepast worden wanneer er gegevens van een dergelijk ringonderzoek beschikbaar
zijn.
339

De tweede benadering – uitgebreide meetonzekerheid U uit ringonderzoekingen waaraan men deelgenomen
heeft – heeft eveneens als voordeel dat de spreiding tussen laboratoria al in de
meetonzekerheid inbegrepen is. U wordt dan op een analoge manier berekend als U = 2sR, met sR de
standaardafwijking van de reproduceerbaarheid bij de ringonderzoekingen. Een voorwaarde om deze
benadering te mogen toepassen is dat het eigen laboratorium goed gescoord heeft bij deze
ringonderzoekingen. Ook hier is het nadeel dat de eigen meetonzekerheid beter kan zijn dan die
afgeleid uit de ringonderzoekingen en men de eigen meetonzekerheid daardoor kan overschatten. En
ook hier kan dit alleen toegepast worden als er ringonderzoekingen voor de betreffende methode en
parameter georganiseerd worden.
De derde benadering – uitgebreide meetonzekerheid U uit gegevens verkregen in het eigen
laboratorium – heeft een aantal voordelen ten opzichte van de vorige benaderingen: het resultaat
heeft betrekking op de methode zoals die werkelijk in het laboratorium toegepast wordt (dus met
inbegrip van de wijzigingen t.o.v. de norm) en men kan resultaten gebruiken die in het kader van de
routine-analyses verkregen worden (controlekaarten, duploverschillen e.d.). Indien gewenst kan men
er ook de resultaten van ringonderzoekingen bij betrekken. En tenslotte is het mogelijk om bij deze
benadering een beter inzicht te krijgen in het relatieve belang van de verschillende bronnen van
meetonzekerheid.
340

5.2 EMAS / OHSAS
5.2.1 Arbomanagementsysteem (veiligheid)
5.2.1.1 Essentie van de OHSAS 18001-norm
5.2.1.2 OHSAS 18001
OHSAS = Occupational Health and Safety Assessment Series
OHSAS 18001 is een in Engeland ontwikkelde norm in samenwerking met diverse normalisatie
instellingen uit Europa en Australië. Het is GEEN internationale norm zoals de ISO-normen, maar is in
veel landen geaccepteerd als certificeerbare norm voor arbomanagementsystemen.
OHSAS 18001 bevat eisen voor een arbomanagementsysteem waarmee de organisatie de
arborisico’s die verband houden met de activiteiten van de organisatie kan beheersen en de prestatie
van het systeem kan verbeteren.
De OHSAS richtlijn heeft in eerste plaats betrekking op arbeidsomstandigheden en niet op de
veiligheid van producten en diensten.
341

Een arbomanagementsysteem op basis van OHSAS 18001 bestaat uit vijf onderdelen:
• Arbobeleid.
• Planning.
• Implementatie en uitvoering.
• Controle en corrigerende maatregelen.
• Beoordeling door de directie.
5.2.1.2.1 Arbobeleid
In dit onderdeel van het arbomanagemensysteem legt de organisatie algemene uitgangspunten voor
het arbobeleid vast. Wat betreft het arbobeleid moet een organisatie zich committeren aan drie
basisverplichtingen:
• Voldoen aan relevante wet- en regelgeving.
• Streven naar continue verbetering t.a.v. risico’s en gevaren.
• Bekendmaking aan alle medewerkers zodat zij zich bewust zijn van hun eigen verplichtingen
op arbogebied.
Veel organisaties leggen het arbobeleid vast in een beleidsverklaring.
5.2.1.2.2 Planning
Hierin worden de uitgangspunten uitgewerkt in concrete doelstellingen, taakstellingen en
arbomanagementprogramma’s.
De beleidsuitgangspunten moeten vanuit de specifieke organisatieomstandigheden worden vertaald in
doelstellingen en programma’s die zijn gericht op het verminderen van arborisico’s en incidenten.
Daarvoor is het essentieel dat alle arborisico’s en gevaren worden geïnventariseerd.
Afhankelijk van de ernst van arborisico’s en -gevaren speelt wat in wet- en regelgeving is opgenomen
een belangrijke rol. Eisen uit wet- en regelgeving vormen het minimumniveau voor de geformuleerde
doelstellingen.
5.2.1.2.3 Implementatie en uitvoering
Voor de realisatie van de doel- en taakstellingen en het arbomanagementprogramma zijn allerlei
organisatorische maatregelen nodig. Het gaat onder meer om:
• het vastleggen van taken en verantwoordelijkheden;
• het opstellen van procedures en werkinstructies voor werkzaamheden en activiteiten die
samenhangen met de belangrijke arborisico’s en –gevaren;
• het geven van opleiding aan het personeel;
342

• interne- en externe communicatie;
• het beheer van informatie en documenten.
5.2.1.2.4 Controle en corrigerende maatregelen
De organisatie dient zichzelf te controleren door meting en monitoring van de arboprestaties en het
uitvoeren van arbomanagementsysteemaudits.
Tijdens de arboaudits wordt de goede werking en samenhang van het systeem als geheel
geanalyseerd.
Een belangrijk criterium is daarbij of het arbomanagementsysteem in staat is de geformuleerde
doelstellingen te realiseren. Bij geconstateerde afwijkingen worden corrigerende en preventieve
maatregelen geformuleerd.
5.2.1.2.5 Beoordeling door de directie
De directie moet de werking van het arbomanagementsysteem periodiek beoordelen en zich daarbij
de vraag stellen of de doelstellingen niet moeten worden bijgesteld, bijvoorbeeld vanwege het streven
naar continue verbetering zoals vastgelegd in het arbobeleid.
Met het opnieuw vaststellen van beleid en doelstellingen begint de beheers- en verbetercyclus
opnieuw.
343

5.2.2 Milieumanagementsysteem – ISO 14001
5.2.2.1 Essentie van de ISO 14001-norm
5.2.2.2 ISO 14001
ISO 14001 is de wereldwijd geaccepteerde norm met eisen voor een milieumanagementsysteem. Het
milieumanagementsysteem is daarin gedefinieerd als dat deel van het algemene
managementsysteem van de organisatie dat wordt gebruikt om het milieubeleid te ontwikkelen en te
implementeren en milieuaspecten te beheersen.
De eisen in ISO 14001 zijn gerubriceerd in vijf onderdelen:
• Milieubeleid.
• Planning.
• Implementatie en uitvoering.
• Controle en corrigerende maatregelen.
• Beoordeling door de directie.
344

5.2.2.2.1 Milieubeleid
In dit onderdeel van het milieumanagementsysteem legt de organisatie algemene uitgangspunten voor
het milieubeleid vast.
Wat betreft het milieubeleid moet een organisatie zich committeren aan drie basisverplichtingen:
• Voldoen aan relevante wet- en regelgeving.
• Streven naar continue verbetering van milieuprestaties.
• Streven naar preventie van milieubelasting.
Veel organisaties hebben het milieubeleid vastgelegd in een zogenaamde milieubeleidsverklaring.
5.2.2.2.2 Planning
Hierin worden de uitgangspunten uitgewerkt in concrete doelstellingen, taakstellingen en
milieumanagementprogramma’s.
De beleidsuitgangspunten moeten vanuit de specifieke organisatieomstandigheden worden vertaald in
doelstellingen en programma’s. Deze zijn gericht op:
• verbetering van de milieuprestaties;
• en de beheersing van de milieukritische activiteiten.
Daarvoor is het essentieel dat alle milieuaspecten (alle interacties tussen de organisatie en milieu)
worden geïnventariseerd, zoals bvb.:
• emissies naar de omgeving;
• productgerelateerde milieuzaken;
• en milieueffecten die optreden bij toeleveranciers en onderaannemers.
Afhankelijk van de ernst van de (mogelijke) milieueffecten speelt wat in de wet- en regelgeving is
opgenomen een belangrijke rol. Eisen uit wet- en regelgeving zullen het minimumniveau vormen voor
de geformuleerde doelstellingen. Ook een eventueel aanwezig bedrijfsmilieuplan zal in de planning
moeten zijn verwerkt.
5.2.2.2.3 Implementatie en uitvoering
Voor de realisatie van de doel- en taakstellingen en het milieumanagement-programma zijn allerlei
organisatorische maatregelen nodig.
Het betreft o.a.:
• het vastleggen van taken en verantwoordelijkheden;
• uitwerken van procedures en werkinstructies voor werkzaamheden en activiteiten die
samenhangen met de belangrijke milieuaspecten;
345

• opleiding geven aan het personeel;
• interne en externe communicatie;
• het beheer van de informatie en documenten;
• maatregelen ter voorbereiding op mogelijke noodsituaties.
5.2.2.2.4 Controle en corrigerende maatregelen
De organisatie dient zichzelf te controleren door meting en monitoring van de milieukritische
activiteiten en het uitvoeren van milieuaudits.
Tijdens de milieuaudits wordt de goede werking en samenhang van het systeem als geheel
geanalyseerd.
Een belangrijk criterium is daarbij of het milieumanagementsysteem in staat is de geformuleerde
doelstellingen te realiseren. Bij geconstateerde afwijkingen worden corrigerende en preventieve
maatregelen geformuleerd.
5.2.2.2.5 Beoordeling door de directie
De directie moet de werking van het milieumanagementsysteem periodiek beoordelen en zich daarbij
de vraag stellen of de doelstellingen moeten worden bijgesteld, bijvoorbeeld vanwege het streven
naar continue verbetering zoals vastgelegd in het milieubeleid.
Met het opnieuw vaststellen van beleid en doelstellingen begint de beheers- en verbetercyclus
opnieuw.
5.2.3 Milieumanagementsysteem – EMAS
5.2.3.1 EMAS-verordening
EMAS = Eco Management and Audit Scheme
Dit is de titel van een verordening van de Europese Unie die de lidstaten verplicht om een systeem in
te voeren waarbij organisaties het recht kunnen krijgen om een Europees ‘milieu-logo’ te voeren.
Deelname aan de EMAS-verordening is vrijwillig.
5.2.3.2 Doelstelling EMAS
De doelstelling van de verordening is om alle soorten organisaties te stimuleren tot verbetering van de
milieuprestaties.
346

Uitgangspunt is het stimuleren van continue verbetering van de milieuprestaties door invoering van
een milieumanagementsysteem, interne audits en het uitbrengen van een milieujaarverslag.
5.2.3.3 Wanneer kan een organisatie worden geregistreerd?
Een organisatie kan worden geregistreerd als EMAS-deelnemer wanneer:
• Een milieumanagementsysteem is ingevoerd.
• Een milieuverslag is opgesteld (in de EMAS-verordening wordt dit een milieuverklaring
genoemd).
• Een erkende milieuverificatie-instelling het milieumanagementsysteem en de milieuverklaring
heeft goedgekeurd.
In de tekst van de verordening zijn eisen opgenomen waaraan het milieumanagementsysteem en de
milieuverklaring moeten voldoen.
De ISO 14001-norm vormt de basis voor de eisen van het milieu-managementsysteem.
De milieuverklaring is vergelijkbaar met een milieujaarverslag. De eisen voor de milieuverklaring zijn
vastgelegd in de verordening.
Wanneer de erkende milieuverificatie-instelling het milieumanagementsysteem en de milieuverklaring
heeft goedgekeurd kan de organisatie een registratie aanvragen bij de ‘competent body’ in de
betreffende lidstaat.
5.2.3.4 Relatie met certificatie volgens ISO 14001
De eisen aan het milieumanagementsysteem in de EMAS-verordening zijn identiek aan ISO 14001.
Om te voldoen aan ISO 14001 moet het milieubeheersysteem van de organisatie een aantal
voorwaarden vervullen. De organisatie vb. het laboratorium moet:
• de milieu-impact van uw activiteiten, producten en diensten identificeren en controleren;
• het milieubeheer continu verbeteren;
• een systematische aanpak implementeren om milieuobjectieven te stellen, ze te bereiken en
ze kenbaar te maken wanneer ze gerealiseerd zijn.
Bovendien hecht EMAS veel belang aan volgende elementen:
• naleving van de regelgeving;
• verbetering van de milieuprestaties;
• externe communicatie;
• en betrokkenheid van de werknemers.
De eisen voor het milieuverslag staan apart beschreven in de EMAS-verordening.
347

In de praktijk kan een organisatie die een ISO 14001-certificaat bezit, een EMAS-registratie krijgen
door het milieuverslag aanvullend te laten valideren volgens de daarvoor geldende regels.
Dat is ook meteen het verschil tussen ISO 14001 en EMAS. ISO 14001 vereist niet dat een
organisatie periodiek extern informatie verstrekt over haar milieuprestaties. EMAS vereist dat wel.
5.2.4 Certificatie
5.2.4.1 Wat is certificatie?
Certificatie betekent dat een onafhankelijke deskundige beoordeelt of het onderwerp van certificatie
(product of managementsysteem) aan een duidelijk vastgelegde norm voldoet. Wanneer dat
inderdaad het geval is, dan wordt dit vastgelegd in een officieel document: het certificaat.
Bureaus die hierbij als onafhankelijke deskundige optreden, worden certificatie-instellingen genoemd.
De beoordeling vindt plaats op basis van spelregels die zijn goedgekeurd door een college van
deskundigen waarin alle belanghebbende partijen zitting hebben.
Een certificatie-instelling geeft een certificaat af wanneer zij het vertrouwen heeft dat een organisatie
aan de norm voldoet en daaraan kan blijven voldoen. Minstens eenmaal per jaar wordt gecontroleerd
of de organisatie nog steeds aan de norm voldoet. Zo niet, dan kan het certificaat worden ingetrokken.
Een certificaat wordt afgegeven voor drie jaar, daarna vindt een complete herbeoordeling plaats.
Met het certificaat kan een organisatie aantonen dat het aan alle eisen van de norm voldoet; daarmee
is het certificaat dus een waardevol communicatiemiddel. Verschillende doelgroepen zijn
geïnteresseerd in bvb. de arboprestaties of milieuprestaties van een organisatie, en daarmee in het
certificaat.
5.2.4.2 Voorwaarden voor het krijgen van een certificaat
Een organisatie kan worden gecertificeerd wanneer zij werkt met een compleet managementsysteem
(vb. arbomanagementsysteem of milieumanagementsysteem) waarvan de werking is bewezen.
Tijdens het certificatieonderzoek wordt beoordeeld of alle elementen van het managementsysteem
daadwerkelijk volgens de norm zijn geïmplementeerd. Vervolgens wordt nagegaan of het systeem ook
in de praktijk functioneert.
Een belangrijke eis, en voorwaarde voor certificatie, is daarbij of de organisatie voldoet aan alle eisen
uit wet- en regelgeving.
Uiteraard blijft het mogelijk dat een organisatie die eisen niet haalt. Daarom wordt tijdens het
certificatieonderzoek veel aandacht besteed aan:
• de beoordeling van het meet- en registratiesysteem;
• het controleren van eventuele overschrijdingen;
• en de werking van procedures voor het nemen van corrigerende maatregelen;
• de procedures voor de melding van overschrijdingen aan de overheid.
348

De adequate werking van deze elementen van het arbomanagementsysteem of
milieumanagementsysteem is een belangrijke voorwaarde voor certificatie.
Een norm voor certificatie is ook dat het arbobeleid of milieubeleid gericht is op de beperking van
risico´s en -gevaren en op continue verbetering.
De organisatie zal daarom moeten aantonen dat het inzicht heeft in de mogelijkheden om de risico´s
te verminderen en deze mogelijkheden betrekt bij de formulering van de doelstellingen.
Uit deze doelstellingen moet de ambitie tot verbetering blijken.
5.2.5 Integratie van managementsystemen
Steeds meer managementsystemen doen hun opmars: kwaliteit (ISO 17025, ISO 9001), veiligheid
(OHSAS 18001) en milieu (ISO 14001, EMAS). Deze systemen hebben duidelijke verschillen maar
ook diverse gelijkenissen.
Gemeenschappelijke kenmerken zijn o.a.:
• engagement management en managementbeleid;
• documentbeheer en beheer van registraties;
• procedures voor het beheer van opleiding en registreren van kwalificaties;
• communicatie;
• planning van doelstellingen;
• interne audits;
• beheer van non-conformiteiten;
• beheer van klachten;
• correctieve en preventieve acties;
• voortdurende verbetering;
• directiebeoordeling;
• evaluatie van leveranciers;
• …
Een geïntegreerd beheersysteem dient te worden aanzien als een transversale verbinding tussen de
verschillende systemen, zeker daar waar de normen voor deze systemen een aantal gelijkenissen en
gemeenschappelijke activiteiten hebben.
Voordelen van geïntegreerde beheersystemen:
• minder papier;
• minder tegenstrijdigheden;
• duidelijkere afspraken.
349

De integratie van de verschillende beheersystemen verloopt volgens onderstaand stappenschema:
• Stap 1: engagement van het management (wordt vertaald in een beleid)
• Stap 2: oprichting van een managementsysteemteam
• Stap 3: nulmeting (wat is de huidige stand van zaken?)
• Stap 4: procesmodel als kapstok
• Stap 5: uitvoering integratie voor verschillende processen
• Stap 6: uitschrijven van een systeemhandboek
• Stap 7: opleiding en sensibilisering
• Stap 8: interne audit van het geïntegreerd systeem
• Stap 9: directiebeoordeling
• Stap 10: externe systeemaudit(s)
350

5.3 FOODLIMS
5.3.1 Inleiding
Vanaf 01/01/2008 werken we binnen DG laboratoria met het software pakket UNILAB.
Unilab is de commerciële naam voor een LIMS-systeem (LIMS= Laboratory Information Managment
System) en is aangekocht bij de firma Siemens te Ninove. Het basispakket biedt tal van
mogelijkheden. Maar toch vereist het systeem een grondige configuratie vooraleer het programma de
gewenste gegevens kan beheren. DG Laboratoria gaf het dit softwarepakket de naam ‘FOODLIMS’.
5.3.2 Foodlims (Unilab)
5.3.2.1 Configuratie – gedeelte
Het deel Configuratie is enkel toegankelijk voor toepassingsbeheerders en wordt hier niet verder
besproken.
5.3.2.2 Operationele gedeelte = Analyser
5.3.2.2.1 Objecten
Foodlims is opgebouwd volgens onderstaande structuur:
Info Card (IC)
Info Field (II)
• Requesten: een groep van monsters die in 1 opdracht ontvangen zijn
• Sample: 1 monster
Request (RQ)
Sample (SC)
Parameter Group
(PG)
Parameter (PA)
Method (ME)
351

• Parametergroep: groep van parameters die op een bepaald matrixtype kunnen uitgevoerd
worden.
o FIX: parametergroep met bijhorende parameters wordt volledig aangevraagd op het
monster
o FREE: monsternemer kan kiezen welke parameters in deze parametergroep die
moeten geanalyseerd worden
• Parameter: de te analyseren stof
• Methode: een parameter kan met verschillende methodes geanalyseerd worden, met 1 of
meerdere methodes
• Infokaart: Aan een monster kunnen verschillende infokaarten hangen.
• Infoveld: velden met informatie die gekoppeld zijn aan een infokaart.
5.3.2.2.2 Taken en layout
Afhankelijk van uw userprofiel zal je beschikken over andere taken en bijhorende layouts. Taken
helpen u bij het invullen of opzoeken van bepaalde gegevens.
5.3.2.2.3 Overzicht van de flow van een foodnetmonster
1 PCE
Inscannen van het monster
2 Dispatch
Ontvangst dispatch
Problemen oplossen
Vertrek dispatch
Afhaallijst afdrukken
3 RECEPTIONIST
Ontvangen van monsters
Invullen infokaart van de monsters
Etiketten afdrukken
4 ANALIST
Bewaring stalen
Werklijst oproepen en afdrukken
Labo-etiketten afdrukken
Begin analyse invullen
Resultaten invullen
Validatie 1 (methodeniveau)
5 AFDELINGSVERANTWOORDELIJKE
Validatie 2 (parameterniveau)
Controle facturatie (enkel bij betalende FN-monsters)
352

6 LABOVERANTWOORDELIJKE
Validatie 2b (parameterniveau)
Validatie 3 (monsterniveau - enkel bij betalende FN-monsters)
Facturatie monsters (enkel bij betalende FN-monsters)
7 ANALIST
Vernietigen stalen
5.3.2.2.4 Overzicht van de flow van een klantenmonster
1 RECEPTIONIST
• Aanmaak request
• Invullen infokaart van de request
• Aanmaak monsters
• Invullen infokaart van de monsters
• Parameters toekennen
• Waarborgen
• Etiketten afdrukken
2 ANALIST
• Bewaring stalen
• Werklijst oproepen en afdrukken
• Labo-etiketten afdrukken
• Begin analyse invullen
• Resultaten invullen
• Validatie 1 (methodeniveau)
3 AFDELINGSVERANTWOORDELIJKE
• Validatie 2 (parameterniveau)
• Controle facturatie
4 LABOVERANTWOORDELIJKE
• Validatie 2b (parameterniveau)
• Validatie 3 (requestniveau)
• Facturatie request
5 ANALIST
• Vernietigen stalen
353

5.3.2.3 Usermanagement
In User Management worden de gebruikersprofielen en gebruikers gedefinieerd. De bestaande
profielen zijn nu :
• voor elk labo : Receptie, Analist, Verantwoordelijke afdeling, Verantwoordelijke labo, QAM
• voor elke PCE : PCE (reden : per PCE zijn er 2 à 3 personen die kunnen scannen in Unilab)
• Directoraat-Generaal : enkel leesrechten
• LIMS-teamleden : systeembeheer, toepassingsbeheer
Sommige personen hebben meerdere profielen, bij hun standaardprofiel staat een sleutel.
5.3.2.4 Equipment Definition
Equipment definition (EQ) is een onderdeel van de databank voor alle toestellen. Om de databank upto-date
te houden, moet aan de QAM worden gemeld dat een toestel in of uit gebruik wordt genomen.
Alle informatie van een toestel kan hier worden bijgehouden. Ook de informatie van de leverancier kan
hier geraadpleegd worden. In de toekomst kan deze toepassing uitgebreid worden met een
onderhoudsmodule en eventueel een kalibratiemodule.
5.3.2.5 Define Address
Define Address is een onderdeel van de databank waarin alle gegevens van gebruikers
opgenomen zijn, alsook de gegevens van leveranciers van toestellen.
5.3.3 Koppeling met andere applicaties
5.3.3.1 Foodnet
FoodNet is de databank met alle gegevens die door de controleurs worden ingevoerd.
Verantwoordelijke voor FoodNet is Leen De Rycke. FoodNet is gekoppeld aan Unilab. Voor problemen
rond FoodNet is een aparte helpdesk opgericht : FoodNethd@favv.be (Tielens Christel). De
communicatie tussen FoodNet en Unilab verloopt in twee richtingen : informatie van monsters
ingegeven door de controleurs gaat naar het LIMS, informatie van resultaten van stalen gaan naar
FoodNet (op het moment dat de parameter gevalideerd is op niveau 2b).
5.3.4 Extra modules op maat gemaakt
5.3.4.1 Extlab
Deze toepassing is op maat gemaakt door Siemens en dient voor elektronische overdracht van
gegevens van en naar externe labo’s. Externe labo’s krijgen een verwittiging per mail van zodra een
staal kan opgehaald worden in het dispachting center (Melle of Gembloux). Het systeem blijft mails
automatisch mails versturen (om de 2u tussen 8u en 16u) tot het labo de stalen heeft opgehaald.
354

Externe labo’s moeten resultaten invoeren in Extlab. Via een webservice worden de resultaten
ontvangen in Foodlims en – indien nodig – op hun beurt automatisch doorgestuurd naar foodnet.
5.3.4.2 Labnet
Met deze toepassing worden de facturen afkomstig van de externe labo’s beheerd. Labnet laat ons
toe om een bestelbon te genereren per extern labo. De analyses die in een bepaald labo gedaan
werden verschijnen in deze applicatie en worden één voor één beoordeeld. Indien er geen problemen
zijn met de analyseresultaten, afgesproken doorlooptijden, dan worden de stalen op een bestelbon
geplaatst. Deze wordt dan per mail overgemaakt aan het externe labo. Zij kunnen op hun beurt op
basis van onze bestelbon een factuur opmaken.
5.3.4.3 Dashboard
Deze toepassing geeft ons een up-to-date weergave van alle cijfers van FOODLIMS. Vb,in hoeverre
worden doorlooptijden gerespecteerd, hoeveel monster zijn er deze week verwerkt in de
dispatchcentra, hoeveel monsters zijn er ontleed in de labo’s…
5.3.5 Hulpsoftware
5.3.5.1 Business Objects (B.O.)
Dit software pakket wordt gebruikt voor het opmaken van rapporten op basis van gegevens uit Unilab.
B.O. kan gegevens halen uit eender welke databank. Het BO-team van DG labo (2-tal mensen per
labo) heeft enkel toegang tot de universe van FOODLIMS.
5.3.5.2 PL/SQL
Dit software programma is de tegenhanger van Databrowser : via deze tool kunnen gegevens in direct
op de databank gewijzigd worden. Het spreekt voor zich dat slechts een beperkt aantal personen
toegang heeft tot deze toepassing.
355