NewsLab 135

AUTORES:
PAULO ALEXANDRE 1 ,
LARA CASTANHEIRA 1 ,
TERESA FERREIRA 1,2 ,
AMADEU BORGES-FERRO 1
artigo 3
referem a curta duração da impregnação
como uma condição
preferencial para o sucesso da
IHQ(9). No entanto, a literatura
é escassa no que diz respeito
a estudos experimentais que se
debrucem exclusivamente sobre
a influência da duração da etapa
da impregnação da técnica histológica
na qualidade da marcação
pela técnica de IHQ.
Assim, resolveu-se aprofundar
essa temática com o intuito de
fornecer dados que possam guiar
a prática, melhorando a qualidade
final das imunomarcações.
Definiu-se como objetivo determinar
qual o tempo de impregnação
em parafina que oferece
melhores resultados na qualidade
final da imunomarcação para
antigénios com expressão membranar,
citoplasmática e nuclear.
Materiais e Métodos
Os diferentes tempos de impregnação
foram escolhidos de
acordo com os padrões habituais
do aparelho processador utilizado
(Tissue-Tek® Xpress® 120x)
(10) e foram definidos em 30 minutos,
60 minutos e 300 minutos.
O primeiro valor corresponde ao
tempo standard para a etapa da
impregnação, o segundo valor
será o dobro do tempo normal e
o último é um valor extremo que
corresponde a 10 vezes o tempo
standard considerado. Desta
forma, procurou-se simular um
leque de situações possíveis, de
modo a que a duração da impregnação
e consequente ação sobre
as proteínas tecidulares fosse
ampla.
A impregnação foi realizada à
temperatura de 64ºC, uma vez
que esse é o valor máximo recomendado
na literatura(4). Dessa
forma procuramos que a ação da
temperatura nas proteínas tecidulares
fosse máxima, para que,
mais uma vez, fosse possível tirar
ilações práticas da experiencia.
Para realizar a imunomarcação
foram selecionados os soros
de anticorpos anti-CD79α (clone
JCB117 - Dako® M7050), anti-
-citoqueratinas (clone MNF116
– Dako® M0821), anti-Ki67
(clone MIB-1 - Dako® M7240) e
anti-proteína S100 (Policlonal -
Dako® Z0311) que possuem padrões
de expressão membranar,
citoplasmática ou nuclear.
Como material histológico foram
utilizadas 10 amostras de
apêndice íleo-cecal, por ser uma
estrutura constituída por diferentes
tipos celulares, expressando
assim os antigénios em estudo.
As referidas amostras foram fixadas
em Formol Neutro Tamponado
até 24 horas e posteriormente
processadas em fixador molecular
(Sakura® cat. nº 7120) por
30 minutos. De cada amostra colheram-se
3 fragmentos, um para
cada processamento histológico
com as durações de impregnação
estudadas. Após a etapa da inclusão,
de cada um dos 30 blocos
preparados foram obtidas 4 secções
de 2μm de espessura para
realização da técnica IHQ.
Utilizou-se o método de polímero
indireto EnVision FLEX+,
High pH (Dako K8012) no equipamento
Dako® Autostainer Plus,
utilizando controlos internos e
externos para todos os casos.
Para a recuperação antigénica
utilizou-se o equipamento Dako®
PT Link com o reagente Target Retrieval
Solution, High pH (Dako®
K8004). O bloqueio da peroxidase
endógena foi realizado com
recurso ao reagente EnVision
FLEX Peroxidase-Blocking Reagent
(Dako® DM821) durante
5 minutos. A incubação do soro
primário decorreu durante 20 minutos.
Após este passo procedeu-
-se à aplicação do polímero EnVision
FLEX /HRP (Dako® DM822)
durante 20 minutos. Foi depois
realizada a revelação com EnVision
FLEX DAB+ Chromogen
(Dako® DM827) com a duração de
5 minutos. O contraste foi realizado
com hematoxilina de Harris.
Todas as lâminas foram desidra-
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Revista NewsLab | Abr/Mai 16