Inimese DNA koopiaarvu variatsioonid: nende tekkemehhanismid ja ...
Inimese DNA koopiaarvu variatsioonid: nende tekkemehhanismid ja ...
Inimese DNA koopiaarvu variatsioonid: nende tekkemehhanismid ja ...
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
4.2. PCR-põhised uurimismeetodid<br />
4.2.1. Multipleks amplifitseeritavate proovide hübridisatsioon<br />
Kuna <strong>DNA</strong> eelnev manipuleerimine <strong>ja</strong> fragmentide amplifikatsioon võib tuua kaasa<br />
probleeme, siis on alternatiiviks – multipleks amplifitseeritavate proovide hübridisatsioon<br />
(MAPH) (Armour et al., 2000). Uuritav genoomne <strong>DNA</strong> denatureeritakse, kinnitatakse<br />
membraanile (peamiselt kasutatakse nailon filtrit) <strong>ja</strong> hübridiseeritakse amplifitseeritava <strong>DNA</strong><br />
proovidega. Peale selektiivsetel tingimustel pesemist on <strong>DNA</strong>-le jäänud kinni ainult<br />
spetsiifiliselt seondunud proovid. Need fragmendid eraldatakse membraanilt <strong>ja</strong><br />
amplifitseeritakse PCR-ga kasutades universaalseid praimejärjestusi, kusjuures proovide hulk<br />
peale amplifitseerimist on proportsionaalne proovidele homoloogsete järjestuse arvuga<br />
uuritavas <strong>DNA</strong>-s. Saadud PCR produktid lahutatakse elektroforeesi abil akrüülamiid geelis<br />
või kasutades kapillaarsekvenaatorit fluorestseeruvate fragmentide detekteerimiseks. Proovide<br />
detekteerimiseks märgitakse üks praimeritest radioaktiivse isotoobiga või fluorokroomiga<br />
(joonis 10).<br />
MAPH meetodi suurim puudus on geeli kasutamine, kuna proovid peavad identifitseerimiseks<br />
olema hästi lahutatud <strong>ja</strong> see piirab tunduvalt kasutatavate proovide arvu eksperimendis.<br />
Sellest probleemist aitab üle saada mikrokiipide kasutamine – arrayMAPH (Kousoulidou et<br />
al., 2008). Meetodi põhimõte jääb samaks, ainult et peale <strong>DNA</strong>le seondunud proovide<br />
selektiivset pesemist <strong>ja</strong> eraldamist hübridiseeritakse need kvantiseerimiseks mikrokiibile<br />
kinnitanud proovidega. Teine miinus seisneb selles, et pesemine on küllaltki aeganõudev<br />
protsess <strong>ja</strong> toob endaga saastumise ohtu, mis teeb raskeks MAPH-i kasutamist igapäevases<br />
diagnostikas.<br />
Joonis 10. MAPH tehnoloogia. (Sellner and Taylor, 2004)<br />
26
Change language