Inimese DNA koopiaarvu variatsioonid: nende tekkemehhanismid ja ...

TARTU ÜLIKOOL
LOODUS- JA TEHNOLOOGIATEADUSKOND
MOLEKULAAR- JA RAKUBIOLOOGIA INSTITUUT
BIOTEHNOLOOGIA ÕPPETOOL
Olga Tšuiko
Inimese DNA koopiaarvu variatsioonid:
nende tekkemehhanismid ja uurimismeetodid
Bakalaureusetöö
Juhendaja prof. Ants Kurg, Ph.D
TARTU 2010

Sisukord
Sissejuhatus ................................................................................................................................. 3
Lühendid ja mõisted .................................................................................................................... 4
1. Koopiaarvu variatsioonid: fenomen inimese genoomis ....................................................... 5
2. Koopiaarvu variatsioonide tekkemehhanismid .................................................................... 7
2.1. Mitte-alleelne homoloogiline rekombinatsioon ............................................................ 7
2.2. Mittehomoloogne DNA otste liitmine......................................................................... 12
2.3. Replikatsioonikahvli peatumine ja matriitsi ümberlülitus/Mikrohomoloogia
vahendatud katkestusest indutseeritud replikatsioon ............................................................. 14
3. Koopiaarvu variatsioonide mõju inimese genoomile ......................................................... 17
3.1. Genotüüp-fenotüüp suhe ............................................................................................. 19
4. Koopiaarvu uurimismeetodid ............................................................................................. 22
4.1. Mikrokiibipõhised uurimismeetodid ........................................................................... 22
4.1.1. Kiibipõhine võrdlev genoomne hübridisatsioon ..................................................... 22
4.1.2. SNP-de genotüpiseerimine ...................................................................................... 24
4.2. PCR-põhised uurimismeetodid ................................................................................... 26
4.2.1. Multipleks amplifitseeritava proovi hübridisatsioon ............................................... 26
4.2.2. Multipleks ligeeritava proovi amplifikatsioon ........................................................ 27
4.2.3. Multipleks ligeeritav genoomne amplifikatsioon .................................................... 27
Kokkuvõte ................................................................................................................................. 29
Summary .................................................................................................................................... 30
Kirjanduse loetelu ...................................................................................................................... 31
2

Sissejuhatus
Inimese genoomi lõplik järjestamine 2003. aastal lõi uued võimalused inimgenoomi
variatsioonide uurimiseks. Lisaks juba eelmise sajandi viimasest kümnendist tuntud
ühenulekotiidilistele polümorfismidele, mis moodustavad inimese genoomi järjestuse
variatsioonide põhiosa, hakati suuremat tähelepanu pöörama ka struktuursetele
variatsioonidele. Kui varasematel aegadedel arvati, et kromosomaalsed ümberkorraldused on
peaaegu alati seotud genoomsete haigusetega, siis aastal 2004 ilmusid esimesed artiklid
koopiaarvu variatsioonide (copy number variation; CNV) esinemise kohta normaalsetel
indiviididel. Järgnevate uuringute käigus näidati, et CNV-de esinemine inimese genoomis on
üsna tavaline ja neid leidub suurel hulgal ka tervetel indiviididel pakkudes sellel põhjusel
erilist huvi teadlastele. Aastal 2007 valiti seesama üllatav avastus – struktuursete
variatsioonide ulatuslik esinemine inimgenoomis ka ajakirja Science poolt aasta teaduslikuks
läbimurdeks. Praeguseks on üle kogu inimgenoomi kaardistatud tuhandeid koopiaarvu poolest
varieeruvaid regioone, mis võivad hõlmata mitmeid geene või teisi funktsionaalseid elemente,
kuid seejuures ei pruugi põhjustada mingit selget kliinilist fenotüüpi. Samas on uuringute
käigus leitud ka hulgaliselt regioone, mille koopiaarvu muutused on erinevate genoomsete
haiguste põhjuseks. Tehnoloogiline revolutsioon genoomiuuringutes on muutnud kergesti
kättesaadavaks sadu tuhandeid kuni miljoneid proove kandvad kogu-genoomi mikrokiibi
analüüsid ning järjest populaarsemaks on saamas teise põlvkonna sekveneerimise meetodid.
Tehnoloogia areng ja meetodite lahutusvõme paranemine on võimaldanud järjest detailsemalt
uurida CNV-de tekkemehhanisme ja rohkem teada saada nende seosest teiste genoomi
struktuurelementidega.
Antud bakalaureusetöö eesmärgiks oli anda kirjandusel põhinev ülevaade inimgenoomis
esinevatest koopiaarvu variatsioonidest, nende tekkemehhanismidest, seosest genoomsete
häiretega ning nende uurimismeetodist ja samuti püüda kirjeldada antud uuringute võimalikke
edasisi arenguid.
3

Lühendid ja mõisted
array-CGH Mikrokiibipõhine võrdlev genoomne hübridisatsioon
(Array-based Comparative Genomic Hybridization)
array-MAPH Mikrokiibipõhine multipleks amplifitseeritavate proovide hübridisatsioon
(Array Multiplex Amplifiable Probe Hybridization)
BAC
Bakteri kunstlik kromosoom (Bacterial Artificial Chromosome)
BIR
Katkestusest indutseeritav replikatsioon (Break Induced Replication)
CMT1A Pärilik motosensoorne neuropaatia (Charcot-Marie-Tooth disease type 1A)
CNV
Koopiaarvu variatsioon (Copy-Number Variation)
DSB
Kaheahelalised katkestused (Double Strand Breaks)
FISH
Fluorestsents in situ hübridisatsioon (Fluorescence In Situ Hybridization)
FoSTeS Replikatsioonikahvli peatumine ja matriitsi ümberlülitus
(Fork Stalling and Template Switching)
HNPP Kompressioonipareeside eelsoodumusega pärilik neuropaatia
(Hereditary Neuropathy with liability to Pressure Palsies)
HR
Homoloogne rekombinatsioon (Homologous Recombination)
LCR
Madala koopiaarvuga kordusjärjestus (Low-Copy Repeats)
LOH
Heterosügootsuse kadu (Loss of Heterozygosity)
MAPH Multipleks amplifitseeritavate proovide hübridisatsioon
(Multiplex Amplifiable Probe Hybridization)
MEPS Minimal Efficient Processing Segment
MLGA Multipleks ligeeritav genoomne amplifikatsioon
(Multiplex Ligation-dependent Genome Amplification)
MLPA Multipleks ligeeritavate proovide amplifikatsioon
(Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification)
MMBIR Mikrohomoloogia vahendatud katkestusest indutseeritud replikatsioon
(Microhomology Mediated Break Induced Replication)
NAHR Mittealleelne homoloogne rekombinatsioon
(Non-Allelic Homologous Recombination)
NHEJ Mittehomoloogne DNA otste liitmine (Non-Homologous End Joining )
PMD
Pelizaeus-Merzbacher’i haigus (Pelizaeus-Merzbacher Disease)
SNP
Ühenukleotiidne polümorfism (Single Nucleotide Polymorphism)
4

1. Koopiaarvu variatsioonid: fenomen inimese genoomis
Inimese genoom sisaldab arvukalt polümorfisme. Polümorfne muutus võib olla vaid ühe aluse
vahetumine või ka erineva pikkusega DNA-lõikude kordumine genoomis. Põhimõtteliselt
tuleneb geneetiline varieeruvus peamiselt ühenukleotiidsete polümorfismide (single
nucleotide polymorphism; SNP) esinemisest, erinevast tandeemstete korduste (mini- ja
mikrosatelliitide) arvust ja transponeeruvate elementide esinemisest või puudumisest
genoomis (Freeman et al., 2006). Koopiaarvu variatsioonid (copy number variation; CNV) on
arvatavasti sama olulised nagu SNP-id erinevuste määramisel indiviidide vahel ja on
tõenäoliselt suur liikumapanev jõud evolutsioonis. CNV-d defineeritakse kui >1kb pikkused
DNA segmendid, mille koopiaarv on võrreldes referentsgenoomiga erinev. Kui tavaliselt
esineb geen kahe koopiana, siis CNV-de puhul on struktuursete ümberkorralduste tõttu DNA
koopiaarv kas suurenenud või vähenenud ning vastavalt on tegu kas duplikatsiooniga või
deletsiooniga. Lisaks deletsioonidele ja duplikatsioonidele võivad ka teised antud DNA
regiooni kordistumised (triplikatsioonid jne.), insertsioonid ja translokatsioonid anda
tulemuseks koopiaarvu muutuse. Samuti võivad balansseeritud inversioonid, mis otseselt ei
põhjusta CNV-de teket, kaasa aidata nende ilmnemisel. CNV algus- ja lõpp-positsioone
nimetatakse murrukohtadeks (breakpoints); kompleksete ümberkorralduste murrukohti võib
olla rohkem kui kaks ja samas võib ümberkorralduses esineda mitu erinevat muutust.
Inimese genoomi sekveneerimise lõpetamine 2003.aastal andis võimaluse põhjalikult uurida
selle genoomseid variatsioone. Inimese genoomi nukleotiidse ehituse selgitamise järgmine
etapp oli eri indiviidide genoomi varieeruvuse uurimine ja kaardistamisega saadud
informatsiooni täpsem analüüs, nn HapMap projekt 1 . Kasutades HapMap projekti andmeid,
mis sisaldasid aastaks 2007 juba rohkem kui 3,1 miljonit ühenukleotiidset polümorfismi, sai
võimalikuks läbi viia edukaid ülegenoomseid assotsiatsiooni uuringuid. Juba 2004. aastal
avaldati kaks tööd, milles näidati, et DNA koopiaarvu variatsioonid on inimeste
üldpopulatsioonis laialt levinud (Iafrate et al., 2004; Sebat et al., 2004). Inimestel esineb üle
tuhande erineva CNV regiooni ning kokku võivad need hõlmata kuni 600Mb genoomist.
Koopiaarvu variatsioonide jaotumine genoomis pole juhuslik, vaid sõltub regiooni
genoomsest kontekstist. Näiteks soodustab ümberkorralduste teket segmentaalsete
duplikatsioonide ja teatud lühikeste mitte-B-DNA struktuure moodustavate järjestusmotiivide
esinemine. Umbes 1/3 CNV-dest esinevad peritsentromeersetes ja subtelomeersetes alades,
ülejäänud lokaliseeruvad nn hotspot-idesse (Conrad et al., 2009).
5

Tehtud uuringutest selgus ka see, et CNV-de sagedus erinevates populatsioonides varieerub.
White ja kollegid uurisid 12 Genoomsete Variantide andmebaasis oleva CNV sagedust viie
etnilise grupi hulgas. Uuringusse võeti kolm erinevat Euroopa, üks Aasia ja üks Aafrika
päritolu populatsiooni - kokku 300 indiviidi. Näidati, et 7 CNV-d esinesid kõigis
populatsioonides ja nende esinemissagedus varieerus 3 kuni 52% (White et al., 2007).
Järgnevalt jälgiti CNV-de esinemist varem uurimata Okeaania ja Ameerika põlisrahvaste
populatsioonides ja leiti uusi, seni kaardistamata CNV lookuseid (Jakobsson et al., 2008).
Loodetavasti aitab DNA koopiaarvu variatsioonide levik ja sagedus erinevates
populatsioonides mõista nende rolli nii genoomsete kui mendeliaalsete haiguste kujunemisel.
Samas on CNV-de ulatust ning sagedust erinevates etnilistes gruppides veel suhteliselt vähe
uuritud. Alles viimastel aastatel on hakanud ilmuma teaduspublikatsioonid, mis võrdlevad
DNA koopiaarvu variatsioonide sagedusi erinevates populatsioonides.
Nagu ka teised geneetilised variatsioonid võivad ka koopiaarvu muutusted olla seotud kas
vastuvõtlikuse või resistentsusega teatud haigustele. Selle kohta, kuidas täpselt CNV-d
otseselt või kaudselt geeniekspressiooni ning seeläbi fenotüüpi mõjutavad, ei ole hetkel veel
selget arusaamist. Samas on juba teada CNV-de seos selliste komplekshaiguste ja –tunnustega
nagu autism, skisofreenia, Crohn’i tõbi, psoriaas või isegi kehamassindeks (Zhang et al.,
2009). Samuti on teada koopiaarvu variatsioonid, millel on kaitsev toime HI viirusesse ning
malaariasse nakatumise eest. Näiteks on suurenenud koopiaarv CCL3L1 geenis seotud
väiksema vastuvõtlikusega HIV nakatumisele. Võimalik seletus on see, et ekspresseeritakse
rohkem CCL3L1 valku, mis kuulub kemokiinide perekonda ja on võimeline interakteeruma
CCR5-ga, ja seega tekkib konkurents CCR5 seondumissaidi pärast. See viib aeglasemale
haiguse progressioonile HIV-nakkatatud inimestel, tõstes nende resistentsust antud haiguse
suhtes (Kulkarni et al., 2008).
Praeguseks on teada, et ka erinevate pahaloomuliste kasvajate puhul on teatud geenide
koopiaarv suurenenud ja on tuvastatud mitmeid CNV-sid, mis kattuvad täielikult või osaliselt
nn „vähigeenidega”. Arvatakse, et edasised uuringud vähi tekkel osalevate CNV-de
tuvastamisel aitavad paremini aru saada ka selle haiguse geneetilistest alusest. Samuti on
oluline selles vallas uuringuid jätkata, sest palju on veel avastada, näiteks CNV-de väärtus
biomarkeritena vähiuuringutes (Shlien and Malkin, 2009).
Kuna CNV-d võivad hõlmata kas terve geeni või ainult osa sellest või osutuda rohkem geene
sisaldavaks genoomseks segmendiks, siis võivad mõned CNV-d tõenäoliselt mõjutada
mõningaid füsioloogilisi omadusi inimestel. Seega, lisaks haiguste põhjustamisele võivad
inimese-spetsiifilised koopiaarvu muutused olla aluseks kasulike tunnuste ilmnemisele, nagu
näiteks tunnetus või vastupidavus. Sellisel juhul alluvad CNV-d tõenäoliselt evolutsioonilisele
6

valikule ja geneetilise triivile. Kuna inimese genoomi puhul on täheldatud, et CNV-d asuvad
pigem väljaspool funktsionaalseid järjestusi (kodeerivad järjestused) ning paiknevad pigem
ultrakonserveerunud elementidega alades, siis annab see alust arvata, et vähemalt inimeste
puhul rakendub CNV-dele puhastav valik. Samuti on mitmete CNV-de puhul võimalik
kindlaks teha, kas nad on olnud evolutsioonis eelistatud, vastavalt sellele, kas nad omavad
adaptiivseid eeliseid nii inimese kui ka teiste liikide näitel. CNV-de uurimine võimaldab
avastada uusi funktsionaalseid geene ning paljastada neid muutusi genoomis, mis on
mõjutanud inimese evolutsiooni (Zhang et al., 2009).
Tänapäeval on koopiaarvu muutuste kirjeldamise jaoks tehtud mitmeid andmebaase. Kaks
kõige olulisemat andmebaasi, mida CNV-de interpreteerimisel kasutatakse, on polümorfseid
CNV-sid sisaldav Database of Genomic Variants 2 ehk nn Toronto andmebaas ja
haigusseoselisi CNV-sid koguv DECIPHER 3 (Database of Chromosomal Imbalances and
Phenotype in Humans using Ensembl Resources).
2. Koopiaarvu variatsioonide tekkemehhanismid
Kromosomaalseid ümberkorraldusi on palju uuritud erinevatel mudelorganismidel, nagu
pagaripärm Saccharomyces cerevisiae, soolekepike Escherichia coli ja äädikakärbes
Drosophila melanogaster. Mudelorganismide kasutamine aitas suurel määral aru saada
protsessidest, mis osalevad DNA replikatsioonil ja DNA reparatsioonil. Neid mehhanisme
peetakse liikumapanevateks jõududeks DNA koopiaarvu variatsioonide tekkel.
Inimesel on tänapäeval kirjeldatud kolm peamist viisi koopiaarvu variatsioonide tekkeks:
mittealleelne homoloogiline rekombinatsioon (Non-Allelic Homologous Recombination;
NAHR), mittehomoloogne DNA otste liitmine (Non-Homolgous End Joining; NHEJ) ning
replikatsiooni kahvli peatumise ja matriitsi ümberlülitamise mehhanism/mikrohomoloogia
vahendatud katkestusest indutseeritud replikatsioon (Fork Stalling and Template Switching/
Microhomology Mediated Break-Induced Replication; FoSTeS/MMBIR).
2.1. Mitte-alleelne homoloogiline rekombinatsioon
Homoloogiline rekombinatsioon (HR) üldiselt on geneetilise materjali rekombinatsioon, mille
käigus toimub nukleotiidsete järjestusi vahetus kahe identseid lõike sisaldavate DNA ahelate
vahel. Protsessi käigus toimub DNA füüsiline katkemine ja sellele järgnev taasühinemine,
mille tulemuseks on ahelate ümbervahetus. HR on aluseks paljudele DNA reparatsiooni
mehhanismidele ja samuti vastutab kromosoomide segregatsiooni ning uute järjestuste
kombinatsioonide tootmise eest meioosi käigus (Watson et al., 2003).
7

Lisaks alleelide omavahelisele rekombinatsioonile võib HR toimuda ka kohas, kus on olemas
nn madala sagedusega kordusjärjestused (low copy repeats; LCR), mis käituvad
rekombinatsiooni vahendajana (Hastings et al., 2009b). LCR piirkonnad on umbes 10-300 kb
pikkused segmentaalsed duplikatsioonid eukarüootses genoomis, millele on iseloomulik
>95% omavaheline identsus ja seetõttu omavad nad väga kõrget homoloogsust. LCR-id
võivad koosneda pseudogeenidest, geeni fragmentidest ja teistest kromosomaalsetest
segmentidest. Seetõttu on need regioonid geneetiliselt ebastabiilsed, mis on eelduseks
erinevate ümberkorralduste ja aberratsioonide tekkeks. Fakt, et paljude CNV-de murrukohad
esinevad just LCR regioonides viitab sellele, et need koopiaarvu muutused on arvatavasti
tekkinud HR käigus kordusjärestuste vahel mitte-alleelse homoloogilise rekombinatsiooni
kaudu (Non-allelic homologous recombination; NAHR). Sellise HR tulemuseks võivad olla
kromosomaalsed ümberkorraldused. Arvatakse, et NAHR vastutab paljude suuremate
muutuste eest ning selle toimumise tõenäosus on kuni 10− 4 ühe generatsiooni kohta (Conrad
and Hurles, 2007).
Esimesena kirjeldati mitte-alleelset homoloogset rekombinatsiooni CNV tekkemehhanismina
aastal 1998 James R. Lupski poolt päriliku motosensoorse neuropaatia ja
kompressioonipareeside eelsoodumusega päriliku neuropaatia haigetel CMT1A/HNPP
(Charcot-Marie-Tooth disease type 1A/Hereditary Neuropathy with liability to Pressure
Palsies; CMT1A/HNPP) patsientidel (Lupski, 1998a). Sagedaseimaks haigust põhjustavaks
muutuseks on LCR-ide regioonis ebavõrdse krossingoveri tõttu toimunud 1,5 Mb
tandemduplikatsioon CMT1A piirkonnas 17p11.2-17p12 ja vastavalt 1,5Mb deletsioon PMP2
geenil (kodeerib perifeerset müeliini valku), mis viib HNPP tekkele.
Sõltuvalt LCR-ide iseloomust võib NAHR-i tulemus olla erinev (Gu et al., 2008):
1. Kui kaks LCR regiooni asuvad samas kromosoomis ja samasuunaliselt, siis soodustab
NAHR nende vahel duplikatsiooni või deletsiooni teket.
2. Kui LCR-id asuvad samas kromosoomis, aga vastupidises orientatsioonis, siis on
NAHR-i tulemuseks nendevahelise fragmendi inversioon.
3. NAHR-i esinemine erinevate kromosoomide vahel viib kromosomaalsele
translokatsioonile.
Antud ümberkorralduste võimalikud variandid on näidatud joonisel 1.
Rekombinatsiooni initsioonis mängib suuremat rolli LCR-ide suurus, kui homoloogia tase.
Märgati ka, et ümberkorraldatud regiooni ulatus sõltub kordusjärjestuste pikkusest: mida
pikem on LCR, seda suurem on ümberkorraldatud regioon. Samuti on näidatud,
kordusjärjestuste vaheline kaugus määrab nende pikkuse: mida suurem on see kaugus, seda
pikemad on tekkinud vastavad kordusjärjestused (Shaw and Lupski, 2004).
8

Joonis 1. Genoomsete ümberkorralduste tekke. (Gu et al., 2008)
LCR-ide asukoht samas kromosoomis ja samas orientatsioonis põhjustab
deletsiooni/duplikatsiooni (vasakul). Kui orientatsioon on vastupidine, põhjustab NAHR
inversiooni.
Lisaks LCR järjestustele võivad NAHR substraatidena esineda ka sellised kordusjärjestused
nagu retrotransponeeritavad elemendid L1, Alu elemendid või transposoonide-sarnased ja
teised potentsiaalsed cis-rekombinogeensed järjestused. Selliseid elemente leidub inimese
genoomis suurel hulgal ja mõned neist kutsuvad esile kaheahelalisi DNA katkestusi, mis on
rekombinatsiooni toimumise eelduseks. Eriti tundlikud on meiootiliste paardumisvigade
suhtes Alu-järjestused. Kuna need kordusjärjestused on üsna väiksed, siis on nendevahelise
NAHR-i tulemusena ümberpaiknenud DNA fragmendid ka suhteliselt lühikesed (Zhang et al.,
2009).
Tavaliselt tekib NAHR meioosis ebavõrdse ristsiirde tulemusel, mis viib genoomsete
ümberkorralduste tekkele. DNA struktuuri muutus võib olla kas päriliku haiguseni viiv geeniviga,
hulgitegurilisele haigusele vastuvõtlikuks muutev variatsioon või neutraalne
polümorfism. Meioosi käigus võib NAHR toimuda kahe paraloogse järjestuse vahel, mis
asuvad kas samal kromatiidil (intrakromatiidne), tütar-kromatiididel
(intrakromosomaalne/interkromatiidne) või homoloogsetel kromosoomidel
(interkromosomaalne). Interkromatiitsed ja interkromosomaalsed ümberkorraldused kahe
samas orientatsioonis oleva kordusjärjestuse vahel viivad deletsiooni või duplikatsiooni
tekkele, samas kui intrakromatiidsete ümberkorralduste tulemusel tekivad ainult
9

deletsioonid. Antud muutused on näidatud joonisel 2. Sellest tuleneb, et vähemalt
teoreetiliselt peaks deletsioonide tekkesagedus olema kõrgem, kui duplikatsioonide oma (Gu
et al., 2008).
Joonis 2. Interkromosomaalsed, intekromatiidsed ja intrakromatiitsed genoomsed
ümberkorraldused. (Gu et al., 2008)
Kromosoomid on näidatud mustana, LCR kollaste nooltena. Interkromosomaalne ja
interkromatiidne ristsiire tekitab nii duplikatsioone, kui deletsioone. Intrakromatiidne
rekombinatsioon tekitab ainult deletsioone.
NAHR võib toimuda ka mitoosis, tekitades mosaiikse rakkude populatsiooni, mis kannavad
erinevat koopiaarvu. CNV-de esinemine monosügootsetel kaksikutel kinnitab genoomsete
ümberkorralduste esinemist somaatilistes rakkudes. Somaatiline NAHR võib põhjustada ka
genoomhäireid mosaiiksuse ilminguga, nagu näiteks somaatilise NF1 deletsiooni puhul, mille
tulemusena tekkib segmentaalne neurofibromatoos. Kromosoomipiirkonnas 17q11.2 on
tuvastatud arvukalt erinevaid mutatsioone. Geeni ekspressioonitase on väga varieeruv: mõnel
suguvõsa antud mutatsiooni kandjal on vaid mõningaid nahamuutusi, teisel aga võib juba
lapsena esineda muutusi kesknärvisüsteemis (Aula et al., 2010).
Samuti on pakutud, et mõnedes lookustes on NAHR-i toimumise sagedus naiste ja meeste
gametogeneesis erinev. On näidanud, et suurem osa CMT1 duplikatsioonidest toimub just
spermatogeneesil, samas kui umbes 80% NF1 deletsioonidest on emapoolse päritoluga
(Lazaro et al., 1996; Lopes et al., 1997). Need selged erinevused on ilmselt tingitud
loomuomasest NAHR-i erinevusest meeste ja naiste sugurakkude vahel, või peegeldavad
erineva valiku kalduvust ümberkorraldatud alleelide suhtes naiste ja meeste sugurakkudes.
Epigeneetilised modifikatsioonid naiste- ja meeste gametogeneesis ja gameetides ise võivad
10

ka olla aluseks sellistele erinevustele, kuigi praegusel hetkel on selle kohta vähe andmeid ja ei
saa üldistusi veel teha.
Selleks, et homoloogiline rekombinatsioon üldse saaks aset leida, on vaja piisavalt
homoloogsete DNA lõikude olemasolu ehk nn. MEPS segmente (minimal efficient processing
segment, MEPS), mis määravad minimaalse homoloogia taseme NAHR-i toimumiseks.
Genoomse ümberkorralduse analüüsimise käigus CMT1A/HNPP patsientidel tuvastasid
Reiter ja tema kolleegid, et inimese meioosi puhul peab MEPS olema 300-500bp pikkune,
samas kui somaatilise homoloogse rekombinatsiooni jaoks on vaja 200-300bp katkestamatut
homoloogiat (Reiter et al., 1998). Uuringud on näidanud ka, et NAHR ei pruugi toimuda üle
terve LCR regiooni, vaid on koondunud nn „hotspot`ideks“ ehk piirkondadeks, kus ahelate
ümbervahetus toimub sagedamini, kui teistes regioonides genoomis (Lupski and Stankiewicz,
2005). Alu järjestustes detekteeriti 28bp pikkune rekombinatsiooni „hotspot“, samal ajal kui
L1 elementidel ei leitud ühtegi „hotspot-i“. NAHR-i „hotspot-id“ on tihedalt seotud ka alleelse
homoloogilise rekombinatsiooni omadega, nimelt on NAHR-i ja HR-i „hotspot-idel“ mitu
ühist tunnust:
1. nad asuvad väikeste (

induced replication; BIR). Kui reparatsiooni protsessist võtavad osa need homoloogsed
järjestused, mis asuvad kromosoomi erinevates lookustes, siis võivad tekkida
translokatsioonid, duplikatsioonid või deletsioonid, moodustades alternatiivse NAHR
tekkemehhanismi (joonis 3b).
Joonis 3. Koopiaarvu muutused homoloogilise rekombinatsiooni käigus (Hastings et al.,
2009b).
a) Ebavõrdne ristsiire NAHR-i käigus moodustub siis, kui rekombinatsiooni reparatsiooni
süsteem kasutab homoloogina otseseid kordusjärjestusi (x). Selle tulemusena tekkivad
vastavad duplitseeritud ja deleteeritud regioonid järjestuste vahel (y). b) NAHR tekkib BIR
mehhanismi kaudu juhul, kui katkenud molekulid kasutavad ektoopilist homoloogiat
replikatsioonikahvli taaskäivitamiseks. Deletsioonid ja duplikatsioonid formeeruvad
erisündmustel.
Kuigi HR on oluline osa DNA reparatsioonil, see on samuti ohtlik sündmus, kuna võib viia
kromosomaalsete struktuuride muutuste, kaasa arvatud koopiaarvu variatsioonide tekkele. HR
reparatsioonimehhanismid püüavad seda minimeerida, vältides ristsiiret ja reguleerides
homoloogia valikut kahe lõigu vahel. Ometi nõuab meioos krossingoveri toimumist ja selle
tingimuse mõju avaldub kõrgenenud CNV tekkes meioosi käigus.
2.2. Mittehomoloogne DNA otste liitmine
Kuigi arvatakse, et NAHR on CNV-de põhiline tekkemehhanism, ei ole siiski kõik
ümberkorraldused inimese genoomis seotud homoloogse rekombinatsiooniga. Mõned
genoomsed haigused on seotud hoopis selliste ümberkorraldustega, mille murdepunktid ei asu
LCR piirkondades, vaid unikaalsetes järjestustes või erinevates LCR-des. See viitab, et need
on tekkinud tõenäoliselt mittehomoloogsete protsesside vahendusel (Shaw and Lupski, 2004).
12

Esimesena pakkusid mittehomoloogset DNA otste liitmist (non-homologous end joining;
NHEJ) CNV-de tekkemehhanismina välja Inoue ja tema kolleegid, uurides PLP1 geeni
deletsiooni Pelizaeus-Merzbacher haiguse (Pelizaeus-Merzbacher Disease; PMD) patsientidel
(Inoue et al., 2002). NHEJ on üks põhimehhanismidest, mida kasutavad eukarüootsed rakud
DSB parandamiseks ning mida on kirjeldatud peaaegu kõikides organismides. NHEJ on
aluseks juhuslike CNV-de tekkes, ümberkorralduse tekkel murrukohad ei kattu ning seetõttu
on ka nende esinemissagedus teatud lookuses harvem -

osalevate valkude sünteesiks. Ku-vahendatud NHEJ ei ole täpne protsess ja võib viia kuni
mitme tuhande aluspaari pikkuste deletsioonide tekkele (Watson et al., 2003).
NHEJ mehhanismi iseloomustab kaks olulist tunnust :
1. esiteks, võrreldes NAHR-ga, NHEJ ei vaja LCR-e ega MEPS-e
2. teiseks, NHEJ jätab nn „informatsioonilise jälje“, milleks võib olla kas nukleotiidide
lisandumine või nende kadu.
Genoomsed ~600-700kb duplikatsioonid PLP1 geenis on peamised mehhanismid haiguse
põhjustamisel, olles aluseks PMD ilmnemisel 50-70% kõikidest haigejuhtumitest. PLP1 geen
kodeerib transmembraanset proteolipiidset valku, mis on domineeriv müoliini valk inimese
kesknärvisüsteemis ja mängib olulist rolli müoliini formeerumises ja struktuuri
stabiliseerimises. PLP1 deletsiooni piirkonna analüüs näitas, et deletsiooni ümbritsevate
järjestuse vahel puudub homoloogia ning distaalse ning proksimaalse murdepunkti vahel asub
tundmatu päritoluga lühike DNA järjestus. Need avastused olid kooskõlas NHEJ
mehhanismiga (Inoue et al., 2002).
Nobile ja Toffolati teadusgrupid tegelesid Duchenne lihasdüstroofiaga (Duchenne muscular
dystrophy; DMD) ja seda põhjustava düstrofiini geeni deletsiooni uurimisega. DMD
patsientide vastavas geenis on mutatsioon, mis rikub kopeerimisraami, ja düstrofiini
tekkimine on täielikult takistatud. Sekveneerimine näitas, et NHEJ-toimel tekitud
ümberkorralduste murdepunktid langevad tihti kokku selliste kordusjärjestustega nagu LTR,
LINE, Alu, MIR ja MER2. Lisaks sellele sisaldasid paljud järjestused niisugust motiivi nagu
TTTAAA, mis on tuntud selle poolest, et on võimeline põhjustama kaheahelisi katkestusi või
muutma DNA mikrostruktuuri (Nobile et al., 2002; Toffolatti et al., 2002).
2.3. Replikatsioonikahvli peatumine ja matriitsi ümberlülitus
/Mikrohomoloogia vahendatud katkestusest indutseeritud replikatsioon
Kasutades kiibipõhist võrdlevat genoomset hübridisatsiooni PLP1 mittekorduva
duplikatsiooni uurimiseks samuti Pelizaeus-Merzbacher’i haiguse patsientidel, avastas Lee
koos oma kolleegidega, et antud regioonis esineb väga kõrge kompleksete ümberkorralduste
(complex chromosomal rearrangement; CCR) sagedus. CCR defineeritakse kui struktuurne
ümberkorraldus, milles esineb vähemalt kolm murdpunkti ja geneetiline materjal on
vahendatud kahe või enama kromosoomi vahel.
Normaalse või triplitseeritud koopia arvuga lõike, mis sisalduvad duplitseeritud järjestuste
sees, oli üsna raske seletada ainult NAHR-i või NHEJ-ga. Seetõttu pakuti aastal 2007 välja uus
14

mehhanism – replikatsioonikahvli peatumine ja matriitsi ümberlülitus (Fork Stalling and
Template Switching; FoSTeS). Vastavalt sellele mudelile peatub DNA replikatsiooni käigus
DNA replikatsioonikahvel teatud positsioonil (näiteks, DNA juuksenõelastruktuuri
kohtamisel), replikatsioonikompleks tuleb sünteesitavalt DNA ahelalt lahti ja liitub teise
läheduses asuva aktiivse replikatsioonikahvliga, kopeerides DNA järjestust ühest ahelast
teisse. (joonis 5). Kordusjärjestuste piirkonnad moodustavad DNA-s anomaalseid
sekundaarstruktuure, mille abil DNA-polümeraas võib replikatsiooni ajal sünteesida uude
DNA ahelasse suurema hulga kordusjärjestusi, kui neid on komplementaarses ahelas.
Selliseks ümberlülitamiseks on piisav isegi 4-15bp mikrohomoloogia ja selle tulemusena ei
teki murdepunkt, vaid nn „liite-punkt“ (joint-point) (Lee et al., 2007). Ümberlülitamine
kahvlile, mis asub allavoolu (edaspidine invasion) annab deletsiooni, samas kui
ümberlülitamine kahvlile, mis asub ülesvoolu (tagurpidine invasion) lõpeb duplikatsiooniga.
Huvitav on see, et protsess võib toimuda mitu korda järjest (FoSTes x 2, FoSTes x 3 jne.), mis
peegeldab DNA polümeraasi viletsat efektiivsust ning põhjustab komplekseid
kromosomaalseid ümberkorraldusi. Kuna FoSTes on replikatsioonil põhinev protsess,
arvatakse, et see toimub mitoosis, erinedes seega NAHR ja NHEJ mehhanismidest, mille
aluseks on pigem meiootilised rekombinatsiooni mehhanismid.
Joonis 5. Replikatsioonikahvli peatumine ja maatritsi ümberlülilatime (Hastings et al.,
2009b).
Paljas üksikahelalise mahajääva DNA template (a) võib omandada sekundaarse struktuuri,
mis blokeerib replikatsioonikahvli edasi liikumise (b). 3’ots vabaneb maatritsist (c) ning
lülitub ümber teisele ahelale, genereerides selllega genoomseid ümberkorraldusi.
Aastal 2009 avaldati Hastings`i ja kaastöötajate poolt artikkel mehhanismist, mis on lähedane
FoSTeS mehhanismiga ning mida nimetatakse Mikrohomoloogia vahendatud katkestusest
indutseeritud replikatsiooniks (Microhomology-mediated Break Induced Replication;
MMBIR). Seda mehhanismi kasutatakse üksikahelaliste katkestatud otste parandamiseks, kui
üksikahelalised DNA (single-stranded DNA; ssDNA) otsad on kättesaadavad ja omavad
15

mikrohomoloogiat lõhutud replikatsioonikahvli 3’ otsaga. Pakutakse, et MMBIR leiab aset
siis, kui rakk on stressis. BIR-i toimumiseks on vajalik Rad51 valkude olemasolu, mis omavad
olulist funktsiooni DNA parandamisel, aktiveerides homoloogse rekombinatsiooni ja teisi
mehhanisme, mis võtavad osa DSB reparatsioonist. Kui rakk on stressis, siis klassikaline BIR
ei saa toimuda, kuna vastusena stressile on Rad51 valgud allaekspresseeritud ning
homoloogsete interaktsioonide toimumise arv langeb, mille tulemusena BIR vahetakse
MMBIR-i vastu. On näidanud, et näiteks hüpoksia viib Rad51 repressioonile ja seega kahaneb
homoloogilise rekombinatsiooni sagedus (Hastings et al., 2009a).
Üldiselt lüheneb selle mehhanismi toimumisel katkenud 5’ ots ja 3’ ots jääb katmata ning
võib liituda iga mikrohomoloogiat omava ssDNA molekuliga moodustades uue madalaprotsessiivsusega
replikatsioonikahvli. Selline protsess võib toimuda mitmeid kordi, kuni
jõutakse tagasi algsele tütar-kromatiidile, moodustades uuesti protsessiivse
replikatsioonikahvli, mis lõpetab DNA sünteesi. (Joonis 6). Vastupidise suunaga
kordusjärjestuste olemasolu võib tekitada juuksenõela struktuuri, mis paljastab üksikahelisi
järjestusi. Lisaks võivad need struktuurid tõsta tõenäosust, et replikatsioonikahvel peatub ja
algatab BIR-i toimumise.
Joonis 6. MMBIR mehhanism.(Hastings et al., 2009a)
(A) näitab katkestatud replikatsioonikahvli õlga. (B) madala-protsessiivsusega
replikatsioonikahvliteke. Mehhanism võib toimuda mitu korda; pikendatud ots lüheneb (C) ja
(D) ning moodustatakse uusi replikatsioonikahvleid erinevatel maatritsidel (E) ja (F). Kui
ümberlülitumine jõuab tagasi algsele tütar-kromatiidile (F), DNA süntees viiakse lõpuni.
Tulemuseks saadud regioon sisaldab järjestusi erinevatest genoomsetest piirkondadest (G).
16

MMBIR võib põhjustada erinevate struktuursetee ümberkorralduste teket (Tabel 1):
1. Translokatsioonid tekivad, kui ümberlülitamine toimub teisele kromosoomile;
ümberlülitamine kas teisele tütar-kromatiidile või homoloogile pöördorientatsioonis
annaks inverteeritud kromosomaalse segmendi;
2. Duplikatsioonid tekivad, kui ümberlülitamine toimub kas tütar-kromatiidi või
homoloogi replikatsioonikahvli murdpunktist tahapoole ning
3. Deletsiooni puhul replikatsioonikahvli murdepunktist ettepoole.
4. Kui ümberlülitus toimub järjestusele, mis eelnevalt oli juba duplitseerunud, on
tulemuseks triplitseerunud piirkond.
5. Juhul aga, kui ümberlülitus toimub samal molekulil replikatsioonikahvli murdpunktist
tagapool, võib see käivitada „veereva ratta“ replikatsiooni ning antud piirkonda
amplifitseerimise.
MMBIR mehhanism mõjutab bioloogilisi protsesse inimesel mitmel tasandil. Esiteks,
rakutasemel võib mehhanism olla aluseks sündmustele, mis põhjustavad pahaloomuliste
kasvajate teket ja progresseerumist. Teiseks, organismitasemel võib MMBIR luua LCRjärjestusi,
mis on eelduseks NAHR-i toimumisele, ja seega soodustab CNV-de teket ning
nendega seotud genoomsete häirete, eeskätt mikrodeletsiooni ja –duplikatsiooni sündroomide
teket (Hastings et al., 2009a).
Tabel 1. MMBIR-i vahendatud maatritsi ümberlülitamise kromosomaalsed tagajärjed.
(Hastings et al., 2009a)
Ümberlülitamise koht:
Tulemus:
Tütarkromatiidile või homoloogile replikakatsioonikahvlist tahapoole Duplikatsioon
Tütarkromatiidile või homoloogile replikakatsioonikahvlist ettepoole Deletsioon
Tütarkromatiidile või homoloogile, mis asub vastupidises orientatsioonis Inversioon
Mittehomoloogsele järjestusele
Translokatsioon
Järjestusele, mis oli juba duplitseerunud
Triplikatsioon
Sama molekulile murdpunktist tahapoole "Veerava ratta"
replikatsioon
3. Koopiaarvu variatsioonide mõju inimese genoomile
CNV-de mõju genoomi tasandil sõltub muutuste iseloomust, ulatusest ja asukohast (joonis 7)
(Lee and Scherer, 2010):
A) Koopiaarvu muutus võib mõjutada funktsionaalsete geenide arvu läbi terve või osalise
deletsiooni või duplikatsiooni. Tulemuseks on kas geeni inaktiveerimine (“loss-of-
17

function” mutatsioon) või nn. “gain-of-function” mutatsioon, mille käigus geenijärjestus
ühineb mõne teise kodeeriva järjestusega või uue regulatoorse järjestusega, mis
suurendavad geeniekspressiooni aktiivsust või hulka.
B) Deletsiooni korral võivad avalduda retsessiivsed mutatsioonid või funktsionaalsed
polümorfismid, mis omavad mõju geenide funktsioneerimisele ning võivad põhjustada
geenide inaktiveerimist.
C) Deletsioon võib samuti ka kõrvaldada või katkestada läheduses olevaid funktsionaalseid
geene, kusjuures mehhanism, mis põhjustab omavahel ühendatud geenide deletsiooni võib
põhjustada ka duplikatsiooni.
D) CNV võib mõjutada fenotüüpi juhul, kui ümberkorraldused kromosoomis mõjutavad
geeniekspressiooni/regulatsiooni regulatoorjärjestuste muutuste või deleteerumiste tõttu
(positsiooniline efekt) või kui geeni ja selle regulaatorelementide deleteerumine võib
mõjutada allelidevahelisi interaktsioone (trans-efekt).
Joonis 7. Molekulaarsed muutused genoomsete ümberkorralduste tulemusena (Lee and
Scherer, 2010)
Joonis illustreerib mehhanisme, mis on aluseks geenide doosiefekti ilmnemiseks koopiaarvu
muutusel. Geenid on näidanud värviliste kastikestena, promootorid – värviliste ovaalidega.
Painutatud nool tähistab transkriptsiooni suunda.
18

3.1. Genotüüp-fenotüüp suhe
Fenotüübi muutust põhjustav geeniviga võib varieeruda ühe aluse muutusest kuni mitmete
tuhandete või isegi miljonite aluspaaride vigadeni. Genoomsete ümberkorralduste, kaasa
arvatud CNV-de päritolu võib jagada neljaks:
1) Nad võivad olla päritud vanemalt, kellel on sama iduliini variant
2) Nad võivad olla päritud vanemalt, kellel on iduliini mosaiiksus antud variandi suhtes
3) Tekkida de novo vanemate sugurakkudest
4) Tekkida de novo somaatilistet rakkudest
Viimane on eriti asjakohane vähigenoomikas, tänu üldisele genoomsele ebastabiilsusele ja
vähirakkude laienemisele ja evolutsioonile (Lee and Scherer, 2010).
Koopiaarvu muutused, mis hõlmavad ainult üht paari geene, võivad omada funktsionaalseid
tagajärgi, mis on sarnased punktmutatsioonidele, ja avalduvad klassikaliste mendeliaarsete
dominantsete või retsessiivsete tunnustena. Ka geeni suurus mõjutab mutatsioonide arvu:
suurtes geenides tekib rohkem mutatsioone, kui väikestes. Seega leidub suurtes düstrofiini-,
A-hemofiilia- ja neurofibramatoosigeenides rohkesti de novo tekkelisi mutatsioone.
Mutatsioonid võivad mitmeti mõjutada geenide talitlust. Väga selge muutus on deletsioon,
mis hõlmab kogu geeni tervikuna või suuremat osa sellest; geeni informatsiooni kadumine
kõrvaldab täielikult ka geeni produkti. Geneetiliste segmentide deletsioonid põhjustavad
hemisügootsust deleteeritud lõigu suhtes, mis omakorda võib viia haplopuudulikusele
doositundlikes geenides. Näiteks, koopiaarvu vähenemine LCE3B ja LCE3C geenides
(kodeerivad vajalikke epidermaalkihi valke) on seotud suurenenud riskiga psoriaasi
haigestumiseks (de Cid et al., 2009). Geeni kopeerimisraami muutvate deletsioonide tähtus
sõltub ka sellest, kui olulises kohas valgustruktuuri ja ensüümitoime regulatsiooni seisukohalt
viga paikneb. Düstrofiini geeni kopeerimisraami muutvad deletsioonid põhjustavad üldiselt
rasket, Duchenne’i tüüpi lihasdüstroofiat, seevastu kopeerimisraami mittekahjustavad
deletsioonid harilikult kergemat, Beckeri tüüpi lihasdüstroofiat. CNV-põhjustatud geenide
ülekattumine võib viia geenide ühinemisele, mis võib samuti mõjutada fenotüübi avaldumist.
Koopiaarvu suurenemine duplikatsioonide tõttu võib tekitada tasakaalutust, kuna
duplitseerunud geenidelt võidakse hakata transkribeerima liigset produkti. Teisel juhul, kui
duplikatsioon toimub ühe geeni sees (intrageenne), võib see muuta produkti struktuuri ja
seeläbi mõjutada tema funktsiooni (Lupski, 1998b).
Deletsioonid ja duplikatsioonid kutsuvad esile geeni produkti suure muutuse sel juhul, kui
muudavad geeni kopeerimisraami (frame shift mutation). Kopeerimisraami muutus tingib
eranditult vale aminohappeahela moodustamist ja sageli enneaegset kohtumist
stoppkoodoniga. Aminohappe muutus võib tekitada omakorda ebasobiva valgustruktuuri, kus
19

aminohappeahelaist koosnev valgukompleks laguneb ja tekib raskekujulisem fenotüüp. See
ilmneb tavaliselt siis, kui valmis valk koosneb mitmest subühikust. Sel juhul häirib vigane
komponent lõpp-produkti toimimist. Näiteks, I tüüp kollageen moodustub kolmest alfaahelast,
mis keerduvad üksteise ümber ja moodustavad kolmekeermelise ahela. Kui I tüüp
kollageeni moodustumisel mutatsiooni tõttu tekkib vigane alfa-ahel, kujuneb raske pärilik
luustumishäire, osteogenesis imperfecta (Aula et al., 2010).
CNV-de geenide katkestamise efekt võib ilmneda erinevate mehhanismide vahendusel.
Murdpunkt geeni sees võib blokeerida funktsionaalse geeni tööd, aga samuti võib geeni töö
olla häiritud ka siis, kui on toimunud muutused promootori- ja/või teiste
regulatoorsejärjestuste piirkondades või kui ümberkorraldused on mõjutanud kromatiini
struktuuri. HapMap’i andmete kasutamisel toimunud lümfoblastide geeni ekspressiooni
uuringute käigus sai selgeks, et rohkem, kui pooled tuntud CNV efektidest on seotud just
geenide lõhkumisega ja ümberkorraldustega regulatoorsetes regioonides, ja mitte muutmisega
geenidoosides (Stranger et al., 2007).
Geeni 5’ otsas paikneva promootorala mutatsioon võib transkriptsioonifaktori kinnituskoha
hävitada ning selle tagajärjel jääb geeniinformatsiooni kopeerimine mRNA-ks ära.
Progresseeruv müoklooniline epilepsia tuleneb tsüstatiin B (CSTB) geeni mutatsioonist, mille
puhul geeni toimimine lakkab ja mRNA-d ei teki. Promootoralaga seonduvad ka geeni
avaldumist pärssivad tegurid (supressorid), mille identifitseerimisjärjestuse mittetoimimine
võib põhjustada geeni kodeerimisprotsessi jätkumist (Aula et al., 2010).
Tõenäoliselt mõjutavad mõned geenid, mille geenidoosi tundlikus on varieeruv, kas otseselt
või kaudselt naabergeenide ekspressiooni. Siit tuleneb, et koopiaarvu muutused nendes
geenides võivad negatiivselt avalduda nende geenide töös. Kui vastavate geenide enhanserid
või repressorid paiknevad ümberkorraldatud piirkondades, siis tekib suur tõenäosus, et CNVde
muutused, eriti deletsiooni puhul, võivad mõjutada vajaliku RNA taseme sünteesi ja seega
ka valgu transleerimist teatud geenist (Reymond et al., 2007).
Kui koopiaarvu variatsioon mõjutab tervet geeni, eriti sellist, millel on oluline bioloogiline
funktsioon, siis loomulikult oodatakse, et see võib mõjutada ka vastuvõtlikkust haigustele.
Funktsionaalne mõju võib sõltuda sellest, kas CNV muudab järjestust või relatiivset asukohta
antud genoomses DNA segmendis, mis käitub kas enhanserina või supressorina geeni
ekspressioonil. Kuna CNV-d mõjutavad suurel määral genoomset ebastabiilsust, siis
võimaldavad perekonna uuringud kindlasks teha mitte ainult seda, kui tavapärased CNV-d on
inimeste genoomis, vaid ka seda, kui tihti nad ilmnevad de novo või kuidas muutuvad
põlvkonniti. Perekonna uuringud võivad olla informatiivsed ka CNV tekke kohta (samuti ka
CNV-de tõenäolise patogeensuse määramiseks) (Lee and Scherer, 2010). Näiteks võib,
20

inversioon vanemate kromosoomis soodustada de novo ümberkorralduste teket järeltulijatel.
17q21.3 mikrodeletsiooni sündroom on märkimisväärne näide sellest, kuna kõik käesoleval
hetkel teadaolevad haigestumisjuhtumid tulenevad sellest, et vanematel on olemas
spetsiifiline inversioon, mis on eurooplastele üsna iseloomulik. Antud inversioon on 900kb
pikk ja ta surub alla rekombinatsiooni H1 ja H2 haplotüüpide vahel ja sellega kaasneb 500-
650kb deletsioon, mis võib mõjutada vähemalt kuut geeni, millest üks, MAPT geen, kodeerib
mikrotuubulitega-seostunud valku (Shaw-Smith et al., 2006).
Inversioonid mängivad üldse erilist rolli struktuursete ümberkorralduste tekkel. Kuna
inversioonid viivad ainult orientatsiooni muutmisele, mitte aga koopiaarvu variatsioonidele, ei
saa neid detekteerida kasutades hübridisatsioonipõhiseid meetodeid. Kõige tihedamini
esinevad peritsentraalsed inversioonid kromosoomidel 1, 2, 3, 5, 9, 10 ja 16. Käesoleval ajal
on Toronto andmebaasis kirjeldatud 914 inversiooni. Märkimisväärseks erinevuseks
inversioonide ja CNV-de puhul ongi see, et geenid inversioonide sees võivad jääda
mõjutamata, samal ajal kui koopiaarvu muutused mõjutavad alati geeni tööd. Tänu oma
tasakaalustatud iseloomule, inversioonid tavaliselt ei oma kliinilist olulisust, välja arvatud
juhtudel kui murdpunkt lõhub geeni või asub geeni ja tema transkriptsiooni regulaatorite
vahel (Feuk, 2010).
Üks paremini kirjeldatud inversiooni-põhjustatud haigustest on hemofiilia A, X-liiteline
haigus, mida põhjustab mutatsioon faktori VIII geenis. Korduv inversioon leiti umbes 43%
patsientidel. Murdpunktide molekulaarne iseloomustus näitab, et inversioon ilmnes intrakromosomaalse
homoloogse rekombinatsiooni tõttu ja see tuleneb ainult meeste
sugurakkudest. Selline korduv inversioon võib olla umbes 400kb pikk ja on vahendatud kahe
inverteerunud segmentaalse duplikatsiooni vahel, millest üks asub faktor VIII geeni intronis
22.
On olemas ka spetsiifiline inversioonide kategooria, mis otseselt ei põhjusta genoomseid
häireid, vaid suurendab ümberkorralduste tekke riski, mis omakorda võib olla aluseks
haiguste avaldumisele. Selline seos kirjeldati esimesena Williams-Beureni sündroomi puhul,
mis on tavaliselt tingitud 1,5Mb mikrodeletsiooni esinemisest 7q11.23 regioonis. Nagu ka
17q21.3 mikrodeletsiooni sündroomi puhul soodustab, inversioon NAHR-i teket, millega
kaasneb deletsioon. Reymond ja tema kolleegid demonstreerisid, et inimese DNA deletsioon
kromosoomis 7 mõjutab piirnevate geenide transkriptsiooni taset. Samuti mikrodeletsioonid
kromosoomides 17 ja 22, mis vastavad Smith-Magenis ja DiGeoge sündroomitele, mõjutasid
teiste geenide ekspressiooni (Reymond et al., 2007).
21

Kokku on kirjeldatud vähemalt üheksa mikrodeletsiooni sündroomi, mille deletsiooni
regiooni on leitud inversiooni variantidena üldpopulatsioonis (Tabel 2).
Tabel 2. Inversioonidega seotud ümberkorraldused. (Feuk, 2010)
Kromosoomipiirkond Inversiooni suurus (Mb) Häire/ümberkorraldus
3q29 1,9 3q29 deletsiooni sündroom
5q35.2-q35.3 1,9 Sotos mikrodeletsiooni sündroom
7q11.23 1,5 Williams-Beuren mikrodeletsiooni sündroom
8p23 4,7 Inv dup(8p) ja del (8)(p23.1;p23.2)
15q11-q13 4 Angelman deletsiooni sündroom
15q13.3 2 15q13.3 mikrodeletsioon
15q24 1,2 15q24 mikrodeletsioon
17q12 1,5 Neerutsüsti ja diabeedi (RCAD) mikrodeletsiooni
sündroom
17q21.31 0,9 17q21.31 mikrodeletsiooni sündroom
4. Koopiaarvu muutuste uurimismeetodid
Esimesi koopiaarvu muutusi hakati uurima juba kümneid aastaid tagasi, kasutades selleks
standartseid molekulaargeneetika analüüsimeetodeid, nagu näiteks erinevad vöödistusmeetodid,
Southern blot, FISH, kvantitatiivne ja murdepunkti PCR. Varasemal ajal kasutati
neid peamiselt lokaalsete, suuremalt osalt genoomsete haigustega seotud, ümberkorralduste
uurimiseks konkreetsetes genoomi regioonides. Tänapäeval on arendatud palju uusi
kiibipõhiseid ja PCR-põhiseid meetodeid, mille abil saab läbi viia kogugenoomseid uuringuid
ja mis võimaldavad paralleelselt uurida erinevaid regioone. Nendeks enimkasutatud
meetoditeks on array-CGH, SNP-de genotüpiseerimine, MAPH, MLPA ja MLGA.
4.1. Mikrokiibipõhised uurimismeetodid
4.1.1. Kiibipõhine võrdlev genoomne hübridisatsioon
Kiibipõhine võrdlev genoomne hübiridisatsioon (array comparative genomic hybridisation;
arrayCGH) arenes klassikalisest võrdlevast genoomsest hübridisatsioonist (comparative
genomic hybridization; CGH), mis põhineb erinevate fluorokroomidega märgitud uuritava ja
referents DNA hübridiseerimisel normaalsetele metafaasis olevatele kromosoomidele. CGH
meetodi suurimaks puuduseks oli tema väga madal lahutusvõime, mis jäi 5-10Mb vahele ja
pidev vajadus metafaasi kromosoomi preparaatide järgi. Seetõttu arendati välja kiibipõhine
22

meetod, mille lahutusvõime on praeguseks ajaks jõudnud 20-100kb (Carter, 2007).
ArrayCGH meetodi kasutamist soodustas Inimese Genoomi Projekti andmebaasi loomine,
mille käigus moodustati suured inimese DNA inserte sisaldavate kloonide (BAC kloonide)
raamatukogud ja järjestati need kloonid sekveneerimiseks. Metafaasi kromosoomid asendati
mikrokiipidega, millele kinnitati pikad DNA järjestused kloonide raamatukogust (Solinas-
Toldo et al., 1997). Nagu ka tavalise CGH puhul märgitakse testitav ja normaalne DNA
erinevate fluorokroomidega Cyanine 3 (Cy3) ja Cyanine 5 (Cy5). (joonis 8) Selleks, et
blokeerida uuritava DNA kordusjärjestuste seondumist proovidele lisatakse Cot-1 DNAd.
Kiipe skaneeritakse fluorokroome ergastava laservalgusega ning tekkivate
fluorestsentssignaalide tugevuse järgi saadakse teada hübridiseerinud test- ja referents-DNA
hulgad. Kui fluorokroomide suhe on võrdne, siis on nii test- kui ka kontroll DNA’l sama
koopiaarv; kui Cy3:Cy5 suhe on muutunud, viitab see sellele, et meid huvitavas regioonis on
toimunud kas DNA kadu või juurde lisandumine. ArrayCGH lahutusvõime määrab see,
kuidas mikrokiibile kinnitatud proovijärjestused katavad antud genoomset regiooni või
kogugenoomi kiipide puhul kogu genoomi.
ArrayCGH lubab kasutada kõrget lahutusvõimet ja see on võimas meetod koopiaarvu
määramiseks ning muutuste kaardistamiseks otseselt inimese genoomi järjestusele. Samuti on
see tehnoloogia kiirendanud kasvajate koopiaarvu muutuste uurimist, näitades lootustandvaid
tulemusi CNV detekteerimiseks normaalsete ja kasvaja rakkude vahel, olles seega väga
tähtsaks meetodiks kasvajate uuringutes ja diagnostikas (Wain et al., 2009).
Käesoleval ajal on arrayCGH tasapisi muutumas uueks peamiseks standardseks meetodiks
kliinilises tsütogeneetikas. Paljud kliiniliselt kasutatavad arrayCGH platvormid on disainitud
nii, et nende abil on võimalik võimalik detekteerida aneuploidsust, hästi kirjeldatud
mikrodeletsiooni/mikroduplikatsiooni sündroome ja subtelomeerseid või muid
kromosoomalseid ümberkorraldusi. Peamine puudus sellel meetodil on see, et arrayCGH ei
võimalda detekteerida translokatsioone, inversioone ja polüploidsust (Shinawi and Cheung,
2008).
23

Joonis 8. Array CGH. (Wain et al., 2009)
Test ja referents DNAd märgitakse erinevalt, segatakse kokku ja hübridiseeritakse
mikrokiibile. Peale hübridisatsiooni määratakse fluorokroomide fluorestsentsi suhted ja
lõpptulemust saadakse log 2 skaala kujul.
4.1.2. SNP-de genotüpiseerimine
Viimastel aastatel on kaks suurt firmat, Affymetrix 4 (Santra Clara, CA, USA) ja Illumina 5
(San Diego, CA, USA) tegelenud SNP-de genotüpiseerimise tehnoloogia väljatöötamisega.
Esialgu kasutati seda tehnoloogiat SNP-de määramiseks, nüüdseks on aga see kasutusel ka
koopiaarvu muutuste uurimiseks üle kogu inimese genoomi. (Wain et al., 2009).
Üldiselt seisneb selle meetodi (SNP-CGH) eelis selles, et võrreldes teiste meetoditega vajavad
SNP kiibid vähem uuritavat DNA-d eksperimendi kohta. Hübridisatsioonil ei kasutata kahe
DNA ko-hübridisatsiooni, nagu arrayCGH puhul, vaid ühe DNA hübridisatsiooni. Selleks, et
vähendada signaali-müra suhet, töödeldakse DNA esialgu restriktsiooni ensüümidega, seejärel
ligeeritakse adapterid ning amplifitseeritakse saadud väiksed fragmendid universaalsete
praimerite abil, et vähendada hübridisatsiooni kompleksust. DNA kompleksuse vähenemine
võib aga tuua ka raskusi analüüsi tulemuste interpreteerimisel. Nimelt võib DNA fragmentide
amplifitseerimine PCR-ga viia mõnede genoomiosade esinemissageduse suurenemisele või
vähenemisele, mis omakorda võivad olla ekslikult määratud nagu koopiaarvu muutused.
Samuti võib erinevatel inimestel restriktsioon toimuda erinevalt ja seega on võimalik, et
24

mõnede indiviidide puhul sõltub tulemus rohkem restriktsioonifragmentide suurusest, kui
koopiaarvu muutustest. CNV määramiseks võrreldakse paarduvate ja osaliselt
mittepaarduvate proovide signaalide intensiivsust teiste indiviidi (või indiviidide rühma)
näitajatega. Vale signaalide vähendamist võib saavutada ka arvestadesa ka proovide
pikkusega ja GC% sisaldusega (Carter, 2007).
Uus Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0 sisaldab 1,8 miljonit geneetilist
markerit, kaasa arvatud rohkem kui 906,600 SNPd ning 946,000 proovi CNV-de
detekteerimiseks 4 .
Illumina BeadArray ® tehnoloogia põhineb 3-mikromeetriliste kuulikeste kogumisel ränikiibi
mikrokaevudes, mis on asetatud kas optilise kiu kimpude tippudesse või klaaskandjale.
Juhuslikult järjestatunud kuulikeste vahel on ~5,7 mikromeetrit. Iga kuul on kaetud suure
hulgaga spetsiifiliste oligonukleotiitidega, mida kasutatakse proovidena SNP-de
genotüpiseerimisel 4 (joonis 9). SNP alleelide määramisel kasutatakse alleelispetsiifilist
märklaudjärjestuste praimerekstensiooni, mis koos lookusspetsiifilise hübridisatsiooniga
annab hea signaali-müra suhte. Lisaks on BeadArray ® kiipide eeliseks kogu uuritava DNA
kasutamine analüüsiprotsessis, samas kui Affymetrixi tehnoloogia puhul selekteeritakse
kiipidele hübridiseerimiseks kuni 200-aluspaarilised DNA fragmendid.
Uuem Illumina HumanOmni1-Quad BeadChip sisaldab hoolikalt valitud SNP-de kogumit ja
proove CNV analüüsimiseks. See on esimene BeadChip, mis lähiajal annab võimalusel
kasutada kuni 5 miljonit markerit proovi kohta 5 .
Joonis 9. Illumina mikrokiibi konstrueerimine 5 .
25

4.2. PCR-põhised uurimismeetodid
4.2.1. Multipleks amplifitseeritavate proovide hübridisatsioon
Kuna DNA eelnev manipuleerimine ja fragmentide amplifikatsioon võib tuua kaasa
probleeme, siis on alternatiiviks – multipleks amplifitseeritavate proovide hübridisatsioon
(MAPH) (Armour et al., 2000). Uuritav genoomne DNA denatureeritakse, kinnitatakse
membraanile (peamiselt kasutatakse nailon filtrit) ja hübridiseeritakse amplifitseeritava DNA
proovidega. Peale selektiivsetel tingimustel pesemist on DNA-le jäänud kinni ainult
spetsiifiliselt seondunud proovid. Need fragmendid eraldatakse membraanilt ja
amplifitseeritakse PCR-ga kasutades universaalseid praimejärjestusi, kusjuures proovide hulk
peale amplifitseerimist on proportsionaalne proovidele homoloogsete järjestuse arvuga
uuritavas DNA-s. Saadud PCR produktid lahutatakse elektroforeesi abil akrüülamiid geelis
või kasutades kapillaarsekvenaatorit fluorestseeruvate fragmentide detekteerimiseks. Proovide
detekteerimiseks märgitakse üks praimeritest radioaktiivse isotoobiga või fluorokroomiga
(joonis 10).
MAPH meetodi suurim puudus on geeli kasutamine, kuna proovid peavad identifitseerimiseks
olema hästi lahutatud ja see piirab tunduvalt kasutatavate proovide arvu eksperimendis.
Sellest probleemist aitab üle saada mikrokiipide kasutamine – arrayMAPH (Kousoulidou et
al., 2008). Meetodi põhimõte jääb samaks, ainult et peale DNAle seondunud proovide
selektiivset pesemist ja eraldamist hübridiseeritakse need kvantiseerimiseks mikrokiibile
kinnitanud proovidega. Teine miinus seisneb selles, et pesemine on küllaltki aeganõudev
protsess ja toob endaga saastumise ohtu, mis teeb raskeks MAPH-i kasutamist igapäevases
diagnostikas.
Joonis 10. MAPH tehnoloogia. (Sellner and Taylor, 2004)
26

4.2.2. Multipleks ligeeritavate proovide amplifikatsioon
Multipleks ligeeritavate proovide amplifitseerimine (MLPA) on küllaltki tundlik meetod ja
seda on lihtsam kasutada kui MAPH, kuna ei ole vaja DNA filtrile immobiliseerimist ja
filtrite pesemist (Schouten et al., 2002). Iga sihtmärgi jaoks disainitakse kaks proovi ja
hübridiseeritakse target järjestusele. Iga proov koosneb kahest oligonukleotiidist, mis
sisaldavad universaalseid praimerjärjestusi, kusjuures üks oligonukleotiid sisaldab ka
mittehübridiseeritavat „stuffer“ järjestust, mille pikkus on varieeruv ja tänu millele toimub
proovide lahutamine elektroforeesil (joonis 11). Peale hübridiseerimist, ligeeritakse kaks
proovi kokku, kusjuures ligeeritud proovide arv on proportsionaalne target järjestuste arvule
uuritavas DNAs. Seejärel amplifitseeritakse ligeeritud proove PCR-ga. Deletsiooni ja
duplikatsiooni analüüs MLPA meetodil on sarnane MAPH omaga. Nii MAPH kui ka MLPA
on tundlikumad väikeste koopiaarvu muutuste suhtes kui arrayCGH.
Joonis 11. MLPA tehnoloogia 6
4.2.3. Multipleks ligeeritav genoomne amplifikatsioon
Aastal 2007 töötasid Magnus Isaksson ja tema kolleegid välja uue meetodi, mille nimi on
multipleks ligeeritav genoomne amplifikatsioon (MLGA) (Isaksson et al., 2007). MLGA
meetodil on mitu eelist võrreldes MAPH ja MLPA-ga. Esiteks, MLGA proovidega on palju
lihtsam ja odavam töötada, kuna on vajalik ainult üks proov lookuse kohta. Iga proov sisaldab
kaks oligonukleotiidi: target järjestuse spetsiifilise proovi jaoks (70-74 nt) ja universaalse
vektori proovi jaoks (34 nt). Pesemine ei ole nõutav, kuna proovid ei vaja ja ei sisalda
funktsionaalseid otsi, nagu see oli MPLA-l, ja samuti ei toimu 5’ otste modifitseerimist.
Teiseks, uni-molekulaarne tsirkulisatsiooni reaktsioon on loomupäraselt kiirem ja
efektiivsem, kui bi-molekulaarne ligeerimise reaktsioon.
27

MLGA meetod hõlmab endas mitu ensümaatilist protsesse (joonis 12). Esimeses etapis
lõigatakse proovi-DNAd restriktaasidega, et tekkiksid kindlate otstega genoomsed
fragmendid. Järgmisena DNA denatureeritakse, hübridiseeritakse vastavatele target
fragmentidele ja tsirkulariseeritakse liigaside abil. Selleks, et vähendada signaal-müra suhet,
DNAd töödeldakse eksonukleaasidega (ExoI). Lõpuks amplifitseeritakse need
tsirkulariseeritud fragmendid PCR-ga, kasutades universaalseid praimereid, ja lahutatakse
elektroforeesil.
Joonis 12. MLGA meetodi põhimõte (Isaksson et al., 2007).
Uuritav DNA lõigatakse restriktaasidega fragmentideks, mis peale denaturatsiooni ja
hübridisatsiooni moodustavad tsirkulariseeritud target DNAd koos MLGA proovidega.
Ülejäänud lineaarne DNA kõrvaldatakse eksonukleaasidega. Tsirkulariseetitud fragmentid
amplifitseeritakse PCR-i abil ja analüüsitakse.
Koopiaarvu variatsioonide uurimismeetodeid on palju, aga tänapäeval on kõige sagedamini
kasutatavaks platvormiks CNV-de leidmisel mikrokiibil põhinev võrdlev genoomne
hübridisatsioon (arrayCGH) ja SNP-de genotüpiseerimisel põhinevad mikrokiibid.
Kiibipõhised meetodid võimaldavad läbi viia kogu-genoomseid skriininguid variatsioonide
detekteerimiseks. Ometi ei ole nende meetodide kasutamisel võimalik analüüsida koopiaarvu
neutraalseid muutusi, nagu näiteks balansseerituid ümberkorraldusi. PCR-põhiseid meetodeid,
kaasa arvatud reaalaja kvantitatiivne PCR, kasutatakse põhiliselt koopiaarvu muutuste
esinemise kinnitamiseks ja samuti struktuursete variatsioonide kandidaatregioone uurimiseks,
et täiendada üle-genoomsetest skriiningutest saadud tulemusi. Samas tuleb märkida, et ka
MLPA on selliste uuringute jaoks laialt levinud.
28

Kokkuvõte
Viimaste aastate jooksul on meie teadmised koopiaarvu variatsioonide kohta oluliselt
suurenenud tänu inimese genoomi lõplikule sekveneerimisele ja HapMap projektile.
Tänapäeval on loodud mitmed andmebaasid koopiaarvu variatsioonide kirjeldamiseks. Nende
andmete analüüsil sai selgeks, et CNV-de levik inimeste genoomis on üsna lai, kusjuures suur
osa CNV-dest võib olla seotud ebanormaalse fenotüübi kujunemisega. CNV-d võivad esile
kutsuda sporaadiliste haiguste, mendeliaalsete või kompleksete tunnuste tekket, mõjutades
geeni doositundlikust, lõhkudes geene või põhjustades positsioonilist efekti. Viimase kümne
aasta jooksul on suuresti tänu mikrokiipide kasutamisele leitud ligikaudu 10-20%
arenguhäirete puhul, mille põhjus oli patsientidele ja nende peredele varem teadmata, et
haigusfenotüüp on tingitud submikroskoopilisest DNA koopiaarvu muutvast aberratsioonist.
Uuringute tulemuste põhjal pakuti, et CNV-d vastutavad põhilise osa geneetiliste ja
fenotüübiliste variatsioonide eest, erinevalt varasematest uuringutest, mille alusel peeti
variatsioonidega suuremal määral seotuks SNP-sid. Tänu uurimismeetodite kiirele arengule
on pakutud kolm peamist mehhanismi, mille toimumisel leiab aset koopiaarvu variatsiooni
formeerumine: rekombinatsioonipõhised mitte-alleelne homoloogiline rekombinatsioon ja
mittehomoloogne DNA otste liitmine ning suhteliselt uus replikatsioonipõhine mehhanism –
replikatsioonikahvli peatumine ja matriitsi ümberlülitus/mikrohomoloogia vahendatud
katkestusest indutseeritud replikatsioon. Põhjalikud CNV kaardid pakuvad huvi ka
evolutsiooni uurijate jaoks. Arvatakse, et CNV võivad olla põhiline jõud inimese genoomse
evolutsiooni kujunemisel, viides geene duplikatsioonile ja eksonite ümber paigutamisele.
Samas on suur osa koopiaarvuga seotud muutustest veel avastamata, seda eelkõige just
väiksemate - mõnekümne kuni paarisaja aluspaari pikkuste CNV-de osas. Seega võimaldavad
edasised uuringud meetodite täiustumisel ja lahutusvõime paranemisel detailsemalt uurida
CNV-de tekkemehhansime ja nende muutuste aluseks olevate ümberkorralduste mõju seal
asuvatele geenidele ja nende regulaatorjärjestustele. Aru saamine sellest, kuidas CNV-de
formeerumise mehhanismid toimivad molekulaarsel tasemel võimaldab leida rohkem
regioone, mis on vastuvõtlikud ümberkorraldustele, seega on see väga perspektiivne suund
kliniliistel molekulaardiagnostika arenemisel ja ravimeetodite määramisel.
29

Human copy number variations: mechanisms of formation and methods of
detection.
Olga Tšuiko
Summary
During the recent years our knowledge regarding to human copy number variants has greatly
increased due to completion of Human Genome Sequencing project and establishing of
HapMap project. Nowadays, numerous databases for describing CNV-s have been created,
according to which, it is now clear that CNV distribution among human genome is rather
wide and a major part of CNV-s might be involved in the development of an abnormal
phenotype. CNV-s were shown to cause sporadic diseases and mendelian or complex traits,
by affecting gene dosage, disruption of the gene or by causing the positional effect. The use of
microarrays has made it possible to establish that in about of 10-20% of clinical cases, the
reason for developmental delay lies in the submicroscopic DNA aberrations. Despite the fact,
that SNP-s are considered to be the main factor in the determination of human variability, it
was proposed that CNV-s are responsible for most of genetic and phenotypic variation.
Thanks to accelerated development of methods for studying copy number changes, three main
mechanisms were proposed for the formation of CNV-s: recombination-based Non-Allelic
Homologous Recombination and Non-Homologous End Joining, and a relatively new
replication-based mechanism – Fork Stalling and Template Switching/Microhomology
Mediated Break Induced Replication. Detailed CNV maps offer a great deal of interest for
researches involved in the study of evolution as well. It is thought that CNV may be a leading
force in the human evolution via gene duplication and exon shuffling. However, a lot of CNV
regions are yet to be discovered, especially those that cover only a couple of dozens of base
pairs. Thus, further studies in the improving of methods of CNV detection and increasing
resolution may give an opportunity to examine CNV mechanisms of formation in greater
detail and to give the picture of how genomic rearrangements affect genes and their regulatory
elements. Understanding of the molecular basis for CNV formation will provide the
opportunity to find more regions, susceptible to genomic rearrangements, thus being a very
promising tool in clinical molecular diagnostic development and proper assessment of
medical methods.
30

Kirjanduse loetelu
A) Ajakirjad
Armour, J. A., Sismani, C., Patsalis, P. C., and Cross, G. (2000). Measurement of locus copy
number by hybridisation with amplifiable probes. Nucleic Acids Res 28(2), 605-9.
Aula, P., Kääriäinen, H., and Palotie, A. (2010). "Pärilikkusmeditsiin."
Carter, N. P. (2007). Methods and strategies for analyzing copy number variation using DNA
microarrays. Nat Genet 39(7 Suppl), S16-21.
Conrad, D. F., and Hurles, M. E. (2007). The population genetics of structural variation. Nat
Genet 39(7 Suppl), S30-6.
Conrad, D. F., Pinto, D., Redon, R., Feuk, L., Gokcumen, O., Zhang, Y., Aerts, J., Andrews,
T. D., Barnes, C., Campbell, P., Fitzgerald, T., Hu, M., Ihm, C. H., Kristiansson, K.,
Macarthur, D. G., Macdonald, J. R., Onyiah, I., Pang, A. W., Robson, S., Stirrups, K.,
Valsesia, A., Walter, K., Wei, J., Tyler-Smith, C., Carter, N. P., Lee, C., Scherer, S.
W., and Hurles, M. E. (2009). Origins and functional impact of copy number variation
in the human genome. Nature 464(7289), 704-12.
de Cid, R., Riveira-Munoz, E., Zeeuwen, P. L., Robarge, J., Liao, W., Dannhauser, E. N.,
Giardina, E., Stuart, P. E., Nair, R., Helms, C., Escaramis, G., Ballana, E., Martin-
Ezquerra, G., den Heijer, M., Kamsteeg, M., Joosten, I., Eichler, E. E., Lazaro, C.,
Pujol, R. M., Armengol, L., Abecasis, G., Elder, J. T., Novelli, G., Armour, J. A.,
Kwok, P. Y., Bowcock, A., Schalkwijk, J., and Estivill, X. (2009). Deletion of the late
cornified envelope LCE3B and LCE3C genes as a susceptibility factor for psoriasis.
Nat Genet 41(2), 211-5.
Feuk, L. (2010). Inversion variants in the human genome: role in disease and genome
architecture. Genome Med 2(2), 11.
Freeman, J. L., Perry, G. H., Feuk, L., Redon, R., McCarroll, S. A., Altshuler, D. M.,
Aburatani, H., Jones, K. W., Tyler-Smith, C., Hurles, M. E., Carter, N. P., Scherer, S.
W., and Lee, C. (2006). Copy number variation: new insights in genome diversity.
Genome Res 16(8), 949-61.
Gu, W., Zhang, F., and Lupski, J. R. (2008). Mechanisms for human genomic rearrangements.
Pathogenetics 1(1), 4.
Hastings, P. J., Ira, G., and Lupski, J. R. (2009a). A microhomology-mediated break-induced
replication model for the origin of human copy number variation. PLoS Genet 5(1),
e1000327.
Hastings, P. J., Lupski, J. R., Rosenberg, S. M., and Ira, G. (2009b). Mechanisms of change in
gene copy number. Nat Rev Genet 10(8), 551-64.
Iafrate, A. J., Feuk, L., Rivera, M. N., Listewnik, M. L., Donahoe, P. K., Qi, Y., Scherer, S.
W., and Lee, C. (2004). Detection of large-scale variation in the human genome. Nat
Genet 36(9), 949-51.
31

Inoue, K., Osaka, H., Thurston, V. C., Clarke, J. T., Yoneyama, A., Rosenbarker, L., Bird, T.
D., Hodes, M. E., Shaffer, L. G., and Lupski, J. R. (2002). Genomic rearrangements
resulting in PLP1 deletion occur by nonhomologous end joining and cause different
dysmyelinating phenotypes in males and females. Am J Hum Genet 71(4), 838-53.
Isaksson, M., Stenberg, J., Dahl, F., Thuresson, A. C., Bondeson, M. L., and Nilsson, M.
(2007). MLGA--a rapid and cost-efficient assay for gene copy-number analysis.
Nucleic Acids Res 35(17), e115.
Jakobsson, M., Scholz, S. W., Scheet, P., Gibbs, J. R., VanLiere, J. M., Fung, H. C., Szpiech,
Z. A., Degnan, J. H., Wang, K., Guerreiro, R., Bras, J. M., Schymick, J. C.,
Hernandez, D. G., Traynor, B. J., Simon-Sanchez, J., Matarin, M., Britton, A., van de
Leemput, J., Rafferty, I., Bucan, M., Cann, H. M., Hardy, J. A., Rosenberg, N. A., and
Singleton, A. B. (2008). Genotype, haplotype and copy-number variation in
worldwide human populations. Nature 451(7181), 998-1003.
Kousoulidou, L., Mannik, K., Sismani, C., Zilina, O., Parkel, S., Puusepp, H., Tonisson, N.,
Palta, P., Remm, M., Kurg, A., and Patsalis, P. C. (2008). Array-MAPH: a
methodology for the detection of locus copy-number changes in complex genomes.
Nat Protoc 3(5), 849-65.
Kulkarni, H., Agan, B. K., Marconi, V. C., O'Connell, R. J., Camargo, J. F., He, W., Delmar,
J., Phelps, K. R., Crawford, G., Clark, R. A., Dolan, M. J., and Ahuja, S. K. (2008).
CCL3L1-CCR5 genotype improves the assessment of AIDS Risk in HIV-1-infected
individuals. PLoS One 3(9), e3165.
Lazaro, C., Gaona, A., Ainsworth, P., Tenconi, R., Vidaud, D., Kruyer, H., Ars, E., Volpini,
V., and Estivill, X. (1996). Sex differences in mutational rate and mutational
mechanism in the NF1 gene in neurofibromatosis type 1 patients. Hum Genet 98(6),
696-9.
Lee, C., and Scherer, S. W. (2010). The clinical context of copy number variation in the
human genome. Expert Rev Mol Med 12, e8.
Lee, J. A., Carvalho, C. M., and Lupski, J. R. (2007). A DNA replication mechanism for
generating nonrecurrent rearrangements associated with genomic disorders. Cell
131(7), 1235-47.
Lopes, J., Vandenberghe, A., Tardieu, S., Ionasescu, V., Levy, N., Wood, N., Tachi, N.,
Bouche, P., Latour, P., Brice, A., and LeGuern, E. (1997). Sex-dependent
rearrangements resulting in CMT1A and HNPP. Nat Genet 17(2), 136-7.
Lupski, J. R. (1998a). Charcot-Marie-Tooth disease: lessons in genetic mechanisms. Mol Med
4(1), 3-11.
Lupski, J. R. (1998b). Genomic disorders: structural features of the genome can lead to DNA
rearrangements and human disease traits. Trends Genet 14(10), 417-22.
Lupski, J. R., and Stankiewicz, P. (2005). Genomic disorders: molecular mechanisms for
rearrangements and conveyed phenotypes. PLoS Genet 1(6), e49.
32

Nobile, C., Toffolatti, L., Rizzi, F., Simionati, B., Nigro, V., Cardazzo, B., Patarnello, T.,
Valle, G., and Danieli, G. A. (2002). Analysis of 22 deletion breakpoints in dystrophin
intron 49. Hum Genet 110(5), 418-21.
Reiter, L. T., Hastings, P. J., Nelis, E., De Jonghe, P., Van Broeckhoven, C., and Lupski, J. R.
(1998). Human meiotic recombination products revealed by sequencing a hotspot for
homologous strand exchange in multiple HNPP deletion patients. Am J Hum Genet
62(5), 1023-33.
Reymond, A., Henrichsen, C. N., Harewood, L., and Merla, G. (2007). Side effects of genome
structural changes. Curr Opin Genet Dev 17(5), 381-6.
Schouten, J. P., McElgunn, C. J., Waaijer, R., Zwijnenburg, D., Diepvens, F., and Pals, G.
(2002). Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligationdependent
probe amplification. Nucleic Acids Res 30(12), e57.
Sebat, J., Lakshmi, B., Troge, J., Alexander, J., Young, J., Lundin, P., Maner, S., Massa, H.,
Walker, M., Chi, M., Navin, N., Lucito, R., Healy, J., Hicks, J., Ye, K., Reiner, A.,
Gilliam, T. C., Trask, B., Patterson, N., Zetterberg, A., and Wigler, M. (2004). Largescale
copy number polymorphism in the human genome. Science 305(5683), 525-8.
Sellner, L. N., and Taylor, G. R. (2004). MLPA and MAPH: new techniques for detection of
gene deletions. Hum Mutat 23(5), 413-9.
Shaw-Smith, C., Pittman, A. M., Willatt, L., Martin, H., Rickman, L., Gribble, S., Curley, R.,
Cumming, S., Dunn, C., Kalaitzopoulos, D., Porter, K., Prigmore, E., Krepischi-
Santos, A. C., Varela, M. C., Koiffmann, C. P., Lees, A. J., Rosenberg, C., Firth, H.
V., de Silva, R., and Carter, N. P. (2006). Microdeletion encompassing MAPT at
chromosome 17q21.3 is associated with developmental delay and learning disability.
Nat Genet 38(9), 1032-7.
Shaw, C. J., and Lupski, J. R. (2004). Implications of human genome architecture for
rearrangement-based disorders: the genomic basis of disease. Hum Mol Genet 13 Spec
No 1, R57-64.
Shinawi, M., and Cheung, S. W. (2008). The array CGH and its clinical applications. Drug
Discov Today 13(17-18), 760-70.
Shlien, A., and Malkin, D. (2009). Copy number variations and cancer. Genome Med 1(6), 62.
Solinas-Toldo, S., Lampel, S., Stilgenbauer, S., Nickolenko, J., Benner, A., Dohner, H.,
Cremer, T., and Lichter, P. (1997). Matrix-based comparative genomic hybridization:
biochips to screen for genomic imbalances. Genes Chromosomes Cancer 20(4), 399-
407.
Stranger, B. E., Forrest, M. S., Dunning, M., Ingle, C. E., Beazley, C., Thorne, N., Redon, R.,
Bird, C. P., de Grassi, A., Lee, C., Tyler-Smith, C., Carter, N., Scherer, S. W., Tavare,
S., Deloukas, P., Hurles, M. E., and Dermitzakis, E. T. (2007). Relative impact of
nucleotide and copy number variation on gene expression phenotypes. Science
315(5813), 848-53.
33

Toffolatti, L., Cardazzo, B., Nobile, C., Danieli, G. A., Gualandi, F., Muntoni, F., Abbs, S.,
Zanetti, P., Angelini, C., Ferlini, A., Fanin, M., and Patarnello, T. (2002).
Investigating the mechanism of chromosomal deletion: characterization of 39 deletion
breakpoints in introns 47 and 48 of the human dystrophin gene. Genomics 80(5), 523-
30.
Turner, D. J., Miretti, M., Rajan, D., Fiegler, H., Carter, N. P., Blayney, M. L., Beck, S., and
Hurles, M. E. (2008). Germline rates of de novo meiotic deletions and duplications
causing several genomic disorders. Nat Genet 40(1), 90-5.
Wain, L. V., Armour, J. A., and Tobin, M. D. (2009). Genomic copy number variation,
human health, and disease. Lancet 374(9686), 340-50.
Watson, J. D., Baker, T. A., Bell, S. P., Gann, A., Levine, M., and Losick, R. (2003).
"Molecular Biology of The Gene, Fifth Edition."
White, S. J., Vissers, L. E., Geurts van Kessel, A., de Menezes, R. X., Kalay, E., Lehesjoki,
A. E., Giordano, P. C., van de Vosse, E., Breuning, M. H., Brunner, H. G., den
Dunnen, J. T., and Veltman, J. A. (2007). Variation of CNV distribution in five
different ethnic populations. Cytogenet Genome Res 118(1), 19-30.
Zhang, F., Gu, W., Hurles, M. E., and Lupski, J. R. (2009). Copy number variation in human
health, disease, and evolution. Annu Rev Genomics Hum Genet 10, 451-81.
B) Raamatud
Aula, P., Kääriäinen, H., and Palotie, A. (2010). "Pärilikkusmeditsiin."
Watson, J. D., Baker, T. A., Bell, S. P., Gann, A., Levine, M., and Losick, R. (2003).
"Molecular Biology of The Gene, Fifth Edition."
Kasutatud veebiadressid:
1 www.hapmap.org
2 http://projects.tcag.ca/variation
3 https://decipher.sanger.ac.uk/application
4 www.affymetrix.com
5 www.illumina.com
6 www.mlpa.com
34