Ülegenoomne assotsiatsiooniuuring kubemesonga geneetiliste ...

TARTU ÜLIKOOL 

LOODUS JA TEHNOLOOGIA TEADUSKOND 

MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT 

BIOTEHNOLOOGIA ÕPPETOOL 

Natalia Tšernikova 

Ülegenoomne assotsiatsiooniuuring 

kubemesonga geneetiliste markerite leidmiseks 

Eesti populatsioonis 

Magistritöö 

TARTU 2012 

Juhendajad: Evelin Mihailov, M.Sc. 

Reedik Mägi, Ph.D. 

Prof. Andres Metspalu, M.D., Ph.D.

Sisukord 

1 Kasutatud lühendid .............................................................................................................. 4 

2 Sissejuhatus ......................................................................................................................... 5 

3 Kirjanduse ülevaade ............................................................................................................ 6 

3.1 Song .............................................................................................................................. 6 

3.1.1 Songa klassifikatsioon ............................................................................................... 6 

3.1.2 Songa epidemioloogia ................................................................................................ 6 

3.1.3 Kubemesong .............................................................................................................. 7 

3.1.4 Kubemesonga riskitegurid ......................................................................................... 8 

3.1.5 Kubemesong kui sidekoehaigus ................................................................................. 9 

3.2 Ülegenoomsed assotsiatsiooniuuringud ...................................................................... 13 

3.2.1 SNP markerid ........................................................................................................... 13 

3.2.2 Markerite imputatsioon ............................................................................................ 14 

3.2.3 Populatsiooni geneetiline stratifikatsioon ................................................................ 14 

3.2.4 Uuringute võimsus ja valimi suurus ........................................................................ 15 

3.2.5 Tulemuste visualiseerimine ..................................................................................... 15 

4 Töö eesmärk ........................................................................................................................ 17 

5 Materjalid ja metoodika ..................................................................................................... 18 

5.1 Valimi kirjeldus .......................................................................................................... 18 

5.2 Fenotüüp ..................................................................................................................... 18 

5.3 Genotüpiseerimine ja andmete kvaliteedikontroll ...................................................... 19 

5.4 Imputeerimine ............................................................................................................. 20 

5.5 Assotsiatsioonianalüüs ................................................................................................ 20 

5.6 Ekspressioonianalüüs .................................................................................................. 21 

5.7 Bioloogiliste radade analüüs ....................................................................................... 21 

5.8 Haplotüübianalüüs ...................................................................................................... 21 

6 Tulemused ......................................................................................................................... 23 

2

6.1 Regionaaljoonised ....................................................................................................... 27 

6.2 Haplotüübianalüüs ...................................................................................................... 28 

5.3 Bioloogiliste radade analüüs ....................................................................................... 29 

7 Arutelu ............................................................................................................................... 34 

8 Kokkuvõte ......................................................................................................................... 37 

9 Summary ............................................................................................................................ 38 

10 Kasutatud kirjandus ......................................................................................................... 40 

11 Kasutatud veebilehed ....................................................................................................... 46 

12 Lisad ................................................................................................................................ 47 

3

1 Kasutatud lühendid 

CR Edukalt genotüpiseeritud indiviidide protsent markeril (Call Rate) 

ECM Ekstratsellulaarne maatriks (Extracellular matrix) 

EGV Eesti Geenivaramu (Estonian Genome Center) 

GWAS Ülegenoomne assotsiatsiooniuuring (Genome-Wide Association Study) 

HMM Peitud Markovi Mudel (Hidden Markov Model) 

HWE Hardy-Weinbergi tasakaalustatus (Hardy-Weinbergi Equilibrium) 

LD Aheldatuse tasakaalustamatus (Linkage Disequilibrium) 

MAF Minoorse alleeli sagedus (Minor Allele Frequency) 

MMP Maatriksmetalloproteinaas (Matrix metalloproteinase) 

OR Šansside suhe (Odds Ratio) 

Q-Q plot Kvantiil-kvantiil joonis (Quantile-quantile plot) 

eQTL Ekspressiooni kvantitatiivse tunnuse lookused (Expression Quantitative Trait 

Loci) 

SNP Ühe nukleotiidne polümorfism (Single Nucleotide Polymorphism) 

WHO Maailma Terviseorganisatsioon (World Health Organization) 

λ Korrektsioonifaktor lambda (Correction Factor Lambda) 

4

2 Sissejuhatus 

Kubemesong on väga sage kirurgiline haigus mis mõjutab ligikaudu 12% elanikkonnast. 

Maailma Terviseorganisatsiooni (The world health report - Health systems financing: the 

path to universal coverage World Health Organization, WHO) 2010 aasta raporti andmetel 

ulatuvad kulud kubemesongade likvideerimiseks ning dotatsioonide maksmiseks Ameerika 

Ühendriikides umbes 28 miljardi dollarini aastas. 

On näidatud, et kubemesonga patogenees on multifaktoriaalne ja mitmed teadusgrupid on 

proovinud leida geneetilisi tegureid, mis antud patoloogia kujunemises osaleks, kuid siiani 

edutult. Lisaks ei ole seni tehtud ka ühtegi ülegenoomset uuringut, mis võimaldaks hinnata 

haigusega seotud riske. 

Ülegenoomsed assotsiatsiooniuuringud on osutuks edukaks haigusriski mõjutavate 

geneetiliste variantide leidmisel. Tänaseks päevaks on ülegenoomseid 

assotsiatsiooniuuringuid teostatud juba enam kui 600 haiguse korral ning tuvastanud enam 

kui 3000 tunnust mõjutavat geneetilist varianti. Seepärast valiti antud strateegia ka 

kubemesonga geneetiliste tegurite leidmiseks kasutades Eesti Geenivaramu 

(http://www.geenivaramu.ee/et/) andmeid. Eesti Geenivaramu biopank sisaldab hetkel 

ligikaudu 52 000 Eesti täiskasvanud elaniku DNA proove ja andmeid haiguste ning 

tervisekäitumise kohta. 

Kõike seda arvesse võttes on käesoleva magistriväitekirja eesmärk leida geneetilisi 

variatsioone, mis suurendavad kubemesonga haigestumise riski. 

5

3 Kirjanduse ülevaade 

3.1 Song 

Song on parietaalse peritoneumi ehk kõhukelme väljasopistus läbi kõhuseina olemasoleva 

või sekundaarselt tekkinud avause (Murruste et al., 2005). Tekke järgi on võimalik eristada 

kahte tüüpi songasid, kaasasündinud ehk kongenitaalseid songasid ja omandatud songasid. 

Sellisteks kohtadeks, millel on eeldused songa tekkimiseks, on näiteks kubemekanal, 

reiekanal ja nabavõru või kõhuseina laparotoomiajärgsed armid (Geissler ja Anthuber, 

2011). Song võib esineda vaevusteta, kuid põhjustab sageli ka ebamugavustunnet ja valu 

(Jenkins ja O’Dwyer, 2008; Geissler ja Anthuber, 2011). 

3.1.1 Songa klassifikatsioon 

Rahvusvaheline Haiguste Klassifikatsiooni ehk RHK-10 (International Statistical 

Classification of Disease, ICD10) järgi jaotatakse songad vastavalt nende asukohale 

järgnevalt: 

K40 – Kubemesong 

K41 – Reiesong 

K42 – Nabasong 

K43 – Kõhuseinasong 

K44 – Vahelihasesong 

K46 – Täpsustamata kõhuõõnesong 

M62.8 – Lihase (tupe) song (RHK-10 klassifikatsioon, Sotsiaalministeerium, 

http://www.sm.ee/index.php?id=771). 

3.1.2 Songa epidemioloogia 

Songad on üheks kõige sagedamaseks kirurgiliseks patoloogiaks, eriti Lääne-Euroopas ja 

Ameerika Ühendriikides. Sagedus ulatub keskmiselt 1,7 protsendist kõikides 

vanusgruppides kuni 4 protsendini 45 aastastel ja vanematel (Primatesta ja Goldacre, 1996). 

Tänapäeval hinnatakse songa operatsioonide arvu 20 miljonile aastas üle maailma; 

operatsioonide arv varieerub keskmiselt 100 ja 300 vahel 100 000 inimese kohta (Bay- 

Nielsen et al., 2011). Kubemesong moodustab 75% kõikidest kõhuseina songadest ning selle 

tekkerisk meestel on elu jooksul 27% ja naistel 3% (Kingsnorth ja LeBlanc, 2003). 

Eestis tehakse aastas ligikaudu 3500 songa operatsiooni ja neist umbes 2/3 kubemesongade 

likvideerimiseks (Murruste et al., 2005). Eestis on kõikidest songadest umbes 95% välised 

6

songad, millest 65-75% on kubemesongad (2/3 indirektsed ja 1/3 direktsed), 10% - 15% on 

armisongad, umbes 10% nabasongad, 1% - 3% reiesongad ja ca 3% haruldase 

lokalisatsiooniga songad. Meestel esineb kubemesong 80% - 90% juhtudest. Naistel esineb 

reiesong 75% juhtudest. Kubemesong naistel on võrreldes reiesongaga harv (Murruste et al., 

2005). Lastel esineb kubemesonga 0,8% – 4,4% juhtudest, poistel aga esineb songa 3 – 10 

korda rohkem kui tüdrukutel (Grosfeld, 1989). Perekondlik anamnees songa esinemisel on 

11,5% (Murruste et al., 2005). 

3.1.3 Kubemesong 

Kubemesong on kõhukoopa elundi või selle osa väljasopistumine läbi kubemekanali naha- 

alustesse kudedesse. Väljasopistumine toimub läbi niinimetatud nõrkade kohtade ehk 

songavärati kaudu kõhuseina lihaste ja kubemesideme vahel (Murruste et al., 2005). 

RHK-10 (http://www.sm.ee/index.php?id=771) järgi jaotub kubemesong veel omakorda: 

K40.0 - Bilateraalne ehk kahepoolne kubemesong, sulgusega, ilma gangreenita 

K40.1 - Bilateraalne kubemesong gangreeniga 

K40.2 - Bilateraalne kubemesong ilma sulguse või gangreenita 

K40.3 - Unilateraalne ehk ühepoolne või täpsustamata kubemesong, sulgusega ja 

ilma gangreenita 

K40.4 - Unilateraalne või täpsustamata kubemesong, gangreeniga 

K40.9 - Unilateraalne või täpsustamata kubemesong ilma sulguse või gangreenita 

Kubeme- ja reiesongade puhul on kasutuses ka lihtne ja praktiline 2002. a. Magdeburgi 

klassifikatsioon, kus jaotatakse songad järgnevatesse rühmadesse: 

indirektne kubemesong 

direktne kubemesong 

kombineeritud kubemesong 

reiesong 

retsidiivsong (Geissler ja Anthuber, 2011). 

Kasutusel on ka Schumpelick Aachen klassifikatsioon, mis baseerub European Hernia 

Society klassifikatsioonil ning jaotab songad asukoha („L“ lateraalne/indirektne, „M“ 

mediaalne/direktne, „F“ femoraalne/reie -, „ML“ kombineeritud) ja suuruse järgi (3 cm) (vt. Joonis 1) (Geissler ja Anthuber, 2011). 

7

Joonis 1. Kubemesonga klassifikatsioon, mis kirjeldab songasid tüübi ja suuruse järgi (Robert 

ja Zollinger, 2004). 

3.1.4 Kubemesonga riskitegurid 

Songade patogenees on multifaktoriaalne. Kaasasündinud songade puhul on anatoomiliseks 

riskiteguriks kõhuseinas olev avaus, mis tuleneb kõhuseina mittetäielikust sulgumisest. 

Omandatud songade korral on tegemist lihas-aponeurootilise kõhuseina struktuuride 

dehistentsiga, mis on tingitud kõhuseina toonuse vähenemisest (Murruste et al., 2005). 

Lisaks anatoomilistele teguritele mängivad kubemesonga formeerumisel rolli ka sellised 

faktorid nagu intra-abdominaalse rõhu tõus, krooniline obstruktiivne kopsuhaigus, 

rasvumine, kõhuvesitõbi, raskuste tõstmine, stress, suitsetamine, vanus, sugu, kubemesonga 

esinemine perekonnas, traumad ja rasedus (Read, 1984; Murruste et al., 2005; Lau et al., 

2007; Akbulut et al., 2010). Tänapäeval on teada ka, et kubemesong on sagedasem 

patsientidel, kel esineb kaasasündinud sidekoehaigusi, nagu näiteks ebatäiuslik luuteke, 

vanurite nahalõtvus, Ehlersi-Danlosi, Hurler – Hunter ja Marfan` sündroom (Liem et al., 

1997; Hayakawa et al., 1982; Abrahamson 1998). Kubemesonga sagedasem esinemine 

8

perekonnas viitab geneetilistele faktoritele haiguse kujunemises (Liem et al., 1997; Lau et 

al., 2007; Akbulut et al., 2010). 

3.1.5 Kubemesong kui sidekoehaigus 

Morfoloogilised muutused 

Morfoloogilised ja molekulaarsed uuringud kubemesonga patsientidel toetavad hüpoteesi, et 

geneetilistel teguritel on songa tekkimisele oluline mõju (Lynen et al., 2004). 

Lihas–aponeurootilise kõhuseina vastupanu survele võib olla põhjustatud ka kõhuseina 

sidekoe patoloogilistest muutustest, mida seostatakse kollageeni metabolismi häirega 

(Peacock, 1982). Inimese keha transversaalfastsia (Fascia Transversalis) on tihesidekoest 

anatoomiline struktuur, mis katab kõhu sirglihast seespoolt ja on selle toeks ning lisaks 

eraldab kõhulihased sooltest. Transversaalfastsia struktuur sõltub elastsetest 

kollageenikiududest ja -komponentidest, mis on vajalikud koevõrgustikus pingejõu 

hoidmiseks. Ekstratsellulaarse maatriksi muutumine aga soodustab koe vastupidavuse ja 

transversaalfastsia elastsuse kadumist (Rodrigues Junior et al., 2002). Uuringud näitavad 

morfoloogilist seost transversaalfastsia elastsuse kaotuse ning vananemise vahel. See seos 

võimaldab seletada kubemesonga kõrgemat esinemissagedust patsientidel vanuses 50 aastat 

ja vanemad (Rodrigues Juniror ja Quintas, 2002). 

Transversaalfastsias esinevaid morfoloogilisi erinevusi näidati indirektse ja direktse 

kubemesonga vahel. Indirektse kubemesonga korral esines struktuurselt rohkem säilinud ja 

homogeenselt jaotunud küpseid elaunini ja oksütalaani elastseid kiude. Samas kui 

patsientidel, kellel esines direktne kubemesong, leiti transfersaalfastsias väiksem hulk 

küpseid elastseid kiude, mida iseloomustab nende paksenemine, keerdumine ja lühendamine 

(Rodrigues Junior et al., 2002). 

Transversaalfastsias esinevad vanusest sõltuvad muutused soodustavad küpsete elastsete 

kiudude lagundamist ning suure hulga oksütalaani kiudude redutseerimist. Näidatud on 

kollageeni sisalduse vähenemist milligrammi kohta transversaalfastsias direktse 

kubemesonga puhul (Rodrigues Junior et al., 2002). Biomehhaanilisi ja struktuurseid 

muutuseid transversaalfastsias arvesse võttes (Pans et al., 1997, Pans et al., 1999), on välja 

pakutud, et kubemesonga tekkimise eest vastutavad tõenäoliselt muutused nii kollageeni 

ekspressioonis kui ka elastsete kiudude metabolismis (Rodrigues Junior et al., 2002). 

9

Kollageeni regulatsiooni häired kubemesonga patsientidel 

Tänapäeval eksisteerib mitu teooriat, mis seostavad kubemesonga tekkimist geneetiliste 

teguritega. Üheks versiooniks on muutused kollaageeni ekspressioonis. Kollageen on üks 

kõige levinum valk inimese organismis. Koe vigastuse korral viib kollageeniga seotud 

geenide koordineeritud ekspressiooni regulatsioon ajutise maatriksi moodustumiseni, mis 

edasi muutub küpseks armiks (Lynen et al., 2006). Heteromeerne kollageen koosneb 

vähemalt 9 kollageenimolekuli tüübist ning need ahelad on kodeeritud vähemalt 17 geeni 

poolt (Ninomiya ja Olsen, 1984). Välja on pakutud, et üheks kubemesonga põhjuseks võib 

olla kollageeni sünteesi kvantitatiivne aberratsioon, mida omakorda mõjutavad mutatsioonid 

kollageeniga seotud geenide regulatoorsetes elementides (Lynen et al., 2006). Regulatoorsed 

elemendid paiknevad promooterjärjestuses või geeni intronites ning on harilikult 

kodeerivatest järjestusest kuni 20 kb kaugusel (Mautner et al., 1996). Uuringute käigus on 

identifitseeritud interstitsiaalse tüüp I ja tüüp III kollageeni transkriptsiooni regulatsiooni 

oluliseimad piirkonnad ning on näidatud, et mutatsioonid regulatoorsetes elementides 

segavad transkriptsioonifaktorite seondumist või jällegi suurendavad nende seondumise 

affiinsust (vt. Joonis 2) (Lynen et al., 2006). 

Geneetilised variandid tüüp I kollageeni geenide promooterite piirkondades mõjutavad 

kollageeni sünteesi ka osteoporoosiprotsessis. Analoogiliselt võivad aberratsioonid 

kollageeni geenide promooteralades olla seotud ka songaga (Yamada et al., 2005). 

Transversaalfastsia kollageeni struktuuri ümberpaigutused suurendavad koe elastsust. Tüüp 

I: tüüp III kollageeni suhte vähenemine detekteeriti transversaalfastsia naha proovidest 

mRNA ja valkude tasemel. Sarnased morfoloogilised muutused esinevad ka songakotis ning 

armikoes (Junge et al., 2004). Muutused kollageeni ekspressioonis kubemesonga 

patsientidel, viitavad transkriptsiooni düsregulatsioonile (Si et al., 2002). 

10

Joonis 2. Regulatoorse järjestuse geneetiliste variatsioonide mõju kollageeni geeni 

transkriptsioonile. A) normaalne transkriptsioonifaktorite seondumine; B) vähenenud 

transkriptsioonifaktorite seondumine viib geeni transkriptsiooni vaigistamiseni; C) vähenenud 

transkriptsioonifaktorite seondumine viib geeni transkriptsiooni tõusule. Mutatsioonid kodeerivates 

alades on märgitud punaste katkendlike joontega (Lynen et al., 2006). 

Kollageeni geenide transkriptsiooniline regulatsioon 

Lisaks regulatoorsete elementide geneetilisele varieeruvusele, on olemas ka teine võimalus 

kollageeni sünteesi eest vastutava geeniregulatsiooni muutusteks rakus. See on seotud raku 

signaalradade muutustega, mis hõlmab omakorda ekstratsellulaarseid tsütokiine. Signaalne 

transduktsioon ankurdatust valkudest on lokaliseeritud tsütoplasmas ja järgnevalt toimub 

transkriptsioonifaktorite seondumine DNA motiividega, võimaldades regulatoorset 

aktiivsust (vt. Joonis 2). Selline signaalraja muutus võib omada sarnast mõju nagu 

regulatoorsete elementide mutatsioon geeni kodeerivas alas. Transkriptsioonifaktorid AP1, 

Sp1, Sp3, YB-1 ja C/EBP on aktiveeritud peale rakulist kontakti selliste tsütokiinidega, nagu 

näiteks TNF- α, TGF-ß, IFN- α, mis omakorda mängivad olulist rolli kollageeniga seotud 

geenide regulatsioonis (Mertens et al., 1997; Mertens et al., 2002). 

Veel üks võimalik hüpotees kubemesonga haiguse korral hõlmab 

maatriksmetalloproteinaaside molekule (Matrix metalloproteinase, MMP). Kollageenid on 

11

ekstratsellulaarmaatriksi (Extracellular matrix, ECM) põhilised komponendid koos 

glükoproteiinide ja proteoglükaanidega (Lynen et al., 2004). ECM asub dünaamilises 

bilansis sünteesi ja degradatsiooni vahel, mida teostatakse maatriksmetalloproteinaaside 

poolt (Basson, 2003). Viimaste aastate jooksul pannakse suurt rõhku MMP-d uurimisele, 

seoses nende võimega kollageeni degradeerida ja remodelleerida. MMP-d on füsioloogiliselt 

seotud erinevate protsessidega, näiteks surnud kudede eemaldamine, angiogeneesi 

soodustamine ning äsja sünteesitud sidekoe remodelleerimine (Kähäri ja Saarialho-Kere, 

1997). 

MMP perekond koosneb vähemalt 23-st geenist, ning on tsink-sõltuvad substraat 

spetsiifilised proteaasid ning omavad olulist rolli protsessides, mis on seotud haava 

kinnikasvamisega. Nii näiteks on MMP-2, -7, -8, ja -9 ekspressioon alanenud terves nahas; 

MMP-1, -2,-3,-9,-11,-13,-14 on aga ülesekspresseeritud haava tekkimisel (Saarialho-Kere, 

1998). 

Songa geneetilisest regulatsioonist arusaamiseks on väga oluline meeles pidada, et geeni 

regulatsiooni programmid täidavad kindlaid eesmärke, näiteks fibroblastid organiseerivad 

kollageeni sünteesi teisel moel kui makrofaagid ning „teadmised“ ühest rakus võivad olla 

varjatud teiste rakkude jaoks (Lynen et al., 2006). 

Mitmed uuringud on analüüsinud kollageeni sünteesi muutuseid songa patsientidel (Lynen 

et al., 2006, Aren et al., 2011). Kirjeldatud on konstitutiivse tüüp III kollageeni sünteesi 

tõusu naha fibroblastides, mis assotsieerub songa formeerumisega (Friedman et al., 1993). 

Võrreldes kubemesonga patsientide ja tervete indiviidide fibroblaste, detekteeriti esimestel 

tüüp I ja tüüp III kollageeni suhte langus ning leiti, et kubemesonga patsientidel tõusis 

MMP- 1 ja MMP-13 valgu ja mRNA tase (Friedman et al., 1993). MMP-2 ülesekspressiooni 

fibroblastides on aga näidatud direktse kubemesonga patsientidel (Bellon et al., 2001). 

Lisaks detekteeriti MMP-13 ülesekspressioon inimestel, kellel esines kubemesong korduvalt 

(Zheng et al., 2002). 

Kokkuvõtteks võib öelda, et kubemesonga esinemine on tulemus kompleksete 

interaktsioonide, keskkonnategurite ja mitmete geeneetiliste faktorite vahel. Eelnevalt 

läbiviidud uuringud näitavad, et kollageeniga ja MMP-ga seotud geenid on kindlasti 

tõenäolised kandidaatgeenid, mida järgnevatel geneetilistel uuringutel võiks arvesse võtta 

(Lynen et al., 2006, Aren et al., 2011). 

12

3.2 Ülegenoomsed assotsiatsiooniuuringud 

Geneetilised variatsioonid DNA järjestuses mõjutavad suuremal või väiksemal määral 

haigestumise riski. Harvaesinevate Mendeliaalsete haiguste põhjuslike mutatsioonide 

tuvastamine on olnud väga edukas, kuna kindlale haigusele vastab kindel genotüüp. Paljud 

haigused aga kujunevad välja mitmete geenide ja keskkonnafaktorite koostoimel ning neid 

nimetatakse multifaktoriaalseteks ehk komplekshaigusteks. Komplekshaiguste geneetilise 

tausta uurimine on osutunud märksa keerukamaks, kuivõrd iga variatsioon on vaid üks 

paljudest mis haigestumise riski mõjutab (Zondervan ja Cardon, 2007). Edukaks strateegiaks 

komplekhaiguste geneetiliste variatsioonide tuvastamisel on osutunud ülegenoomsed 

assotsiatsiooniuuringud (Genome-Wide Association Studies, GWAS) (Wang et al., 2005). 

Assotsiatsiooniuuringud põhinevad hüpoteesil, et geneetilise markeri ühe alleeli kõrgem 

esinemissagedus patsientidel näitab seost haigusfenotüübi ning antud variatsiooni vahel 

(Kruglyak, 1999). 

Paljude komplekshaiguste, nagu näiteks tüüp 1 ja tüüp 2 diabeet, põletikuline soolehaigus, 

rinna- ja eesnäärme vähk, suuremahulised GWAS-id, on viimasel ajal tuvastatud palju uusi 

geneetilisi lookuseid, mis on seotud nende haiguste eelsoodumusega (Sladek et al., 2007; 

Duerr et al., 2006; Gudmundsson et al., 2007; Easton et al., 2007). Lisaks on 

identifitseeritud ka hulk geene, mis on seotud pidevate tunnustega, nagu näiteks lipiidide 

tase, pikkus ja keha rasvaprotsent (Willer et al., 2008; Sanna et al., 2008; Scuteri et al., 

2007, http://www.genome.gov/gwastudies/). 

3.2.1 SNP markerid 

Human Genome Project tulemused on näidanud, et inimese genoom koosneb ligikaudu 

22 000 geenist ning inimesed on identsed ligikaudu 99,5% DNA järjestusest. Ülejäänud osa 

genoomist on variatsioonid ning neid nimetatakse polümorfismideks (Lander et al., 2001). 

Kõige tavalisem polümorfismide klass on ühe nukleotiidi asendus, mida nimetatakse SNP-ks 

(Single Nucleotide Polymorphism) ning nad moodustuvad ligikaudu 90% inimese genoomi 

variatsioonidest (Petterson et al., 2009). SNP-d esinevad keskmiselt iga 1 000 aluspaari 

tagant ning neid saab detekteerida automaatselt, mis teeb nende analüüsi kiireks ja odavaks 

(Wang et al., 2005). Kromosoomil lähestikku asuvate markerite vahelist aheldatust ära 

kasutades on võimalik valida väiksem hulk SNP-e, mida nimetatakse tag-SNP-ideks, ning 

mis kirjeldavad omakorda nendega seostunud SNP-de gruppe ehk haploblokke (Gabriel et 

al., 2002). Selliselt valitud markerid võimaldavad hinnata enamikku sagedasematest SNP- 

13

dest. Näiteks Illumina HumanOmniExpress beadchip võimaldab kasutada üheaegselt 

rohkem kui 700 000 markerit genoomi katmiseks (Illumina Inc. http://www.illumina.com). 

Ülegenoomsete assotsiatsiooniuuringute läbiviimisel kasutatakse SNP-de genotüpiseerimisel 

meetodeid, mis teostatakse standartiseeritud protokollide järgi kasutades kommertsiaalseid 

ülegenoomseid kiipe (näiteks Illumina Inc. http://www.illumina.com; Affymetrix Inc. 

http://www.affymetrix.com). 

3.2.2 Markerite imputatsioon 

Markerite imputatsiooni all mõistetakse genotüüpide ennustamist, mida ei ole indiviididel 

genotüpiseeritud. Need, in silico markerid, suurendavad SNP-de arvu, mida testitatakse 

GWAS-i käigus (Marchini ja Howie, 2010). Imputeerimiseks kasutatakse ülegenoomset 

genotüpiseeritud markereid. Need andmed haplotüpiseeritakse ning nende vahele jäävate 

puuduolevate markerite genotüübid ennustatakse kasutades olemasolevaid 

referentshaplotüüpe. Nii saavutatakse tihedam markerite katvus, kasutades nii 

genotüpiseeritud kui imputeeritud markereid ja see aitab assotsiatsioonianalüüsis parandada 

geneetiliste assotsiatsioonide leidmise tõenäosust (Marchini ja Howie, 2010). 

Üheks imputatsiooni teostamise programmiks on IMPUTE. See programm kasutab 

haplotüpiseerimiseks HM mudelit (Hidden Markov Model, HMM) ja võimaldab 

kombineerida referentspaneelidena erinevaid haplotüüpide referentse, näiteks 1000 Genome 

Project, HapMap2 ja HapMap3 (Marchini ja Howie, 2010). 

3.2.3 Populatsiooni geneetiline stratifikatsioon 

Populatsiooni stratifikatsioon on alleelisageduste erinevus juhtude ja kontrollide vahel, mis 

on põhjustatud nende erinevast päritolust (Freedman et al., 2004). Suurte valimite korral on 

vaja kontrollida populatsiooni geneetilist stratifikatsiooni, mida nimetatakse ka 

populatsiooni struktuuriks (Knowler et al., 1988). Juhul, kui juhud ja kontrollid on 

komplekteeritud sisemiselt struktueeritud populatsioonist, võib assotsiatsiooniuuring anda 

vale-positiivseid assotsiatsioone (Marchini et al ., 2004). 

Üheks meetodiks geneetilise stratifikatsiooni hindamiseks on genoomse kontrolli meetod 

(Genomic Control) (Devlin ja Roeder, 1999). Genoomse kontrolli meetod eeldab, et juhud ja 

kontrollid on võetud samast populatsioonist ning markerite alleelisagedused varieeruvad 

juhtude ja kontrollide vahel juhuslikult. See annab võimaluse eeldada, et korrektsioonifaktor 

λ väärtus jääb terve genoomi ulatuses muutumatuks. Korrektsioonifaktor λ arvutatakse kui 

mediaan χ2 statistiku väärtustest jagatuna eeldatava χ2 statistiku jaotuse mediaanväärtusega 

14

ühe vabadusastme korral, mis võrdub 0,456. Stratifikatsiooni korral on λ väärtus suurem kui 

üks ja leitud teststatistikuid korrigeeritakse λ väärtusega. Eespool kirjeldatud ümberarvutus 

võimaldab vähendada vale-positiivsete assotsiatsioonide hulka (Plenge et al., 2007). 

3.2.4 Uuringute võimsus ja valimi suurus 

Ülegenoomsete assotsiatsiooniuuringute probleemiks see, et leitud geneetilised efektid on 

komplekstunnustele väikesed. Tihti ei piisa nende tuvastamiseks ühest populatsiooni 

kohordist, et saavutada GWAS-i puhul optimaalselt 80%-list statistilist võimsust (Reich ja 

Lander, 2001, Spencer et al., 2009). Seetõttu tuleb eksperimenti planeerides silmas pidada 

seda, et valim peab olema piisavalt suur väikeste efektide tuvastamiseks. Näiteks markerite 

korral, minoorse alleeli sagedusega > 1% (Minor Allele Frequency, MAF) peab minimaalne 

kohordi suurus olema ligikaudu 2 000 indiviidi, et saavutada olukorda, kui markeri alleeli 

šansside suhe (Odds Ratio, OR) on 1,3. Antud arvud näitavad 80% võimsuse olulisuse 

nivooks P-väärtus < 10 -6 (Wang et al., 2005). 

Samuti tuleb GWAS-i teostamisel arvesse võtta fenotüüpide maksimaalselt täpset 

kindlaksmääramist. Ülegenoomsete assotsiatsiooniuuringute puhul võrreldatakse kahte tüüpi 

indiviide – kontrollid ehk terved indiviidid ning juhud ehk inimesed, kellel esineb vaadeldav 

haigus. Enamik publitseeritud GWAS analüüsidest põhinevad just sellisetel juht-kontroll 

tüüpi uuringutel. Selliste analüüside läbiviimisel tuleb panna suurt rõhku juhtude ja 

kontrollide valimise hoolikusele (McCarthy et al., 2008). Juhtude valimisel püüakse vältida 

fenotüübi heterogeensust või valida eriti ekstreemsete fenotüübiväärtustega indiviidid ja/või 

perekonnad (WTCCC, 2007). Ebakorrektselt defineeritud fenotüübi tagajärjeks on viga 

gruppidevahelise alleelisageduste määramisel ning seeläbi uuringu statistilise võimsuse 

mitmekordne vähenemine (Burton et al., 2009). Juhtude ja kontrollide suurem arv tagab 

GWAS-ide suurema statistilise võimsuse (Howson et al., 2005, WTCCC, 2007). 

Kuna GWAS-is testitakse korraga palju markereid, tuleb võtta arvesse ka mitmesel 

testimisel tekkiv valepositiivsete assotsiatsioonide hulk. Ülegenoomsete 

assotsiatsioonianalüüside standardiks on kujunenud P-väärtuse nivoo 5 x 10 -8 (Risch ja 

Merikangas, 1996; WTCCC, 2007). 

3.2.5 Tulemuste visualiseerimine 

Üheks kõige levinumaks meetodiks GWAS tulemuste visualiseerimiseks on kvantiilide 

joonis (quantile-quantile plot, Q-Q joonis). See visualiseerib vaadeldava teststatistiku jaotust 

saadud ülegenoomsest uuringust (Clayton et al., 2005) – võrreldakse omavahel oodatavaid 

15

ja leitud GWAS tulemuste z-skooride jaotusi, mis peaks vastama χ 2 jaotusele. Sellisel 

joonisel leitud erinevus oodatavast jaotusest võib tuleneda populatsiooni stratifikatsioonist 

või andmeanalüüsi vigadest. Teisel populaarsel joonisel, Manhattani joonisel, 

visualiseeritakse leitud assotsiatsioonid vastalt nende kromosomaalsetele asukohtadele 

(McCarthy et al., 2008). Leitud geenilookuste struktuuri paremaks mõistmiseks kasutatakse 

regionaalseid jooniseid, kus on esitatud vaid huvipakkuv kromosoomi lõik. 

16

4 Töö eesmärk 

Käesoleva magistriväitekirja eesmärgiks oli geneetiliste variatsioonide leidmine, mis 

suurendavad kubemesonga haigestumise riski. 

17

5 Materjalid ja metoodika 

5.1 Valimi kirjeldus 

Antud töö raames kasutati Tartu Ülikooli Eesti Geenivaramu proove, mis on kogutud 

geenidoonoritelt üle kogu Eesti. Uurimuse läbiviimiseks analüüsiti 3851 indiviidi ning viidi 

läbi juht-kontrolltüüpi uuring. Haigusjuhte oli kokku 500 indiviidi ning kontrollgrupp 

koosnes 3351 indiviidist. Haigusjuhtude ja kontrollindiviidide ealine ja sooline jaotuvus on 

toodud tabelites 1 ja 2. 

Tabel 1. Ealine jaotuvus töös käsitletud uuringurühmas. 

Mehed Naised Kokku 

Juhud 342 85 427 

Kontrollid 1449 1975 3424 

Tabel 2. Sooline jaotuvus töös käsitletud uuringurühmas. 

Juhud 58.5 

(13.7) 

Kontrollid 48.4 

5.2 Fenotüüp 

Keskmine vanus 

(standardhälve) 

Vanuse vahemik: 

Miinimum - maksimum 

Mehed Naised Mehed Naised 

(18.5) 

56.8 

(14.1) 

54.3 

(21.6) 

20 - 85 23 - 86 

18 - 100 18 - 103 

Haigusjuhtude valikul lähtuti järgnevatest kriteeriumitest: 

1. kubemesong (K40.0 ) oli diagnoositud täiskasvanueas (vanus alates 18 eluaastast) 

2. ei esine haigusi, mis võivad nõrgestada kõhuseina 

3. ei esine haigusi, mis võivad tõsta kõhusisest rõhku, näiteks krooniline kõhukinnisus 

(K59) 

4. ei esine kõhupiirkonna operatsioone 

5. naised ei ole sünnitanud 

6. song ei ole tekkinud raske füüsilise töö või pingutuse tõttu 

18

Haigusjuhtude valik teostati Tartu Ülikooli Eesti Geenivaramu teaduri dr. Taie Kaasiku 

poolt. 

Kontrollgruppi valiti indiviidid, kellel ei olnud järgnevaid diagnoose: 

1. song (K40-K46) 

2. seedeelundite ülaosa muud kaasasündinud väärarendid (Q40) 

3. lihasluukonna mujal klassifitseerimata kaasasündinuid väärarendid (Q79) 

4. muud osteokondrodüsplaasiaid (Q78) 

5. osteokondrodüsplaasia toruluude ja lülisamba kasvupuue (Q77) 

6. põletikulised polüartropaatiad (M05-M14) 

7. süsteemsed sidekoe haigusseisundid (M30-M36) 

8. Ehlersi-Danlosi sündroomi (Q79.6) 

9. mitut elundkonda hõlmavad muud täpsustatud kaasasündinud väärarendi sündroomid 

(Q87) 

10. astsiit ehk vesikõht (R18) 

11. alumiste hingamisteede kroonilised haigused (J40-J47) 

12. muud soole talitlushäired (K59) 

13. meessuguelundite haigused (N40-N51) 

14. muud täpsustatud luu haigusseisundid (M89.8) 

15. fibroblastilised haigusseisundid (M72) 

16. muud paiksed sidekoehaigused (L94) 

Käesoleva töö raames teostatavate uuringute läbiviimiseks on geenidoonorid andnud 

informeeritud nõusoleku ning on olemas Tartu Ülikooli inimuuringute eetika komitee luba. 

5.3 Genotüpiseerimine ja andmete kvaliteedikontroll 

Ülegenoomne genotüpiseerimine teostati kasutades Illumina Infinium II tehnoloogiat 

(www.illumina.com). Genotüpiseerimiseks kasutati Illumina HumanOmniExpress – 

BeadChip (Illumina Inc.), 733 202 markeriga kiipi. Genotüpiseerimine teostati Eesti 

Biokeskuse Tuumiklabori Genotüpiseerimiskeskuses. 

Genotüpiseeritud andmeid filtreeriti järgnevate parameetrite osas: 

1. eduka genotüpiseerimise protsentuaalne osakaal (Call Rate, CR) nii indiviidi kui iga SNP 

kohta. 

2. minoorse alleeli sagedus (MAF), 

19

3. Hardy – Weinbergi tasakaalustatus (Hardy-Weinbergi equilibrium, HWE), 

4. indiviidide vaheline sugulus 

5. genotüübi põhjal leitud soo mitte-kokkulangevus Eesti Geenivaramu proovi feotüübi 

informatsiooniga. 

Analüüsidest jäeti välja indiviidid kelle CR oli alla 95%. Samuti jäeti välja SNP-d mille CR 

oli alla 95%, MAF alla 1% ning HWE testi p-väärtus alla 10 -5 . Lähisugulaste tuvastamiseks 

hinnati ühiste alleelide osakaalu genoomis (Identity By State, IBS) ning selle põhjal 

ennustati iga paari jaoks päritolult identsete (Identical by Descent, IBD) osakaalu. 

Sugulaspaaridest, kus IBD osakaal oli suurem või võrdne 10% (PIHAT ≥ 0.1) genoomist, 

eemaldati üks sugulastest. Välja jäeti ka indiviidid kelle raporteeritud fenotüübi sugu ei 

vastanud geneetiliste andmete põhjal ennustatud soole. Genotüpiseeritud 3851 indiviidist 

läbis kvaliteedikontrolli 427 haigusjuhtu ja 3424 kontrollindiviidi ning kokku 733 202 SNP- 

d. Andmete kvaliteedi hindamine ning filtreerimine teostati programmiga PLINK (Purcell et 

al. 2007). 

5.4 Imputeerimine 

Kromosoomide imputeerimiseks konverteeriti LINKAGE formaadis 

genotüpiseerimisandmed IMPUTE formaati kasutades tööriista GTOOL 

(http://www.well.ox.ac.uk/~cfreeman/software/gwas/gtool.html). Imputeerimiseks kasutati 

IMPUTE v2 programmi (http://mathgen.stats.ox.ac.uk/impute/impute_v2.html) ning 

referentsgenoomi 1000 Genome projekti andmeid (http://www.1000genomes.org), et 

imputeerida SNP-d, mida polnud Illumina HumanOmniExpress kiibil. Peale imputeerimist 

filtreeriti markerid minoorse alleeli sageduse (MAF ≥ 5%) ja imputeerimise kvaliteeti 

hindava parameetri proper_info väärtus ≥ 0.8 alusel, mis andis kokku tulemuseks 8 178 592 

imputeeritud markerit. Genotüpiseeritud ja imputeeritud markerite kombineerimine andis 

ülegenoomseks markerite arvuks 8 911 794 SNP-d. 

Imputeerimise referentsina kasutati kõikidest kohortides koostatud 1000 Genoomi Projekti 

1094 indiviidi haplotüüpe (1000 Genome Project freeze from 23 nov 2010). 

5.5 Assotsiatsioonianalüüs 

Analüüsimaks geneetiliste variantide mõju kubemesongale, kasutati logistilise regressiooni 

mudelit programmis SNPTEST v2 

(https://mathgen.stats.ox.ac.uk/genetics_software/snptest/snptest.html). Markereid analüüsiti 

kasutades alleeliefektide aditiivset mudelit. Analüüsis kasutati kovariaatidena vanust ja 

20

sugu, kuna haigus avaldub ennekõike vanemaealistel ning on oluliselt sagedasem meeste 

hulgas. Eraldi analüüsisime ka mehi, kus kovariaadina kasutati ainult vanust. Imputeeritud 

markerite puhul kasutati analüüsis genotüüpide asemel nende tõenäosusi. 

Assotsiatsioonitulemuste visualiseerimine 

Assotsiatsioonitulemuste visualiseerimiseks kasutati Manhattani joonist. Manhattani joonisel 

esitatakse markerite negatiivsed kümnendlogaritmid nende assotsiatsioonide P-väärtustest 

vastavalt nende genoomsetele asukohtadele. 

Assotsieerunud lookuste markeritevahelise LD struktuuri paremaks mõistmiseks 

visualiseeriti assotsiatsioone regionaalsetel joonistel, kasutades Locuszoom 

(https://statgen.sph.umich.edu/locuszoom/genform.php?type=yourdata) programmi. 

Kontrollimaks, et tulemused ei ole mõjutatud populatsiooni stratifikatsioonist, kasutati 

genoomse kontrolli meetodit (Devlin ja Roeder, 1999) ning arvutati populatsiooni 

stratifikatsiooni hindava parameetri λ väärtused mõlema analüüsi jaoks. Tulemused esitati 

ka kvantiilide joonisel (QQ joonis), mille telgedel võrreldakse leitud P-väärtuste jaotust 

eeldatavatega. Manhattan ja QQ joonised tehti kasutades R-i skripti (well.ox.ac.uk/gwama). 

5.6 Ekspressioonianalüüs 

Leidmaks, kas töös identifitseeritud SNP-d mõjutavad geeniekspressiooniga ehk on eQTL 

(Expression Quantitative Trait Loci), kasutati andmebaasi, mis on koostatud 5 300 indiviidi 

andmete meta-analüüsist (Westra et al. avaldamata andmed). Valim koosnes Eesti, Saksa, 

Hollandi, Itaalia ning kahest Ameerika Ühendriikide kohortist. RNA eraldati täisverest ning 

ekspressiooniprofiil määrati kasutades erinevate põlvkondade Illumina kiipe. HapMap2 

referentsile imputeeritud genotüüpide ja geeniekspressiooni väärtuste vahelised 

korrelatsioonid leiti kasutades eQTL-Mapperit (Westra et al., 2011). 

5.7 Bioloogiliste radade analüüs 

Leidmaks, millistesse bioloogilistesse radadesse kuuluvad antud töös leitud geenid, kasutati 

kõiki geene, mille lähedal või sees leidus markereid P-väärtusega alla 10 -5 . Bioloogiliste 

radade ennustamiseks kasutati GeneNetwork andmebaasi (Franke et al, avaldamata 

andmed), mis põhineb 80 000 proovi ekspressiooni võrgustikele. 

5.8 Haplotüübianalüüs 

Haplotüübianalüüsis võrreldi indiviide, kes kandsid sagedaseimat haplotüüpi (-ehk 

metsiktüüpi) alternatiivsete haplotüüpidega. Haplotüüpide ennustamine sooritati 

21

programmiga PLINK (http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/plink/) ning analüüs sooritati 

statistikapaketis R (www.R-project.org), kasutades logistilist regressiooni. 

Kõik arvutused viidi läbi Tartu Ülikooli teadusarvutuste keskuses (http://www.hpc.ut.ee/). 

22

6 Tulemused 

Antud töö raames analüüsiti 427 indiviidi (342 meest ja 85 naist). Kvaliteedikontrolli läbis 8 

911 794 markerit autosomaalsetelt kromosoomidelt, sugukromosoomide andmeid ei 

kasutatud. Ülegenoomses assotsiatsioonianalüüsis kasutati kõiki indiviide koos ja lisaks 

analüüsiti mehi eraldi. Naisi eraldi ei analüüsitud kuna valim oli liiga väike. Kovariaatidena 

võeti arvesse vanus ja sugu (sugu ainult mehi ja naisi koos analüüsides). 

Assotsiatsiooniuuringus kasutati aditiivset alleelidoosi mudelit. 

Populatsiooni stratifikatsiooni hindava parameetri väärtused olid järgmised: λmehed+naised = 

1,029 ja λmehed = 1,034, näitavad, et teatav stratifikatsioon küll esines, aga ei olnud suur ja ei 

mõjuta saadud tulemusi (vt. Joonis 3) 

Joonis 3. Eeldatavate ja leitud assotsiatsioonide P-väärtuste kvantiilide joonised. Telgedel 

võrreldakse leitud P-väärtuste jaotust juhuslikult eeldatavatega. A) mehed ja naised; B) mehed. 

Mitte kummaski analüüsis – ei mehi ja naisi koos analüüsides ega ka mehi eraldi 

analüüsides ei saadud tulemust, mida võiks lugeda ülegenoomselt statistiliselt oluliseks (P- 

väärtusega alla 5 x 10 -8 ). Seetõttu kirjeldame tulemustes seoseid, mille P-väärtus jääb alla 

10 -5 ja seda markeritega, mille harvema alleeli sagedus on võrdne või üle 5%. Leitud 

olulisemad seosed on esitatud graafiliselt Manhattan jooniste abil (vt. Joonised 4 ja 5). 

23

Joonis 4. Kubemesonga assotsiatsioonianalüüsi Manhattan joonis. Esitatud on 

assotsiatsiooniuuringu andmed analüüsides nii mehi kui naisi. Y-teljel on negatiivne 

kümnendlogaritm assotsiatsiooni P-väärtusest. X-teljel on genoomsed asukohad. 

24

Joonis 5. Kubemesonga assotsiatsioonianalüüsi Manhattan joonis. Esitatud on 

assotsiatsiooniuuringu andmed analüüsides ainult mehi. Y-teljel on negatiivne kümnendlogaritm 

assotsiatsiooni P-väärtusest. X-teljel on genoomsed asukohad. 

Mehi ja naisi koos analüüsides ja kasutades P-väärtuse nivoona < 10 -5 leiti erinevaid seoseid, 

mis võivad olla potentsiaalselt seotud kubemesonga tekkimisega (vt. Joonis 4, Tabel 3). 

25

Tabel 3. Kubemesonga assotsiatsioonianalüüsi tulemused analüüsides mehi ja naisi koos. 

Lähim geen on määratud, kui selle kaugus assotsieerunud SNP-st on väiksem kui 100 kb. 

Kromosoom SNP-i ID Lähim geen Testitud 

alleel/ 

teine alleel 

OR 

(95% 

usaldusintervall) 

P-väärtus 

1 rs10916394 1q42.13 A/G 0.54(0.42-0.69) 6.28 x 10 -06 

2 rs149633809 RMNDA5 A/G 0.43(0.29-0.63) 3.51 x 10 -06 

3 rs4539902 ZCWPW2 A/C 1.42(1.22-1.65) 4.24 x 10 -06 

3 rs12491076 PDZRN3 C/T 1.52(1.28-1.81) 4.22 x 10 -06 

3 rs74446186 ZNF717 G/T 1.59(1.32-1.93) 1.70 x 10 -06 

3 rs189287746 3p11.2 T/C 2.11(1.58-2.83) 1.36 x 10 -06 

5 rs4868436 MSX2 G/C 0.68(0.58-0.80) 1.33 x 10 -06 

6 rs2797301 IRF4, 

DUSP22 

C/G 1.53(1.27-1.85) 9.89 x 10 -06 

6 rs760659 JARID2 T/C 0.58(0.47-0.72) 3.36 x 10 -07 

7 rs10487581 AGR3 C/A 1.78(1.40-2.26) 5.42 x 10 -06 

8 rs28758285 NRG1 C/T 1.43(1.23-1.66) 2.30 x 10 -06 

9 rs1889103 PTPRD C/G 1.49(1.26-1.78) 7.16 x 10 -06 

9 rs7032609 EPB41L4 G/T 0.68(0.57-0.81) 9.73 x 10 -06 

15 rs4984172 15q11.2 C/T 2.02(1.50-2.73) 3.82 x 10 -06 

16 rs2966218 HS3ST4 T/C 0.57(0.45-0.73) 1.16 x 10 -06 

17 rs9891085 AIPL1 G/A 1.40(1.21-1.63) 9.50 x 10 -06 

21 rs13048013 KRTAP8-1 C/T 0.39(0.26-0.60) 1.86 x 10 -06 

22 rs145243392 22q12.3 C/T 0.31(0.18-0.55) 6.34 x 10 -06 

22 rs10212061 22q13.32 A/G 1.57(1.29-1.91) 9.74 x 10 -06 

Leitud tulemustest viis lookust asuvad geenidest kaugemal kui 100 kb: 1q42.13, 3p11.2, 

5q11.2, 22q12.3 ja 22q13.32. Ülejäänud lookuste jaoks määrasime lähima geeni. 

Kromosoomidest 3, 5, 6, 7, 8 ning 16 leidsime assotsiatsiooni, mis asuvad geenide lähedal 

(

Leitud tulemustest kolm lookust asuvad lähimast geenist kaugemal kui 100 kb: 1q43, 5q23.2 

ja 6q15. Ülejäänud lookuste jaoks määrasime lähima geeni. Kromosoomidest 2, 4, 5, 7, 8, 9 

ning 21 leidsime assotsiatsioone, mis asuvad geenide lähedal (

lookus. Lisaks on regionaalsel joonisel näidatud rekombinatsioonide määr ning antud 

regioonis olevate geenide nimed (vt. Lisa 1 ja 2). Enamikel regionaalsetel joonistel tundub 

olevat tegemist ühe signaaliga, kus kõik kubemesongaga assotsieerunud markerid on ka 

omavahel tugevas seoses. Ainult lookuses 6q15 (rs72919729 ümbritsev regioon) leiti madala 

P-väärtusega markereid, mis samal ajal polnud omavahel tugevalt korreleerunud. Selliste 

markerite suhtes oli teostatud haplotüübi analüüs. 

6.2 Haplotüübianalüüs 

6q15 lookuse regionaalselt jooniselt on näha, et seal paikevad kubemesongaga 

assotsieerunud markerid pole omavahel tugevalt aheldunud (vt. Joonis 6). Parim tulemus 

selles lookuses on rs72919729 (P-väärtus=7.4x10 -6 ), lisaks leidub seal marker rs4235842 

(P-väärtus=1.70x10 -5 ), mille LD parima markeriga on r 2 =0.268, D'=0.796. Selles lookuses 

kontrollisime võimalikku haplotüübiefekti, analüüsides nendel kahel markeril põhinevaid 

haplotüüpe. Siinkohal tuleb arvesse võtta seda, et tegemist on imputeeritud andmetega, ning 

haplotüübianalüüsis olid kasutatavad vaid genotüübid, mis on määratud vähemalt 90% 

tõenäosusega. Seepärast on haplotüübianalüüsis väiksem andmestik. Haplotüübianalüüsi 

tulemused geenipiirkonnas 6q15 on esitatud tabelis 5. Mõlemat markerit koos haplotüübina 

analüüsides saime assotsiatsiooni metsiktüüpi haplotüübi (rs72919729:G, rs4235842:C) ja 

haplotüübi rs72919729:C, rs4235842:C vahel P-väärtusega=1.15x10 -5 . Eraldi markerite 

assotsiatsioonide P-väärtused nimetatud väiksemalt andmestikult olid: rs72919729 

P=9.1x10 -5 ja rs4235842 P=0.000101. Testimaks, kas haplotüübianalüüsi kasutamine annab 

lisainformatsiooni, võrreldi dispersioonianalüüsi kasutades omavahel mudelit kus analüüsiti 

eraldi valitud markereid ja mudelit, kus kasutati lisaks ka haplotüüpi. Analüüsi tulemusel 

selgus, et kuigi haplotüübianalüüsi P-väärtus oli madalam, kui kahe üksiku markeri analüüsi 

P-väärtused, siis mudelite vahel erinevust ei leitud (P=0.359). 

28

Joonis 6. Regionaalne joonis meeste assotsiatsioonianalüüsi tulemustega lookuses 6q15. 

Parim leitud assotsieerunud marker rs72919729 on esitatud lilla ristkülikuna ja ülejäänud 

markerite assotsiatsioonid ringidena. Markerite värv näitab nende LD-d parima markeriga. 

Joonisel olev joon näitab rekombinatsiooni määra. 

Tabel 5. Haplotüübianalüüsi tulemus teostatud positsiooni 6q15 metsiktüüpi haplotüübi 

testimiseks alternatiivsetele haplotüüpidele. Uuritav haplotüüp koosnes markeritest 

rs72919729 ja rs4235842. 

Haplotüüp Sagedus (%) OR (95% 

usaldusintervall) 

P-väärtus 

CT 13.0 1.23(0.97-1.55) 0.0917 

GT 22.8 1.67(1.33-2.09) 8.95x10 -6 

CC 9.3 0.82(0.28-2.44) 0.7202 

5.3 Bioloogiliste radade analüüs 

Kasutades Westra et al. andmebaasi, kontrolliti, kas mõni assotsieerunud SNP-dest omab 

mõju geeniekspressiooni varieerumisele. Leiti, et ainult üks SNP (rs760659) on 

korreleerunud DTNBP1 geeni ekspressiooniga (P=2.99x10 -19 ). Leitud seos näitab, et 

29

tegemist võib olla kas DTNBP1 geeni splaisingu variantidega või tegemist on muude 

bioloogiliste replikaatidega. 

Geenide funktsioonide leidmiseks kasutati GeneNetwork andmebaasi. Antud andmestik 

võimaldab ennustada geenide molekulaarset funktsiooni, seotust erinevate bioloogiliste 

protsessidega ning ekspressiooni taset erinevates kudedes (vt. Tabel 6 ja Tabel 7). Tabelist 

on näha, et kandidaatgeenid ekspresseeruvad kudedes, mille funktsioon on tagatud 

kollageeni ja maatriksmetalloproteinaaside olemasoluga. Sama programmi kasutades 

analüüsiti, kas leitud kandidaatgeenid klasterduvad mõne bioloogilise raja või funktsiooni 

suhtes (vt Lisa 3-7). Bioloogiliste radade ja koeekspressiooni analüüsi statistiliselt oluliseks 

P-väärtuse nivooks on andmebaasi loojad seadnud P

Tabel 7. Viie geeni ennustatavad funktsioonid. 

Bioloogiliste radade ning molekulaarsete funktsioonide kasterdusanalüüs ennustas järgnevat: 

A) MFAP5 (microfibrillar associated protein 5) geeni poolt tagatud ennustatud 

bioloogilised protsessid; B) Ennustatud rakuline komponent MFAP5 geeni jaoks; C) 

MFAP5 ennustatavad molekulaarsed funktsioonid; D) NRG1 (neuregulin 1) ennustatud 

bioloogilised protsessid; E) NRG1 geeni ennustatud molekulaarsed funktsioonid; F) HTRA3 

(HtrA serine peptidase 3) geeni ennustatud bioloogilised protsessid; G) HTRA3 geeni 

rakuline komponent; H) PDZRN3 (PDZ domain containing ring finger 3) geeni ennustatud 

rakuline komponent. I) PDZRN3 geeni rakuline komponent; J) PDZRN3 geeni ennustatud 

molekulaarsed funktsioonid. 

31

7 Arutelu 

Mitmed eelnevad tööd on näidanud, et kubemesonga tekkimisel on geneetiline komponent 

(Rodrigues Jr et al., 2002, Lynen et al., 2006). Antud töö raames ei õnnestunud tuvastada 

ülegenoomselt statistiliselt olulisi assotsiatsioone, mis tõenäolisel tuleneb kubemesonga 

põhjustavate geneetiliste lookuste väikesest relatiivsest riskist. Seetõttu polnud piisavalt 

statistilist võimsust ülegenoomselt statistiliste efektide leidmiseks. Probleemiks on ka see, et 

kubemesonga fenotüüp on raskesti klassifitseeritav. Antud uuringust jäeti välja indiviidid, 

kelle kubemesonga tekkimine oli seotud keskkonnafaktoritega (operatsioonijärgne tüsistus, 

raske füüsiline pingutus jne.) samuti kaasasündinud kubemesongaga isikud. Samuti ei ole 

võimalik täielikult välistada diagnoosi ja anamneesi vigu. Töös keskendusime lookustele, 

mille P-väärtust oli alla 10 -5 . Selliseid nominaalselt olulisi P-väärtusi leidsime mehi ja naisi 

koos analüüsides 19, ning ainult mehi analüüsides 16 erinevast lookusest. Nende 34 lookuse 

(üks geenilookus oli oluline nii mehi kui ka kogu andmestiku analüüsides) puhul peab 

arvesse võtma, et osa neist võivad olla valepositiivsed tulemused, ning saadud tulemusi peab 

replitseerima sõltumatus kohordis. 34 leitud lookuse hulgast 5 olid seotud kollageeniga ja 

maatriksmetalloproteinaasidega. 

Kandidaatlookuste seos geeniekspressiooniga andis samuti huvipakkuvaid tulemusi. Kolm 

polümorfismi geenis DTNBP1 (dystrobrevin binding protein 1) mõjuvtavad 

geeniekspressiooni taset. Mitu uuringut on näidanud DTNBP1 seost skisofreeniaga (Straub 

et al., 2002). Lisaks on leitud, et DTNBP1 on düstrofiiniga seotud valgulise kompleksi osa 

(Fallgater et al., 2006). Antud kompleks on assotsieerunud lihasdüstroofiaga, mida 

iseloomustab lihaste nõrgenemine ja funktsioonide kadu (Motlagh et al., 2005). 

Leitud geenidest olid huvipakkuvamateks HTRA3 (HtrA serine peptidase 3), NRG1 

(neuregulin 1), MFAP5 (microfibrillar associated protein 5), PDZRN3 (PDZ domain 

containing ring finger 3) ja TBC1D19 (TBC1 domain family, member 19), kuna nende 

bioloogiliste radade analüüs näitas põhifunktsioonideks seost kollageeniga ja maatriks 

metalloproteinaasidega, mis võiks olla kõige tõenäolisemad kandidaatgeenid kumebesonga 

haiguse jaoks. 

Nii näiteks, bioloogiliste radade analüüs näitas, et HTRA3 geen ekspresseerub enamasti 

skeletilihastes. HTRA3 on ekstratsellulaarse maatriksi koostisosa ning tema 

põhifunktsiooniks on kollageeniga seondumine. Uuritud artiklid valdavalt toetavad andmeid 

saadud bioloogiliste radade analüüsist. Näidatud on, et HTRA3 on imetajate HTRA 

perekonda seriini peptidaas (High-Temperature Requerement Factor A), mis aktiveeritakse 

34

hiirtel platsenta moodustumise perioodil ning antud valk osaleb ka inimese platsenta 

moodustumisel. Hiire emaka endomeetriumis on Htra3 mRNA ekspressioon enne rasedust 

suhteliselt madal. Htra3 mRNA ekspressiooni tase suureneb postimplantatsiooni ja platsenta 

perioodi moodustumise jooksul. HTRA3 on konserveerunud inimese ja hiire vahel 87% 

mRNA tasemel ning 95% valgu tasemel (Nie et al., 2006). 

Samade bioloogiliste radade klasterdusanalüüs näitas, et NRG1 osaleb ekstratsellulaarse 

maatriksi düsassambleerumises ning ekspresseerub fibroblastides, müotsüütides ja 

skeletilihastes. Uuringud on näidanud, et NGR1 on üks neljast valgust, mis kuulub 

neureguliini perekonda. NRG1 on tihedalt seotud EFGR (Epidermal Growth Factor 

Receptor) perekonna retseptoritega. NGR1 moodustub arvukalt isoforme alternatiivse 

splaisingu kaudu, mis võimaldab tal omada mitut funktsiooni. Näiteks, üheks tema 

olulisemaks funktsiooniks on osalemine närvisüsteemi ja südame arengus (Britch, 2007; 

Talmade, 2008). EGFR ja tema ligandid on signaaliülekande molekulid, mis on seotud 

erinevate rakufunktsioonidega, nagu rakkude proliferatsioon, diferentseerumine ja kudede 

areng (Herbst, 2004). 

MFAP5 veel üks prioritiseeritud kandidaatgeen, vastutab bioloogiliste radade 

klasterdusanalüüsi põhjal kollageeni fibrillide- või ekstratselulaarse maatriksi 

organisatsiooni eest. Ekspresseerub peamiselt silelihastes ja müotsüütides. 

MFAP5 geen kodeerib 25 kDA mikrofibrillidega seotud glükoproteiine (Gibson et al., 

1996). MFAP5 stabiliseerib tüüp I kollageeni ja seega mängib olulist rolli ekstratsellulaarse 

maatriksi homeostaasis (Lemaire et al., 2005). 

Sarnaselt MFAP5 geeniga, on PDZRN3 ekstratsellulaarse maatriksi ja fibrillaarse kollageeni 

komponent. Ekspressioon toimub lihastes ning mitmed artiklid viitavad sellele, et tegemist 

on geeniga, mis mängib olulist rolli osteoblastide differentseerumisel (Honda et al., 2010). 

Osteoblastid on mononukleaarsed rakud, mis osalevad luu moodustumisel. Põhimõtteliselt, 

on osteoblastid spetsialiseerunud fibroplastid, mis ekspresseerivad lisaks fibroplastilise 

produktidele luude sialoproteiine ja ostekaltsiumi (Salentijn, 2007). Osteoblastid tootvad ka 

osteoidide maatriksit, mis koosneb enamasti tüüp I kollageenist (D`ippolito et al., 1999). 

Näidatud on ka, et PDZRN3 mängib olulist rolli lihaste differentseerumisel ja arengus 

(Honda et al., 2010). 

Viimaseks leitud kandidaatgeeniks on TBC1D19. Bioloogiliste radade analüüs ei näidanud 

tema põhifunktsiooniks seoseid kollageeniga või ekstratsellulaarse maatriksiga, kuigi leiti, et 

ekspressioon toimub fibroblastides, müotsüütides ja silelihastes. Hetkel ei ole nimetatud 

35

geen piisavalt uuritud, kuigi on leitud, et tema ennustatavaks funktsiooniks on 

odontoblastide polarisatsioon. Näidatud on ka see, et TBC1D19 kolokaliseeritud 

ekspressioon omab põhifunktsiooni dentiini moodustumisel (Choi et al., 2011). Dentiin 

koosneb kahest komponendist, mineraalne ja fibrilaarne kollageeni/mitte-kollageeni 

maatriks (Dayan et al., 1983). Tuleb mainida, et dentiini moodustumisel osalevad sellised 

maatriksmetalloproteinaasid nagu MMP-2 ja MMP-3 (Boushell et al., 2009, Dumas et al., 

1985). 

Kokkuvõtteks võib väita, et antud uuringus saadud tulemused viidavad sellele, et 

kubemesonga geeniriskid võivad olla seotud kollageenide geeniga, tema häiretega või 

polümorfismidega. Samas peab silmas pidama ka seda, et kollageen on levinuim valk 

inimese organismis, seepärast pakub ainult üks kandidaatgeen NRG1 hetkel kõige rohkem 

huvi, kuna ta osaleb ekstratsellulaarse maatriksi düsassambleerumise protsessil ning lisaks 

on see ainuke geen, mis leiti mõlemast ülegenoomsest analüüsist: mehed ja naised koos ning 

mehed eraldi. Uurides NRG1 seoseid teiste geenidega, leiti, et NRG1 asub tugevas 

koekspressioonis geenidega MMP-10 ja PTGS2 (Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2). 

PTGS2 geen on seotud tsütokiinide aktiivsusega. Need omavahelised seosed näitavad, et 

NRG1 on kõige tõenäolisem kandidaatgeen kubemesonga jaoks ning vajab kindlasti 

edasiseid uuringuid. 

36

8 Kokkuvõte 

Kubemesong on üheks sagedasemaks kirurgiliseks patoloogiaks üle terve maailma. 

Tänapäeval eksisteerib palju erinevaid meetodeid kubemesonga kirurgiliseks ravimiseks, 

kuid haiguse etioloogia ei ole siiamani lõplikult selgeks tehtud. Kubemesonga patogenees on 

multifaktoriaalne ning geneetilised tegurid omavad kindlasti nišši kubemesonga tekkimisel. 

Antud magistriväitekirja eesmärgiks oli geneetiliste variatsioonide leidmine, mis 

suurendavad kubemesonga haigestumise riski. Selleks analüüsiti 8 911 794 SNP markerit 

3851 indiviidil Eesti populatsioonist. Analüüsimaks geneetiliste variantide mõju 

kubemesongale, kasutasime logistilise regressiooni mudelit. SNP markereid analüüsides 

kasutati aditiivset mudelit ning kovariaatidena kasutati sugu ja vanust. 

Antud uuringu põhjal ei tuvastatud ühtegi ülegenoomselt statistiliselt olulist assotsiatsiooni. 

Seetõttu võiks arvata, et kubemesongaga pole seotud väike hulk tugeva mõjuga geene vaid 

pigem suurem hulk geene, mis kõik on väikese relatiivse riskiga. Lisateguriks on ka see, et 

kubemesonga fenotüüp on raskesti klassifitseeritav. 

Uurides assotsiatsioone, mille P-väärtuse nivoo jäi alla 10 -5 , identifitseeriti 35 

assotsiatsiooni, mille hulgast 5 on seotud kubemesonga fenotüüpidega ning on seetõttu 

potentsiaalsed kandidaatgeenid. Need on HTRA3, NRG1, MFAP5, PDZRN3 ning 

TBC1D19. Kõik need geenid on seotud kas kollageeniga või ekstratsellulaarse maatriksiga 

ning on varemteostatud uuringutes välja pakutud kui kandidaatgeenid. Mehi eraldi 

analüüsides ning võrreldes tulemusi kogu andmestiku analüüsi tulemusega, leidsime, et 

mõlemas analüüsis esines parimate tulemuste hulgas geen NRG1. See on ainuke geen antud 

nimekirjast, mis on seotud ekstratsellulaarse maatriksi düsassambleerumisega. 

Kuna antud uuringu käigus ei õnnestunud tuvastada ülegenoomselt statistiliselt olulisi 

assotsiatsioone, on tulevikuplaaniks analüüse korrata suurema valimiga ning uuringu 

replitseerimine sõltumatus kohordis. 

37

9 Summary 

Repair of inguinal hernia is one of the most common operations in general surgery. Thus 

there are many methods of inguinal hernia repair, etiology of hernia formation still poorly 

understood. The cause of inguinal hernia is multifactorial and previous studies provide 

evidence for a genetic component of the disease. The aim of the present study has been 

identifying genetic loci that can be associated with inguinal hernia in Estonian population. 

In the present study 8 911 794 markers for 3851 were analysed for individuals from Estonia 

population. The logistic regression method was used to analyse inguinal hernia data and 

covariates sex and age were used. Markers were tested using an additive model. 

In this study genome-wide statistical significant associations were not identified. Our results 

suggest, that there are no genes with large effects to hernia but rather many genes all having 

small relative risks. Additionally, the phenotype of disease is complex and the selection of 

cases and controls can be suboptimal. 

The associations with P-value less than 10 -5 revealed 35 loci containing 5 loci, which 

potentially are novel candidate loci for inguinal hernia. These loci were near or within 

HTRA3, NRG1, MFAP5, PDZRN3 and TBC1D19 gene regions. All this genes are 

associated with collagen or extracellular matrix, which have been mentioned in previous 

studies of inguinal hernia. In additional analysis, men were analysed separately. Both 

analysis – men separately and all individuals, revealed the same locus, NRG1. Interestingly, 

this gene is associated with collagen diassamble. 

Even through present genome-wide association study didn’t identify statistically significant 

results, several interesting novel loci were found for inguinal hernia. To validate the results, 

a replication study must be considered using independent cohort data. 

38

Tänuavaldused 

Autor tänab dr. Taie Kaasikut haigusjuhtude valiku eest. 

Aurot tänab Tõnu Eskot abi eest geeniekspressiooni analüüsil. 

Autor tänab juhendajat Reedik Mägi kvaliteedi-kontrolli ja imputeerimise teostamise eest. 

Autor tänab Viljo Sood proovide genotüpiseerimise teostamise abi eest. 

Samuti tänab autor kõiki laborikaaslasi meeldiva tööatmosfääri loomise eest. 

Autor tänab ka kõiki Eesti Geenivaramu doonoreid. 

Autori siiras tänu kuulub pereliikmetele ja sõpradele toetamise ja kaasaelamise 

eest. 

Eelkõige soovib autor tänada oma juhendajaid Evelin Mihailovit, Reedik Mägi ja professor 

Andres Metspalu suunamise, innustamise ning suurejooneliste visioonide eest. 

39

10 Kasutatud kirjandus 

Abrahamson J (1998) Etiology and pathophysiology of primary and reccurent groin hernia 

formation. Surg Clin North Am 78:953-72 

Aren A, Gökce AH, Gökce FS, Dursun N (2011) Roles on matrix metalloproteinases in the 

etiology of inguinal hernia. Hernia 15:667 - 671 

Bay-Nielson M, Kehlet H, Strand L, Malmstrom J, Andersen FH, Wara P, Juul P, Callesen 

T (2011) Quality assessment of 26 304 herniorrhaphies in Denmark: a prospective 

nationwide study. Lancet 358:1124-1128 

Bellon JM, Bajo A, Ga-Honduvilla N, Gimeno MJ, Pacual G, Guerrero A, Bujan J (2001) 

Fibroplasts from the transversalis fascia of young patients with direct inguinal hernias show 

constitutive MMP-2 overexpression. Ann Surg 233:287-91 

Britsch S (2007) The neuregulin-I/ErbB signaling system in development and disease. Adv 

Anat Embryol Cell Biol 190: 1–65 

Burton PR, Hansell AL, Fortier I, Manolio TA, Khoury MJ et al. (2009) Size matters: just 

how big is BIG?: Quantifying realistic sample size requirements for human genome 

epidemiology. Int J Epidemiol 38:263-73 

Choi SJ, Song IS, Feng JQ, Gao T, Haruyama N, Gautam P, Robey PG, Hart T (2010) 

Mutant DLX 3 disrupts odontoblast polarization and dentin formation. Devol Bio 344(2): 

682-692 

Clayton D, Walker NM, Smyth DJ, Pask R, Cooper JD et al., (2005) Population structure, 

differential bias and genomic control in a large scale, case-control association study. Nature 

Genet 37:1243-1246 

D’ippolito G, Schiller P, Ricordi C, Roos BA, Howard GA (1999) Age-Related Osteogenic 

Potential of Mesenchymal Stromal Stem Cells from Human Vertebral Bone Marrow. 

Journal of Bone and Mineral Research 14 (7): 1115–1122. 

Dayan D, Binderman I, Mechanic GL (1983) A Preliminary Study of Activation of 

Collagenase in Carious Human Dentin Matrix. Archives of Oral Biol 28(2):185–187. 

Devlin B, Roeder K (1999) Genomic control for association studies. Biometrics 55:997- 

1004 

Duerr RH, Taylor KD, Brant SR, Rioux JD, Silver MS et al., (2006) A genome-wide 

association study identifies IL23R as an inflammatory bowel disease gene. Science 314: 

1461-1463 

Dumas J, Hurion N, Weill R, Keil B (1985) Collagenase in mineralized tissues of human 

teeth. Fed of Eur Biochem Societies. 187(1):51–55. 

40

Easton DF, Pooley KA, Dunning AM, Pharoah PD, Thompson D et al., (2007) Genomewide 

association study identifies novel breast cancer susceptibility loci. Nature 447, 1087- 

1093 

Fallgatter AJ, Herrmann MJ, Hohoff C, Ehlis AC, Jarczok TA, Freitaf CM, Deckert J 

(2006) DTNBP1 (Dysbindin) Gene Variants Modulate Prefrontal Brain Function in Healthy 

Individuals. Neuropsychopharmacology 31(9): 2002-2010 

Freedman ML, Reich D, Penney KL, McDonald G, Mignault AA et al., (2004) Assessing 

the impact of population stratification on genetic association studies. Nature Genet 36:388- 

393 

Friedman DW, Boyd CD, Norton P, Greco RS, Boyarski AH, Mackenzie JW, Deak SB 

(1993) Increases in type III collagen gene expression and protein synthesis in patients with 

inguinal hernias. Ann Surg 218:754-60 

Gabriel SB, Schaffner SF, Nguyen H, Moore JM, Roy J et al. (2002) The structure of 

haplotype blocks in the human genome. Science 296:2225-2229 

Geissler B, Anthuber M (2011) Chirurgie der Leisten- und Schenkelhernien. Chirurg 

82:451-465 

Gibson MA, Hatzinikolas G, Kumaratilake JS, Sandberg LB, Nicholl JK, Sutherland GR, 

Cleary EG (1996) Further characterization of proteins associated with elastic fiber 

microfibrils including the molecular cloning of MAGP-2 (MP25). J Biol Chem 271 (2): 

1096–103 

Grosfeld JL (1989) Current concepts in inguinal hernia in infants and children. World J 

Surg 13:506 

Gudmundsson J, Sulem P, Manolescu A, Amundadottir LT, Gudbjartsson D et al., (2007) 

Genome-wide association study identifies a second prostate cancer susceptibility variant at 

8q24. Nature Genet 39:631-637 

Hayakawa A, Fujimoto K, Ibayashi H (1982) Two cases of Ehlers-Danlos syndrome with 

gastrointestinal complications. Gastroenterol Jpn 17:61-67 

Herbst RS (2004) Review of epidermal growth factor receptor biology. Int. J. Radiat. 

Oncol. Biol. Phys. 59 (2 Suppl): 21–6 

Hirschhorn JN, Lohmueller K, Byrne E and Hirschhorn K (2002) A comprehensive review 

of genetic association studies. Genet. Med. 4:45-61 

Honda T, Yamamoto H, Ishii A, Inui M (2010) PDZRN3 Negatively Regulates BMP-2induced 

Osteoblasr Differentation through Inhibition of Wnt Signaling. Mol Biol Cell 18: 

3269-3277 

Howson JM, Barrat BJ, Todd JA, Cordell HJ (2005) Comparison of population- and family 

– based methods for genetic association analysis in the presence of interacting loci. Genet 

Epidemiol 29:51-67 

41

Jenkins JT, O`Dwyer PJ (2008) Inguinal Hernias. BMJ 336: 269-272 

Junge K, Klinge U, Rosch R, Mertens PR, Kirch J, Klosterhalfen B, Lynen P, Schumpelick 

V (2004) Decrease collagen type I/III ration in parients with recurring hernia after 

implantation of alloplastic prostheses. Langenbecks Arch Surg 389:17-22 

Kingsnorth A, LeBlanc K (2003) Hernias: inguinal and incisional. Lancet 362:1561-71 

Knowler WC, Williams RC, Pettitt DJ, Steinberg AG (1988) Gm3;5,13,14 and type 2 

diabetes mellitus: an association in American Indians with genetic admixture. Am J Hum 

Genet 43:520-526 

Kähäri VM, Saarialho-Kere U (1997) Matrix metalloproteinases in skin. Exp Dermatol 

6:199-213 

Lander ES et al, (2001) Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 

409:860–921 

Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum C, Zody MC (2001) Initial sequencing and 

analysis of the human genome. Nature 409:860-921 

Lau H, Fang C, Yuen WK, Patil NG (2007) Risk factors for inguinal hernia in adult males: 

a case-control study. Surgery 141:262-6 

Lemaire R, Korn JH, Shipley JM, Lafyatis R (2005)Increased expression of type I collagen 

induced by microfibril-associated glycoprotein 2: novel mechanistic insights into the 

molecular basis of dermal fibrosis in scleroderma. Arthritis and Rheumatism 52(6): 1812- 

1823 

Liem MS, van der GY, Breemer FA, van Vroohoven TJ (1997) Increased risk fot inguinal 

hernia in patients with Ehlers-Danlos syndrome. Surgery 122:114-115 

Lynen JP, Klinge U, Mertens PR (2006) Hernia disease and collagen gene regulation: are 

there clues for intervention. Hernia 10:486-491 

Lynen JP, Mertens P.R, Klinge U, Schumpelick V (2004) The biology of hernia formation. 

Surgery 136:1-4 

Marchini J, Cardon LR, Phillips MS and Donnelly P (2004) The effects of human 

population structure on large genetic association studies. Nature Genet 36:512-517 

Marchini J, Howie B (2010) Genotype imputation for genome-wide association studies. 

Nature Genet 11:499-511 

Mautner J, Behrends U, Hortnagel K, Briemeier M, Hammerschmidt W, Strobl L, 

Bornkamm G.W, Polack A (1996) c-myc expresiion is actyvated by the immunoglobulin 

kappa-enchancers from a distance of at least 30 kb but not by elements located within 50 kb 

of the unaltered c-myc locus in vivo. Oncogene 12:1299 – 1307 

42

Mertens PR, Harendza S, Pollock AS, Lovett DH (1997) Glomerular mesangial cellspecific 

transactivation of matrix metalloproteinase 2atranscription is mediated by YB-1. J 

Biol Chem 272:22905 – 22912 

Mertens PR, Steinmann K, Alfonso-Jaume MA, En-Nia A, Sun Y, Lovett DH (2002) 

Combinatorial interactions of p53, AP2 and YB-1 with a single enchancer element regulate 

gelatinase a expression in neoplastic cells. J Biol Chem 277:24875-24882 

Motlagh B, MacDonald JR, Tarnoplosky MA (2005) Nutritional inadequacy in adults with 

muscular dystrophy. Muscle Nerve. 31(6):713-8. 

Murruste M, Lepner U, Vaasna T, Varik K, Sõrmus A (2005) Kõhuseina songad. Eesti Arst 

84(11): 823-839 

Nie G, Li Y, Hale K, Okada H, Manuelpillai U, Wallace EM, Salamonsen LA (2006) Serine 

peptidase HTRA3 is closely associated with human placental development and is elevated in 

pregnancy serum . Biology of Reproduction 74: 2 366-374 

Ninomiya Y, Olsen BR (1984) Synthesis ans characterizatio of cDNA ecoding a cartilagespecific 

short collagen. Proc Natl Acad Sci USA 81:3014-3018 

Paajanen H, Scheinin T, Vironen J (2010) Commentary: Nationwide analysis of 

complications related to inguinal hernia surgery in Finland: a 5 year register study of 55,000 

operations. The American Journal of Surgery 199:746-751 

Pans A, Pierard GE, Albert A (1999) Immunohistochemical study of the rectus sheath and 

transversalis fascia in adult groin hernias. Hernia 3:45 

Pans A, Pierard GE, Albert A et al., (1997) Adult groin hernias: New insight into their 

biomechanical characteristics. Eur J Clin Invest 27:863 

Petterson FH, Anderson CA, Geraldine MC, Barrett JC, Cardon LR, Morris AP, Zondervan 

KT (2009) Marker selection for genetic case-control association studies. Nature Prot Genet 

4:743-750 

Plenge RM, Cotsapas C, Davies L, Price AL, de Bakker PW et al., (2007) Two independent 

alleles at 6q23 associated with risk of rheumatoid arthritis. Nature Genet 39:1477-1482 

Primatesta P, Goldacre MJ (1996) Inguinal hernia repair: incidence of elective and 

emergency surgery, readmission and mortality. Int J Epidemiol 25:835-839 

Quintas M, Rodrigues CJ, Yoo JH et al., (2000) Age related changes in the elastic fiber 

system of the interfoveolar ligament. Rev Hosp Clin Fac Med S Paulo 55:83-6 

Read RC (1984) The development of inguinal herniorrhaphy. Surg Clin North Am 64:185- 

196 

Reich DE, Lander ES (2001) On the allelic spectrum of human disease. Trends Genet 

17:502-510 

43

Risch N, Merikangas K (1996) The future of genetic studies of complex human disease. 

Science 273:1516-1517 

Robert M, Zollinger Jr (2004) An updated traditional classification of inguinal hernias. 

Hernia 8:318-322 

Rodrigues Jr A, Rodrigues CJ, Pereira da Chunha AN, Yoo J (2002) Quantitative analysis 

of collagen and elastic fibers in the transversalis fascia in direct and indirect inguinal hernia. 

Rev. Hosp. Clin. Fac. Med. S. Paulo 57(6):265-270 

Saarialho-Kere UK (1998) Patterns of matrix metalloproteinase and TIMP expression in 

chronic ulcers. Arch Dermatol Res 290:47-54 

Sanna S, Jackson AU, Nagaraja R, Willer CJ, Chen WM et al., (2007) Common variants in 

the CDF5-UQCC region are associated with variation in human height. Nature Genet 

40:198-203 

Scuteri A, Sanna S, Chen WM, Uda M, Albai G et al., (2007) Genome-wide association 

scans shows genetic variants in the FTO gene are associated with obesity-related traits. Plos 

Genet 3:e115 

Si Z, Bhardwaj R, Rosch R, Mertens PR, Klosterhalfen B, Klinge U, Rhanjit B, Rene P. M 

(2002) Impaired balance of type I and type III procollagen mRNA in cultured fibroplasts of 

patients with incisional hernia. Surgery 131:324 – 331 

Sladek R, Rocheleau G, Rung J, Dina C, Shen L et al., (2007) A genome–wide association 

study identifies novel risk loci for 2 type diabetes. Nature 445:881-885 

Spencer CC, Su Z, Donelly P, Marchini J (2009) Designing genome-wide association 

studies: sample size, power, imputation, and the choise of genotyping chip. PLos Genet 5(5): 

e1000477. 

Straub RE, Jiang Y, MacLean CJ, Ma Y, Webb BT, Myakishev MV et al (2002). Genetic 

variation in the 6p22.3 DTNBP1, the human ortholog of the mouse dysbindin gene, is 

associated with schizophrenia. Am J Hum Genet 71: 337–348. 

Zheng H, Si Z, Kasperk R, Bhardwaj R.S, Schumpelick V, Klinge U, Klosterhalfen B 

(2002) Reccurent inguinal hernia: disease of collagen matrix? World J Surg 26:401-8 

Zondervan KT, Cardon LR (2007) Designing candidate gene and genome-wide casecontrol 

association studies. Nature Protoc 2:2492-2501 

Talmage DA (2008) Mechanisms of neuregulin action. Novartis Found Symp 289: 74 - 84 

Wagh PV, Read RC (1971) Collagen deficency in rectus sheath of pathients with inguinal 

herniation Proc Soc Exp Bio Med 137:382 

Wang WY, Barratt BJ, Clayton DG, Todd JA (2005) Genome-wide association studies: 

theoretical and practical concerns. Nature Rev Genet 6:109-18 

44

Westra HJ, Jansen RC, Fehrmann RS, te Meerman GJ, van Heel D, Wijmenga C, Franke L 

(2011) MixupMapper: correcting sample mix-ups in genome-wide datasets increases power 

to detect small genetic effects. Bioinformatics 27(15):2104-11 

Willer CJ, Sanna S, Jackson AU, Scuteri A, Bonnycastle LL et al., (2008) Newly identified 

loci that influence lipid concentrations and risk of coronary artery disease. Nature Genet 

40:161-169 

WTCCC (2007) Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases 

and 3,000 shared controls. Nature 447:661-678 

Yamada Y, Ando F, Niino N, Shimokata H (2005) Association of a -1997G→T 

polymorphism of the collagen Ialpha1 gene with bone mineral density in postmenopausal 

Japanese woman. Hum Biol 77:27 – 36 

45

11 Kasutatud veebilehed 

1000 Genoomi Projekt http://www.1000genomes.org 

Eesti Geenivaramu http://www.geenivaramu.ee 

Illumina Inc. http://www.illumina.com 

R statistikapakett http://www.r-project.org/ 

HapMap2 Projekt http://www.hapmap.com 

PLINK toolset http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/plink/ 

Affymetrix Inc. http://www.affymetrix.com 

Gene Network http://129.125.165.109:8080/GeneNetwork/ 

LocusZoom https://statgen.sph.umich.edu/locuszoom/genform.php?type=yourdata 

GTOOL http://www.well.ox.ac.uk/~cfreeman/software/gwas/gtool.html 

IMPUTE v2 http://mathgen.stats.ox.ac.uk/impute/impute_v2.html 

SNPTEST v2 https://mathgen.stats.ox.ac.uk/genetics_software/snptest/snptest.html 

Catalog of Published Genome-Wide Association Studies 

http://www.genome.gov/gwastudies/ 

RHK-10 http://www2.sm.ee/rhk/ 

46

12 Lisad 

47

Lisa 1. Regionaalsed joonised kõikide indiviidide assotsiatsioonianalüüsi tulemustega. 

48

Lisa 1. (järg) 

49


50


51


52


53


54


55

Lisa 1.(järg) 

56

Lisa1. (järg) 

57

Lisa 2. Regionaalsed joonised meeste assotsiatsioonianalüüsi tulemustega. 

58


59


61


62


64


65

Lisa 3. HTRA3 geenivõrgustik. Erinevate raku osadega seotud geenid on grupeeritud 

taustavärvi järgi. 

67

Lisa 4. MFAP5 geenivõrgustik. Erinevate raku osadega seotud geenid on grupeeritud 


68

Lisa 5. NRG1 geenivõrgustik. Erinevate raku osadega seotud geenid on grupeeritud 


69

Lisa 6. PDZRN3 geenivõrgustik. Erinevate raku osadega seotud geenid on grupeeritud 


70

Lisa 7. TBC1D19 geenivõrgustik. Erinevate raku osadega seotud geenid on grupeeritud 


71

Ülegenoomne assotsiatsiooniuuring kubemesonga geneetiliste ...

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?