Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Quantitativer Nachweis von
Lawsonia intracellularis mittels real-time PCR
in Kotproben von Schweinen.
Kerstin Holthaus
Außenstelle für Epidemiologie
Tierärztliche Hochschule Hannover
2008

Tierärztliche Hochschule Hannover
Außenstelle für Epidemiologie
Quantitativer Nachweis von
Lawsonia intracellularis mittels real-time PCR
in Kotproben von Schweinen.
INAUGURAL - DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae -
( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Kerstin Holthaus
aus Ankum
Hannover 2008

Wissenschaftliche Betreuung: Priv.-Doz. Dr. E. große Beilage
1. Gutachter: Priv.-Doz. Dr. E. große Beilage
2. Gutachter: Prof. Dr. V. Moennig
Tag der mündlichen Prüfung: 13.11.2008
Diese Arbeit wurde durch Mittel der Firma Boehringer Ingelheim Vetmedica
GmbH, Ingelheim am Rhein, finanziell gefördert.

Meinen Meinen Eltern
Eltern
und und Michael Michael

Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung............................................................................................................. 1
2 Literaturübersicht................................................................................................. 2
2.1 Vorkommen und Bedeutung von Lawsonia intracellularis ............................ 2
2.2 Lawsonia intracellularis ................................................................................ 4
2.3 Porzine proliferative Enteropathie ................................................................ 7
2.3.1 Pathogenese......................................................................................... 8
2.3.2 Verlaufsformen der Infektion ............................................................... 10
2.3.3 Immunreaktion auf L. intracellularis..................................................... 12
2.3.4 Kontroll- und Präventionsmaßnahmen................................................ 14
2.3.5 Differentialdiagnosen .......................................................................... 17
2.4 Diagnostik .................................................................................................. 19
2.4.1 Direkter Erregernachweis.................................................................... 19
2.4.2 Indirekter Erregernachweis ................................................................. 22
2.4.3 Weitere Nachweismethoden für L. intracellularis ................................ 23
2.5 Polymerasekettenreaktion (PCR)............................................................... 25
2.5.1 template .............................................................................................. 27
2.5.2 Primer.................................................................................................. 27
2.5.3 Polymerase ......................................................................................... 28
2.5.4 weitere Reagenzien ............................................................................ 29
2.6 Probenaufbereitung, Probenlagerung und Inhibitoren................................ 31
2.6.1 Probenaufbereitung............................................................................. 31
2.6.2 Probenlagerung................................................................................... 33
2.6.3 Inhibitoren ........................................................................................... 34

2.7 Real-time PCR ........................................................................................... 35
2.7.1 Detektion und Sondentechnik ............................................................. 35
2.7.2 Ergebnisauswertung ........................................................................... 40
2.7.3 Quantifizierung .................................................................................... 42
2.8 Validierung von diagnostischen Tests........................................................ 45
3 Material und Methoden...................................................................................... 46
3.1 Guidelines .................................................................................................. 47
3.2 Etablierung und Validierung ....................................................................... 49
3.2.1 Primer- und Sondendesign.................................................................. 49
3.2.2 Referenzmaterial................................................................................. 53
3.2.3 DNA-Isolierung.................................................................................... 55
3.2.4 PCR-Systeme und Ergebnisauswertung............................................. 57
3.2.5 Optimierung der Primer-Konzentrationen............................................ 60
3.2.6 Überprüfung der analytischen Spezifität der Primer............................ 63
3.2.7 Optimierung der Sonden-Konzentration.............................................. 65
3.2.8 Überprüfung der analytischen Spezifität der Sonde ............................ 66
3.2.9 real-time PCR...................................................................................... 67
3.2.10 Sequenzierung.................................................................................... 70
3.2.11 Klonierung........................................................................................... 72
3.2.12 Verdünnungsreihe und Standard ........................................................ 76
3.2.13 Quantifizierung .................................................................................... 78
3.2.14 Interne Positivkontrolle........................................................................ 79
3.2.15 Vergleichspräzision ............................................................................. 81
3.2.16 Diagnostische Sensitivität und Spezifität............................................. 83
3.2.17 Wiederholpräzision.............................................................................. 84

3.2.18 Wiederfindungsrate ............................................................................. 84
3.2.19 Robustheit........................................................................................... 87
3.3 Prüfung der Homogenisierung von Kotproben zum Nachweis von ...............
L. intracellularis .......................................................................................... 89
3.4 Einfluss der Lagerung von Kotproben auf den Gehalt von ....................
L. intracellularis ......................................................................................... 91
3.5 Statistik....................................................................................................... 93
4 Ergebnisse ........................................................................................................ 94
4.1 Etablierung und Validierung ....................................................................... 94
4.1.1 Primer- und Sondendesign.................................................................. 94
4.1.2 Optimierung der Primer-Konzentrationen............................................ 94
4.1.3 Überprüfung der analytischen Spezifität der Primer............................ 95
4.1.4 Optimierung der Sonden-Konzentration.............................................. 96
4.1.5 Überprüfung der analytischen Spezifität der Sonde ............................ 97
4.1.6 Sequenzierung.................................................................................... 98
4.1.7 Klonierung........................................................................................... 98
4.1.8 Verdünnungsreihe und Standard ...................................................... 101
4.1.9 Interne Positivkontrolle...................................................................... 104
4.1.10 Vergleichspräzision ........................................................................... 106
4.1.11 Wiederholpräzision............................................................................ 108
4.1.12 Diagnostische Sensitivität und Spezifität........................................... 109
4.1.13 Wiederfindungsrate ........................................................................... 111
4.1.14 Robustheit......................................................................................... 113
4.1.15 Messunsicherheit .............................................................................. 114

4.2 Prüfung der Homogenisierung von Kotproben zum Nachweis von ...............
L. intracellularis ........................................................................................ 115
4.3 Einfluss der Lagerung auf den Gehalt von L. intracellularis in Kotproben 117
5 Diskussion ....................................................................................................... 120
5.1 Etablierung und Validierung ..................................................................... 120
5.1.1 Testsystem........................................................................................ 120
5.1.2 Analytische Spezifität von Primer und Sonde.................................... 121
5.1.3 Quantifizierungsmethode .................................................................. 123
5.1.4 Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen sowie Effizienz .................. 125
5.1.5 Präzision ........................................................................................... 128
5.1.6 Interne Positivkontrolle und Inhibitoren ............................................. 129
5.1.7 Wiederfindung................................................................................... 131
5.1.8 Diagnostische Sensitivität und Spezifität........................................... 131
5.1.9 Robustheit......................................................................................... 132
5.1.10 Anwendung des Testverfahrens in der Diagnostik............................ 133
5.2 Verteilung von L. intracellularis in Kotproben ........................................... 134
5.3 Einfluss der Lagerung auf den Gehalt von L. intracellularis in Kotproben 135
5.4 Schlussfolgerungen.................................................................................. 136
6 Zusammenfassung.......................................................................................... 137
7 Summary ......................................................................................................... 139
8 Literaturverzeichnis ......................................................................................... 141
9 Anhang............................................................................................................ 169

µg Mikrogramm (x 10 -6 )
µl Mikroliter (x 10 -6 )
µm Mikrometer (x 10 -6 )
µM mikromolar (x 10 -6 )
A Adenosin
Abb. Abbildung
Verzeichnis der Abkürzungen
AKS Staatliche Akkreditierungsstelle Hannover
B. Brachyspira
BDC buoyant density centrifugation
BLMP Bund/Länder-Messprogramm
bp Basenpaare
bspw. beispielsweise
C Cytidin
ca. circa
CCD charge-coupled-device technology
CFR Code of Federal Regulations
CLO campylobacter like organism
Ct threshold cycle
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA desoxyribonucleic acid
dNTP Desoxyribonucleotidtriphosphat
ds-DNA double stranded desoxyribonucleic acid
E. Escherichia
EC 1.5 Eppendorf Cup 1,5 ml
EC 2.0 Eppendorf Cup 2,0 ml
ELISA enzyme-linked immunsorbent assay
ELISPOT enzyme-linked immuno spot technique
EMEA European Agency for the Evaluation of Medicinal Products
ETEC enterotoxische Escherichia coli
e-value equality value
FRET flouorescence resonance energy transfer
G Guanosin

GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
GE genome eqiuvalent
h Stunde(n)
H.E. Haematoxylin Eosin
IAC internal amplification control
ICO internal control oligonucleotide
IEC-18 intestinal epithelium cells 18
IFT Immunfluoreszenztest
IgA Immunglobulin A
IgG Immunglobulin G
IgM Immunglobulin M
IMS immunomagnetic separation
INF γ Interferon gamma
IPC internal positive control
IPMA immunoperoxidase monolayer assay
L. Lawsonia
LB Luria-Bertani
LPS Lipopolysaccharide
LSA Lawsonia surface antigen
LUX light upon extension
M mol / Liter
mAb monoclonal antibody
MGB minor groove binder
MIC minimal inhibitory concentration
ml Milliliter
n Anzahl
nM nanomolar
NaOH Natriumhydroxid
NE nekrotisierende Enteritis
ng Nanogramm
nm Nanometer
NTC non template control
OIE Office International des Épizooties
OMP outer membrane protein

p.i. post infectionem
PCR polymerase chain reaction
PCR-ELOSA polymerase chain reaction-enzyme-linked oligosorbent assay
PHE porzine hämorrhagische Enteritis
PIA porzine intestinale Adenomatose
pmol pikomol (x 10 -9 )
PNA peptide nucleic acid
PPE porcine proliferative Enteropathie
resp. respektive
RI regionale Ileitis
Rn normalized reporter
ROI regions of interest
S. Salmonella
s Sekunden
s.o. siehe oben
SDS Sodiumdodecylsulfat
SPF spezifisch pathogenfrei
ss-DNA single stranded desoxyribonucleic acid
ssp. Subspezies
T Thymidin
Tab. Tabelle
u.a. unter anderen(m)
UV Ultraviolett
VNTR variable number tandem repeat
www world wide web
∆Ct delta threshold cycle
∆Rn delta normalized reporter
∆∆Ct delta delta threshold cycle

1 Einleitung
Einleitung
Lawsonia intracellularis ist der Erreger der proliferativen Enteropathie beim Schwein
(LAWSON u. GEBHART 2000). Die Krankheit kann klinisch apparent als akute oder
chronische Form auftreten; häufiger ist jedoch eine subklinische Erkrankung, deren
Bedeutung nicht selten unterschätzt wird (MCORIST u. GEBHART 1999a, KROLL et
al. 2005a). Zum Nachweis der Infektion stehen serologische
Untersuchungsmethoden und der direkte Erregernachweis in Kot und/oder Proben
der Darmschleimhaut zur Verfügung. Der direkte Nachweis wird derzeit mittels
Immunoassays oder der polymerase chain reaction (PCR) durchgeführt (MCORIST
et al. 1987, JONES et al. 1993), da der kulturelle Nachweis des Bakteriums aufgrund
anspruchsvoller Wachstumsbedingungen in Zellkulturen für die Routinediagnostik
ungeeignet ist (MCORIST et al. 1995a). Die Eignung direkter Nachweisverfahren für
die Diagnostik wird in der Literatur kontrovers diskutiert, da alle Methoden bis dato
lediglich eine qualtitative resp. semiquantitative aber keine absolut quantitative
Aussage über den Erregergehalt in einer Probe ermöglichen. Außerdem ist eine
Unterscheidung zwischen dem Wildtyp von Lawsonia intracellularis und dem
Impfstamm, der zur aktiven Immunisierung von Schweinen verwendet wird, ebenfalls
nicht möglich (GUEDES u. GEBHART 2003a). Andere Autoren diskutieren eine
Inhibition der PCR an Kotproben als Grund für die geringe Sensitivität, die in früheren
Studien für die PCR beobachtet wurde (KNITTEL et al. 1997). Zudem soll es bei der
Lagerung von Kotproben zu einer Degradation von Nukleinsäuren kommen, so dass
keine spezifischen Genomfragmente mehr nachzuweisen sind (DEUTER et al. 1995).
Das Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, eine hochsensitive und spezifische
Methode für für den Nachweis von Genomfragmenten von Lawsonia intracellularis zu
entwickeln, die gleichzeitig eine Quantifizierung des Gehaltes von spezifischen
Genomäquivalenten in einer Kotprobe erlaubt. Die anschließende Validierung der
Methode erfolgte in Anlehnung an nationale und internationale Vorgaben. Außerdem
wurde der Einfluss verschiedener Verfahren zur Homogenisierung des
Probenmaterials auf die Verteilung von Lawsonia intracellularis in Kotproben
untersucht. Abschließend wurde der Einfluss von Temperatur und Dauer der
Probenlagerung auf den quantitativen Nachweis geprüft.
1

2 Literaturübersicht
Literaturübersicht
2.1 Vorkommen und Bedeutung von Lawsonia intracellularis
Lawsonia (L.) intracellularis ist der Erreger der porzinen proliferativen Enteropathie
(PPE) (LAWSON u. GEBHART 2000). Der Begriff „Ileitis“ wird in der Literatur
zunehmend synonym für die PPE verwendet, wenngleich dieser Name, der eigentlich
eine akute entzündliche Veränderung suggeriert, die Komplexität und die
verschiedenen Verlaufsformen der Erkrankung nicht ausdrücken kann. Die klinischen
Symptome und pathologischen Veränderungen der proliferativen Enteropathie des
Schweines wurden erstmals 1931 als „intestinal adenoma“ beschrieben (BIESTER u.
SCHWARTE 1931). Es wurde vermutet, dass eine Infektion die Ursache der
Erkrankung ist. Die infektiöse Ätiologie konnte aber erst 1993 mit Erfüllung der
Koch`schen Postulate nach Isolierung des Erregers und experimenteller
Reproduktion der Erkrankung abschließend geklärt werden (LAWSON et al. 1993).
Die Infektion mit L. intracellularis tritt weltweit bei Schweinen auf. Die Prävalenz
serologisch positiver Bestände beträgt 96 % in den USA, 95 % in Kanada, 97 % in
Mexiko, 100 % in Taiwan und Thailand, 77 % in Frankreich, 95 % in Groß Britannien,
94 % in Dänemark, 65 % in Polen und 67 % in Spanien (MCORIST et al. 2003).
In Deutschland ist die Infektion von Schweinen mit L. intracellularis ebenfalls weit
verbreitet. Bundesweit sind mehr als 81 % der Schweinebestände serologisch positiv.
Sauenhaltende Bestände und Mastbestände sind häufiger positiv als andere
Bestände, die beispielsweise (bspw.) nur Absetzferkel halten (WENDT et al. 2006).
In Herden ist die Infektion mit L. intracellularis endemisch, jedoch verläuft sie nicht
immer klinisch apparent (MCORIST et al. 2003). Die schlechtere Futterverwertung in
infizierten Beständen führt, ebenso wie das geringere Schlachtgewicht bei gleicher
Mastdauer und die erhöhte Mortalität zu großen wirtschaftlichen Verlusten. Der
Mindererlös wird, abhängig vom Verkaufspreis pro Schwein respektive (resp.)
Kilogramm Lebendgewicht und den aktuellen Futterkosten, auf etwa 0,5 bis 1 Euro
pro betroffenem Mastschwein geschätzt (VEENHUIZEN et al. 2002, MCORIST 2005).
2

Literaturübersicht
Verluste durch Minderzunahmen und ein erhöhter Futterverbrauch führen auch im
Zusammenhang mit einer subklinischen Ileitis zu wirtschaftlichen Verlusten (7,60 €
pro Schwein werden angenommen) (SCHOLZ et al. 2008). Der mögliche
wirtschaftliche Verlust durch die PPE wird in Beständen, die Zuchtsauen halten, auf
über 100 € pro erkrankter Sau und Jahr geschätzt (MCORIST 2005).
3

2.2 Lawsonia intracellularis
Literaturübersicht
L. intracellularis gehört zur Familie der Desulfovibrionaceae und ist ein obligat
intrazellulär vermehrendes, stäbchenförmiges gramnegatives Bakterium. Es ist
zwischen 1,25 und 1,75 µm lang und zwischen 0,5 und 1,5 µm breit. Der
Bakterienkörper ist unterschiedlich stark gebogen, die Zellenden sind verjüngt. Es
bildet keine Sporen, ist unpigmentiert und nicht von einer Kapsel umgeben. Die
Bakterienwand wird von einer äußeren dreiblättrigen welligen Membran umhüllt. Das
Bakterium besitzt, im Gegensatz zu den unipolar begeißelten Desulfovibrio
desulfuricans, keine Pili oder Fimbrien und zeigt keine Motilität. Isolate aus
Zellkulturen besitzen ein unipolares Flagellum. Die Zellwand ist in der modifizierten
Ziehl-Neelsen Färbung säurefest (MCORIST et al. 1995a, LAWSON u. GEBHART
2000). Morphologisch ist L. intracellularis den Desulfovibrionaceae ähnlich, jedoch
kann L. intracellularis kein Sulfat reduzieren (MCORIST et al. 1995a).
Das Genom von L. intracellularis wurde an der University Minnesota durch KAUR et
al. vollständig sequenziert (Accession NC_008011) (www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/
entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=NC_008011). Es besteht aus einem ring-
förmigen Chromosom, dass ca. 1,46 Megabasen lang ist, 1231 Gene enthält und für
1180 Proteine kodiert. Zusätzlich zu dem ringförmigen Chromosom gibt es 3
zirkuläre Plasmide. Diese sind zwischen 27 und 194 Kilobasen lang und kodieren für
29, 24 resp. 104 Proteine. In einer vergleichenden Untersuchung konnte anhand von
Wachstumsbedingungen, Antigeneigenschaften sowie der PCR und Sequenzierung
eines 319 Basenpaare (bp) langen desoxyribonucleic acid-(DNA)-Abschnittes keine
Variation zwischen europäischen und amerikanischen Isolaten von L. intracellularis
festgestellt werden (KNITTEL et al. 1996). Japanische Isolate, die aus Proben vom
Schwein isoliert wurden, zeigten in der DNA-Sequenz von vier Genen eine
Homologie von 99,6 % bis 100 % zum Typstamm aus Dänemark (KOYAMA et al.
2006). Das Genom von L. intracellularis ist stark konserviert. Durch Untersuchungen
an vier variable number tandem repeat (VNTR)-regions konnten dennoch
verschiedene VNTR-Profile erstellt werden, die für L. intracellularis aus Proben
natürlich infizierter Schweine und für den attenuierten Stamm, der in einem Impfstoff
verwendet wird (Enterisol ® Ileitis, Boehringer Ingelheim) charakteristisch waren
(BECKLER et al. 2005).
4

Literaturübersicht
Der Erreger, L. intracellularis, wurde zunächst aufgrund seiner morphologischen
Ähnlichkeit im Fluoreszenzlicht zu den Bakterien der Spezies Campylobacter als
Campylobacter sputorum subspecies (ssp.) mucosalis bezeichnet (LAWSON u.
ROWLAND 1974). Nachdem festgestellt wurde, dass der Erreger der proliferativen
Enteropathie des Schweines sich antigenetisch von Campylobacter ssp.
unterscheidet und nur dieser Erreger in affektierten Darmzellen nachgewiesen
werden konnte, wurde mit der Bezeichnung campylobacter-like organism (CLO) die
Differenz zu den derzeit bekannten Campylobacter ssp. deutlich gemacht (MCORIST
et al. 1987). Die Zugehörigkeit des Erregers zu den Desulfovibrionaceae und der
heute offiziell geführte Name Lawsonia intracellularis wurde 1995 veröffentlicht
(MCORIST et al. 1995a).
Die kulturelle Anzucht von L. intracellularis ist sehr anspruchsvoll. Da der Erreger
obligat intrazellulär wächst, ist eine Vermehrung nur in zellhaltigen Medien möglich.
Es wird eine mikroaerophile Atmosphäre (8 – 15 % Sauerstoff) empfohlen, wobei
8 % Sauerstoff als optimal erachtet werden (MCORIST et al. 1995a). Die Anzucht
von L. intracellularis aus infizierter Darmmukosa ist auf verschiedenen Zelllinien
möglich, von denen sich Dünndarmzellen von Ratten (intestinal epithelium cells 18,
IEC-18) als Monolayer besonders gut eignen (LAWSON et al. 1993).
L. intracellularis kommt nicht nur in den Enterozyten beim Schwein vor. Der Erreger
konnte mittels PCR und Immunfluoreszenztest (IFT) auch in Tonsillen von
Schweinen nachgewiesen werden. Fehlende Anzeichen einer Bakterienproliferation
in den Tonsillen ließen die Autoren vermuten, dass es sich um eine lokale Retention
des Erregers mit folgender Inaktivierung durch Makrophagen handelt (JENSEN et al.
2000).
Die Tenazität von L. intracellularis in der Umwelt ist relativ groß. Eine
Vermehrungsfähigkeit konnte noch nach ein bis zwei Wochen außerhalb des Wirtes
bei 5 °C Umgebungstemperatur festgestellt werden (M CORIST u. GEBHART 1999a).
Die Fähigkeit von L. intracellularis den Darm zu besiedeln bleibt im Kot bis zu zwei
Wochen bei einer Lagertemperatur zwischen 5 °C und 15 °C erhalten. Mit
erregerhaltigem Kot, der über fünf Wochen gelagert wurde, konnte nach Inokulation
von Schweinen keine Infektion mehr ausgelöst werden.
5

Literaturübersicht
Desinfektionsmittel mit Komponenten auf der Basis von quartären
Ammoniumgruppen oder Jod haben eine bakterizide Wirkung auf L. intracellularis
(COLLINS et al. 2000).
6

Literaturübersicht
2.3 Porzine proliferative Enteropathie
Die PPE ist eine Darmerkrankung des Schweins, die in verschiedenen
Verlaufsformen auftritt, die anhand ihrer pathologischen Veränderungen an der
Darmschleimhaut unterteilt werden. Eine proliferative Enteropathie des Schweins
kann akut als porzine hämorrhagische Enteropathie (PHE) auftreten. Die porzine
intestinale Adenomatose (PIA), die nekrotisierende Enteritis (NE) und die regionale
Ileitis (RI) sind Verlaufsformen, die in der Regel einen chronischen Charakter haben.
Betroffene Darmabschnitte sind das Ileum und in selteneren Fällen das Kolon
und/oder Zäkum (MCORIST u. GEBHART 1999a). Es ist eine klinisch inapparente
Form beschrieben, die als subklinische Ileitis bezeichnet wird (KROLL et al. 2005a).
Der Übertragungsweg der Infektion ist fäkal-oral (KROLL et al. 2005a). Die wichtigste
Infektionsquelle ist der Kot infizierter Tiere. Die Ausscheidung wird bei infizierten
Tieren mit bis zu 7x10 8 Erreger pro Gramm Kot angegeben; dies entspricht einer
Vielzahl infektiöser Einheiten (SMITH u. MCORIST 1997). Die minimale
Infektionsdosis für L. intracellularis ist derzeit nicht bekannt; allerdings konnte eine
positive Korrelation zwischen Infektionsdosis und der klinischen resp. pathologischen
Ausprägung der Erkrankung nachgewiesen werden. Die Infektion von Schweinen mit
10 10 , 10 9 resp. 10 8 Erregern pro Tier führte relativ zur eingesetzten Erregermenge zu
deutlichen Unterschieden in Mortaliltät, tägliche Körpermassezunahme und Länge
der pathologisch veränderten Darmabschnitte. Diarrhoe trat in der Gruppe mit
geringer Erregermenge (10 8 ) eine Woche später auf als in der Gruppe mit hoher
Erregermenge (10 10 ) (GUEDES et al. 2003b). Nach experimenteller Infektion mit
einem pathogenen Isolat von L. intracellularis wurde in der ersten Untersuchung von
Proben eine Woche post infectionem (p.i.) die Erregerausscheidung im Kot
nachgewiesen. Die maximale Ausscheidung wurde zwei Wochen p.i. beobachtet. Die
Ausscheidung des Erregers erfolgt intermittierend und kann bis zu 12 Wochen nach
einer Infektion anhalten. Auch der Impfstamm wird intermittierend über einen
Zeitraum von zwei bis neun Wochen nach Impfung ausgeschieden (GUEDES u.
GEBHART 2003a).
In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen konnte nach experimenteller Infektion
von Absetzferkeln mit L. intracellularis gezeigt werden, dass Tiere dieser
7

Literaturübersicht
Altersgruppe den Erreger über einen Zeitraum von zwei bis 10 Wochen p. i.
ausscheiden (SMITH u. MCORIST 1997).
In einer Studie an fünf infizierten Beständen (geschlossene Systeme) wurde mittels
real-time PCR gezeigt, dass L. intracellularis von infizierten Tieren zwischen der
achten und 18. Lebenswoche mit dem Kot ausgeschieden werden kann. Die höchste
Ausscheidungsrate wurde in der 12. Lebenswoche festgestellt. Die Ausscheidungs-
dauer bei einzelnen Schweinen betrug in der Regel vier bis sechs Wochen (STEGE
et al. 2004). Ein ähnliches Ausscheidungsverhalten wurde auch in einem Bestand
nach einem Ausbruch von PHE nachgewiesen. Hier wurde der Erreger bei Tieren im
Alter von sieben bis 19 Wochen im Kot nachgewiesen (GUEDES et al. 2002a). Die
Infektion von Saugferkeln wurde durch den Nachweis von L. intracellularis im Kot von
zwei Wochen alten Tieren belegt (JENSEN et al. 2005).
Die lang anhaltende Ausscheidung und die hohe Tenazität von L. intracellularis
begünstigen die endemische Ausbreitung einer Infektion in infizierten Beständen. Es
wird vermutet, dass serologisch positive, aber klinisch gesunde Sauen zwar infiziert
sind, jedoch keine Darmläsionen zeigen. Diese Tiere können als carrier betrachtet
werden. Bei Mastschweinen konnte eine Infektion ohne Darmläsionen nicht
nachgewiesen werden (MCORIST et al. 2003).
Zwischen Herden stellen latent infizierte Schweine den Hauptübertragungsweg dar
(JORDAN et al. 2004). Innerhalb von Herden tragen vermutlich vor allem Tier-
kontakte, sowie unbelebte und belebte Vektoren zur Ausbreitung des Erregers bei
(GUEDES 2004). Die Kontamination nicht infizierter Betriebsbereiche erfolgt
wahrscheinlich passiv durch Verschleppung erregerhaltigen Kotes (CHOUET et al.
2003).
2.3.1 Pathogenese
Die Besiedlung des Darms mit L. intracellularis nach oraler Aufnahme ist wenig
untersucht. Pathogenesemechanismen, wie bspw. Chemotaxis, werden zwar
vermutet, sind aber bis heute nicht vollständig analysiert (SMITH u. LAWSON 2001).
Auch der Vorgang des Anheftens von L. intracellularis an Enterozyten ist weitgehend
8

Literaturübersicht
unbekannt. Vermutlich sind spezifische Moleküle während der Adhäsion von
Bakterien an die Wirtszelle bedeutsam (MCORIST et al. 1996a).
Das Eindringen von L. intracellularis in Rattenenterozyten IEC-18 konnte unabhängig
von der Vermehrungsfähigkeit des Erregers festgestellt werden. Die
Wirtszellpenetration der Erreger wird allein von den vitalen Enterozyten vermittelt.
Darüber hinaus scheint die Penetration auch von einer Aktin-Polymerisation
abhängig zu sein. Der wichtigste Faktor für das bakterielle Wachstum ist die
Teilungsfähigkeit der Enterozyten (LAWSON et al. 1995). Mitotische Zellen
unterstützen die bakterielle Vermehrung und sorgen durch die eigene Replikation für
eine Verteilung der Bakterien im Darmepithel (SMITH u. LAWSON 2001). Das
intrazelluläre Habitat bietet dem Erreger einen Schutz vor körpereigenen
Immunmechanismen und sorgt so für die lange Persistenz des Erregers in der
Darmschleimhaut (SMITH u. LAWSON 2001). In den Enterozyten bleibt L.
intracellularis nach der Aufnahme zunächst mit der Zellmembran in Verbindung.
Innerhalb von drei Stunden nach der Infektion lösen sich diese Vakuolen auf und
entlassen so die Erreger ins Zytoplasma (MCORIST et al. 1995b). Der Mechanismus,
mit dem die Bakterien die Vakuolen zerstören, ist bis heute noch nicht beschrieben
(SMITH u. LAWSON 2001). Im Zytoplasma vermehrt sich L. intracellularis durch
äquatoriale Zweiteilung (MCORIST et al. 1995a). Nach circa (ca.) sechs Tagen
werden die Bakterien aus zytoplasmatischen Protrusionen ausgeschleust und
können im Anschluss in neue Zellen eindringen (MCORIST et al. 1995b).
Die PPE ist durch eine Hyperproliferation der infizierten unreifen Enterozyten
gekennzeichnet. Etwa 10 Tage nach Inokulation der Erreger haben sie die Krypten
des Ileums und den Dickdarm besiedelt und vermehren sich. Nach 20 Tagen können
erste proliferative Prozesse nachgewiesen werden (MCORIST u. LAWSON 1989).
Die Proliferation beginnt in den infizierten Zellen der Darmkrypten, die sich allmählich
Richtung Schleimhautoberfläche vorschieben. Mögliche Ursachen für die
Hyperproliferation sind die Regulation von Differenzierungs- und/oder
Apoptosegenen durch die Bakterien, Bildung von mitogenen Stoffen durch die
Erreger, eine Art Wundheilung des geschädigten Epithels oder ein Einfluss auf
rezeptorgebundene Wachstumsfaktoren. Das Fehlen der Becherzellen in der
Darmschleimhaut ist typisch (MCORIST et al. 1996a). Durch die starke Vermehrung
der infizierten unreifen Kryptenzellen kommt es an der Oberfläche der
9

Literaturübersicht
Darmschleimhaut zu Mikrovilliverlust und Funktionsstörungen, die sich in
Malabsorption mit Diarrhoe und auch in Maldigestion von Proteinen und Fetten
äußern (POHLENZ 2005).
Die Hyperproliferation kommt trotz der bestehenden Infektion nach einiger Zeit zum
Stillstand. Infizierte Zellen werden in das Darmlumen abgestoßen oder degenerieren
innerhalb der Darmmukosa (MCORIST et al. 1996a). Die gesunden Zellen teilen sich
und regenerieren; es entsteht wieder ein normales, differenziertes Darmepithel. Wie
diese Ausheilung initialisiert wird und welche Faktoren eine Rolle haben, ist nicht
hinreichend bekannt (SMITH u. LAWSON 2001).
2.3.2 Verlaufsformen der Infektion
Akuter Verlauf:
Diese Form der akuten hämorrhagischen Enteropathie tritt üblicherweise bei
Schweinen im Alter von vier bis 12 Monaten auf (MCORIST u. GEBHART 1999a).
Betroffen Tiere stammen häufig aus Beständen, die ein konsequentes Rein-Raus-
Verfahren anwenden und Schweine nach dem Alter getrennt aufstallen (MCORIST et
al. 2003, CHOUET et al. 2003). Erste Hinweise auf das Vorliegen einer PHE sind
schwarzer, teerartiger Kot und Symptome einer hämorrhagischen Anämie. Die
Krankheitssymptome können auf die anämische Blässe beschränkt sein, ohne dass
der Kot verändert ist. Die Mortalität beträgt bis zu 50 %. Tiere, die überleben,
genesen innerhalb kurzer Zeit. Tragende Sauen können aufgrund der Erkrankung
abortieren (MCORIST u. GEBHART 1999a). Die pathologischen Veränderungen der
PHE beschränken sich in der Regel auf das terminale Ileum und das Kolon. Die
Darmwand ist verdickt, die Darmserosa ist ödematös. Im Lumen des Ileums befindet
sich eine „Blutsäule“. Makroskopisch ist die Mukosa mit Ausnahme der Verdickung
unverändert, im histologischen Schnittbild zeigen sich jedoch degenerierte Zellen
und Blutungen in der Schleimhaut. Auf der Mukosa befinden sich zahlreiche Erreger
und Zelldetritus (MCORIST u. GEBHART 1999a).
10

Chronischer Verlauf:
Literaturübersicht
Diese Verlaufsform tritt typischerweise nach einer Infektion im Ferkelalter auf
(MCORIST et al. 2003). Sie äußert sich am häufigsten als porzine intestinale
Adenomatose (PIA). Es sind in der Regel Tiere im Alter von sechs bis 12 Wochen
betroffen (MCORIST u. GEBHART 1999a). Die PIA tritt vor allem in geschlossenen
Beständen auf, die keine räumliche Trennung von Produktionsstufen vornehmen.
Subklinisch infizierte Sauen sind als Erregerreservoir anzusehen (MCORIST et al.
2003, CHOUET et al. 2003). Die klinischen Symptome sind wenig spezifisch. Es
kommt zu verminderten Zunahmen bei erhaltener Futteraufnahme. Etwa die Hälfte
der erkrankten Tiere zeigt Diarrhoe mit Kot von normaler Farbe. In schwereren Fällen
kann es zum sichtbaren Konditionsverlust in Verbindung mit Anorexie und Diarrhoe
kommen. Die Tiere genesen bei komplikationslosem Verlauf etwa vier bis 10
Wochen nach dem ersten Auftreten klinischer Symptome. Die Körpermassezunahme
normalisiert sich, jedoch wird das Schlachtgewicht meist nicht mehr in der sonst
üblichen Zeit erreicht (MCORIST u. GEBHART 1999a). Die Läsionen, die durch die
Infektion entstehen, treten im Bereich des Ileums und des vorderen Kolons auf,
wenigstens jedoch im Bereich der Ileozäkalklappe. Die Darmwand ist in diesem
Bereich unterschiedlich stark verdickt, die Schleimhautoberfläche ist feucht. Die
Schleimhaut selbst ist in tiefe Längs- und Querfalten gelegt. Mukosa und Submukosa
sind ödematös und in fortgeschrittenen Fällen mononuklear infiltriert. Es sind
vergrößerte, aus mehreren Zellschichten bestehende Krypten nachzuweisen. Das
Epithel besteht vor allem aus unreifen Enterozyten, Becherzellen fehlen (MCORIST u.
GEBHART 1999a).
Die NE und die RI kommen weitaus seltener vor als die PIA. Sie äußern sich in
einem gestörten Allgemeinzustand und Gewichtsverlust. Nicht selten kommt es bei
der RI zum Tod durch eine generalisierte Peritonitis nach Darmperforation. Im
Verlauf der NE überlagern Zeichen einer Entzündung die bereits bestehende
Schleimhautproliferation. Grau-gelbe käsige Massen aus Fibrin und Zelldetritus
haften dabei der Mukosa an (MCORIST u. GEBHART 1999a). Die RI ist durch eine
Hypertrophie der äußeren Darmmuskelschicht gekennzeichnet. Die Schleimhaut
weist sowohl streifig ulzerierte, wie auch daneben liegende gesunde Areale auf.
Markant ist auch die Bildung von Granulationsgewebe (MCORIST u. GEBHART
1999a).
11

Subklinischer Verlauf:
Literaturübersicht
Es wird vermutet, dass die subklinische Ileitis weitaus häufiger vorkommt, als bislang
angenommen wird, und somit von allen Verlaufsformen die am weitesten verbreitete
Form darstellt. Sie ist definiert als L. intracellularis-Infektion, bei der keine klinischen
Symptome der PPE sichtbar sind, sehr wohl aber spezifische makroskopische und/
oder mikroskopische Veränderungen im Darm im Zusammenhang mit verminderten
täglichen Zunahmen vorkommen (KROLL et al. 2005a). In einer Studie an 16 mit L.
intracellularis infizierten spezifisch pathogenfreien (SPF)-Schweinen, die nach der
Infektion keine klinischen Symptome zeigten, konnten sowohl makroskopische als
auch mikroskopische Läsionen der PPE nachgewiesen werden (MCORIST et al.
1993).
In einem serologischen screening an 694 schweinehaltenden Betrieben aus
Deutschland konnten mittels indirektem Immunfluoreszenztest (IFT) Antikörper
gegen L. intracellularis in 94,1 % aller klinisch unauffälligen Bestände und in 76,3 %
solcher Herden nachgewiesen werden, in denen Diarrhoe und/oder Kümmern
festgestellt wurde. Der hohe Anteil seropositiver Bestände ohne Anzeichen einer
Darmerkrankung lässt auf eine weite Verbreitung latenter Infektionen mit L.
intracellularis schließen (WENDT et al. 2006).
2.3.3 Immunreaktion auf L. intracellularis
Die Infektion mit L. intracellularis führt zu einer humoralen und zu einer
zellvermittelten Reaktion des Immunsystems. Daneben kann auch zwischen
systemischen und einer mukosalen Reaktionen unterschieden werden.
In einer vergleichenden Untersuchung an Schweinen, die entweder über das
Trinkwasser vakziniert oder mit einem pathogenen Isolat von L. intracellularis infiziert
wurden, konnten Immunglobuline der Klasse G (IgG) bei geimpften Tieren mittels
immunoperoxidase monolayer assay (IPMA) erst fünf Wochen nach der Impfung
festgestellt werden. Die IgG-Titer der Tiere, die mit dem pathogenen Isolat infiziert
worden waren, stiegen bereits nach zwei Wochen an, waren deutlich höher und bis
13 Wochen p.i. nachweisbar. Die Protektivität der nachgewiesenen Serumantikörper
gegenüber dem intrazellulären Erreger wurde jedoch angezweifelt (GUEDES u.
GEBHART 2003a). Darüber hinaus muss bei der Interpretation der Ergebnisse
12

Literaturübersicht
berücksichtigt werden, dass der Versuch mit dem zur damaligen Zeit hauptsächlich
in den USA vertriebenen Produkt Enterisol ® Ileitis FF (FF= tiefgefrorenes Produkt)
durchgeführt wurde. Die Ergebnisse dieser Untersuchung können daher nicht
uneingeschränkt auf europäische Verhältnisse übertragen werden, da hier
ausschließlich die lyophilisierte Form von Enterisol ® Ileitis vertrieben wird (pers.
Mitteilung: Dr. Ricarda Deitmer, Boehringer Ingelheim; 24.09.2008). Die nicht-
humoralen Reaktionen des Immunsystems haben wahrscheinlich eine größere
Bedeutung für die Immunität gegen L. intracellularis (KROLL et al. 2004).
An Tieren aus infizierten Beständen konnte eine Serokonversion erst ab einem Alter
von 10 Wochen festgestellt werden (STEGE et al. 2004). Sauen entwickeln nach
einer akuten PHE hohe IgG-Antikörpertiter. Nach maximal drei Monaten sind diese
Antikörper nicht mehr nachweisbar (GUEDES et al. 2002a). Maternal übertragene
Antikörper können bei Ferkeln über einen Zeitraum von zwei bis sechs Wochen nach
der Geburt detektiert werden (HOLYOAKE et al. 1994, GUEDES et al. 2002a,
JENSEN et al. 2005).
Die zelluläre Immunantwort auf eine Infektion resp. auf eine Exposition zum
Impfstamm wurde mittels enzyme-linked immuno spot technique (ELISPOT)-Assay
untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Sekretion von Interferon Gamma
(INFγ) durch immunkompetente Zellen mit der Menge des präsentierten Antigens
positiv korreliert ist. Eine zelluläre Reaktion konnte bei Exposition gegenüber dem
Wildtyp erstmals neun bis 14 Tage p.i. gezeigt werden und war bis zur 13. Wochen
p.i. nachweisbar. Im Vergleich dazu war die zellvermittelte Immunreaktion der Tiere,
die mit dem Impfstamm vakziniert wurden, erst später nachzuweisen (ab Tag 28) und
fiel deutlich schwächer aus (GUEDES u. GEBHART 2003a).
Im Zytoplasma infizierter Enterozyten kommt es zur Konzentration von Immun-
globulinen der Klasse A (IgA) (LAWSON et al. 1979, MCORIST et al. 1992) Diese
Konzentration könnte einerseits auf einer Sekretionsstörung der Enterozyten
beruhen oder aber Folge einer Überproduktion spezifischer Antikörper sein. Es
wurde vermutet, dass diese Antikörperproduktion der Beginn der Immunantwort ist,
die vom Einwandern von T-Zellen in die erkrankte Mukosa begleitet wird (MCORIST
et al. 1992). Für den Verlauf der Infektion wird den Makrophagen eine gewisse
Bedeutung zugeschrieben, die allerdings nicht spezifiziert werden konnte. Die
Makrophagen begünstigen vermutlich das Auftreten der akuten hämorrhagischen
Form (MACINTYRE et al. 2003).
13

Literaturübersicht
Schweine, die mit L. intracellularis infiziert wurden und eine belastbare Immunität
entwickeln konnten, zeigen bei erneuter Infektion mit L. intracellularis eine geringere
Besiedlung des Darmes als bei Erstinfektion. Klinische Erkrankungen treten in der
Regel nicht mehr auf (COLLINS u. LOVE 2007).
2.3.4 Kontroll- und Präventionsmaßnahmen
Die PPE stellt trotz des heute üblichen Hygienemanagements weiterhin ein großes
Problem in der Schweineproduktion dar. Im Schweinebestand sind das Absetzen der
Ferkel und der Infektionsstatus der Zuchtsauen die wichtigsten Risikofaktoren für
eine Infektion mit L. intracellularis. Darüber hinaus haben die Größe des Bestandes
und die Organisation der Betriebswege eine Bedeutung (MCORIST et al. 2003). Um
eine Erregerausbreitung zu minimieren, ist eine Reinigung und wirksame
Desinfektion der Stallungen vor jeder Einstallung notwendig (COLLINS et al. 2000).
Der Nachweis von L. intracellularis und Brachyspira (B.) pilosicoli gelingt häufiger in
Beständen mit geringer Herdenleistung (Alter der Tiere beim Erreichen von 25 kg
Körpergewicht). In Herden mit vergleichbar guter Leistung (s.o.) konnte L.
intracellularis nicht nachgewiesen werden (JACOBSON et al. 2003a).
Klinisch manifeste Infektionen mit L. intracellularis werden üblicherweise antibiotisch
behandelt. In einer in vitro-Studie wurden 19 antimikrobielle Wirkstoffe an drei
verschiedenen Isolaten von L. intracellularis auf ihre Wirksamkeit untersucht.
Penicillin, Erythromycin, Difloxacin, Virginiamycin und Chlortetracyclin zeigten die
beste Wirksamkeit (minimal inhibitory concentration (MIC) < 1 µg/ml). Die MIC für
Tiamulin und Tilmicosin betrug 4 µg/ml. Lincomycin und Tylosin wiesen eine MIC von
32 resp. 64 µg/ml auf (MCORIST et al. 1995c). Auch eine vergleichende in vitro-
Untersuchung an amerikanischen und europäischen Isolaten von L. intracellularis
kam zu dem Ergebnis, dass Tiamulin, Tylosin und Valnemulin sowie, mit
Einschränkungen, auch Lincomycin und Chlortetracyclin eine gute Wirksamkeit
gegen den Erreger besitzen (WATTANAPHANSAK et al. 2007). Tiamulin ist in vivo
gut wirksam. Sowohl nach präventivem als auch nach therapeutischem Einsatz von
Tiamulin wurden bei infizierten Tieren keine Darmläsionen festgestellt (MCORIST et
al. 1996b). Die therapeutische Wirksamkeit von wasserlöslichem Lincomycin-
14

Literaturübersicht
Spectinomycin-Pulver führt zu einem schnelleren Rückgang der klinischen
Symptomatik sowie zu höheren täglichen Gewichtszunahmen bei infizierten und
behandelten Tieren im Vergleich zu nicht behandelten Tieren einer Kontrollgruppe
(MCORIST et al. 2000). Die Verabreichung von Chlortetracyclin kann das Auftreten
von makroskopischen und mikroskopischen Läsionen im Darm im Zusammenhang
mit einer L. intracellularis-Infektion verhindern und die täglichen
Körpermassezunahmen fördern (MCORIST et al. 1999b). Einen ähnlichen Effekt
erzielt man durch die Behandlung infizierter Schweine mit Tylosin, wie bspw. Tylan ®
200. Klinische Symptomatik und die tägliche Körpermassezunahme konnten im
Gegensatz zur nicht behandelten aber infizierten Gruppe verbessert werden
(MARSTELLER et al. 2000).
In Fütterungsversuchen konnte gezeigt werden, dass ein fermentiertes Futtermittel
zu einer verringerten Erregerausscheidung führt. Läsionen im Darm infizierter
Schweine waren vier Wochen nach der Exposition signifikant geringer ausgeprägt,
wenn dem Futter 2,4 % Milchsäure zugesetzt wurde (BOESEN et al. 2004).
Die spezifische Immunität gegenüber intrazellulären Pathogenen, wie auch L.
intracellularis, beinhaltet in der Regel eine zellvermittelte Immunantwort. Diese
Immunreaktion kann durch eine natürliche Infektion mit L. intracellularis oder durch
Applikation des attenuierten Impfstammes hervorgerufen werden (KROLL et al.
2005a).
Seit 2004 ist in Deutschland der Impfstoff Enterisol ® Ileitis (Boehringer Ingelheim
Vetmedica GmbH) verfügbar. Er beinhaltet ein vermehrungsfähiges, attenuiertes
Isolat von Lawsonia intracellularis (MS B3903) in lyophilisierter Form. Der Impfstoff
kann gemäß Zulassung bei Schweinen ab einem Alter von drei Wochen angewendet
werden. Die Dauer des Impfschutzes beträgt mindestens 22 Wochen (ANON. 2004b).
Zur Prüfung der Protektivität einer avirulenten Lebendvakzine von L. intracellularis
wurden Tiere oral geimpft (Tag 0) und nach 21 Tagen mit einem virulenten
heterologen Isolat inokuliert. Ab Tag 21 des Versuches schieden sowohl geimpfte
wie auch nicht geimpfte Tiere den Erreger aus, wobei die Prävalenz der
Ausscheidung bei den nicht geimpften inokulierten Tieren höher war. Ab Tag 28 nach
der Inokulation konnte mittels indirektem IFT eine Serokonversion festgestellt werden.
Die geimpfte Gruppe zeigte einen höheren Anstieg der Zahl seropositiver Tiere.
15

Literaturübersicht
Makroskopische und mikroskopische Läsionen fielen bei den geimpften Tieren
signifikant milder aus als bei den nicht geimpften (KROLL et al. 2004).
Der Versuch, Schweine über das Futter mit in Hühnereiern hergestellten Antikörpern
passiv zu immunisieren, führte zu dem Ergebnis, dass sowohl die tägliche
Futteraufnahme als auch die täglichen Körpermassezunahmen signifikant höher
waren als bei den Tieren, die keine Antikörper erhalten hatten (WINKELMAN et al.
2004).
In einer vergleichenden Untersuchung konnte gezeigt werden, dass durch den
Einsatz des Impfstoffes in einer infizierten Herde die Ausscheidungsrate von L.
intracellularis nicht reduziert wird. Dagegen führte eine Behandlung mit Tylosin zu
einer signifikanten Reduktion der Ausscheidungsrate. Zwischen geimpften, nicht
geimpften und mit Tylosin behandelten Schweinen konnte kein Unterschied in der
Serokonversion festgestellt werden (NATHUES 2007). In einer anderen
Untersuchung zur Wirksamkeit der Impfung gegen L. intracellularis konnte zwar ein
geringere Auscheidungsrate des Erregers bei geimpften Schweinen im Vergleich zu
ungeimpften Schweinen beobachtet werden (GUEDES u. GEBHART 2003a),
allerdings muss auch hier bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt
werden, dass der Versuch mit dem zur damaligen Zeit hauptsächlich in den USA
vertriebenen Produkt Enterisol ® Ileitis FF (FF= tiefgefrorenes Produkt) durchgeführt
wurde. Die Ergebnisse dieser Untersuchung können daher ebenfalls nicht
uneingeschränkt auf europäische Verhältnisse übertragen werden (pers. Mitteilung:
Dr. Ricarda Deitmer, Boehringer Ingelheim; 24.09.2008). Auch Kroll et al. (2004)
finden in ihren Untersuchungen Anhaltspunkte für die Annahme, dass mit Enterisol ®
Ileitis geimpfte Schweine weniger Erreger ausscheiden als ungeimpfte Schweine.
Das Ausscheiden von Wildtyp und/oder Impfstamm kann derzeit weder mittels PCR
noch mit anderen zur Verfügung stehenden Methoden diskriminiert werden
(GUEDES u. GEBHART 2003a).
16

2.3.5 Differentialdiagnosen
Literaturübersicht
Diarrhoe ist das Leitsymptom der PPE, jedoch ist dieses Symptom wenig spezifisch,
sodass verschiedene Differentialdiagnosen berücksichtigt werden müssen. Neben
Intoxikationen und diätetisch bedingten Ursachen sollten vor allem andere
Infektionskrankheiten ausgeschlossen werden.
Dysenterie
Die Dysenterie des Schweins wird durch eine Infektion mit B. hyodysenteriae
verursacht. Die Erkrankung beginnt zunächst mit Ausscheidung weichen, später
wässrigen, grau-gelben Kotes, dem sich nach einiger Zeit Schleim, Blut und Fibrin
beimengen. Läsionen treten ausschließlich im Dickdarm auf. Es kommt zu Ödemen
in Darmwand und Mesenterium, die Schleimhaut ist nekrotisch und mit
Fibrinauflagerungen bedeckt. Für die Diagnose ist der direkte Nachweis von B.
hyodysenteriae notwendig (HARRIS et al. 1999).
Spirochaetendiarrhoe
Die Spirochaetendiarrhoe kann Folge einer Infektion mit B. pilosicoli sein. Diese
Erkrankung kann bei Tieren verschiedener Altersstufen auftreten. Erste Anzeichen
sind das Absetzen von klebrigem Kot, der zementartig bis breiig ist. Jüngere Tiere
zeigen oft wässrigen und grün-braunen Kot. Der Blinddarm ist schlaff und
flüssigkeitsgefüllt. Im Dickdarm befindet sich eine wässrig-grüne oder schaumig-
gelbe Ingesta. Je nach Schwere der Erkrankung sind mehr oder weniger ulzerierte
und nekrotische Bereiche in der hyperämischen Schleimhaut von Kolon und Zaekum
sichtbar. Die ätiologische Diagnose erfordert den direkten Erregernachweis
(HAMPSON u. TROTT 1999).
Salmonellose
Die Infektion von Schweinen mit Salmonellen ist weit verbreitet. Einige Serovare
können klinisch manifeste Infektionen auslösen, die dann zu einer Septikämie
und/oder einer Enterocolitis führen. Die Enterocolitis wird häufig durch eine Infektion
mit Salmonella (S.) typhimurium oder S. choleraesuis ausgelöst, es kommen jedoch
auch andere Serovare als Ursache in Betracht. Die Erkrankung tritt besonders oft
nach dem Absetzen bis zu einem Alter von vier Monaten auf und äußert sich in
17

Literaturübersicht
wässrigem, gelbem Kot, dem gelegentlich Blut beigemengt ist. In Dünndarm,
Dickdarm und Blinddarm sind auf der teils nekrotischen Schleimhaut grau-gelbe,
anhaftende Beläge sichtbar. Der Inhalt von Kolon und Zäkum ist grün-gelb gefärbt.
Für eine ätiologische Diagnose sollte der Erreger in entsprechendem Probenmaterial
nachgewiesen werden (SCHWARTZ 1999).
Colidiarrhoe
Einige Serovare von Eschericha (E.) coli sind, neben vielen apathogenen Serovaren,
beim Schwein fakultativ oder obligat pathogen und verursachen Septikämien,
Enterotoxämien und/oder Diarrhoe. Die Gruppe der enterotoxinbildenden E. coli
(ETEC) löst häufig eine Diarrhoe aus, die mit wässrigem Kot und einer verminderten
Futteraufnahme einhergeht. Diese Erkrankung tritt in der Regel etwa zwei Tage nach
dem Absetzen auf. Der Dünndarm ist dilatiert und geringgradig ödematös. Die
Magenschleimhaut und die Dünndarmwand sind häufig hyperämisch. Der Inhalt des
Dünndarms ist flüssig bis schleimig und hat einen typischen Geruch. Für eine
ätiologische Diagnose sollte ein direkter Erregernachweis erfolgen, dem sich eine
Charakterisierung von Virulenzfaktoren, mindestens jedoch eine Serotypisierung
anschließt (BERTSCHINGER u. FAIRBROTHER 1999).
Transmissible Gastroenteritis
Die transmissible Gastroenteritis wird durch die Infektion mit einem Coronavirus
verursacht. Die Tiere zeigen vorübergehend Erbrechen und gleichzeitg oder
zeitversetzt einen stinkenden, wässrigen, gelblichen Kot, der oft mit unverdauter
Nahrung durchsetzt ist. Die Erkrankung betrifft in der Regel Saugferkel in den ersten
beiden Lebenswochen. Die Wand des Dünndarms ist extrem dünn, der Inhalt ist gelb
und schaumig-flüssig. Die ätiologische Diagnose erfordert einen direkten
Erregernachweis (SAIF u. WESLEY 1999).
18

2.4 Diagnostik
2.4.1 Direkter Erregernachweis
Literaturübersicht
Die ersten Nachweise der PPE waren rein deskriptiv und basierten auf einer
Beschreibung von proliferativen Prozessen im Ileum. Die Prozesse konnten nach
einer Hämatoxilin-Eosin (HE)-Färbung histologischer Präparate detaillierter
dargestellt werden, allerdings blieb die Ätiologie ungeklärt (ROWLAND u.
HUTCHINGS 1978). Intrazelluläre Erreger konnten erstmalig mit einer Silberfärbung
nachgewiesen werden. Nach einer modifizerten Ziehl-Neelsen Färbung konnten
diese Erreger als säurefeste intrazelluläre Bakterien angesprochen werden
(ROWLAND u. LAWSON 1986). Beide Färbemethoden sind nicht spezifisch für L.
intracellularis.
Die Kombination aus HE-Färbung, Silberfärbung sowie alcian blue-Färbung zum
Nachweis von apikal in den Enterozyten gelegenen Bakterien erlaubt, zusammen mit
dem Nachweis histopathologischer Veränderungen, eine relativ sichere Diagnose
(DRIEMEIER et al. 2002). Die beschriebene Methode ist allerdings nur für eine
Diagnostik post mortem geeignet.
Mit der Entwicklung von monoklonalen Antikörpern (monoclonal antibody (mAb))
gegen ausgewählte Proteine der äußeren Zellmembran von L. intracellularis
(MCORIST et al. 1987) konnten erstmalig spezifische Immunoassays zur Diagnostik
etabliert werden. Zahlreiche Arbeitsgruppen entwickelten Antikörper gegen diverse
antigene Strukturen von L. intracellularis. Heute sind mAb´s gegen ein Proteinase K-
resistentes Antigen (BOESEN et al. 2005a), gegen das Lawsonia surface antigen
(LSA) (MCCLUSKEY et al. 2002) und gegen Lipopolysaccharide (LPS) (KROLL et al.
2005b) verfügbar. Andere Arbeitsgruppen haben monoklonale und polyklonale
Antikörper charakterisiert, die gegen spezifische outer membrane proteins (OMPs)
von L. intracellularis gerichtet sind (GUEDES u. GEBHART 2003c). Die
verschiedenen Antikörper werden zur Detektion von Antigen in histologischen
Präparaten post mortem oder zum Nachweis von L. intracellularis intra vitam an
Kotproben genutzt (MCORIST et al. 1987). Zur späteren Visualisierung müssen die
Antikörper mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder einer Peroxidase markiert werden
19

Literaturübersicht
(KROLL et al. 2005a). Sensitivität und Spezifität der Methode werden im Allgemeinen
als hoch eingeschätzt. In einer vergleichenden Untersuchung konnte für den
indirekten IFT an Darmgewebe eine hohe Sensitivität (89 %) und eine hohe Spezifität
(97 %) im Vergleich zur PCR festgestellt werden. Die Übereinstimmung der
Ergebnisse von IFT und PCR wurde mit almost perfect beurteilt (kappa 0,82)
(HUERTA et al. 2003). In einer anderen Untersuchung zum Vergleich von IFT an
Kotausstrichen und PCR an Kotproben derselben Tiere wurden mittels PCR 8 %
mehr Tiere als positiv erkannt. Die Sensitivität wurde mit 56,5 % angegeben. Darüber
hinaus wurde vom Autor die hohe Belastung des Untersuchers bei der Auswertung
von IFTs als Nachteil der Methode angeführt (BONITZ 2001).
Die PCR ist eine sensitive, sehr spezifische und schnelle molekularbiologische
Nachweismethode. Sie ist besonders für Erreger geeignet, die nur schwer
anzuzüchten sind. In 1993 wurde eine nested-PCR zum Nachweis spezifischer
Genomfragmente von L. intracellularis entwickelt. Die untere Nachweisgrenze betrug
10 Erregern aus gereinigter Mukosa und 1000 Erregern pro Gramm Kot. Die
Aufreinigung der DNA erfolgte durch einfache Waschschritte (JONES et al. 1993). Es
wurden weitere PCR-Assays etabliert, bei denen durch zusätzliche Schritte in der
DNA-Aufreinigung, Kochen und Verdünnen, der Einfluss von Inhibitoren aus Gewebe
und Kot reduziert werden sollte (MCORIST et al. 1994). Die Sensitivität der PCR
wurde zunächst von vielen Autoren als relativ niedrig eingeschätzt, weil diese
Inhibitoren zu falsch negativen Ergebnissen führen können. In einer Studie mit PCR-
Untersuchungen an Kotproben waren nur 38 % der experimentell infizierten Tiere bis
24 Tage p.i. positiv; im Gegensatz dazu erzielte eine PCR an Ileumgewebe zu 100 %
positive Ergebnisse. Das Vorkommen von Inhibitoren im Kot und die intermittierende
Ausscheidung des Erregers wurden als Grund für diese Diskrepanz diskutiert
(KNITTEL et al. 1997). Durch die Entwicklung von Substanzen, die Inhibitoren aus
Kot während der DNA-Extraktion weitestgehend durch Bindung entfernen können,
und weiterentwickelte Extraktionsprotokolle ist die Sensitivität der PCR deutlich
gestiegen. Die Sensitivität der PCR aus Schleimhautproben und Kot betrug in
neueren Untersuchungen 94,1 % und 88,2 % (SUH et al. 2000). Vorteile der PCR
sind die hohe Sensitivität und die sichere Durchführbarkeit, die auch bei hohem
Probendurchsatz gewährleistet ist. Darüber hinaus ist der Nachweis spezifischer
Genomfragmente von L. intracellularis in Kot eine Methode, die eine intra vitam
Diagnostik ermöglicht (SUH et al. 2000). In den vergangenen Jahren wurde die PCR
20

Literaturübersicht
von zahlreichen Autoren in verschiedenen Studien zur Untersuchung der
Epidemiologie der L. intracellularis-Infektion sowie zur Prüfung der Wirksamkeit von
Antibiotika und Impfstoffen eingesetzt (DÜNSER et al. 2003, NASCIMENTO
CHIRIBOGA et al. 1999, JACOBSON et al. 2005, JENSEN et al. 2000, JENSEN et al.
2005, KOYAMA et al. 2006 und weitere).
L. Intracellularis kann auch mittels multiplex-PCR, die Genomfragmente unter-
schiedlicher Erreger gleichzeitig detektiert, nachgewiesen werden. Es wurden
verschiedene multiplex-PCRs entwickelt, die einen schnellen Ausschluss von
Differentialdiagnosen zulassen. Eine triplex-PCR zum Nachweis von L. intracellularis,
B. hyodysenteriae und Salmonella ssp. aus Kot und Darmmukosa konnte als
spezifisch beurteilt werden, jedoch war die Sensitivität für S. typhimurium zehnmal
niedriger als in der entsprechenden uniplex-PCR (SUH u. SONG 2005). Eine weitere
triplex-PCR zum Nachweis von L. intracellularis, Serpulina hyodysenteriae und
Salmonella ssp. zeigte, mit Ausnahme einer einzigen Probe, eine 100 %ige
Übereinstimmung mit den Ergebnissen klassisch kultureller Nachweisverfahren resp.
der histopathologischen Untersuchung (ELDER et al. 1997). In einer anderen Studie
wurde die untere Nachweisgrenze bei der simultanen Detektion von L. intracellularis,
B. hyodysenteriae und B. pilosicoli in Kotproben von Schweinen mit 10 2 bis 10 3
Zellen pro Gramm Kot angegeben. Vergleicht man diese Ergebnisse mit dem
kulturellen Nachweis von B. hyodysenteriae und B. pilosicoli resp. der uniplex-PCR
von L. intracellularis ergibt sich eine Sensitivität von 97,3 % für die multiplex-PCR
(LA et al. 2006). In einer duplex-PCR können L. intracellularis und Salmonella ssp
parallel nachgewiesen werden. Die Sensitivität ist genau so hoch wie bei
beschriebenen uniplex-PCR-Methoden (BACCARO et al. 2003). In 2002 wurde ein
5´-nuclease assay zur Detektion von L. intracellularis etabliert und mit
immunhistochemischen Untersuchungsverfahren verglichen (LINDECRONA et al.
2002). Das Zielgen dieser real-time PCR war die 16S ribosomale DNA, die auch
schon von anderen Autoren als Zielgen gewählt wurde (u.a. KNITTEL et al. 1998,
JONES et al. 1993, ZMUDZKI et al. 2004). Mit dieser PCR-Methode ist neben dem
sehr schnellen, hochspezifischen Nachweis auch eine Quantifizierung des Gehalts
spezifischer Genomfragmenten möglich. Die Nachweisgrenze beträgt ein genome
eqiuvalent (GE) von L. intracellularis pro PCR-tube bei einem threshold cycle (Ct)-
Wert von 35,7; das entspricht 4 x 10 4 GE L. intracellularis pro Gramm Kot. Die
Übereinstimmung der Testergebnisse der real time-PCR und der Immunhistochemie
21

Literaturübersicht
war 91 %, wobei in der real-time PCR 6 % mehr Proben als positiv identifiziert
wurden (LINDECRONA et al. 2002).
2.4.2 Indirekter Erregernachweis
Der erste serologische Test zum Nachweis von Lawsonia-spezifischen Antikörpern
der Klassen IgM und IgA wurde 1988 entwickelt (LAWSON et al. 1988). Es wurde ein
indirekter IFT benutzt, um im Serum von natürlich und experimentell infizierten
Schweinen Immunglobuline nachzuweisen. Die IgM-Antikörper waren in den ersten
acht Wochen p. i. dominant nachweisbar. Für epidemiologische Studien wurde
anschließend ein indirekter IFT zum Nachweis von spezifischen Immunglobulinen
der Klasse IgG entwickelt, da diese Antikörper-Klasse ist im Serum über einen
längeren Zeitraum nach der Infektion nachweisbar ist als IgM. Erste Antikörper sind
mit dieser Methode ab dem Tag 14 p. i. detektierbar. Ab Tag 21 nach der
experimentellen Infektion konnten 90 % der infizierten Schweine positiv auf
Antikörper der Klasse IgG getestet werden. Dieser spezifische und schnelle Test
besitzt eine Nachweisgrenze bei einem Titer von 1:1000. In dieser Studie war die
Sensitivität des IFT deutlich höher (90 % der infizierten Tiere positiv) als die der
ebenfalls an der Versuchsgruppe durchgeführte PCR an Kot (39 % der infizierten
Tiere positiv) (KNITTEL et al. 1998). Der IPMA ist ein weiteres serologisches
Nachweisverfahren für L. intracellularis-spezifische Antikörper der Klasse IgG. Die
Spezifität dieses Tests ist nur in Serumverdünnungen sehr hoch (100 %), da bei
Verwendung von unverdünntem Serum die hohe Hintergrundfärbung eine
Auswertung des Tests stark erschwert (Spezifität 5 %). Die Sensitivität nimmt
allerdings mit dem Verdünnungsgrad des Serums ab; sie beträgt bei einer
Verdünnung von 1:30 nur noch 89 % (GUEDES et al. 2002b).
In einer vergleichenden Untersuchung konnten deutliche Differenzen zwischen den
Ergebnissen von IFT und IPMA festgestellt werden. Die Übereinstimmung zwischen
den beiden Tests betrug auf Einzeltierniveau nur 28 %. Diese Diskrepanz ist durch
die unterschiedliche Sensitivität zu erklären, wobei der IFT mehr falsch positive
Ergebnisse liefert, der IPMA hingegen mehr falsch negative. Beide Tests sind
dadurch charakterisiert, dass eine subjektive mikroskopische Auswertung
vorgenommen wird. Trotz der verbesserten Übereinstimmung der Testergebnisse auf
Herdenniveau (55 %) muss die Einstufung der Herden in positiv und negativ
22

Literaturübersicht
aufgrund der Diskrepanzen in 45 % aller Fälle mit entsprechender Vorsicht erfolgen
(CORZO et al. 2005). Andere serologische Vergleichsuntersuchungen von IFT und
IPMA haben eine Übereinstimmung von 98,6 % gezeigt, jedoch wurde keine
Differenzierung in Herden- oder Einzeltierniveau vorgenommen (GUEDES et al.
2002c).
Ein enzyme linked immunsorbent assay (ELISA) wurde auf der Basis des LSA-
Antigens entwickelt (WATARAI et al. 2004a), das von L. intracellularis auf der
Oberfläche exprimiert wird und vermutlich der Anheftung und dem Eindringen in die
Enterozyten dient (MCCLUSKEY et al. 2002). Mit einem synthetisierten Epitop des
LSA-Antigens konnte im ELISA eine starke Reaktion von Serum infizierter Kaninchen
nachgewiesen werden (WATARAI et al. 2004a).
Lipopolysaccharide (LPS) von L. intracellularis wurden ebenfalls als Zielstruktur im
indirekten ELISA zum Nachweis von IgG eingesetzt. Die hohe Spezifität (100 %) und
Sensitivität (99,5 %) des Tests konnte an Seren solcher Tiere gezeigt werden, die
experimentell infiziert wurden. In einer vergleichenden Untersuchung konnten mittels
indirektem LPS-ELISA signifikant mehr Tiere nach Impfung oder experimenteller
Infektion als positiv befundet werden als mit einem IFT. Dieser Test kann darüber
hinaus die L. intracellularis-Infektionen in einem früheren Stadium nachweisen als
der IFT (KROLL et al. 2005b).
Ein anderer indirekter ELISA zeigte eine durchschnittliche Sensitivität von 98 % und
eine durchschnittliche Spezifität von 99,3 %. Der ELISA ist in beiden Parametern
dem IFT und dem IPMA überlegen (BOESEN et al. 2005b).
In Deutschland ist ein vom Friedrich-Löffler-Institut zugelassener blocking ELISA zum
Nachweis von Antikörper gegen Lawsonia intracellularis unter dem Warennamen
Enterisol® Ileitis ELISA kommerziell erhältlich. Sensitivität und Spezifität dieses
Tests werden mit 97 % resp. 98 % angegeben (KELLER et al. 2004)
2.4.3 Weitere Nachweismethoden für L. intracellularis
Andere Verfahren zum Nachweis von L. intracellularis werden überwiegend für
wissenschaftliche Untersuchungen und nur selten in der Routinediagnostik
eingesetzt.
Neben der in situ-Hybridisierung an Darmmukosa erkrankter Schweine (GEBHART
et al. 1991) ist es möglich, mit Hilfe von magnetischen „Perlen“, die mit Anti-LSA-
23

Literaturübersicht
Antikörpern aus Kaninchenserum beschichtet sind, L. intracellularis aus Kot zu
isolieren und mittels Biolumineszenz sichtbar zu machen (WATARAI et al. 2004b). Im
hochspezifischen polymerase chain reaction-enzyme-linked oligosorbent assay
(PCR-ELOSA) werden markierte PCR-Produkte in eine Mikrotiterplatte hybridisiert
und mittels eines Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplexes sichtbar gemacht. Die
Auswertung erfolgt automatisiert über die optische Dichte bei einer Wellenlänge von
450 nm (ZHANG et al. 2000).
24

Literaturübersicht
2.5 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die PCR ist eine in vitro Technik, die es ermöglicht ausgewählte DNA-Sequenzen
gezielt zu vervielfältigen. Dieser DNA-Abschnitt kann separat oder auch als Teil
eines komplexen DNA-Moleküles zur Verfügung stehen. Es ist nicht zwingend
notwendig, die Zielsequenz selbst zu kennen. Es ist ausreichend, wenn ca. 15 bis 20
Basenpaare zweier flankierender DNA-Sequenzen bekannt sind. Komplementär zu
diesen flankierenden DNA-Sequenzen können kurze gegenläufig orientierte
Oligonukleotide synthetisiert werden, die dann in der folgenden zyklischen Reaktion
als Startermoleküle (Primer) verwendet werden (MULLIS u. FALOONA 1987):
Im ersten Schritt wird der zu amplifizierende DNA-Abschnitt (template, Matrize) zu
einzelsträngiger DNA (ss-DNA) denaturiert. Um sicherzustellen, dass komplex
strukturierte genomische DNA vollständig denaturiert, wird häufig vor dem ersten
Zyklus eine initiale Denaturierung (first denaturation) bei ca. 95 °C durchgeführt, die
in der Regel drei bis fünf Minuten dauert. Im Zyklus wird das Reaktionsgemisch zur
Denaturierung für 30 bis 60 Sekunden auf etwa 90 °C bis 94 °C erhitzt. Danach folgt
der Schritt des annealing, der ebenfalls 30 bis 60 Sekunden dauert. Die annealing-
Temperatur ist abhängig von der Sequenz der eingesetzten Primer. Hier
hybridisieren die Primer mit der einzelsträngigen template-DNA, so dass der dritte
Schritt, die Amplifikation (extension), beginnen kann. In diesem Reaktionsschritt
synthetisiert eine DNA-Polymerase vom 3´-Ende der Primer aus den neuen
komplementären DNA-Strang aus Desoxyribonukleotidtriphosphaten (dNTP´s).
Diese Amplifikation findet, abhängig von der verwendeten Polymerase, bei
Temperaturen von etwa 72 °C statt und benötigt in d er Regel etwa 60 Sekunden für
500 bp (ARNHEIM u. ERLICH 1992).
Diese drei Schritte werden als ein Zyklus zusammengefasst. Die in jedem Zyklus
entstehenden DNA-Fragmente stehen im folgenden Zyklus wiederum als template-
DNA zur Verfügung (MULLIS u. FALOONA 1987). Es sind auch einfachere
Protokolle mit einer Phase der Denaturierung bei 95 °C und einer Phase des
annealing sowie der extension bei 60 °C beschrieben, die zu guten Ergebnissen
führen (ARNHEIM u. ERLICH 1992). In der Regel werden 20 bis 30 Zyklen der PCR
durchgeführt (LORKOWSKI u. THIEMANN 2006). Nach dem letzten Zyklus wird
dann eine weitere Phase der Amplifikation (final extension) angefügt, um alle
25

Literaturübersicht
synthetisierten DNA-Stränge zu vervollständigen. Diese Phase sollte etwa fünf bis 10
Minuten dauern (BANGSOW et al. 2007).
Theoretisch kommt es nach jedem Zyklus zu einer Verdopplung der Ziel-DNA.
Dieses ist jedoch nur zu Beginn einer PCR der Fall. Mit zunehmender Zykluszahl
erfolgt die Vermehrung von DNA-Strängen nicht mehr exponentiell zur Basis 2
sondern linear, bis sie in eine Plateauphase übergeht; dann werden nur noch wenig
neue PCR-Produkte gebildet (LORKOWSKI u. THIEMANN 2006). Für diese Kinetik
sind mehrere Faktoren ursächlich. Der wichtigste Faktor ist die Anreicherung von
PCR-Produkten. Durch die unspezifische Bindung der DNA-Polymerase an die
bereits synthetisierte doppelsträngige DNA wird die weitere Amplifikation gehemmt
(KAINZ 2000). Zusätzlich wird durch diese Anreicherung ein reannealing der
komplementären PCR-Produkte wahrscheinlicher als ein annealing der Primer an die
Matrize (ARNHEIM u. ERLICH 1992). Im Verlauf der PCR werden außerdem Primer
und dNTP´s verbraucht. Durch das zyklische Erwärmen und Abkühlen kommt es zur
Schädigung der Polymerase. Während der PCR können auch Verbindungen
entstehen, die inhibitorische Eigenschaften besitzen. Mit dem Einbau der
Desoxyribonukleotide kommt es zur Freisetzung von Pyrophosphaten, die einen
negativen Einfluss auf die Reaktionskinetik haben (LORKOWSKI u. THIEMANN
2006).
Die Detektion von PCR-Produkten kann mittels Gelelektrophorese erfolgen. Die
Amplifikate werden zusammen mit einem Längenstandard auf ein Agarosegel
aufgetragen und im elektrischen Feld unter einer Gleichspannung von ca. einem Volt
pro Zentimeter Länge des Gels der Größe nach aufgetrennt. Anschließend werden
die DNA-Fragmente mit einem unspezifisch in doppelsträngige (ds)-DNA inter-
kalierenden Farbstoff, bspw. Ethidiumbromid, gefärbt und abschließend mittels
ultraviolettem (UV-) Licht sichtbar gemacht. Diese Technik erlaubt die visuelle
Detektion von etwa 1 ng DNA (TIEMANN 2006, HIGUCHI et al. 1992). Weitere
Verfahren zur Visualisierung von PCR-Produkten beruhen auf dem Prinzip des
ELISA oder auf der reversen Hybridisierung (TIEMANN 2006, KEMP et al. 1989).
26

2.5.1 template
Literaturübersicht
Als template für die PCR dient immer DNA. Diese DNA kann genomischen
Ursprungs sein, es kann aber auch rekombinante DNA in verschiedenen Vektoren
eingesetzt werden (BANGSOW et al. 2007). Die empfohlene Ausgangsmenge für
genomische DNA beträgt etwa 1 bis 100 ng (MÜLLER 2001).
Soll indirekt RNA nachgewiesen werden, muss diese für die PCR zunächst durch ein
Enzym (Reverse Transkriptase) in komplementäre DNA transkribiert werden
(BANGSOW et al. 2007). Auch Amplifikate einer PCR können als template für eine
zweite PCR eingesetzt werden; diese Methode wird dann als nested-PCR bezeichnet
(DIEFFENBACH et al. 1993).
Für einen korrekten Ablauf der PCR ist die Qualität des template wichtig. In der
template-Matrix dürfen keine Inhibitoren der Polymerase vorhanden sein
(DIEFFENBACH et al. 1993).
Die optimale Länge des zu amplifizierenden DNA-Abschnittes beträgt zwischen 0,1
und 1 Kilobasen und wird von der Prozessivität der Polymerase bestimmt. In einer
long range PCR können mittels geeigneter Enzyme und PCR-Protokolle auch
längere DNA-Fragmente amplifiziert werden (LORKOWSKI u. THIEMANN 2006).
2.5.2 Primer
Die Auswahl der Primer bestimmt neben der Qualität des template den Erfolg einer
PCR. Für ein Design der Primer sollten einige wichtige Regeln beachtet werden:
Primer sollten eine Länge von 18 bis 24 bp besitzen. Diese Grenzen sollten nur bei
speziellen Fragestellungen unterschritten werden. Der Gehalt von Guanin (G)- und
Cytosin-(C)-basen sollte etwa 50 % betragen (DIEFFENBACH et al. 1993). Die
Anzahl der Basen bestimmt die Schmelztemperatur der Primer von der Matrize. Die
annealing-Temperatur der Primer ist etwa 5 °C niedriger als der Schmelzpunkt. Die
genaue annealing-Temperatur sollte immer im Versuch bestimmt werden
(BANGSOW et al. 2007), da sie die Ausbeute resp. Effizienz des PCR-Ansatzes
beeinflusst (RYCHLIK et al. 1990). Daneben sollten forward- und reverse-Primer
dieselbe Schmelztemperatur besitzen. Um Primer-Dimere zu vermeiden, sollen
komplementäre Basenpaare an den 3´-Enden nicht vorkommen (DIEFFENBACH et
27

Literaturübersicht
al. 1993). Außerdem sollten an diesen Enden keine drei- oder mehrfache
Wiederholung von G bzw. C und auch keine Thymin-(T)-basen vorhanden sein
(BANGSOW et al. 2007). Die Primersequenz selbst sollte keine mehrfachen
Wiederholungen von einzelnen Nukleotiden beinhalten (ABD-ELSALAM 2003).
Die Konzentration, in der die Primer im jeweiligen PCR-Ansatz verwendet werden,
muss üblicherweise empirisch bestimmt und anschließend im Versuch optimiert
werden. Eine optimale Konzentration ist etwa 50 bis 500 nM (LORKOWSKI u.
THIEMANN 2006).
In einem PCR-Ansatz können gleichzeitig mehrere Primer-Paare eingesetzt werden
(multiplex-PCR). Auf diese Weise ist es möglich, mehrere Genomfragmente simultan
zu detektieren (CHAMBERLAIN et al. 1988). Bei der nested-PCR wird das PCR-
Produkt einer vorangegangenen PCR für eine weitere Reaktion verwendet. Diesem
Ansatz werden andere Primer hinzugefügt, die innerhalb des produzierten DNA-
Fragmentes binden. Dadurch wird die Sensitivität und die Spezifität einer PCR erhöht
(ARNHEIM u. ERLICH 1992).
Heute steht diverse Software zur Verfügung, die ein Primer-Design unterstützen
kann (ABD-ELSALAM 2003).
2.5.3 Polymerase
Erste PCR-Assays wurden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase von E.
coli durchgeführt. Da dieses nicht thermostabil ist, musste nach jedem Zyklus neue
Polymerase zum Reaktionsgemisch hinzugegeben werden (MULLIS u. FALOONA
1987). Die Verwendung einer thermostabilen Taq-Polymerase (isoliert aus Thermus
aquaticus) vereinfachte die Durchführung der PCR. Da die PCR nun auch bei
höheren Temperaturen durchgeführt werden konnte, war ein Anstieg der Spezifität,
der Sensitivität und der Ausbeute der PCR festzustellen (SAIKI et al. 1988). Die Taq-
Polymerase ist die heute am häufigsten verwendete DNA-Polymerase (MÜLLER
2001). Sie besitzt eine hohe Prozessivität und eine akzeptable Lesegenauigkeit. Eine
3´-5´-Exonuklease-Aktivität (proofreading) fehlt, jedoch besitzt sie eine 5´-3´-
Exonuklease-Aktivität. Das Temperaturoptimum der Taq-Polymerase ist breit und
liegt im Bereich von 75 °C (INNIS et al. 1988, LONGLEY et al. 1990). Ein weiteres
Merkmal der Taq-Polymerase ist das matritzen-unabhängige Anfügen von dNTP´s,
vor allem Adenosin (A), an synthetisierte DNA-Stränge (CLARK 1988). Die Pfu-
28

Literaturübersicht
Polymerase, isoliert aus Pyrococcus furiosus, hat eine proofreading-Aktivität und
dadurch eine zehnfach höhere Amplifikationsgenauigkeit als die Taq-Polymerase
(LUNDBERG et al. 1991).
Die Tth-Polymerase, isoliert aus Thermus thermophilus, ist durch die Fähigkeit
gekennzeichnet, sowohl die reverse Transkription als auch die DNA-Amplifikation
durchführen zu können (MYERS u. GELFAND 1991). Weitere thermostabile
Polymerasen sind aus verschiedenen Bakterien isoliert worden (ARNHEIM u.
ERLICH 1992).
Mit dem Ziel eine höhere Sensitivität und Spezifität der PCR zu erreichen, wurde
eine hot start Technik für die PCR entwickelt, die eine Erhitzung des
Reaktionsgemisches vor der eigentlichen Amplifikation beinhaltet (D’AQUILA et al.
1991). Auf diese Weise wird eine extension von Primern, die bei niedrigen
Temperaturen unspezifisch an DNA binden können, und die Bildung von Primer-
Dimeren verhindert. Diese hot start-Technik wird durch den Einsatz veränderter
Polymerasen vereinfacht. Diese können chemisch oder durch die Verwendung
monoklonaler Antikörper zunächst inaktiviert sein. Eine Aktivierung erfolgt durch eine
Erhitzung auf 95°C. (LORKOWSKI u. THIEMANN 2006, S CALICE et al. 1994).
Kältesensitive Mutanten der Taq-Polymerase, die resistent gegen Temperaturen von
95 °C sind, wurden ebenfalls beschrieben (KERMEKCHI EV et al. 2003).
2.5.4 weitere Reagenzien
Die dNTP´s sind die Grundelemente des neu zu synthetisierenden DNA-Strangs
(MULLIS u. FALOONA 1987). Die Nukleotide sollten dem PCR-Ansatz in
äquimolaren Konzentrationen zugesetzt werden, um die Wahrscheinlichkeit eines
fehlerhaften Einbaus von Nukleotiden durch Überangebot einer Base während der
Synthese zu verringern (INNIS et al. 1988). Die optimale Konzentration der
Nukleotide ist abhängig von der Länge des PCR-Produktes, der Anzahl der Zyklen,
den Primern und der Menge von zugesetztem Magnesiumchlorid (MÜLLER 2001)
und liegt etwa zwischen 50 und 200 µM (INNIS et al. 1988). Des Weiteren benötigt
die DNA-Polymerase für ihre enzymatische Aktivität Magnesiumionen als
zweiwertige Kationen, weniger gut eignen sich Manganionen (CHIEN et al. 1976).
Diese Magnesiumionen beeinflussen ebenfalls das annealing der Primer und die
Schmelztemperatur von ds-DNA (STEFFAN u. ATLAS 1991). Kalium- bzw.
29

Literaturübersicht
Natriumchlorid fördern in niedrigen Konzentrationen (40 mM resp. 60 mM) die
katalytische Aktivität der Taq-Polymerase, in hohen Konzentrationen kommt es
allerdings zur Inhibierung der Polymerase. Darüber hinaus ist es für die Prozessivität
der Polymerase notwendig im Reaktionsansatz einen stabilen pH-Wert zwischen 7,0
und 8,0 durch die Auswahl eines geeigneten Puffersystems herzustellen (CHIEN et
al. 1976). Der PCR können weitere Substanzen, bspw. Formamid oder Glycerin,
zugesetzt werden, um den Ablauf der PCR positiv zu beeinflussen (LORKOWSKI u.
THIEMANN 2006).
30

Literaturübersicht
2.6 Probenaufbereitung, Probenlagerung und Inhibitoren
2.6.1 Probenaufbereitung
Die Ziele der Probenaufbereitung sind die Reduktion vorhandener PCR-Inhibitoren,
die Homogenisierung der Probe zu einer für die Amplifikation geeigneten Matrix und
die Konzentrierung der Zielstrukturen. Die Probenmatrix bestimmt die Art der
Probenaufbereitung. Diese Aufbereitung beeinflusst wesentlich den Erfolg der
folgenden PCR (RADSTRÖM et al. 2004).
Eine einfache und schnelle Probenaufbereitung von Bakterien aus Kulturen besteht
aus einer Kombination von Probenverdünnung, Zentrifugation und Waschschritten.
Einen großen Einfluss auf die Entfernung von PCR-Inhibitoren wurde der
Probenverdünnung zugesprochen (AL-SOUD et al. 1998). Eine einfache
Zentrifugation aus Anreicherungsmedium ist nur ausreichend, wenn dieses Medium
nur sehr wenige PCR-Inhibitoren enthält (KNUTSSON et al. 2002).
Im aqueous two-phase system werden verschiedene Polymere, häufig Polyethylen-
glykol und Dextran, eingesetzt, die in Wasser nicht mischbare Phasen bilden. Zellen
verteilen sich überwiegend in der dextranreichen unteren Phase und der Interphase.
Im Gegensatz dazu sind niedermolekulare Stoffe in beiden Phasen zu finden
(ANDERSSON u. HAHN-HAGERDAL 1990). So lassen sich PCR-Inhbitoren und
Zielzellen partionieren (RADSTRÖM et al. 2004).
Eine weitere Möglichkeit der physikalischen Probenaufbereitung ist die buoyant
density centrifugaton (BDC). Aufgrund ihrer unterschiedlichen Dichte werden
Bakterien von der Probenmatrix (hier Käse und Milch) getrennt und lokal konzentriert.
PCR-Inhibitoren bleiben in der Probenmatrix zurück. Theoretisch ist mit Hilfe dieser
Technik eine Differenzierung zwischen lebenden und toten Zellen möglich
(LINDQVIST et al. 1997). Die Methode eignet sich besonders für Proben mit hohem
Gehalt an PCR-Inhibitoren (KNUTSSON et al. 2002).
Die immunomagnetic separation (IMS) ist eine Methode der Probenaufbereitung, die
auf immunologischen Reaktionen beruht. Es werden spezifische Antikörper mit
paramagnetic beads gekoppelt. Die an diese Strukturen gebundenen Bakterien (hier
Listeria monozytogenes) können isoliert und anschließend in einer PCR
nachgewiesen werden (SKJERVE et al. 1990, NIEDERHAUSER et al. 1994).
31

Literaturübersicht
Die Lyse von Zellen kann durch eine Hitzebehandlung erfolgen. Allerdings kann es
nach einfachem Kochen zum Abbau von template und/oder PCR-Produkten durch
thermostabile Nucleasen kommen. Die zusätzliche Verwendung von
Natriumhydroxid/Sodiumdodecylsulfat (NaOH/SDS) kann nach einer
Hitzebehandlung die Degradation von Amplifikaten verhindern (RASMUSSEN et al.
1994). Da allein durch Kochen die DNA nicht von Struktur- und DNA-bindenden
Proteinen getrennt wird und die Lysis selbst auch mangelhaft sein kann, haben
PCRs mit diesem Ausgangsmaterial häufig eine geringe Sensitivität (WILSON 1997).
Aus diesem Grund ist die Verwendung von Enzymen wie bspw. Proteinase K
notwendig, die über ein breites Spektrum proteolytisch wirken und so die Entfernung
von Proteinen aus DNA und die Zerstörung DNA-degradierender Enzyme
ermöglichen. Eine Verbesserung der Proteolyse kann durch Zugabe von SDS
erreicht werden (GROSS-BELLARD et al. 1973). Auch Lysozym kann zur
enzymatischen Lyse verwendet werden (MILLER et al. 1999).
Detergentien können ebenfalls die Lysis von Zellen fördern. Häufig wird dazu die
Verwendung von SDS in die Protokolle integriert (ZHOU et al. 1996). Andere
Substanzen zur Zelllysis enthalten Natriumchlorid oder verschiedene Puffer (MILLER
et al. 1999).
Nach der Lyse der Zellen erfolgt die Aufreinigung der DNA. Eine Präzipitation von
DNA kann durch Zugabe von Ethanol erreicht werden (MILLER et al. 1988).
Isopropanol, Polyethylenglykol oder Trichloressigsäure können ebenfalls zur DNA-
Fällung eingesetzt werden. Nachfolgend wird die Matrix zentrifugiert und gewaschen.
Die so erhaltene DNA wird in einem geeigneten Puffer aufgenommen (FRECH et al.
2007). In diesem Puffer ist DNA über lange Zeit bei -20 °C haltbar (SETZKE 2007).
Eine andere Möglichkeit der Aufreinigung ist die Phenolextraktion. Dabei reichert sich
die DNA in der Chloroformphase an; Proteine kumulieren dagegen in der
Phenolphase. Die so isolierte DNA hat als template eine mittlere Qualität. Hochreine
DNA kann durch Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation separiert werden
(FRECH et al. 2007, GRIESS et al. 2007).
Moderne Techniken zur DNA-Aufreinigung basieren auf Silikagel- oder auf die
Anionenaustauschchromatographie. Die DNA bindet an die entsprechenden
Oberflächen und kann mit speziellen Puffern gewaschen werden. Die Entfernung der
32

Literaturübersicht
DNA von der Oberfläche erfolgt durch geeignete Elutionspuffer. Auf diesem Weg
kann DNA mit einem sehr hohen Reinheitsgrad isoliert werden. (GRIESS et al. 2007)
Die biochemische DNA-Extraktion beruht auf verschiedenen Schritten der Lyse und
DNA-Isolierung. Für diese Form der Probenaufbereitung sind zahlreiche Kits,
abgestimmt auf verschiedene Ausgangsmaterialien, kommerziell erhältlich. Soweit
erkennbar werden die Silikagel- und andere Säulentechnologien verwendet
(QUEIPO- ORTUNO et al. 2007, MCORIST et al. 2002). Sie liefern eine homogene
und qualitativ hochwertige Matrix für die Amplifikation (RADSTRÖM et al. 2004).
Allerdings kann es auch mit kommerziellen Kits (hier: QIAamp ® DNA Stool Mini Kit)
zu einem Verlust von DNA durch mangelnde Zelllysis kommen (LI et al. 2003). Die
Ausbeute der DNA-Extraktion aus Stuhlproben mit diesem Kit war jedoch höher als
mit den anderen kommerziell erhältlichen Kits (MCORIST et al. 2002). Die
Verwendung des QIAamp ® DNA Stool Mini Kits führte im Vergleich zu anderen
Methoden der Präparation von DNA aus Kotproben vom Schwein, wie Kochen,
Phenol/Chlorophorm-Präzipitation oder BDC zur Isolierung zu einem template, das
die beste Qualität besaß. In einer anschließenden nested-PCR zum Nachweis von L.
intracellularis konnte mit diesem template die höchste Sensitivität erzielt werden.
Inhibitoren wurden mit dieser Methode zuverlässig entfernt (JACOBSON et al. 2004).
2.6.2 Probenlagerung
Proben für molekularbiologische Untersuchungen sollten, anders als Proben für
bakteriologische Untersuchungen, bei -20 °C oder ni edrigeren Temperaturen
gelagert werden, wenn die Untersuchung nicht unmittelbar erfolgt (SETZKE 2007).
Die Lagerung von Kotproben ist aufgrund von Gallensalzen und –säuren in der
Probenmatrix oft mit einer Degradation der DNA verbunden. Durch eine Aufreinigung
der DNA mit dem DNeasy ® Blood & Tissue Kit (Qiagen GmbH) konnten diese
Substanzen nicht ausreichend entfernt werden. Eine Degradation von DNA war hier
auch nach einer Woche Lagerung bei -20 °C immner no ch deutlich nachweisbar.
Eine signifikante Reduzierung der Degradation von DNA konnte durch die
zusätzliche Verwendung von Kartoffelstärke oder einer Mischung von Cellulose,
Stärke, Fetten und Salzen erreicht werden (DEUTER et al. 1995). Im Gegensatz
dazu konnten in zuvor positiv charakterisierten Kotproben nach sechsmonatiger
33

Literaturübersicht
Lagerung bei -80 °C immer noch spezifische Genomfra gmente von L. intracellularis
mittels nested-PCR detektiert werden (JONES et al. 1993).
2.6.3 Inhibitoren
Substanzen, die eine PCR inhibieren können, sind unterschiedlichen Ursprungs.
Inhibitoren können aus der Probe selbst stammen (RADSTRÖM et al. 2004).
Typische Inhibitoren in Kot- bzw. Stuhlproben sind bspw. Bilirubin, Gallensalze,
komplexe Polysaccharide, die hohe Ausgangsmenge an Mikroorganismen,
Hämoglobin und dessen Abbauprodukte, Harnstoff und Heparin (MONTEIRO et al.
1997, SAULNIER u. ANDREMONT 1992, DAHLENBORG et al. 2001,
WIDJOJOATMODJO et al. 1992). Inhibitoren können aber auch Substanzen sein, die
bei der Probenaufbereitung aktiv eingesetzt wurden (RADSTRÖM et al. 2004). Der
inhibitorische Mechanismus verschiedener Substanzen beruht im Allgemeinen auf
drei zentralen Punkten. Zum einen können sie im Rahmen der Probenaufbereitung
die Zelllyse negativ beeinflussen. Zum anderen können sie die DNA degradieren
oder an diese binden, so dass die Polymerase an diese Strukturen nicht mehr binden
kann. Schlussendlich ist auch eine Hemmung der Aktivität der DNA-Polymerase
möglich. Dabei kann ein Inhibitor auf mehrere Arten durch chemische, physikalische
und enzymatische Reaktionen wirken (WILSON 1997). Einige Stoffe, wie
Dimethylsulfoxid (DMSO), Glycerin oder Polyethylenglykol, wirken in niedrigen
Konzentrationen als Agonisten der PCR, in höheren Konzentrationen allerdings als
Inhibitoren (MÜLLER 2001).
34

2.7 Real-time PCR
Literaturübersicht
Die real-time PCR ist eine weiterentwickelte Form der PCR, bei der die Entstehung
von Amplifikationsprodukten durch fluoreszierende Reportermoleküle visualisiert wird.
Im Gegensatz zur konventionellen PCR wird nicht die DNA-Menge am Ende der
PCR bestimmt, sondern es wird der Zeitpunkt während der Reaktion (real time)
festgestellt, zu dem erstmals PCR-Produkte detektiert werden können. Die
Fluoreszenz ist in der Regel proportional zur Menge der entstandenen Amplifikate.
Mit dieser Methode ist es auch möglich, die Ausgangsmenge von template zu
quantifizieren (BUSTIN 2005). Die real-time PCR ermöglicht die Untersuchung einer
Probe in einem Zeitraum von zwei bis drei Stunden (SCHMITTGEN 2001). Eine
abschließende Trennung der Amplifikate nach Größe und Visualisierung zur
Identifikation sind nicht mehr notwendig.
Die Anzahl von Publikationen mit dem Stichwort „real-time PCR“ hat in den letzten
Jahren stark zugenommen (VALASEK u. REPA 2005). Die einfache Durchführbarkeit,
die Sensitivität, die Spezifität und fortlaufenden Verbesserungen der
Reaktionsbedingungen haben dazu geführt, dass die real-time PCR zur
maßgebenden Technologie für den DNA-Nachweis geworden ist (BUSTIN 2005).
Aktuell sind mehr als 20.000 wissenschaftliche Untersuchungen mit dem Stichwort
„real-time PCR“ veröffentlicht (ANON. 2008).
2.7.1 Detektion und Sondentechnik
Die Visualisierung von Amplifikaten kann grundsätzlich mit zwei verschiedenen
Detektionssystemen erfolgen. Nichtspezifische Detektionssysteme basieren auf der
Verwendung interkalierender Farbstoffe. Dagegen werden in spezifischen
Detektionssystemen sequenzspezifische fluorogene Sonden verwendet (BUSTIN
2005).
35

Nichtspezifische Detektionssysteme
Literaturübersicht
Erste Versuche zur Echtzeit-Visualisierung der Amplifikation wurden mit
Ethidiumbromid durchgeführt. Dieser Farbstoff interkaliert in ds-DNA und bewirkt so
einen starken Anstieg seiner Fluoreszenz. Im Verlauf der PCR steigt diese
Fluoreszenz durch die Akkumulation doppelsträngiger PCR-Produkte weiter an. Die
Bildung von ebenfalls doppelsträngigen Primer-Dimeren wird in dieser Art der PCR
als problematisch angesehen, da auch diese einen Anstieg der Fluoreszenz
bewirken und somit zu falsch positiven Ergebnissen führen können. Eine große
Menge genomischer DNA in der Ausgangsmatrix kann zu einer störenden
Hintergrundfluoreszenz führen (HIGUCHI et al. 1993, HIGUCHI et al. 1992). Heute
werden zunehmend interkalierende Cyaninfarbstoffe, wie bspw. das SYBR Green I,
eingesetzt (KUBISTA et al. 2006). Dieses bindet an ds-DNA mit hoher Affinität, in
dem es sich in der kleinen Furche der Doppelhelix anlagert. In hohen
Farbstoffkonzentrationen kann eine deutliche Affinität zu A/T-reichen Sequenzen
festgestellt werden (ZIPPER et al. 2004). Vergleicht man die Fluoreszenz von
Cyaninfarbstoffen in Lösung mit und ohne ds-DNA, ist sie in Anwesenheit von DNA
etwa 1000fach höher. Diese Erhöhung beruht auf der planaren Fixierung des
Moleküls durch die Basen des DNA-Stranges (NYGREN et al. 1998).
Die Farbstoffe der nichtspezifischen Detektionssysteme interkalieren grundsätzlich in
jede ds-DNA. Aus diesem Grund können spezifische PCR-Produkte nicht anhand der
Fluoreszenz identifiziert werden und Primer-Dimere sowie unerwünschte PCR-
Produkte bleiben unerkannt. Eine Schmelzkurvenanalyse ermöglicht Amplifikate
nach Länge, Sequenz und G/C resp. A/T-Verhältnis zu differenzieren. Dabei wird die
Fluoreszenz gegen die Temperatur aufgetragen und anschließend die 1. Ableitung
dieser Funktion betrachtet. Wird die jeweilige Schmelztemperatur eines Amplifikates
erreicht, denaturiert dieses in ss-DNA und der Farbstoff löst sich von der DNA.
Dadurch kommt es zu einem starken Abfall der Fluoreszenz. Mit dieser Methode
können Amplifikationsprodukte differenziert werden, deren Schmelztemperaturen
sich um weniger als 2 °C unterscheiden (RIRIE et al. 1997).
Interkalierende Farbstoffe bieten die Vorteile, dass sie (a) unkompliziert in
verschiedenen Protokollen eingesetzt werden können, (b) eine einfache Etablierung
von Primern in neuen Protokollen ermöglichen und (c) niedrigere Kosten im
Vergleich zu Hybridisierungssonden verursachen (BUSTIN u. NOLAN 2004).
36

Spezifische Detektionssysteme
Literaturübersicht
Die spezifische Detektion von Amplifikaten basiert auf der Verwendung sequenz-
spezifischer Hybridisierungssonden, die mit fluoreszierenden Farbstoffen gelabelt
sind. Üblicherweise werden Farbstoffe wie Fluorescein, Rhodamin und
Cyaninfarbstoffe und/oder deren Derivate eingesetzt (BUSTIN u. NOLAN 2004).
Zurzeit sind diverse Farbstoffe mit verschiedenen Anregungs- und
Emissionsspektren im Handel erhältlich und können individuell nach Kundenwunsch
an Oligonukleotide gebunden werden (MARRAS 2008). Für jede Zielsequenz ist die
Verwendung einer separaten Sonde nötig. Durch die Auswahl verschiedener
Farbstoffe können mit dieser Art der Detektion real-time multiplex-PCRs durchgeführt
werden (BUSTIN u. NOLAN 2004).
Unspezifische Amplifikate und/oder Primer-Dimere werden nicht visualisiert, da eine
Fluoreszenz nur nach Hybridisierung der Sonde an die komplementäre target-
Sequenz auftritt. Diese hohe Spezifität kann zugleich ein Nachteil sein, da bspw.
unspezifische Amplifikate nicht detektiert werden und ihr möglicher negativer Einfluss
auf die Effizienz der eigentlichen Amplifikation unerkannt bleibt. Viele
Sondensysteme beruhen auf dem Prinzip des fluorescence resonance energy
transfer (FRET) (BUSTIN u. NOLAN 2004). Das FRET-Prinzip wurde 1988 erstmals
zur Detektion von Nukleinsäuren eingesetzt. Damals wurde ein fluoreszierender
Farbstoff sowohl als Donor wie auch als Akzeptor verwendet (CARDULLO et al.
1988). Heute ist der Akzeptor häufig ein Quencher-Molekül, das nach Anregung die
Energie nicht in Form von Licht, sondern als Wärme abgibt (MARRAS 2008,
KUBISTA et al. 2006).
Der Energietransfer und die Auslöschung des Signals sind beim FRET abhängig von
der Entfernung zwischen Donor und Akzeptor. Der Donor emittiert ein Photon, das
vom Akzeptor aufgenommen wird. Auf diese Weise wird ein Fluoreszenzsignal
(emittiertes Licht) des Donors verhindert. Durch räumliche Umordnung der Sonde
wird die Entfernung zwischen Donor und Akzeptor vergrößert und es kann ein
Fluoreszenzsignal entstehen. Wichtig ist, dass das Emissionsspektrum des Donors
mit dem Absorptionsspektrum des Akzeptors einen gemeinsamen Bereich aufweist
(KUBISTA et al. 2006, MARRAS 2008).
37

Hydrolysesonde (TaqMan -Sonde)
Literaturübersicht
Das Prinzip der Hydrolysesonde beruht auf der 5´-3´-Exonucleaseaktivität der Taq-
Polymerase. Diese schneidet in einer nick-Translation während der Polymerisation
5´-terminale Nukleotide aus ds-DNA. Dadurch wird die hybridisierte Sonde degradiert
Die Hydrolysesonde ist am 5´-Ende mit einem Donorfarbstoff und am 3´-Ende mit
einem Akzeptor gelabelt. Die Moleküle befinden sich in räumlicher Nähe zueinander,
wenn die Sonde an der target-DNA hybridisiert vorliegt; es kommt zum quenching
der Fluoreszenz des Donors. Mit dem Abbau der Sonde durch die Taq-Polymerase
in der Phase der Amplifikation steigt die Fluoreszenz des Donors messbar an, da
Donor und Akzeptor räumlich voneinander getrennt werden. (HOLLAND et al. 1991,
LIVAK et al. 1995). Eine TaqMan -Sonde, deren Emission auf dem beschriebenen
Prinzip der Hydrolyse basiert, sollte so beschaffen sein, dass sie eine Länge von 20
bis 30 bp hat und dass die annealing-Temperatur der Sonde 5 °C bis 10 °C über
derjenigen der Primer liegt (LIE u. PETROPOULOS 1998). Die TaqMan -Sonde wird
bspw. in einer quantitativen real-time PCR zum Nachweis von Genomfragmenten
des porzinen Circovirus Typ 2 verwendet (OLVERA et al. 2004).
Hybridisierungssonde (FRET-Sonde, adjacent probe)
Diese Art der Sondentechnologie wurde ebenfalls 1988 erstmalig zur Detektion von
Nukleinsäuren beschrieben. Zwei kurze Oligonukleotide hybridisieren wenige bp
voneinander entfernt an der Zielsequenz. Die Sonden sind am 5´-Ende resp. am 3´-
Ende mit einem Donor resp. Akzeptor gelabelt und bringen so zwei Fluorochrome in
eine räumliche Nähe. Im Zustand der Hybridisierung wird die Fluoreszenz des
Donors unterdrückt und die Fluoreszenz des Akzeptors aktiviert (CARDULLO et al.
1988). Liegen beide Oligonukleotide getrennt voneinander in Lösung vor kommt es
nicht zum FRET (MARRAS 2008).
Molecular beacon
Die molecular beacons sind einsträngige DNA-Moleküle, die durch eigen-
komplementäre Sequenzen an ihren Enden eine Haarnadelstruktur ausbilden. Die
Sequenz der Schlaufe selbst ist wiederum komplementär zur Zielsequenz. An den
eigenkomplementären Enden befinden sich jeweils der Donor und der nicht-
fluoreszierende Akzeptor. Durch diese räumliche Nähe wird das Signal des Donors
gelöscht. In Anwesenheit spezifischer ss-DNA mit der Zielsequenz bindet die Sonde
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an diese, wodurch ein längerer und stabilerer Doppelstrang entsteht als in der
Haarnadelstruktur. Durch die nun lineare Struktur entfernen sich Donor und Akzeptor
und es wird ein Fluoreszenzsignal messbar. Diese Art der Sonde zeichnet sich durch
eine hohe Spezifität während der Hybridisierung aus, da schon eine einzige
unpassende Base genügt, um eine Hybridisierung zu verhindern (TYAGI u. KRAMER
1996).
Displacement probe
Diese Sonde besteht aus zwei komplementären Oligonukleotidsträngen. Der Strang,
der an die Zielsequenz binden soll, ist länger als der andere. Am 5´-Ende des langen
Stranges befindet sich der Donor. Am 3´-Ende des Komplementärstranges ist der
Akzeptor gebunden. Liegt die Sonde als ds-DNA vor, sind in diesem Doppelstrang
Donor und Akzpetor in räumlicher Nähe. Durch die Zielsequenz wird der
Komplementärstrang von dem eigentlichen Hybridisierungsstrang verdrängt
(displacement hybridisation) und es entsteht Fluoreszenz. Die überragende Spezifität
und die hohe Sensitivität werden als Vorteil dieser Technik bewertet (LI et al. 2002).
Light-Up probe
Eine light-up probe ist ein Oligonukleotid aus peptide nucleic acid (PNA). An diesem
Oligonukleotid ist über einen linker der Cyaninfarbstoff Thiazolorange gebunden. Die
Fluoreszenz des Farbstoffes steigt mit der Hybridisierung der Sonde an die
Zielstruktur bis auf das 50fache der Grundfluoreszenz an. Die relativ hohe
Fluoreszenz der freien Sonde beruht auf den Interaktionen des Farbstoffes mit den
Basen der Sonde selbst. Dieses unerwünschte Phänomen wurde durch den Einsatz
der PNA als Grundgerüst minimiert (SVANVIK et al. 2000).
Minor groove binder
Mit dem Ziel, die Hybridisierungseigenschaften von Sonden zu verbessern, können
minor groove binder (MGB) an das Ende von Sonden gebunden werden. Diese
Moleküle stabilisieren die Sonden-DNA-Doppelhelix durch ihr „Einklappen“ in die
kleine Furche der Doppelhelix. Die Schmelztemperatur der so stabilisierten
Doppelhelix ist signifikant höher. In der Folge können kürzere Sonden eingesetzt
werden, die in der Regel eine höhere Spezifität besitzen (KUTYAVIN et al. 2000).
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Primer zur spezfischen Detektion
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Auch Primer, die fluorogen gelabelt sind, können zur spezifischen Detektion von
Amplifikaten eingesetzt werden. Light upon extension (LUX)-Primer besitzen eine
Haarnadelstruktur und sind nahe dem 3´-Ende mit einem Fluorochrom verknüpft.
Das quenching erfolgt durch die Nähe zu G oder C. Mit dem annealing des Primers
wird die Haarnadelstruktur geöffnet und die Fluoreszenz aktiviert. (NAZARENKO et
al. 2002, MACKAY 2004). Scorpion primer besitzen ebenfalls eine
Haarnadelstruktur. Die Schlaufe ist komplementär zu einem Abschnitt der
Zielsequenz. Scorpion primer sind mit einem Donor- und einem Akzeptorfarbstoff
verknüpft und werden während der Amplifikation in das PCR-Produkt eingebaut. Die
Haarnadelstruktur löst sich und die Donorfluoreszenz wird detektierbar
(NAZARENKO et al. 1997, WHITCOMBE et al. 1999).
2.7.2 Ergebnisauswertung
In der real-time PCR wird die vom Detektionssystem freigesetzte Fluoreszenz in
jedem Zyklus von einem optischen Sensor im real-time Gerät gemessen und
aufgezeichnet. Ein Anstieg der Fluoreszenz verläuft proportional zur Menge des
amplifizierten Produkts (HIGUCHI et al. 1992, BUSTIN 2000). Die Messdaten des
Sensors, der die Fluoreszenz der Sonde oder des interkalierenden Farbstoffs
detektiert, werden gegen einen passiven Referenzfarbstoff, der im Reaktionsmix
enthalten ist, und ebenfalls detektiert wird, normiert. Eine Normalisierung gleicht
Schwankungen der Fluoreszenz aus, die durch unterschiedliche Konzentrationen
oder Volumina der Reaktionseinheiten entstehen können. Diese normierte
Fluoreszenz (Rn) wird als Intensität im amplification plot fortwährend gegen den
entsprechenden Zyklus aufgetragen. In den ersten PCR-Zyklen dominiert eine
niedrige, geringgradig schwankende Fluoreszenz, die durch Eigenfluoreszenz
verschiedener Komponenten (Plastikware, Thermoblock, Sonde, etc.) erzeugt und
als baseline bezeichnet wird (MACKAY 2004, ANON. 2005a). Wird diese baseline
von der normierten Reporterfluoreszenz abgezogen, so erhält man die Signalgröße
∆Rn, die durch die Amplifikation von template-DNA entstanden ist (HEID et al. 1996).
Mit dem Ziel, den zentralen Wert der real-time PCR, den threshold cycle (Ct),
feststellen zu können, muss der threshold festgelegt werden. Dieser threshold wird
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von der Software, die das real-time PCR Gerät steuert und die Messdaten empfängt,
in Abhängigkeit von der baseline berechnet und gilt in der Regel für jede
Reaktionseinheit in einem PCR-Ansatz (BUSTIN u. NOLAN 2004). Der threshold
liegt graphisch betrachtet immer oberhalb der baseline, jedoch so niedrig, dass er als
Gerade die Amplifikationskurve in der Exponentialphase schneidet (ANON. 2005a).
Der Zyklus, in dem die normierte und baseline-korrigierte Reporterfluoreszenz ∆Rn
diesen threshold überschreitet, wird als Ct bezeichnet (ANON. 2005a, HEID et al.
1996). Der Ct-Wert ist umgekehrt proportional zur Anzahl der target-Sequenzen in
der Probe; das heißt je höher die ursprüngliche Konzentration der Ziel-DNA in der
Probe, desto niedriger ist der entsprechende Ct-Wert (BUSTIN 2005).
Die von der Software berechneten Ergebnisse müssen interpretiert und ihrer Validität
überprüft werden. In einem PCR-Assay können immer falsch-positive wie auch
falsch-negative Ergebnisse erzeugt werden. Beide Fehler sollten mit einer hohen
Wahrscheinlichkeit identifiziert werden (BURKARDT 2000).
Falsch-positive Ergebnisse können während der PCR durch unspezifische
Amplifikation, Kontamination und/oder Verdunstung entstehen. Zur Verifizierung
dieser Fehler muss in jedem PCR-Ansatz auch eine Negativkontrolle untersucht
werden (BURKARDT 2000). Diese Negativkontrolle (non template control (NTC))
enthält alle Reagenzien des Reaktionsmixes, jedoch wird keine target-DNA zugefügt
(MALORNY et al. 2003). Ist diese Negativkontrolle positiv, so muss der jeweilige
Ansatz wiederholt werden (BURKARDT 2000). Darüber hinaus sollte eine negative
Extraktionskontrolle untersucht werden, die in allen Bearbeitungsschritten - von der
DNA-Extraktion bis zur PCR - wie eine normale Probe behandelt wird (MALORNY et
al. 2003). Es gibt die Möglichkeit, dass eine Negativkontrolle einen Ct-Wert besitzt,
obwohl sie tatsächlich negativ ist. Hier sind vor allem die Geräteinstellungen
hinsichtich baseline und threshold zu überprüfen und die Interpretation der
Ergebnisse entsprechend anzupassen (BUSTIN u. NOLAN 2004).
Falsch-negative Ergebnisse können unter anderem durch Inhibitionen der PCR
entstehen. Zur Identifizierung dieser Tatsache wird in jedem Ansatz eine
Positivkontrolle untersucht. Ist diese negativ, sind die Testergebnisse nicht gültig
(BURKARDT 2000). Es wird eine positive Extraktionskontrolle empfohlen, die aus
einer negativen Probe besteht und mit Ziel-DNA gespickt ist. Auch diese Kontrolle
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sollte allen Schritten der Probenberarbeitung unterzogen und abschließend
amplifiziert werden.
Mit dem Ziel PCR-Inhibitoren nachzuweisen wird dem Reaktionsmix eine interne
Amplifikationskontrolle (IAC) oder interne Positivkontrolle (IPC) zugefügt, die folglich
in jeder Reaktionseinheit eines PCR-Ansatzes vorhanden ist (MALORNY et al. 2003).
Eine IAC ist ein DNA-Abschnitt, der ungleich der Ziel-DNA ist. Eine IAC kann
grundsätzlich mit demselben Primer-Paar amplifiziert werden wie die Ziel-DNA.
Allerdings kommt es bei diesem Verfahren zur Konkurrenzreaktion, wodurch die
Effizienz der PCR beeinflusst werden kann. Eine nicht-kompetetive IAC wird mit
eigenen Primern amplifiziert und ist somit eine eigenständige zweite PCR. Es sollte
darauf geachtet werden, dass die Konzentration der IAC bzw. der entsprechenden
Primer möglichst niedrig ist, um potentielle Konkurrenzreaktionen zu minimieren.
Eine IAC muss in dem Falle, dass kein spezifisches PCR-Produkt entstanden ist,
immer positiv sein (HOORFAR et al. 2004); andernfalls muss von einer Inhibition
ausgegangen werden.
In der Literatur sind verschiedene Möglichkeiten beschrieben, eine IPC zu designen.
In der real-time PCR ist es möglich, der Probe einzelsträngige Oligonukleotide
(internal control oligonucleotide (ICO)) zuzugeben. Diese ICO sind der Zielsequenz
ähnlich, jedoch bindet die entsprechende Sonde nicht. Der Nachweis der ICO-
Amplifikation erfolgt durch eine Schmelzkurvenanalyse (BURGGRAF u.
OLGEMÖLLER 2004). Für L. intracellularis wurde ein mimic entwickelt, das mit den
Primern der Zielsequenz amplifiziert wird. Mimic und spezifisches Amplikon werden
in der Gelelektrophorese anhand ihrer Größe differenziert (JACOBSON et al. 2003b).
2.7.3 Quantifizierung
Die während einer real-time PCR gemessene Fluoreszenz steigt über einen weiten
Bereich linear zur Menge des PCR-Produkts und erlaubt so neben der qualitativen
Aussage (positiv/negativ) auch eine quantitative Aussage über die Menge von
template in der Probe (BUSTIN 2005). Der Ct-Wert dient dabei als Ausgangspunkt
für eine Berechnung zur Feststellung der ursprünglichen Menge von Ziel-DNA resp.
der Anzahl von Genomäquivalenten in der ursprünglichen Probe (HEID et al. 1996).
Die Zahl der Genomäquivalente im PCR-Ansatz kann absolut oder relativ
quantifiziert werden (MACKAY et al. 2002).
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Absolute Quantifizierung
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In der absoluten Quantifizierung werden externe Standards, wie bspw. in vitro-
Transkripte, rekombinante Nukleinsäuren oder DNA, verwendet, mit denen eine
Standardkurve erstellt wird. Die Ct-Werte der Standards, untersucht in einer
Verdünnungsreihe, werden gegen die bekannten, logarithmierten Werte der
Ausgangsmenge aufgetragen. Das Intervall, das von der Standard-
Verdünnungsreihe inkludiert wird, sollte den Arbeitsbereich einschließen. Die Ct-
Werte der Standardkurve sollten durch Mehrfachbestimmungen validiert werden
(BUSTIN 2000, FRONHOFFS et al. 2002, FERRE 1992); in der Literatur wird dazu
die Untersuchung im dreifachen Ansatz für jede Verdünnungsstufe empfohlen
(LARIONOV et al. 2005). An einer Standardkurve kann durch Vergleich der Ct-Werte
unbekannter Proben deren Ausgangsmenge von Ziel-DNA abgeleitet werden.
Darüber hinaus kann mit Hilfe der Standardkurve die Effizienz der Amplifikation
berechnet werden (BUSTIN 2000, FRONHOFFS et al. 2002). Die Effizienz der
Amplifikation von Standard und Zielsequenz sollte vergleichbar sein. Sind Standard
und Zielsequenz identisch, so können beide mit demselben Master-Mix amplifiziert
werden (FRONHOFFS et al. 2002). In jeder PCR sollte die Standardkurve trotz ihrer
guten Reproduzierbarkeit neu bestimmt werden (LARIONOV et al. 2005).
Relative Quantifizierung
Die relative Quantifizierung erlaubt eine Aussage über die Menge einer Ziel-DNA im
Verhältnis zu einer Referenz, ermöglicht aber nicht, die Ausgangsmenge der Ziel-
DNA absolut zu bestimmen. Diese Art der Quantifizierung wird überlicherweise in
Genexpressionsstudien verwendet, um die Expression des Zielgens mit der
Expression eines Referenzgens zu vergleichen (PFAFFL 2004a). Die Expression des
Referenzgens wird nicht reguliert und ist konstant (PFAFFL 2004b). Housekeeping
genes, wie Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) oder β-Aktin, sind
als Referenzgene (internes Kontrollgen, endogene Referenz) geeignet (LIVAK u.
SCHMITTGEN 2001). Mithilfe der ∆∆Ct-Methode wird der Ct-Wert des Zielgens
gegen den Ct-Wert der endogenen Referenz normalisiert (∆Ct). Diese Berechnung
wird sowohl bei einer unbehandelten wie auch bei einer behandelten Probe
durchgeführt, so dass beide erhaltenen ∆Ct-Werte voneinander abgezogen werden
können. Aus diesem ∆∆Ct-Wert kann das Expressionsverhältnis des Zielgens von
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der behandelten zur nicht behandelten Probe berechnet werden. Eine grundlegende
Voraussetzung für diese Berechnung ist, dass Zielgen und Referenzgen in der PCR
mit gleicher Effizienz amplifiziert werden (LIVAK u. SCHMITTGEN 2001, PFAFFL
2004b). Sind die Effizienzen unterschiedlich, kann das zu Fehlern in der Berechnung
führen. Fehler dieser Art lassen sich ausschließen, indem eine effizienz-korrigierte
Quantifizierung durchgeführt wird (PFAFFL 2004b, PFAFFL 2001). Diese Methode
basiert auf dem Vergleich der Ct-Werte einer Probe und der bekannten Kontrolle
(Ct Kontrolle – Ct Probe = ∆Ct). Die Expression wird dabei unter Berücksichtigung der
PCR-Effizienzen relativ zum Referenzgen (Ct-Ref Kontrolle – Ct-Ref Probe = ∆Ct-Ref)
ausgedrückt. Wird das Referenzgen stabil exprimiert, kann die Normalisierung zu
diesem entfallen. Die Berechnung der Expression beruht dann allein auf dem ∆Ct
von Probe und Kontrolle und der Effizienz der Amplifikation der Ziel-DNA. Folgende
Formel wurde angewendet:
Rate der Expression = (E target) ∆Ct
mit E= Effizienz der Amplifikation = 10
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(-1/Steigung der Standardkurve)
Auf diese Weise kann auf die Erstellung einer Standardkurve in jedem Ansatz
verzichtet werden (PFAFFL 2001) und die relative Quantifizierung unter Verwendung
der Referenz für eine absolute Quantifizierung genutzt werden.

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2.8 Validierung von diagnostischen Tests
Zur Validierung von analytischen und/oder diagnostischen Testverfahren stehen
diverse Richtlinien und/oder Guidelines zur Verfügung, die die Mindestanforderungen
an eine Validierung charakterisieren. Diese Guidelines sind von verschiedenen
Einrichtungen erarbeitet worden (The European Agency for the Evaluation of
Medicinal Products (EMEA), Office International des Épizooties (OIE), Staatliche
Akkreditierungsstelle Hannover (AKS)). Eine geeignete Validierung ist notwendig, um
die diagnostischen Fähigkeiten eines entwickelten Testes für die entsprechende
Fragestellung beschreiben zu können und um sicherzustellen, dass die
Testergebnisse mit dem tatsächlichen Status einer Probe übereinstimmen. Eine
weitere Notwendigkeit der Testvalidierung stützt sich auf Vorderungen zur
Qualitätssicherung und -kontrolle (ANON. 1998a, ANON. 1998b, ANON. 2004a). In
der molekularbiologischen Diagnostik wird zur Qualitätssicherung die Verwendung
von positiven und negativen Präparationskontrollen sowie von Inhibitionskontrollen
erwartet. Eine Inhibition muss durch eine externe oder interne Amplifikationskontrolle
ausgeschlossen oder über geeignete Präparationen zur Entfernung von Inhibitoren
verhindert werden. Ausgenommen sind Probenmatrices oder Verfahren, bei denen
eine Inhibition durch andere geeignete Maßnahmen ausgeschlossen werden kann
(ANON. 2005b). Neben den Hinweisen zur Ermittlung von Spezifität, Präzision,
Detektions- und Quantifizierungsgrenze, Linearität, Messbereich und Robustheit
werden in den Richtlinien auch Empfehlungen zur Durchführung einer Validierung
abgegeben. Darüber hinaus werden die Überprüfung der Wiederfindungsrate sowie
der Messunsicherheit erwartet (ANON. 1998a, ANON. 1998b, ANON. 2004a,
WELLMITZ u. GLUSCHKE 2004). Für bioanalytische Verfahren sind Grenzwerte,
innerhalb derer ein Parameter als valide gilt, kaum beschrieben. Der Parameter
Präzision soll eine relative Standardabweichung von maximal 15 % für Werte
oberhalb des unteren Quantifizierungslimits nicht überschreiten (ANON. 2001). An
anderer Stelle wird für den gleichen Parameter ein Grenzwert von 20 % empfohlen.
Eine Abweichung der Messwerte von >30 % der relativen Standardabweichung wird
dann erst als erhöht betrachtet (ANON. 2004a).
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3 Material und Methoden
Material und Methoden
Die vorliegende Untersuchung wurde mit dem Ziel durchgeführt, eine real-time PCR
zum Nachweis spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis zu etablieren. Die
Methode soll darüber hinaus die Möglichkeit bieten, die Erregermenge im
Probenmaterial zu quantifizieren. Im Gegensatz zu konventionellen PCR-Verfahren,
die auf einer Analyse der PCR-Produkte mittels Gelelektrophorese basieren und sich
nur sehr bedingt für eine Quantifizierung eignen, werden mittels real-time PCR
präzise Messwerte einer metrischen Skala ermittelt. Anhand des Messwertes kann
unter Verwendung von Standards die Menge eines Genomfragments in der
ursprünglichen Probe berechnet werden. Neben diesem Vorteil gegenüber
konventionellen PCR-Verfahren zeichnen sich real-time PCR-Verfahren durch eine
höhere Sensitivität aus, weil das Messsignal nicht vom menschlichen Auge, sondern
von einem optischen Sensor erfasst wird.
Im zweiten Abschnitt wurde das etablierte Testsystem einer kritischen Validierung
unter Berücksichtigung nationaler und internationaler Guidelines unterzogen. Die
Notwendigkeit einer intensiven und strukturierten Validierung ergibt sich aus den
zunehmenden Forderungen nach Maßnahmen zur Qualitätssicherung in der
Veterinärdiagnostik. Diese Maßnahmen müssen im Besonderen von akkreditierten
Untersuchungseinrichtungen erfüllt werden.
Die möglichen Einflüsse der Probenlagerung und der Probenvorbereitung auf einen
quantitativen Nachweis spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis in
Kotproben von Schweinen wurden im dritten Abschnitt der vorliegenden
Untersuchung überprüft.
46

3.1 Guidelines
Material und Methoden
Die Validierung der real-time PCR wurde in Anlehnung an die Richtlinien der
European Agency for the Evaluation of Medicinal Products (EMEA), des Office
International des Épizooties (OIE) und der Qualitätssicherungsstelle im Bund/Länder-
Messprogramm Nord- und Ostsee (BLMP) (s. Kapitel 2.8) durchgeführt. Da in den
Richtlinien die Beschreibung unterschiedlicher Güteparameter verlangt wird, diese
aber nicht alle in einer einzigen zusammengefasst sind, wurden die Anforderungen
aus den Richtlinien kombiniert, um so eine möglichst umfassende Validierung zu
erreichen. Im Rahmen der vorliegenden Untersuchung wurden folgende Parameter
bestimmt (Tabelle (Tab.) 1):
Tabelle 1: Definition verschiedener Güteparameter quantitativer Testverfahren
Testparameter Definition
Spezifität 1
(specificity)
Präzision 1
(precision)
Nachweisgrenze 1
(detection limit)
Spezifität ist die Fähigkeit des Testes, den Analyten auch in
Anwesenheit anderer Komponenten in der Probe eindeutig
zu identifizieren.
Die Präzision ist der Grad der Streuung innerhalb von
Messwiederholungen aus einer homogenen Probe
angegeben als Standardabweichung.
Wiederholpräzision
(repeatability)
Vergleichspräzision
(intermediate
precision)
47
Die Wiederholpräzision ist die
Präzision unter identischen
Testbedingungen.
Die Vergleichspräzision drückt die
Präzision des Testes unter
verschiedenen Bedingungen aus.
Die Nachweisgrenze ist die kleinste Menge des Analyten,
die detektiert, aber nicht unbedingt quantifiziert werden
kann.

Testparameter Definition
Bestimmungsgrenze 1
(quantitation limit)
Material und Methoden
Die Bestimmungsgrenze gibt die kleinste Menge des
Analyten an, die mit ausreichender Präzision quantifiziert
werden kann.
Linearität 1 (linearity) Die Linearität ist die Fähigkeit eines Testes innerhalb des
Kalibrationsbereich 1
(range)
Robustheit 1
(robustness)
Wiederfindungsrate 2
(recovery)
Messunsicherheit 2
(uncertainty)
Diagnostische
Sensitivität 3
(diagnostic sensitivity)
Diagnostische
Spezifität 3
(diagnostic specificity)
1 aus den Richtlinien der EMEA
2 aus den Richtlinien des BLMP
3 aus den Richtlinien des OIE
Kalibrationsbereiches Werte zu liefern, die proportional zur
Menge des Analyten sind.
Der Kalibrationsbereich umfasst das Intervall zwischen
höchster und niedrigster Menge des Analyten, in dem der
Test ein geeignetes Maß an Präzision und Linearität
aufweist.
Die Robustheit ist ein Maß für die Sicherheit eines Testes
bei bewussten Veränderungen der Methodenparameter und
im Rahmen der routinemäßigen Anwendung.
Die Wiederfindung gibt die Ausbeute der gesamten Methode
an. Dabei wird das Verhältnis zwischen dem gemessenen
Wert und einem Referenzwert bestimmt.
Die Messunsicherheit ist das Vertrauensintervall, das die
Streuung jener Werte kennzeichnet, die einer Messgröße
zugeordnet werden können.
Die diagnostische Sensitivität gibt den Anteil der durch den
Test positiv befundeten Proben von den tatsächlich
positiven Proben an.
Die diagnostische Spezifität gibt den Anteil der durch den
Test negativ befundeten Proben von den tatsächlich
negativen Proben an.
48

3.2 Etablierung und Validierung
3.2.1 Primer- und Sondendesign
Material und Methoden
Die Primer und die Sonde wurden unter Anwendung der Software Primer Express ®
3.0 (Applied Biosystems, Forster City, CA 94404 USA, 2004) und der Vorgabe
spezifischer Kriterien (Tab. 2) designd. Die notwendigen Informationen zur
Genomsequenz von L. intracellularis wurden der NCBI GenBank
(http://www.pubmed.de/da ta/nlm.link.html) entnommen. Diverse Gensequenzen, die
potentiell als Zielgen in Betracht kamen, wurden in Primer Express ® 3.0 analysiert
und die Software hat, wenn möglich, zu diesen Sequenzen verschiedene Primer und
Sonden designd. Ihre Eignung für die real-time PCR wurden dann anhand ihrer
Schmelztemperatur und ihrer penalty pionts beurteilt.
Nach Überprüfung von 199 Genen wurde eine Kombination von Primern und Sonde
ausgewählt, mit deren Verwendung die höchste Effizienz und Spezifität während der
Amplifikation einer Sequenz aus einem Gen zu erwarten war (Abb. 1).
Die Sequenzen (Tab. 3 und 4) wurden nochmals mit veröffentlichten Sequenzen der
Gendatenbanken verglichen (BLAST, http://www.ncbi.nlm.gov/blast/), um mögliche
unspezifische Reaktionen durch komplementäre Sequenzen im Genom anderer
Organismen auszuschließen zu können. Die Synthese der Primer (Tab. 3) und der
Sonde (Tab. 4) erfolgte in einem externen Labor (Metabion international AG, 82152
Martinsried, Deutschland).
Mit dem Ziel plasmidale Standards für die real-time PCR herzustellen, sollte ein etwa
500 bp großes Fragment aus dem Zielgen, dass die eigentliche Zielsequenz der real-
time PCR einschließt, amplifziert und das PCR-Produkt anschließend kloniert werden.
Dazu wurde zunächst ein forward- und ein reverse-Primer (Tab. 5) in der Software
FastPCR (http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/fastpcr.htm; Institut für
Biotechnologie, Universität Helsinki, Schweden) designd und anschließend
synthetisiert (Metabion international AG). Die Primer Ubi-Clon-lang-F und –R
schließen neben der Zielsequenz 450 weitere Basenpaare ein, sodass an der
Hybridisierungsstelle der Primer Ubi-F und -R im Plasmid in etwa die gleichen
stöchometrischen Verhältnisse vorliegen, wie im isolierten Genom von L.
intracellularis.
49

Material und Methoden
Tabelle 2: Default settings für TaqMan-Sonden in Primer Express ® 3.0
Parameter Value Parameter Value
Primer Tm
Min Primer Tm
Max Primer Tm
Max Difference in Tm of Two
Primers
Primer GC Content
Min Primer %GC Content
Max Primer %GC Content
Max Primer 3' GC's
Primer 3' End Length
Primer 3' GC Clamp Residues
Primer Length
Min Primer Length
Max Primer Length
Optimal Primer Length
Primer Composition
Max Primer G Repeats
Max Num Ambig Residues in
Primer
Primer Secondary Structure
Max Primer Consec Base Pair
Max Primer Total Base Pair
Primer Site Uniqueness
Max % Match in Primer
Max Consec Match in Primer
Max 3' Consec Match in Primer
General
Max Primers / Probes
58
60
2
30
80
2
5
0
9
40
20
3
0
4
8
75
9
7
50
50
Probe Tm
Min Probe Tm
Max Probe Tm
Probe GC Content
Min Probe %GC Content
Max Probe %GC Content
Probe Length
Min Probe Length
Max Probe Length
Probe Composition
Max Probe G Repeats
Max Num Ambig Residues in
Probe
No G at 5' End in Probe
Select Probe with more C's than
G's
Probe Secondary Structure
Max Probe Consec Base Pair
Max Probe Total Base Pair
Amplicon
Min Amplified Region Tm
Max Amplified Region Tm
Min Amplified Region Length
Max Amplified Region Length
68
70
30
80
13
30
3
0
true
true
4
8
0
85
50
150

Material und Methoden
51
…………………
TGGATTGCATTGGTGGAAAAAAGTATATTCCTAATTAATACTTTGTTACTT
GTTAGCTTTTTCTCCAATGTAAAGGTGTACAATACCTGAAGATAAGGGAGT
ATAATAAGCTTGATGAAAGCCTGCTGCACGGATTTCATCAAGTAATTCATC
AGGATGAGGGAAATCCATAATACTTTGTTTTAAATAGAGATATGCTGAAGG
GTCACTCGAGAGTTTGCCAATAAATGGTAATATTTTTGTAAGGTAATAATT
ATATAATCCCATCCAAATACGTTGTTTTCCTGTTCCAAATTCAAGTATAGC
CATGCGTCCTCCAGGGAGTAGGACTCTCGCAATTTCAGAGAAAGCCTTTG
TACGAGGGACAATATTACGGATACCAAAGGCTAATGTTACTCCATCTATA
CAAGAATCAGGAAACGGTAAAAGTTTTGCGTCTGCTGTTATTGGCCATAC
TCTTGTAATATTAGCTCTATGGAGTTTTTTCATTCCTTGATATAGCATAGAA
AAGCAGAGATCTACAGCAGAAATATGAAGTTGCTCATACCGATTGTGTAA
TGCAATAGCCACATCAAGTGTTCCAGCTGCAAGATCAAGGATACGGCCTG
TTTTTCCAGGTTCCATAGCTTCAACAAGACAATGACGCCAATAAATATCTA
GTCCACCACTTAATATTCTATTCATAGGATCATACCATCTTGATATGCGTC
CAAACATAGAATTAATAGATCTATCATGTTGGGTTGTCTCTATATGTGGAT
TCTGAGACATTTTCTTTGT……….
Abbildung 1: Sequenz des Gens Ubi-E, markiert sind die Postitionen für:
Primer Li-Ubi F (rot), Primer Li-Ubi R (gelb), Sonde Li-Ubi-Probe
(grün), Primer Ubi-Clon-lang-F (hellblau) und Primer Ubi-Clon-
lang-R (blau);

Tabelle 3: Primer der real-time PCR
Material und Methoden
Name Sequenz Zielgen
Li-Ubi F 5´-GCTCATACCGATTGTGTAATGCA-3´
Li-Ubi R 5´-GAAAAACAGGCCGTATCCTTGA-3´
Tabelle 4: Sonde der real-time PCR
52
Methylase in der
Ubichinon/
Menachinon-
Biosynthese
(Accession No. AM
180252.1)
Länge
des
Amplikon
75 bp
Name Sequenz Art der Sonde
Li-Ubi-
Probe
5´-FAM-
TAGCCACATCAAGTGTTCCAGCTGCAAG-
TAMRA-3´
Tabelle 5: Primer zur Klonierung
Name Sequenz
Ubi-Clon-lang-F 5´- GATGAAAGCCTGCTGCACGGA -3´
Ubi-Clon-lang-R 5´- GTCTTGTTGAAGCTATGGAACCTG -3´
TaqMan ® -
Sonde
Länge
des
Amplikon
525 bp

3.2.2 Referenzmaterial
Material und Methoden
Der Stamm Lawsonia intracellularis MS B3903 wurde in lyophilisierter Form bezogen
(Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, D-55216 Ingelheim am Rhein). Das
Lyophilisat wurde in 100 ml Wasser für Injektionszwecke (Boehringer Ingelheim
Vetmedica GmbH) aufgelöst. Alle anderen Referenzstämme zur Überprüfung der
Spezifität von Primer und Sonde wurden der Stammsammlung der Außenstelle für
Epidemiologie (Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, D-49456 Bakum)
entnommen (Tab. 6). Die Stämme wurden im Cryobank-System (Mast Diagnostica,
Laboratoriums-Präparate GmbH, D-23858 Reinfeld) konserviert und in einem
Tiefkühlgefrierschrank (Sorvall ® Heraeus, HFU 486 Basic/40212802; Kendro
Laboratory Products GmbH, D-63450 Hanau) bei -70 °C gelagert.
Die kulturelle Anzucht der Stämme von Brachyspira spp. erfolgte auf Columbia
Blutagar (Heipha, Dr. Müller GmbH, D-69209 Eppelheim). Dazu wurden die
beimpften Platten in einem Anaerobiersystem (Anaerobiertopf (AnaeroJar, Art.-Nr.
AG0025A, Oxoid Deutschland GmbH, D-46483 Wesel) und Anaerocult ® A
(1.13829.0001, Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Germany)) für 6 Tage bei 42 °C
bebrütet. Zur Ernte des Bakterienrasens wurde 2 ml Tris-EDTA Puffer
(Zusammensetzung s. Anhang) auf die Blutagarplatte gegeben und eine halbe
Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Bakterien durch leichtes
Abstreichen mit einer Einmalöse (Gammasterile Impfschlinge, 10 µl Schlinge, Best-
Nummer: 86.1562.010; Sarstedt AG & Co., D-51582 Nümbrecht) von der Agarplatte
gelöst und die Flüssigkeit mit einer Pipette (eppendorf Research variable, Eppendorf
AG, D-22331 Hamburg) in ein steriles DNAse- und RNAse-freies Eppendorf Cup 2.0
(Safe-Lock Tubes 2,0 ml, Eppendorf AG) überführt.
Haemophilus spp. und Actinobacillus pleuropneumoniae wurden auf Kochblutagar
(Heipha, Dr. Müller GmbH) aerob für zwei bis vier Tage bei 36 °C bebrütet. Die
Stämme von Clostridium perfringens wurden anaerob (Anaerocult ® A) im
Anaerobiertopf auf Columbia Blutagar für 1 Tag bei 45 °C bebrütet. Alle übrigen
Referenzstämme wurden auf Columbia Blutagar aerob für ein bis drei Tage bei 36 °C
bebrütet.
53

Tabelle 6: Referenzstämme
Bakterienstamm
Actinobacillus pleuropneumoniae
Serotyp 2
Actinobacillus pleuropneumoniae
Serotyp 9
Actinobacillus suis
Arcanobacterium pyogenes
Bordetella bronchiseptica
Brachyspira hyodysenteriae B 78
Brachyspira innocens
Brachyspira intermedia
Brachyspira murdochii
Brachyspira pilosicoli P 43
Clostridium perfringens Typ A *
Clostridium perfringens Typ B CIP
60.61
Clostridium perfringens Typ C *
Clostridium perfringens Typ D CIP
105568
Clostridium perfringens Typ E CIP
106156
Enterococcus faecalis ATCC 29212
Erysipelothrix rhusiopathiae
Escherichia coli ATCC 25922
Escherichia coli O101:K32 (Kalb)
Escherichia coli O108:K-
Escherichia coli O138:K81
Material und Methoden
Escherichia coli O139:K82
Escherichia coli O141:K85ab
Escherichia coli O141:K85ac
Escherichia coli O147:K89
Escherichia coli O149:K91, F4
Escherichia coli O157:K-
Haemophilus parasuis T1
Haemophilus somnus
Klebsiella pneumonia ATCC 13883
Listeria monozytogenes
Pasteurella multocida
Pseudomonas aeroginosa ATCC
27853
Salmonella der Gruppe D1
Salmonella Derby
Salmonella Infantis
Salmonella Typhimurium
Staphylococcus aureus ssp.
aureus ATCC 29213/ DSM 2569
Staphylococcus hyicus
Streptococcus agalactiae
Streptococcus suis Serotyp 1 + 2
*stammen aus der Routinediagnostik
54

Material und Methoden
Es wurde jeweils so viele Bakterienkolonien durch leichtes Abstreichen mit einer
Einmalöse in 2,0 ml Tris-EDTA Puffer aufgenommen, dass die Suspension eine
optische Dichte von 2,0 McFarland aufwies. Von diesen Suspensionen und den
Suspensionen der Stämme von Brachyspira wurde DNA für die weitere
Untersuchung verwendet. Zur Isolierung genomischer DNA von L. intracellularis
wurden 2 ml der Lösung mit dem Referenzstamm in ein Eppendorf Cup 2.0 (EC 2.0)
abgefüllt und für 6 Minuten bei 20000g zentrifugiert (Centrifuge 5424, no.: 0008452,
Eppendorf AG). Vom entstandenen Bakterienpellet wurde die DNA isoliert.
3.2.3 DNA-Isolierung
Die DNA von Referenzstämmen wurde mit dem Extraktionskit NucleoSpin ® Tissue
Kit (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, D-52355 Düren) gemäß Herstellerangaben
durchgeführt. Im letzten Schritt des Protokolls wurden 100 µl BE-Puffer zur Elution
der DNA von der Silicia-Membran eingesetzt. Das Eluat wurde anschließend im
Tiefkühlgefrierschrank bei -70 °C gelagert. Die DNA -Isolierung von L. intracellularis
wurde mit dem DNeasy ® Blood & Tissue Kit (Qiagen GmbH, D-40724 Hilden) nach
Herstellerangaben für die Isolierung von Bakterienstämmen durchgeführt.
Die zur Etablierung und Validierung notwendigen Kotproben L. intracellularis
infizierter und nicht infizierter Schweine wurden solchen Tieren aus dem Enddarm
entnommen, die zur Sektion an die Außenstelle für Epidemiologie eingesandt wurden.
Die Kotproben wurden zum Teil vor Beginn der weiterführenden Untersuchung über
unterschiedlich lange Zeiträume im Gefrierraum (Freon 22 M25/351/Kuba S6BE 71,
Bitzer Kühlmaschinenbau GmbH, D-71065 Sindelfingen) bei -20 °C gelagert. Der
andere Teil der Kotproben wurde direkt nach der Entnahme untersucht. Von jeder
Kotprobe wurden 200 mg mit dem QIAamp ® DNA Stool Mini Kit (Cat. No. 51504, Lot.
No. 130162215, Qiagen GmbH) aufgereinigt. Dabei wurde folgendes Protokoll
verwendet: Die Kotprobe wurde in einem EC 2.0 mit 1,4 ml ASL-Puffer gemischt und
unmittelbar folgend für mindestens eine Minute auf einem Vortex (Carl Stuart Ltd.,
Dublin, Irland) geschüttelt. Die Suspension wurde für fünf Minuten bei 70 °C inkubiert
(Thermomixer comfort, Modell 5355/34430; Eppendorf AG), anschließend kurz auf
dem Vortex geschüttelt und dann für eine Minute bei 20000 g zentrifugiert. Der
flüssige Überstand wurde in ein neues EC 2.0 dekantiert, in das bereits eine
InhibitEx-Tablette vorgelegt worden war. Im Anschluss wurde die Probe so lange auf
55

Material und Methoden
dem Vortex geschüttelt, bis sich die Tablette vollständig aufgelöst hatte. Danach
wurde die Suspension für sechs Minuten bei 20000 g zentrifugiert, der Überstand in
ein Eppendorf Cup 1.5 (Safe-Lock Tubes 1,5 ml, Eppendorf AG) (EC 1.5) dekantiert
und wiederum für sechs Minuten bei 20000 g zentrifugiert. Maximal 200 µl des
Überstandes wurde in ein EC 1.5 pipettiert, in dem bereits 15 µl Proteinase K
vorgelegt worden waren. Es wurden 200 µl AL-Puffer zugegeben und die Probe
unmittelbar für 15 Sekunden auf dem Vortex geschüttelt. Es folgte eine Inkubation für
10 Minuten bei 70 °C. Nach einer kurzen Zentrifugat ion wurden dem Lysat 200 µl
Ethanol (96 %ig) zur DNA-Fällung zugegeben, die Probe sofort geschüttelt und kurz
zentrifugiert. Der gesamte Inhalt aus dem Reaktionsgefäß wurde auf die Säule
dekantiert, die zuvor in ein Sammelröhrchen gesetzt worden war. Die Säule wurde
für eine Minute bei 20000 g zentrifugiert und in ein neues Sammelröhrchen
umgesetzt. Es wurden 500 µl AW1-Puffer zugegeben und die Säule wurde erneut für
eine Minute für 20000 g zentrifugiert. Die Säule wurde wiederum in ein neues
Sammelröhrchen gesetzt, es wurden 500 µl AW2-Puffer hinzugegeben und für drei
Minuten bei 20000 g zentrifugiert. Diesen beiden Waschschritten folgte ein Schritt
der Trockenzentrifugation für eine Minute bei 20000 g. Nach jeder Zentrifugation
wurde am Boden der Säule überprüft, ob sie mit der Flüssigkeit des
Sammelröhrchens in Kontakt gekommen war. Im Fall, dass Flüssigkeit in oder an der
Säule vorhanden war, wurde der jeweilige Zentrifugationsschritt wiederholt. Zur
Elution der DNA wurde die Säule in ein EC 1.5 gestellt und es wurden 200 µl AE-
Puffer, der zuvor auf 70 °C vorgewärmt wurde, auf d ie Membran pipettiert. Nach
einer Inkubation von einer Minute bei Raumtemperatur wurde die Säule für eine
Minute bei 20000 g zentrifugiert und so die DNA aus der Säule eluiert. Zur
Vermeidung von Kontamination und zum Schutz der DNA wurde die gesamte DNA-
Isolierung an einer Lamina flow Werkbank (Euroflow, EF/4EC/pjo6-001120/03104,
Clean Air Techniek bv, 3449JA Woerden) vorgenommen. Die DNA-Extrakte wurden
im Tiefkühlgefrierschrank bei -70 °C gelagert.
Die Bestimmung der diagnostischen Sensitivität und Spezifität erfolgte durch eine
vergleichende Untersuchung an 300 DNA-Extrakten aus der Routinediagnostik des
Labors der Außenstelle für Epidemiologie in Bakum. Die DNA dieser Proben wurde
ebenfalls unter Verwendung des QIAamp ® DNA Stool Mini Kit nach einer
Methodenanweisung des laborinternen Handbuchs für Qualitätmanagement isoliert.
56

Material und Methoden
Die Proben wurden anschließend mittels multiplex-PCR (NATHUES 2007) auf
spezifische Genomfragmente von L. intracellularis untersucht. Alle DNA-Extrakte
wurden nach der Untersuchung in einem Gefrierraum bei -20 °C gelagert.
3.2.4 PCR-Systeme und Ergebnisauswertung
Für die Untersuchungen standen zwei PCR-Systeme zur Verfügung:
1. Ein real-time PCR System (Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System,
Applied Biosystems). Dieses Gerät besitzt oberhalb des Thermoblocks ein Filterrad
mit fünf Farbfiltern und ermöglicht so eine spezifische Detektion von Lichtemissionen
in den Wellenlängen von 520, 550, 580, 610 und 670 nm über eine integrierte
charge-coupled-device technology (CCD)-Kamera. Das System wurde mittels der
Sequence Detection Software Version 1.4, 7500 System SDS Software (Applied
Biosystems) von einem externen Computer gesteuert. Die Software ist gemäß den
Forderungen der US Food and Drug Administration nach Title 21 CFR Part 11
zertifiziert. Vor Beginn der Untersuchungen und während der Studie wurden am
System verschiedene Maßnahmen zur Qualitätssicherung durchgeführt. Diese
beinhalteten die Kalibration der regions of interest (ROI) und des backgrounds. Die
ROI Kalibration hat zum Ziel, die Positionen der wells auf dem Thermoblock mit dem
optischen Sensor exakt zu orten. In dem System muss zur Messung der Fluoreszenz
während einer PCR die Position der Probe und der Abstand zwischen Probe und
Sensor gerätespezifisch festgestellt werden. Diese Kalibration wurde alle sechs
Monate durchgeführt. Die background-Kalibration dient der Erkennung und
Quantifizierung einer möglichen Hintergrundfluoreszenz im real-time PCR Gerät.
Diese Hintergrundfluoreszenz kann durch Kontamination, Verschmutzung und/oder
die verwendete Plastikware entstehen. Einmal ermittelte Werte für die
Hintergrundfluoreszenz werden für jedes well des Thermoblocks während einer PCR
von der gemessenen Fluoreszenz abgezogen. Diese Kalibration wurde monatlich
durchgeführt.
2. Ein Thermocycler mit Gradientenfunktion (Mastercycler ® EP gradient S, Eppendorf
AG). In diesem System wird ein 96 well block von drei einzelnd gesteuerten
Pelltierelementen temperiert, sodass während der PCR mit einem
57

Material und Methoden
Temperaturgradienten in einem oder mehreren Schritten der Reaktion gearbeitet
werden kann. Die minimale Spreizung von einem zum nächsten well beträgt 0,1 °C
bei einer Temperaturspanne von 30 °C bis 99 °C. Vor Beginn der Untersuchung
wurde eine Validierung des Systems durchgeführt. Dazu wurde die Richtigkeit der
Temperatur des Thermoblocks durch Temperaturmessungen an einem externen
Messgerät überprüft (Validierungssystem für MC/ MC ep, Eppendorf AG).
Beide PCR-Systeme standen in einem separaten Raum, in dem ausschließlich PCR
und Gelelektrophoresen durchgeführt wurden.
Im Amplifikationsprotokoll wurden die Phasen des annealing und der extension zu
einem step mit einer Temperatur von 60 °C zusammengefasst, da im TaqMan-
System die Sonde während der extension-Phase gebunden bleiben muss. Die real-
time PCR wurde in allen Versuchen, falls nicht anders beschrieben, nach folgendem
Protokoll durchgeführt:
Tabelle 7: Amplifikationsprotokoll der real-time PCR
Zyklen (n) Temperatur (°C) Zeit (s)
1
first denaturation und
hot start
45 annealing und
58
95 600
denaturation 95 15
extension
60 60
Jede konventionelle PCR wurde, falls nicht anders beschrieben, nach folgendem
Amplifikationsprotokoll durchgeführt:
Tabelle 8: Amplifikationsprotokoll der konventionellen PCR
Zyklen (n) Temperatur (°C) Zeit (s)
1 first denaturation 94 120
35
denaturation 94 15
annealing 55,9 – 61,9 60
extension 72 30
1 final extension 72 600

Material und Methoden
Die Auswertung erfolgte entweder durch Betrachtung und Analyse der
Amplifikationskurven (real-time PCR) oder durch eine Gelelektrophorese.
Amplifikationskurven stellen das normierte und baseline-korrigierte
Fluoreszenzsignal in jedem well für jeden Amplifikationszyklus graphisch aufgetragen
gegen die Anzahl der Zyklen dar. Die Stärke des Fluoreszenzsignals ist proportional
zur Menge des PCR-Produkts.
Eine Probe wurde als positiv bewertet, wenn
a) die Amplifikationskurve für die Sonde (FAM) einen Schnittpunkt mit dem
und
threshold aufwies
b) die Fluoreszenzkurve für die passive Referenz (ROX) keinen signifikanten
Anstieg erkennen lies; dieses wäre als ein Hinweis auf Verdunstung
interpretiert worden.
Eine Probe wurde als negativ bewertet, wenn
a) die Amplifikationskurve (FAM) keinen Schnittpunkt mit dem treshold aufwies
und
b) die Amplifikationskurve für die IPC (VIC), sofern verwendet, einen
Schnittpunkt mit dem threshold aufwies.
Für die quantitative Auswertung wurde jede Probe und der Standard im
Dreifachansatz untersucht. In der absoluten Quantifizierung (standard curve) waren
die vom real-time System berechneten Ct-Werte die Grundlage der Auswertung von
Ergebnissen. Die Höhe der baseline wurde von der Software anhand der
Hintergrundfluoreszenz in den Zyklen drei bis 15 berechnet und der threshold
manuell auf 0,1 festgelegt. In der relativen Quantifizierung (ddCt Plate) wurden die
Ergebnisse der Proben in Relation zu einem Standard „S3“ betrachtet. Die Höhe der
baseline wurde auch hier durch das System berechnet und der threshold manuell auf
0,1 festgelegt. Ausreißer, die zu einer erhöhten Standardabweichung in den drei Ct-
Werten einer Probe führten, wurden von der Software nicht in die Berechnungen
einbezogen.
59

Material und Methoden
3.2.5 Optimierung der Primer-Konzentrationen
Die Bestimmung der optimalen Konzentrationen der Primer Li-Ubi-F und Li-Ubi-R,
die zu einer maximal effizienten Amplifikation der Zielsequenz führen, wurden an
PCRs mit unterschiedlichen Konzentrationen von Li-Ubi-F und -R durchgeführt. Die
lyophilisierten Primer wurden zunächst in LiChrosolv ® (Merck KGaA) aufgenommen,
sodass eine Stammlösung mit einer Konzentration von 100 nM für weitere Versuche
zur Verfügung stand. Anschließend wurden Aliquots der Primer hergestellt und bis
zur entsprechenden Endkonzentration (Tab. 9) mit LiChrosolv ® verdünnt. Die
Auswirkung jeder Konzentration auf die Effizienz wurde in drei Wiederholungen
überprüft. Der Master-Mix (25 µl / Probe) enthielt zusätzlich zu den Primern 12,5 µl
ReadyMix Taq PCR Reaction Mix 2x with MgCl2 (P4600-100RXN, 096K6821;
SIGMA-ALDRICH Chemie GmbH, P.O. 1120, 89552 Steinheim, Germany) bzw. 12,5
µl QuantiTect ® SYBR ® Green PCR Master Mix (Qiagen GmbH) und Wasser (RNase-
free water, Lot No. 127133117, Qiagen GmbH) sowie 2,5 µl der template-DNA je
Probe. Der Master-Mix wurde anschließend in eine 96 well plate (ABI PRISM ® 96
Well Optical Reaction Plate, Applied Biosystems) aliquotiert.
Tabelle 9: Primer-Konzentrationen in 25 µl Reaktionsvolumen
Primer Li-Ubi R
(nM)
50
300
900
Primer Li-Ubi F (nM)
50 300 900
50/50
50/300
50/900
60
300/50
300/300
300/900
900/50
900/300
900/900
Die PCR-Produkte der ersten Reaktion wurden mittels Gelelektrophorese analysiert.
Hierzu wurde ein 3 %iges Agarosegel (Midi ABgarose, Cat: AG-030013, Lot No:
H101108; ABgene, Blentheim Road, Epsom, Surrey, KT 19 9AP, UK) mit 1xTAE-
Puffer (Merck KGaA) hergestellt. Die 25 µl PCR-Produkt wurden mit 10 µl
Gelladepuffer (Reddy Run Gel Loading Buffer, Cat.#: AB-0965; ABgene) gemischt
und ein Aliquot von je 10 µl in die Geltaschen pipettiert. Ein DNA-Größenmarker

Material und Methoden
(ReddyRun Superladder – Low 100 bp, ABgene) wurde in die äußeren Geltaschen
pipettiert. Die PCR Produkte wurden bei einer Spannung von 1 Volt pro Zentimeter
Länge des Agarosegels (Elektrophoresegerät Biometra Power Pack P25; Biometra
GmbH, D-37079 Göttingen) über einen Zeitraum von 60 Minuten elektrophoretisch
getrennt. Anschließend wurde das Gel 30 Minuten lang in einer 0,1 mM
Ethidiumbromidlösung (Ethidiumbromid 1 %, Merck KGaA) gefärbt und abschließend
in einem Transilluminator analysiert (Alpha Imager 1220 Multimage Light cabinet
plus, Seikosha VP 1500; Biozym Scientific GmbH, D-31833 Hess. Oldendorf).
Die Ergebnisse der zweiten und dritten Wiederholung wurden mittels Sequence
Detection Software Version 1.4 analysiert. Den Proben wurde bereits vor der
Reaktion ein interkalierender Farbstoff zugesetzt (Tab. 10, 11 und 12), sodass die
Amplifikation real-time festgestellt werden konnte.
Tabelle 10: Protokoll der PCR (I) zur Optimierung der Primer-Konzentration
DNA-template: Lawsonia intracellularis MS B3903
Aufgereinigt mit: DNeasy ® Blood & Tissue Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl ReadyMix Taq PCR Reaction Mix 2x
x µl Primer Li-Ubi F
x µl Primer Li-Ubi-R
Wasser ad 22,5 µl Reaktionsvolumen
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: first denaturation: 300 statt 600 Sekunden
Ergebnisauswertung: Gelelektrophorese
(3 %ige Midi-Agarosegel, Laufzeit: 1 h)
61

Material und Methoden
Tabelle 11: Protokoll der PCR (II) zur Optimierung der Primer-Konzentration
DNA-template: Lawsonia intracellularis MS B3903
Aufgereinigt mit: DNeasy ® Blood & Tissue Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl QuantiTect ® SYBR ® Green PCR Master Mix 2x
x µl Primer Li-Ubi F
x µl Primer Li-Ubi-R
Wasser ad 22,5 µl Reaktionsvolumen
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: first denaturation: 900 statt 600 Sekunden
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für SYBR ® Green,
Schmelzkurvenanalyse
Tabelle 12: Protokoll der PCR (III) zur Optimierung der Primer-Konzentration
DNA-template: Lawsonia intracellularis MS B3903
Aufgereinigt mit: DNeasy ® Blood & Tissue Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl 12,5 µl QuantiTect ® SYBR ® Green PCR Master
Mix 2x
x µl Primer Li-Ubi F
x µl Primer Li-Ubi-R
Wasser ad 22,5 µl Reaktionsvolumen
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: first denaturation: 900 statt 600 Sekunden
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für SYBR ® Green
62

Material und Methoden
3.2.6 Überprüfung der analytischen Spezifität der Primer
Die analytische Spezifität der Primer Li-Ubi-F und Li-Ubi–R wurde mittels PCR an
template-DNA verschiedener Referenzstämme solcher Erreger überprüft, die in
großer Menge beim Schwein vorkommen können. Die Primer sollen ausschließlich
ein spezifisches Genomfragment von L. intracellularis amplifizieren und mit keiner
anderen DNA ein PCR-Produkt bilden. Die isolierte DNA der Referenzstämme wurde
wiederholt in PCRs verwendet und die Ergebnisse mittels dem SYBR ® Green-
System visualisiert (Tab. 13 und 14). Der Reaktionsmix setzte sich aus 12,5 µl Power
SYBR ® Green PCR Master Mix (P/N: 4367659, L/N: 0704057; Applied Biosystems),
Wasser, den Primern und 2,5 µl template-DNA zusammen. Die real–time PCR wurde
qualitativ und in der absoluten Quantifizierung ausgewertet.
Tabelle 13: Protokoll der PCR (I) zur Überprüfung der analytischen Spezifität der
Primer
DNA-template: Lawsonia intracellularis MS B3903
Referenzstämme
Aufgereinigt mit: DNeasy ® Blood & Tissue Kit
Reaktionsmix:
NucleoSpin ® Tissue Kit
12,5 µl Power SYBR ® Green PCR Master Mix 2x
2,25 µl Primer Li-Ubi F (10 pmol/ µl)
2,25 µl Primer Li-Ubi-R (10 pmol/ µl)
5,5 µl Wasser
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: keine
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für SYBR ® Green
63

Material und Methoden
Tabelle 14: Protokoll der PCR (II+III) zur Überprüfung der analytischen Spezifität
der Primer
DNA-template: Lawsonia intracellularis MS B3903
Referenzstämme
Aufgereinigt mit: DNeasy ® Blood & Tissue Kit
Reaktionsmix:
NucleoSpin ® Tissue Kit
12,5 µl Power SYBR ® Green PCR Master Mix 2x
2,25 µl Primer Li-Ubi F (10 pmol/ µl)
2,25 µl Primer Li-Ubi-R (10 pmol/ µl)
5,5 µl Wasser
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: Zyklen: 40 statt 45
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für SYBR ® Green
64

Material und Methoden
3.2.7 Optimierung der Sonden-Konzentration
Mit dem Ziel, eine möglichst hohe Amplitude der Amplifikationskurve zu erreichen,
wurde die Sonde in unterschiedlichen Konzentrationen im Reaktionsmix eingesetzt.
Um die optimale Konzentration zu bestimmen wurde die lyophilisierte Sonde in Tris-
EDTA Puffer aufgenommen, so dass eine 100 µM Stocklösung entstand. Die
Effektivität der PCR und Höhe der Amplitude wurde für Konzentrationen der Sonde
von 50 nM, 100 nM und 200 nM in der Reaktion überprüft (Tab. 15). Dazu wurde die
Stammlösung der Sonde in Tris-EDTA Puffer zu einer Arbeitslösung verdünnt, mit
der im Reaktionsmix die jeweilige Endkonzentration einzustellen war. Der
Reaktionsmix enthielt darüber hinaus 12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix
(Part Number: 4304437, Roche Molecular Systems, Branchburg, New Jersey, USA).
Die PCR wurde im real-time Cycler in der absoluten Quantifizierung durchgeführt.
Der Versuch wurde zwei Mal wiederholt.
Tabelle 15: Protokoll der PCR zur Überprüfung der optimalen Konzentration der
Sonde
DNA-template: Lawsonia intracellularis MS B3903
Aufgereinigt mit: DNeasy ® Blood & Tissue Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
2,5 µl Primer Li-Ubi F (5 pmol/ µl)
2,5 µl Primer Li-Ubi-R (5 pmol/ µl)
2,5 µl Wasser
2,5 µl Li-Ubi-Probe (0,5 resp. 1 resp. 2 pmol/ µl)
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: Zyklen: 40 statt 45
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
65

Material und Methoden
3.2.8 Überprüfung der analytischen Spezifität der Sonde
Die Sonde Li-Ubi-Probe soll spezifisch an das PCR-Produkt resp. die Zielsequenz
von L. intracellularis binden und dadurch ein spezifisches Signal erzeugen. Es soll
ausgeschlossen werden, dass die Sonde auch an DNA anderer Erreger in
Probenmaterial vom Schwein hybridisiert. Die Spezifität wurde an DNA der
Referenzstämme und von Lawsonia intracellularis MS B3903 in drei Wiederholungen
mittels real-time PCR getestet (Tab. 16).
Tabelle 16: Protokoll der PCR zur Überprüfung Spezifität der Sonde
DNA-template: Lawsonia intracellularis MS B3903
Referenzstämme
Aufgereinigt mit: DNeasy ® Blood & Tissue Kit
Reaktionsmix:
NucleoSpin ® Tissue Kit
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
2,5 µl Primer Li-Ubi F (5 pmol/ µl)
2,5 µl Primer Li-Ubi-R (5 pmol/ µl)
2,5 µl Wasser
2,5 µl Li-Ubi-Probe (2 pmol/ µl)
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: Zyklen: 40 statt 45
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
66

3.2.9 real-time PCR
Material und Methoden
Die real-time PCR wurde in einem Reaktionsvolumen von 25 µl durchgeführt. Nach
Prüfung der analytischen Spezifität und nach Evaluierung der optimalen
Konzentrationen von Primer und Sonde wurde der Reaktionsmix für die
anschließenden Versuche zunächst immer gleich zusammengestellt (Tab. 17).
Tabelle 17: Optimiertes Protokoll der real-time PCR
Reaktionsmix:
Gesamtvolumen:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR
Master Mix 2x
2,5 µl Primer Li-Ubi-F (5 pmol/ µl)
2,5 µl Primer Li-Ubi-R (5 pmol/ µl)
2,5 µl Li-Ubi-Probe (2 pmol/ µl)
2,5 µl Wasser (RNase-free water)
2,5 µl template-DNA
25 µl
67
Primer- Mix
Die Primer Li-Ubi-F und -R, die Sonde Li-Ubi-Probe und Wasser (LiChrosolv ® )
wurden zu einer Arbeitslösung „Primer-Mix“ zusammengestellt und in DNA LoBind
Tubes 1,5 ml (Order no.: 0300108175; Eppendorf AG) zu 500 µl aliquotiert. Auf diese
Weise wird eine gleichbleibende Zusammensetzung des „Primer-Mix“ in
unterschiedlichen PCR-Versuchen gewährleistet. Die Reagentien für die PCR
wurden bei -20 °C in einem eigens für die real-time PCR vorgesehenen
Gefrierschrank (Liebherr Premium Gefriergerät, Liebherr GN 1856-20D001, Liebherr-
International Deuschland GmbH, D-88400 Biberach an der Riss) gelagert. Der
TaqMan ® universal PCR Master Mix wurde in LoBind Tubes 1,5 ml zu 500 µl
aliquotiert und im Kühlschrank (Profiline FKS 2600/200051; Liebherr-International
Deuschland GmbH) bei +6 °C gelagert.

Material und Methoden
Der Reaktionsmix wurde unter einer DNA-Workstation (L020-GC, DNA/RNA UV-
Cleaner UVC/FM-AR; G. Kisker GbR, D-48543 Steinfurt) mit eigens für diesen Zweck
vorgesehenen und halbjährlich kalibrierten Pipetten in DNAse- und RNAse-freien,
sterilen EC 1.5 hergestellt. Danach wurden 22,5 µl Master-Mix in die Vertiefungen
einer 96 well plate pipettiert, die in einem rack (MicroAmp Splash Free 96-Well
Base, Part No.: 4312063; Applied Biosystems) positioniert war. Nach Zugabe von 2,5
µl template-DNA wurde die 96 well plate mit einer Folie (MicroAmp Optical
Adhesive Film, Lot 2006 11298, Applied Biosystems) unter Verwendung eines
Applikators (Adhesive Seal Applicator, Part No.: 436 5988, Applied Biosystems)
verschlossen. Es folgte eine Zentrifugation (Centrifuge 5810R, 5811 no:0035525;
Eppendorf AG) für eine Minute bei 1000 g um mögliche Luftblasen, die eine optische
Messung in der real-time PCR verfälschen, aus dem Reaktionsmix zu entfernen.
Alle Materialien (Plastikware, Reagenzien, etc.), die in der real-time PCR verwendet
wurden, waren für die PCR lizenziert und als DNA/RNA- resp. DNase/RNase-frei
zertifiziert. Reagenzien mit Volumina ≤10 µl wurden mit speziellen Filterspitzen (ep
Dualfilter T.I.P.S. 0,1 – 10 µl S, Eppendorf AG) pipettiert. Hautkontakt mit der
Plastikware (Plate, Folie, etc.) wurde durch das Tragen von Einmalhandschuhen
(Nobaglove ® - Latex, NOBA Verbandmittel Danz GmbH und Co KG, D-58300 Wetter)
unterbunden, da auch Spuren von Feuchtigkeit und Fetten der Haut mit der
optischen Messung in der real-time PCR interferieren.
Um mögliche Inhibitionen der Amplifikation von Zielsequenzen erkennen zu können,
wurde in den Reaktionsmix eine interne Amplifikationskontrolle integriert (s. Kap.
3.2.14). Mit Verwendung dieser internen Positivkontrolle (IPC) (TaqMan ® Exogenous
Internal Positive Controll Reagents (VIC Probe), Part No. 4308323, Applied
Biosystems) wurde die Zusammensetzung der Reaktionsmix für alle folgenden
Versuche wie folgt verändert:
68

Material und Methoden
Tabelle 18: Reaktionsmix der real-time PCR inklusive IPC
Reaktionsmix:
Gesamtvolumen:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
9 µl Primer- Mix
0,8 µl Exo IPC Mix 10x
0,2 µl Exo IPC DNA 50x
2,5 µl template-DNA
25 µl
In jeder PCR wurde auch eine negative template control (NTC) untersucht. Die NTC
beinhaltete den Reaktionsmix und 2,5 µl Wasser anstatt einer template-DNA. In der
Positivkontrolle wurde zunächst template-DNA des Referenzstamms (Lawsonia
intracellularis MS B3903) verwendet. Später wurde diese Art einer
„einfachen“ Positivkontrolle, die nur eine korrekte Amplifikation erkennen lässt, durch
eine positive Extraktionskontrolle ersetzt. Sie wurde aus Kot von Schweinen
hergestellt, in dem spezifische Genomfragmente von L. intracellularis mittels PCR
nicht nachweisbar waren. Diesen Proben wurde dann eine geringe Menge
plasmidaler DNA zugesetzt, die erstens die Zielsequenz der real-time PCR beinhaltet
und zweitens nur gerade über dem unteren Detektionslimit ein positives Signal
erzeugt. Die negative Extraktionskontrolle bestand aus Kot von Schweinen, in dem
wiederholt keine spezifischen Genomfragmente von L. intracellularis nachgewiesen
werden konnten. Diese Kontrollen wurden in EC 2.0 aliquotiert und bis zur
Bearbeitung resp. Untersuchung im Gefrierraum bei -20 °C gelagert. In jedem
Versuch wurde die positive Kontrolle im Anschluss an die eigentlichen Proben und
die negative Kontrolle an letzter Stelle behandelt resp. untersucht.
69

3.2.10 Sequenzierung
Material und Methoden
Die Spezifität der PCR-Produkte, die durch Amplifikation von DNA mit den Primern
Li-Ubi-F und Li-Ubi-R entstanden sind, wurde durch Sequenzierungen überprüft.
Dazu wurden 10 L. intracellularis-positive Kotproben nach dem einfachen
Zufallsverfahren aus solchen Proben ausgewählt, die zur Routinediagnostik an das
Labor der Außenstelle für Epidemiologie gesendet wurden. Die Proben waren in
einem Gefrierraum bei -20 °C asserviert und zuvor b ereits mittels multiplex-PCR
(NATHUES 2007) zum Nachweis spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis
charakterisiert worden. Der korrekte Nachweis spezifischer Genomfragmente von L.
intracellularis wurde zunächst mit der real-time PCR im Einfachansatz überprüft (Tab.
19). Im Anschluss wurde die DNA aller 10 Proben erneut, jedoch ohne Sonde
amplifiziert (Tab. 20). Die PCR-Produkte wurden mit dem QIAquick ® PCR Purification
Kit (Cat. No. 28104, Lot No. 127143513, Qiagen GmbH) aufgereinigt und die Menge
von DNA spektralphotometrisch (Spektralphotometer LS 500, Dr. Lange GmbH, D-
80687 München) bestimmt. Die Sequenzen wurden nach einem single read mit der
Methode nach Sanger (SANGER et al. 1992) und dem Primer Li-Ubi-F durch die
Firma Qiagen GmbH (Qiagen Genomic Services) analysiert und elektronisch
übermittelt. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit Hilfe der Software Chromas
Version 2.31 (Technelysium Pty Ltd). Alle Sequenzen wurden im BLAST 2
SEQUENCES (http://blast.ncbi.nim.nih.gov/bl2seq/wblast2.cgi) auf ihre
Übereinstimmung mit der Sequenz des Genoms von L. intracellularis überprüft.
70

Material und Methoden
Tabelle 19: Protokoll der PCR zur Verifikation von Proben natürlich infizierter
Schweine vor der Sequenzierung
DNA-template: Proben natürlich infizierter Schweine
Aufgereinigt mit: QIAamp ® DNA Stool Mini Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
10 µl Primer- Mix
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: Zyklen: 40 statt 45
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
Tabelle 20: Protokoll der PCR an DNA aus Proben natürlich infizierter Schweine zur
Herstellung von PCR-Produkten für die Sequenzierung
DNA-template: Proben natürlich infizierter Schweine
Aufgereinigt mit: QIAamp ® DNA Stool Mini Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
2,5 µl Primer Li-Ubi F (5 pmol/ µl)
2,5 µl Primer Li-Ubi-R (5 pmol/ µl)
5 µl Wasser
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: Zyklen: 40 statt 45
Ergebnisauswertung: Spektralphotometrische Bestimmung des DNA-
Gehaltes
71

3.2.11 Klonierung
Material und Methoden
Mit dem Ziel, einen Standard für die absolute Quantifizierung herzustellen, wurde ein
Abschnitt des Zielgens, in dem auch die Zielsequenz der real-time PCR kodiert ist, in
einen Vektor ligiert. Mit diesem Vektor wurden kompetente E. coli transformiert und
anschließend in Kulturmedium vermehrt. Die Plasmide mit der Zielsequenz wurden
isoliert und als Standards verwendet. Plasmid-DNA eignet sich für diese Applikation
besonders gut, weil sie eine hohe Stabilität besitzt und reproduzierbare Ergebnisse
erzeugt.
Die DNA des Referenzstammes Lawsonia intracellularis MS B3930 und drei L.
intracellularis-positiver Kotproben aus der Routinediagnostik wurden aufgereinigt
(DNeasy ® Blood & Tissue Kit und QIAamp ® DNA Stool Mini Kit) und spezifische
Genomfragmente von L. intracellularis mit den Primern Ubi-Clon-lang-F und –R
amplifiziert. Diese Primer kopieren einen größeren Genomabschnitt von L.
intracellularis, der die eigentliche Zielsequenz der real-time PCR beinhaltet. Zur
Überprüfung der optimalen annealing-Temperatur der Primer Ubi-Clon-lang-F und –
R wurde zunächst eine Gradienten-PCR auf dem Thermocycler durchgeführt (Tab.
21). Anschließend wurde die DNA aller vier Proben mit einem Protokoll amplifziert,
dass eine annealing-Temperatur von 61,6 °C enthielt (Tab. 22).
72

Material und Methoden
Tabelle 21: Protokoll der Gradienten-PCR
DNA-template: Lawsonia intracellularis MS B3903
Proben natrülich infizierter Schweine
Aufgereinigt mit: DNeasy ® Blood & Tissue Kit
Reaktionsmix:
QIAamp ® DNA Stool Mini Kit
12,5 µl ReadyMix Taq PCR Reaction Mix 2x
2,5 µl Primer Ubi-Clon-lang-F (5 pmol/ µl)
2,5 µl Primer Ubi-Clon-lang-R (5 pmol/ µl)
5 µl Wasser
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: Thermocycler
PCR-Protokoll: s. Tabelle 8
Modifikationen: keine
Ergebnisauswertung: Gelelektrophorese (4 %iges Multi-Agarose-Gel,
Laufzeit 1,5 h); DNA-Leiter
Tabelle 22: Protokoll der PCR zur Herstellung von PCR-Produkt zum Klonieren
DNA-template:
Aufgereinigt mit:
Reaktionsmix:
Lawsonia intracellularis MS B3903
Proben natürlich infizierter Schweine
DNeasy ® Blood & Tissue Kit
QIAamp ® DNA Stool Mini Kit
12,5 µl ReadyMix Taq PCR Reaction Mix 2x
2,5 µl Primer Ubi-Clon-lang-F (5 pmol/ µl)
2,5 µl Primer Ubi-Clon-lang-R (5 pmol/ µl)
5 µl Wasser
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: Thermocycler
PCR-Protokoll: s. Tabelle 8
Modifikationen: annealing-Temperatur: 61,6 °C
Ergebnisauswertung: Spektralphotometrische Bestimmung des DNA-
Gehaltes
73

Material und Methoden
Die PCR-Produkte wurden mittels QIAquick ® PCR Purification Kit aufgereinigt und
die DNA-Menge spektralphotometrisch bestimmt. Anschließend wurden die
Oligonukleotide in einen Vektor (TOPO TA Cloning ® Kit, pCR ® 2.1-TOPO ® Vector,
Part no. 45-0641, Lot no. 371947, Invitrogen, Carlsbad, CA 92008 USA) ligiert. In
Abhängigkeit des DNA-Gehalts wurden 2 bzw. 3 µl des eluierten PCR-Produkts, 1 µl
Salt-Solution, 1 µl TOPO-Vektor und Wasser ad 6 µl (alles im TOPO TA Cloning ® Kit,
Invitrogen) verwendet und gemischt.
Weitere Reaktionsschritte:
• fünf Minuten Inkubation bei Raumtemperatur
• fünf Minuten Inkubation auf Eis
• Zugabe von je 2 µl des Reaktionsgemisches auf je eine Einheit One Shot ®
E.coli (TOP 10, Lot: 285067; Invitrogen)
• 30 Minuten Inkubation auf Eis
• Hitzeschock-Behandlung der Zellen für 45 Sekunden bei 42 °C ohne Schütteln
auf einem Thermoblock
• fünf Minuten Inkubation auf Eis
• Zugabe von 250 µl S.O.C.-Medium (Cat. No. 15544034; Invitrogen) zu den
Zellen und eine Stunde Schütteln bei 37 °C auf dem Thermoblock
Nach dem letzten Inkubationsschritt wurden je 50 µl bzw. 200 µl der transformierten
Zellen auf vorgewärmte Luria-Bertani (LB)-Nährboden (imMediaAmp Blue, Cat #
Q602-20, Lot: 1320686; Invitrogen) ausgespatelt und für 14 Stunden bei 37 °C
bebrütet. Von jedem Nährboden wurden dann 10 weiße Kolonien selektiert und in 5
ml Flüssigmedium (imMedia Amp liqiud, Part no. 45-0035, Lot no. 402120;
Invitrogen) überimpft. Dieses Flüssigmedium wurde für 12 Stunden bei 37 °C auf
einem Schüttler im Brutschrank inkubiert.
Der Erfolg der Transformationen wurde anhand der Ergebnisse einer PCR überprüft.
Dazu wurden je 2 ml Medium in einem EC 2.0 für 5 Minuten bei 8000 g zentrifugiert
(Centrifuge 5415 C, 39995, Eppendorf AG). Die plasmidale DNA aus den
Bakterienpellets wurde mit dem QIAprep ® Spin Miniprep Kit (Cat. No. 27104, Lot. No.
127155772; Qiagen GmbH) entsprechend den Herstellerangaben isoliert.
Abschließend erfolgte eine Untersuchung der Proben mittels real-time PCR (Tab. 23).
74

Material und Methoden
Tabelle 23: Protokoll der PCR zur Kontrolle der Transformation
DNA-template: Transformierte E. coli, Plasmide
Aufgereinigt mit: QIAprep ® Spin Miniprep Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
10 µl Primer- Mix
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: Zyklen: 40 statt 45
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
Anhand der Ct-Werte (möglichst gering) und der Trübung der Flüssigmedien
(möglichst stark getrübt) wurde ein Klon für die Herstellung der Standards selektiert.
Von dieser Probe wurde 1 ml des LB-Mediums in 200 ml LB-Flüssigmedium
überführt und über Nacht bei 37 °C auf einem Schütt ler im Brutschrank inkubiert.
Nach 12 Stunden wurde die Plasmid-DNA dieser Bakterienkultur mit dem PureLink
Hipure Plasmid Maxiprep Kit (Lot: 4681, Invitrogen) entsprechend den Vorgaben des
Herstellers isoliert und aufgereinigt.
Das Eluat wurde in ein Falcon ® (BLUE MAX, 352070; Becton Dickinson Labware,
NJ. USA 07417-1886) aufgenommen und bis zur weiteren Verwendung im
Tiefkühlgefrierschrank bei -70 °C tiefgefroren.
Ein Teil der transformierten E. coli wurden kryokonserviert. Dazu wurden je 200 µl
des LB-Mediums mit 1,0 ml Glycerol gemischt und im Tiefkühlgefrierschrank bei
-70 °C eingefroren.
75

Material und Methoden
3.2.12 Verdünnungsreihe und Standard
Die DNA-Konzentration des unter 3.2.11 hergestellten Eluates wurde
spektralphotometrisch bestimmt. Anhand der Größe und des Gewichtes eines
Plasmids konnte die Konzentration der Plasmide im Eluat nach folgenden Formeln
berechnet werden:
Länge des Vektors = 3931 bp
Länge des Inserts = 525 bp
Gewicht eines Plasmides:
5,535 x 10 -22 g/ Base x (Länge des Vektors + Insert) x 2
= 4,933 x 10 -18 g/ Plasmid
Anzahl der Plasmide pro ml:
DNA-Konzentration (g/ ml) / Gewicht pro Plasmid (g)
Mit dem Ziel, die Reinheit der Plasmid-Lösung zu überprüfen und größere Mengen
genomischer DNA von E. coli im Eluat auszuschließen, wurde eine PCR mit den E.
coli-spezifischen Primern MICF (5´-GATATTGCCAAATACCCGACC-3´) und MICR
(5´-CTTCCATACCAGCGGCAT-3´) (Metabion international AG) (NATHUES 2007)
durchgeführt. Diese Primer amplifizieren das ras-Gen von E. coli und wurden in
anderen PCR-Verfahren als interne Positivkontrolle verwendet (Tab. 24). Als positive
template-Kontrolle wurde eine Kotprobe aus der Routinediagnostik verwendet.
76

Material und Methoden
Tabelle 24: Protokoll der PCR zur Amplifikation E. coli-spezifischer DNA-Abschnitte
DNA-template: Transformierte E. coli
Kotprobe
Aufgereinigt mit: PureLink Hipure Plasmid Maxiprep Kit
Reaktionsmix:
QIAamp ® DNA Stool Mini Kit
12,5 µl Multiplex PCR Master-Mix 2x (Qiagen GmbH)
2,5 µl Primer MICF (50 pmol/ µl)
2,5 µl Primer MICR (50 pmol/ µl)
4,5 µl Wasser
3 µl template-DNA
PCR-Gerät: Thermocycler
Reaktionsbedingungen:
Ergebnisauswertung:
Zyklen
30
77
first
denaturation
Temperatur
(°C)
Zeit (s)
95 900
denaturation 94 30
annealing 60 90
extension 72 120
final
extension
72 600
Gelelektrophorese (1,3 %ige Macro-Agarose-Gel;
Laufzeit 2,5 h)
Nach Feststellung der exakten Konzentration von Plasmiden in der Lösung, die der
Konzentration spezifischer Genomäquivalente (GE) der Zielsequenz entspricht,
wurde eine logarithmische Verdünnungsreihe hergestellt. Die Lösungen enthielten
zwischen 10 9 und 0,01 GE / µl. Je 2,5 µl dieser Verdünnungsstufen wurden
anschließend in Triplices mittels real-time PCR einer absoluten Quantifizierung
unterzogen. Der Versuch wurde dreimal wiederholt (Tab. 25).

Material und Methoden
Tabelle 25: Reaktion zur Verdünnungsreihe
DNA-template: Plasmid-DNA
Aufgereinigt mit: PureLink Hipure Plasmid Maxiprep Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
10 µl Primer- Mix
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: keine
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
Der Standard, der zur Validierung in den folgenden real-time PCRs verwendet
werden sollte, wurde nach zwei Kriterien ausgewählt. Zum einen sollte die
Standardabweichung in dieser Konzentrationsstufe niedrig sein und zum zweiten
sollte der Ct-Wert des Standards exakt auf der Standardkurve liegen. Die Erfüllung
dieser Kriterien lassen erwarten, dass der Ct-Wert für jeden Standard nahe seinem
eigenen Mittelwert liegt und die Reaktion eine hohe Reproduzierbarkeit hat. Aus dem
Eluat der Plasmidpräparation wurden insgesamt 50 ml des Standards durch
Verdünnen mit LiChrosolv ® hergestellt, zu 50 µl in EC 1.5 aliquotiert und im
Tiefkühlgefrierschrank bei -70 °C eingefroren.
3.2.13 Quantifizierung
Bezugspunkt für die Quantifizierung spezifischer Genomfragmente von L.
intracellularis in Probenmaterial war der Ct-Wert des Standards. Dieser Wert musste
für eine valide Kalkulation innerhalb der einfachen Standardabweichung aus den
Vorversuchen liegen. Die Differenz zwischen den Ct-Werten der Proben und dem Ct-
Wert des Standards wurden als ∆∆Ct angegeben. Da in jedem Zyklus dieser real-
time PCR die Menge an PCR-Produkt nahezu verdoppelt wird, ist nach 3,3293
(negative slope dieser real-time PCR; für die Berechnungen aufgerundet auf 3,33)
Zyklen eine Verzehnfachung der Zielsequenz zu erwarten. Die Menge von GE in
78

Material und Methoden
einer Probe wurde durch folgende Formel in Microsoft ® Office Excel 2003 SP2
(Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA) berechnet:
10 ∆Ct/3.33 x 10 3
10 3 entspricht der Konzentration des Standards (GE/ µl) in der Reaktion
Zur Quantifizierung wurden für Standard und Probe stets die mittleren Ct-Werte des
Dreifachansatzes verwendet. Eine ähnliche Methode wurde für die Quantifizierung
von GE des humanen Immundefizienz-Virus bereits beschrieben (PFAFFL 2001).
3.2.14 Interne Positivkontrolle
Eine PCR kann durch die Anwesenheit fremder Substanzen im Reaktionsmix (bspw.
Bilirubin, Gallensalze oder komplexe Polysaccharide aus Kot) inhibiert werden. Um
eine mögliche Inhibition in jeder Probe ausschließen zu können, wurde in diesem
Versuch zusätzlich eine interne Positivkontrolle (IPC) im Reaktionsmix (Tab. 18)
verwendet. Die IPC basiert auf einer VIC-probe; außerdem wird den eigentlichen
Proben exogene DNA zugesetzt. Entgegen den Empfehlungen des Herstellers
wurden nicht 1µl der 10X Exo IPC DNA sondern nur 0,2 µl der 10X Exo IPC DNA pro
Reaktionseinheit verwendet. Zur Überprüfung eines möglichen Einflusses auf die
Effizienz der real-time PCR wurde plasmidale DNA von L. intracellularis in den
Konzentrationen 10 7 , 10 3 , 10 0 und 10 -1 GE pro µl ohne und mit IPC im Reaktionsmix
amplifiziert und quantifiziert (Tab. 26). Die Konzentration der IPC wurde so gering
gewählt, dass ihre Amplifikation unter den Versuchsbedingungen gerade noch
detektiert wird, eine mögliche Konkurrenzreaktion mit der eigentlichen Amplifikation
von L. intracellularis aber nahezu ausgeschlossen werden kann. Werden zwei oder
mehr Zielsequenzen gleichzeitig amplifiziert, kann es bspw. durch den Verbrauch
von dNTPs zu einer verminderten Amplifikation einer Zielsequenz kommen
(kompetitive Reaktion 2. Ordnung). Diese Tatsache muss besonders dann
berücksichtigt werden, wenn eine der beiden Zielsequenzen in sehr geringer
Konzentration vorliegt. Da die Konzentration der target-DNA in der Regel nicht
bekannt ist, soll eine mögliche Verfälschung der Ergebnisse sicher ausgeschlossen
werden. Dieser Versuch wurde zweimal wiederholt.
79

Material und Methoden
Tabelle 26: Protokoll der PCR zur Etablierung einer IPC
DNA-template: Plasmid-DNA
Aufgereinigt mit: PureLink Hipure Plasmid Maxiprep Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
9 µl Primer- Mix
0,8 µl Exo IPC Mix 10x
0,2 µl Exo IPC DNA 50x
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: keine
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
Abschließend wurde die analytische Spezifität der Primer sowie der Sonde der IPC
anhand einer Untersuchung der Referenzstämme im Einfachansatz geprüft (Tab. 27).
Die interne Positivkontrolle wurde in allen PCR-Reaktionen der folgenden
Untersuchungen verwendet und ist Bestandteil des validierten Testes.
80

Material und Methoden
Tabelle 27: Protokoll der PCR zur Überprüfung der analytischen Spezifität der IPC
DNA-template: Referenzstämme
Aufgereinigt mit: PureLink Hipure Plasmid Maxiprep Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
9 µl Primer- Mix
0,8 µl Exo IPC Mix 10x
0,2 µl Exo IPC DNA 50x
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: keine
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
3.2.15 Vergleichspräzision
Die Vegleichspräzision eines Tests ist die Präzision bei unterschiedlichen
Bedingungen. Um diese Bedingungen zu variieren, wurden die Untersuchungen zur
Feststellung der Vergleichspräzision von der Autorin und zwei Mitarbeiterinnen des
PCR-Labors der Außenstelle für Epidemiologie durchgeführt. Zunächst wurde 10 5 ,
10 4 , 10 3 , 10 2 , 10 1 und 10 0 GE von L. intracellularis pro µl Reaktionsmix mittels real-
time PCR absolut quantifiziert (Tab. 28). Jede Konzentrationsstufe wurde in drei
Wiederholungen untersucht.
Die Vergleichspräzision wurde auch anhand von Kotproben untersucht. Die
Kotproben wurden von Schweinen entnommen, die zur pathologisch-anatomischen
Untersuchung an die Außenstelle für Epidemiologie eingesendet wurden. Der Kot
wurde mit Einmalhandschuhen aus dem Enddarm entnommen und in
verschließbaren Bechern (Urin-Gefäße mit Schraubverschluss, 100 ml-Becher, Best.
Nummer: 75.563 und 76.564; Sarstedt AG & Co., D-51582 Nümbrecht) aufbewahrt.
Darüber hinaus wurden sieben der Kotproben verwendet, die auch in Teil 3.2 benutzt
wurden. Die Probenaufbereitung und die Vorbereitungen für die real-time PCR
wurden von den Mitarbeiterinnen der Molekularbiologie durchgeführt (Tab. 29).
81

Material und Methoden
Tabelle 28: Protokoll der PCR zur Feststellung der Vergleichspräzision an Plasmid-
DNA
DNA-template: Plasmid-DNA
Aufgereinigt mit: PureLink Hipure Plasmid Maxiprep Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
10 µl Primer- Mix
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: keine
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
Tabelle 29: Protokoll der PCR zur Feststellung der Vergleichspräzision an Proben
natürlich infizierter Schweine
DNA-template: Proben natürlich infizierter Schweine
Aufgereinigt mit: QIAamp ® DNA Stool Mini Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
9 µl Primer- Mix
0,8 µl Exo IPC Mix 10x
0,2 µl Exo IPC DNA 50x
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: keine
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
82

Material und Methoden
3.2.16 Diagnostische Sensitivität und Spezifität
Die diagnostische Sensitivität resp. Spezifität ist der Anteil der vom Test positiv resp.
negativ bewerteten Proben an den tatsächlich positiven resp. negativen Proben. Als
Vergleichsuntersuchung für die real-time PCR wurde wurde eine multiplex-PCR
(NATHUES 2007), die in der Routinediagnostik eingesetzt wird, herangezogen.
Die DNA von Kotproben, die im Rahmen der Routinediagnostik im Labor der
Außenstelle für Epidemiologie mittels multiplex-PCR auf spezifische
Genomfragmente von B. hyodysenteriae, B. pilosicoli und L. intracellularis
(NATHUES 2007) untersucht wurden, sind im Anschluss an die Untersuchung
getrennt nach Untersuchungsergebnis in einem Gefrierraum bei -20 °C
kryokonserviert worden. Aus Material, das zwischen Januar 2006 und August 2007
eingelagert wurde, sind nach dem einfachen Losverfahren 150 L. intracellularis-
positive und 150 L. intracellularis-negative DNA-Extrakte ausgewählt worden. Die
Proben wurden anschließend alternierend sortiert und neu beschriftet. Die
spezifischen GE von L. intracellularis wurden mittels real-time PCR quantifiziert (Tab.
30).
Tabelle 30: Protokoll der PCR zur Feststellung der diagnostischen Sensitivität und
DNA-template:
der diagnostischen Spezifität
Proben natürlich infizierter und nicht infizierter
Schweine
Aufgereinigt mit: QIAamp ® DNA Stool Mini Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
9 µl Primer- Mix
0,8 µl Exo IPC Mix 10x
0,2 µl Exo IPC DNA 50x
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: keine
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
83

3.2.17 Wiederholpräzision
Material und Methoden
Die Wiederholpräzision wurde aus den Ergebnissen zur Ermittlung der
Standardkurve abgeleitet. Darüber hinaus wurden 10 DNA-Extrakte (siehe Kapitel
3.2.16) mittels real-time PCR in drei voneinander unabhängigen Versuchen
wiederholt quantifiziert (Tab. 31).
Tabelle 31: Protokoll der PCR zur Feststellung der Wiederholpräzision
DNA-template:
Proben natürlich infizierter und nicht infizierter
Schweine
Aufgereinigt mit: QIAamp ® DNA Stool Mini Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
9 µl Primer- Mix
0,8 µl Exo IPC Mix 10x
0,2 µl Exo IPC DNA 50x
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: keine
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
3.2.18 Wiederfindungsrate
Die Wiederfindung ist ein Maß für die Ausbeute der gesamten Methode. Dieses Maß
bezieht sich auf die gesamte Methode, die sowohl die Probenaufbereitung als auch
die DNA-Amplifikation selbst beinhaltet. Zur Bestimmung der Wiederfindungsrate ist
von 10 Schweinen, die zur Sektion an die Außenstelle für Epidemiologie eingesendet
wurden, eine Kotprobe aus dem Enddarm entnommen worden. Die DNA aus den
Kotproben wurde isoliert (QIAamp ® DNA Stool Mini Kit) und mittels real-time PCR auf
den Gehalt von GE von L. intracellularis untersucht (Tab. 32). Sieben der 10 Proben
wiesen keinen Gehalt spezifischer Genomfragment von L. intracellularis auf - waren
also negativ - und eigneten sich daher für die weitere Untersuchung.
84

Material und Methoden
Von den Proben wurden je zwei Gramm in zwei verschiedene Probengefäße
gegeben. Die Proben wurden mit 100 µl resp. 1 µl (zuzüglich 99 µl LiChrosolv ® ) einer
Lösung mit dem Referenzstamm Lawsonia intracellularis MS B3903 (siehe Kapitel
3.2.2) vermengt. Die Proben wurden mit einem Kotlöffel (Stuhlröhre; Sarstedt AG &
Co) eine Minute lang manuell homogenisiert und anschließend zu 200 mg Kot in ein
EC 2.0 eingewogen (Analysenwaage AC 120 S-ODI, Sartorius AG, D-37075
Göttingen). Aus drei Teilproben je Tier und Verdünnungsstufe wurde die DNA mit
dem QIAamp ® DNA Stool Mini Kit isoliert. Die DNA-Extrakte wurden bis zur weiteren
Bearbeitung im Tiefkühlgefrierschrank bei -70 °C ge lagert.
Die Menge des Referenzstamms von L. intracellularis in 1 ml der Lösung wurde
mittels real-time PCR quantifiziert (siehe Kapitel 3.2.13; PCR wie in Tab. 34).
Ausgehend von diesem Ergebnis konnte die Konzentration von GE pro ml
Referenzlösung bestimmt werden.
Die Ergebnisse der real-time PCR (Tab. 33) an Kotproben und dem Referenzstamm
wurden in der Software Microsoft Office Excel 2003 erfasst und vergleichend
ausgewertet. Die Wiederfindungsrate entspricht dem Quotienten aus der detektierten
Menge von GE und der zugegebenen Menge von GE in denselben Proben. Die
mittlere Wiederfindungsrate ist der arithmetische Mittelwert aller einzelnen
Quotienten.
Tabelle 32: Protokoll der PCR zur Untersuchung von Kotproben auf den Gehalt von
DNA-template:
Genomäquivalenten von L. intracellularis
Proben von Schweinen mit unbekanntem
Infektionsstatus
Aufgereinigt mit: QIAamp ® DNA Stool Mini Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
9 µl Primer- Mix
0,8 µl Exo IPC Mix 10x
0,2 µl Exo IPC DNA 50x
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: keine
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
85

Material und Methoden
Tabelle 33: Protokoll der PCR zur Feststellung der Wiederfindungsrate spezifischer
Genomäquivalente von L. intracellularis in präparierten Kotproben
DNA-template: Präparierte Proben nicht infizierter Schweine
Aufgereinigt mit: QIAamp ® DNA Stool Mini Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
9 µl Primer- Mix
0,8 µl Exo IPC Mix 10x
0,2 µl Exo IPC DNA 50x
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: keine
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
Tabelle 34: Protokoll der PCR zur Quantifizierung von GE in der Referenzlösung
DNA-template: Lawsonia intracellularis MS B3903
Aufgereinigt mit: DNeasy ® Blood & Tissue Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
9 µl Primer- Mix
0,8 µl Exo IPC Mix 10x
0,2 µl Exo IPC DNA 50x
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: keine
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
86

3.2.19 Robustheit
Material und Methoden
Die Robustheit gibt die Sicherheit des Testes bei bewussten Veränderungen der
Versuchsbedingungen an. Das Maß dieser Veränderungen ist nicht festgelegt. Zur
Prüfung der Robustheit des Testsystems wurden wiederholte Untersuchungen an 10
DNA-Extrakten (siehe Kapitel 3.2.16) durchgeführt. In jeder Untersuchung wurden
die Versuchsbedingungen verändert:
R1: der fertige Reaktionsmix wurde für 12 Stunden lichtgeschützt bei
Raumtemperatur inkubiert.
R2: der fertige Reaktionsmix wurde innerhalb von 12 Stunden lichtgeschützt 10
Mal eingefroren und wieder aufgetaut
R3: der fertige Reaktionsmix wurde für 5 Minuten unter der DNA-Workstation mit
UV-Licht bestrahlt.
R4: die template-DNA wurde mit Pipettenspitzen der Größe L (ep Dualfilter T.I.P.S.
0,1 – 10 µl L; Eppendorf AG) anstatt mit Spitzen der Größe S zum
Reaktionsmix in die Vertiefungen der 96 well plate pipettiert
R5: in die 96 well plate wurde Reaktionsmix und template-DNA pipettiert. Die
Platte wurde mit einer Folie verschlossen und anschließend einer so starken
Erschütterung ausgesetzt, dass die Unterseite der Folie sichtbar mit
Flüssigkeit bedeckt war.
R6: der fertige Reaktionsmix, in dem die template-DNA bereits enthalten war,
wurde für fünf Stunden ohne Lichtschutz bei Raumtemperatur inkubiert.
Der Reaktionsmix für den Standard wurde ohne jede Änderung der sonst üblichen
Versuchsbedingungen hergestellt und erst unmittelbar vor der PCR in die 96 well
plate pipettiert. Alle Platten wurden vor dem Einlegen in das real-time Gerät für eine
Minute bei 1000 g zentrifugiert (Centrifuge 5810R). Die real-time PCR wurde ohne
Modifikationen durchgeführt (Tab. 35).
87

Material und Methoden
Tabelle 35: Protokoll der PCR zur Überprüfung der Robustheit
DNA-template: Proben natürlich infizierter Schweine
Aufgereinigt mit: QIAamp ® DNA Stool Mini Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
9 µl Primer- Mix
0,8 µl Exo IPC Mix 10x
0,2 µl Exo IPC DNA 50x
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: keine
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
88

Material und Methoden
3.3 Prüfung der Homogenisierung von Kotproben zum Nachweis
von L. intracellularis
In festem und halbfestem Probenmatrial wie bspw. Kot kann nicht grundsätzlich von
der homogenen Verteilung eines Erregers in der Probenmatrix ausgegangen werden.
Eine inhomogene Verteilung kann jedoch dazu führen, dass bei mehrfacher
Untersuchung derselben Probe unterschiedliche Ergebnisse erzielt werden. Mit dem
Ziel, die Verteilung von L. intracellularis in Kotproben zu überprüfen, wurden
verschiedene Verfahren der Homogenisierung angewendet.
Die Untersuchung wurde an Kot aus dem Enddarm eines Schweins durchgeführt.
Die Kotprobe wurde zunächst mittels real-time PCR auf den Gehalt von L.
intracellularis untersucht. Die als L. intracellularis negative beurteilte Probe wurde auf
sechs Aliquots zu je 2 Gramm Kot aufgeteilt. Drei Aliquots wurden mit 100 µl einer
Plasmidlösung (2,89 x 10 7 GE, 2,89 x 10 5 GE resp. 5,78 x 10 3 GE pro µl) gemischt.
Die Proben wurden anschließend eine Minute mit dem Kotlöffel einer Stuhlröhre
homogenisiert. Die übrigen drei Aliquots wurden ebenfalls mit je 100 µl einer
Plasmidlösung (2,89 x 10 7 GE, 2,89 x 10 5 GE resp. 5,78 x 10 3 GE pro µl) gemischt,
jedoch wurde zur Verringerung der Viskosität des Probenmaterials zusätzlich 900 µl
Lichrosolv ® zu jeder Probe pipettiert. Auch diese Aliquots wurden mit dem Kotlöffel
einer Stuhlröhre eine Minute homogenisiert.
Aus den sechs Aliquots wurden jeweils dreimal 200 mg in EC 2.0 eingewogen. Die
DNA aus den Proben wurde mit dem QIAamp ® DNA Stool Mini Kit isoliert und
spezifische Genomfragmente anschließend in der real-time PCR quantifiziert (Tab.
36).
89

Material und Methoden
Tabelle 36: Protokoll der PCR zur Überprüfung der Homogenisierung
DNA-template: präparierte Proben nicht infizierter Schweine
Aufgereinigt mit: QIAamp ® DNA Stool Mini Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
9 µl Primer- Mix
0,8 µl Exo IPC Mix 10x
0,2 µl Exo IPC DNA 50x
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: keine
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
90

Material und Methoden
3.4 Einfluss der Lagerung von Kotproben auf den Gehalt von
L. intracellularis
Genomische DNA ist in verschiedenen Probenmatrices unterschiedlich lange
nachweisbar. Grundsäztlich kann die Temperatur und die Dauer der Lagerung einen
Einfluss auf die Menge intakter und damit amplifizierbarer DNA nehmen. Ziel dieser
Untersuchung war es, einen möglichen Einfluss der Temperatur und der Dauer einer
Lagerung von Kotproben auf den Nachweis resp. die Quantifizierung von L.
intracellularis mittels real-time PCR zu überprüfen.
Die Untersuchung wurde an Kotproben natürlich infizierter Schweine aus einem
bereits auf L. intracellularis positiv getesteten Bestand durchgeführt. Von 20
Schweinen wurde rektal unter Verwendung von Einmalhandschuhen Kot entnommen.
Die Proben wurden in Probengefäßen mit Kotlöffeln aus Stuhlröhren homogenisiert.
Für die weitere Untersuchung wurde zunächst mittels real-time PCR festgestellt,
welchen Gehalt spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis die Proben im
„frischen“ Zustand aufweisen (Tab. 37, Tag 0). Von 10 positiven Proben wurden
jeweils 24 Aliquots zu je 200 mg in EC 2.0 eingewogen. Die Aliquots wurden
entweder bei 6 °C im Kühlschrank, bei -20 °C im Gef rierraum oder bei -70 °C im
Tiefkühlgefrierschrank gelagert und zu unterschiedlichen Zeitpunkten untersucht
(Tab. 37 und 38).
91

Material und Methoden
Tabelle 37: Untersuchungsschema zur Überprüfung eines Einflusses der Lagerung
auf den Gehalt von GE von L. intracellularis in der Probe
Tag 0 X
frisch 6°C -20°C -70°C
Tag 1 X X X
Tag 2 X X X
Tag 3 X X X
Tag 7 X X X
Tag 14 X X X
Tag 28 X X X
Tag 56 X X X
Tag 132 X X X
X= Untersuchung der 10 aliquotierten Proben
Tabelle 38: Protokoll der PCR zur Untersuchung eines Einflusses der Lagerung von
Kotproben auf den Gehalt spezifischer GE von L. intracellularis
DNA-template: Proben natürlich infizierter Schweine
Aufgereinigt mit: QIAamp ® DNA Stool Mini Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
9 µl Primer- Mix
0,8 µl Exo IPC Mix 10x
0,2 µl Exo IPC DNA 50x
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: keine
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
92

3.5 Statistik
Material und Methoden
Für die statistische Auswertung erfolgte zunächst ein Export der Daten aus der
Software SDS Version 1.4 als Microsoft Office Excel Comma Seperated Value File.
Die Daten wurden anschließend in Microsoft ® Office Excel 2003 SP2 importiert und
in einem spread sheet organisiert. Die Testergebnisse aus vergleichenden
Untersuchungen wurden mit dem Statistical Analysis System for Windows, SAS ® ,
Version 9.1 (SAS Inst., Cary, NC, USA) analysiert.
Die Standardkurve der PCR wurde aus den Mittelwerten einzelner Ct-Werte von
Plasmidlösungen mit den Konzentrationen 10 0 bis 10 7 GE / µl Reaktionsvolumen
erstellt. Unterschiede zwischen den mittleren Ct-Werten jeder Konzentration wurden
mit einem zweiseitgen T-Test überprüft (PROC MEANS). Aus der Standardkurve
wurden die Effizienz, die Wiederholpräzision, das Detektions- und das
Quantifizierungslimit der real-time PCR abgeleitet.
Der Grenzwert für die Präzision liegt für bioanalytische Verfahren (für Werte oberhalb
der unteren Quantifizierungsgrenze) bei maximal 15 % relative Standardabweichung
vom Mittelwert für die jeweilige Konzentrationsstufe (ANON. 2001). Daraus folgt für
die Präzision ein Mindestwert von 85 %. Dieser Wert wurde für die Auswertung der
Präzision der real-time PCR als Grenzwert angenommen. Die Ct-Werte der
Untersuchungen zur Feststellung der Vergleichspräzision wurden mit den Werten der
Standardkurve verglichen. Ein Ergebnis wurde als „präzise“ bezeichnet, wenn die
Abweichung des Ergebnisses in der jeweiligen Konzentrationsstufe kleiner 15 % der
relativen Standardabweichung vom Mittelwert der Standardkurve war. In gleicher
Weise wurden die Ergebnisse der Untersuchungen zur Vergleichspräzision anhand
von Kotproben natürlich infizierter Schweine und zur Wiederholpräzision analysiert.
Der Mittelwert und die Standardabweichung wurden für jeden Versuch getrennt
berechnet.
Die Übereinstimmung der Ergebnisse aus den Untersuchungen zur Feststellung der
diagnostischen Sensitivität und Spezifität wurde an einer 2 x 2-Felder-Tafel
vorgenommen.
Die Robustheit wurde anhand eines Vergleichs der PCR-Ergebnisse vor und nach
einer Bearbeitung der Proben berechnet und als prozentuale Abweichung vom
Ausgangswert angegeben.
93

4 Ergebnisse
4.1 Etablierung und Validierung
4.1.1 Primer- und Sondendesign
Ergebnisse
Der Vergleich der Primer- und Sondensequenzen mit Genomsequenzen anderer
Organismen als L. intracellularis ergaben für den forward-Primer Li-Ubi-F eine
maximale Übereinstimmung von 73 % mit der Sequenz von Prochlorococcus
marinus str. MIT 9312, Medicago truncatula und Carteria palmata. Das equality-(e)-
value betrug 5,2. Der reverse-Primer Li-Ubi-R besitzt eine 81 %ige Übereinstimmung
mit der Sequenz von Xenopus tropicalis und Nitrosomonas europaea ATCC 19718
mit einem e-value von 1,1. Die nächste höhere Übereinstimmung von 77 % der
Basen wurde für die Sequenz von Pan troglodytes BAC und Homo sapiens PAC mit
einem e-value von 4,2 errechnet. Die Sequenz der Sonde Li-Ubi-Probe ist zu 96 %
bzw. 67 % komplementär zu einer Sequenz von Oryza sativa mit einem e-value von
0,6 und zu 64 % und einem e-value von 2,4 komplementär zu den Sequenzen von
Pan troglodytes BAC, Mus musculus und Homo sapiens. Die e-values für alle
anderen bekannten Sequenzen waren deutlich größer als 5,0. Eine 100 %ige
Übereinstimmung der Primer- und Sondensequenzen wurde für Lawsonia
intracellularis PHE/MN1-00 mit einem e-value von 0,004 angegeben.
4.1.2 Optimierung der Primer-Konzentrationen
Die erste Amplifikation spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis mit
unterschiedlichen Konzentrationen der Primer wurde mittels Gelelektrophorese
ausgewertet. Eine ausreichende Konzentration von Primern wurde zunächst anhand
einer visuellen Beurteilung der Menge synthetisierter PCR-Produkte vorgenommen.
Die mit SYBR ® Green durchgeführten real-time PCRs zeigten beiden Versuchen die
gleichen Ergebnisse (Abb. 2). Maximale ∆Rn-Werte und Ct-Werte der
Amplifikationskurven wurden bei Konzentrationen von 300 nM resp. 900 nM erzielt.
94

Ergebnisse
Eine Konzentration von 300 nM des forward- und reverse-Primer im Reaktionsmix
wurde als grundsätzlich ausreichend erachtet. Trotzdem wurde dieser Konzentration
eine Sicherheitsspanne von 200 nM zuaddiert, so dass die Konzentration beider
Primer für die weiteren PCR-Untersuchungen auf 500 nM festgelegt wurde. Die
Spezifität der Primer konnte anhand einer Schmelzkurvenanalyse der PCR-Produkte
gezeigt werden, bei der nur ein Schmelzpunkt nachweisbar war.
300/300 nM bis
900/900 nM
95
50/50 nM bis
50/300 nM
Abbildung 2: amplification plot zur Optimierung der Primer-Konzentration,
gezeigt sind alle Kombinationen zwischen 50 und 900 nM
forward- und revese-Primer bei Amplifikation spezifischer
Genomfragmente von Lawsonia intracellularis MS B3903
4.1.3 Überprüfung der analytischen Spezifität der Primer
Die Amplifikationen von DNA der Referenzstämme mit den Primern Li-Ubi-F und –R
ergaben bei einzelnen Bakterienstämmen positive Ergebnisse. Die Ct-Werte
betrugen für Erysipelothrix rhusiopathiae 42,9, für Listeria monozytogenes 40,

Ergebnisse
Arcanobacterium pyogenes 38,2, für E. coli O141 K85ab 41,7, für E. coli O139 42,
für E. coli O141 K85ac 41,1, für E. coli O149 38,4, für E. coli O147 44,6, für E. coli
O157 K- 41,1, für E. coli O108 42,5 und für E. coli Kalb 40,9.
4.1.4 Optimierung der Sonden-Konzentration
Die Sonde Li-Ubi-Probe wurde im Reaktionsmix in den Konzentrationen 50 nM, 100
nM und 200 nM verwendet. Die Amplifikationskurven der einzelnen Proben wiesen
deutliche Unterschiede in den ∆Rn-Werten und Ct-Werten auf, so dass die Sonde in
der Endkonzentration von 200 nM eingesetzt wurde (Abb. 3).
96
200 nM
100 nM
Abbildung 3: amplification plot zur Optimierung der Sonden-Konzentration,
50 nM
gezeigt sind die Konzentrationen der Sonde von 50 nM, 100 nM
und 200 nM; template-DNA ist Lawsonia intracellularis MS
B3903

Ergebnisse
4.1.5 Überprüfung der analytischen Spezifität der Sonde
Die analytische Spezifität der Sonde Li-Ubi-Probe wurde in einer Konzentration von
200 nM zusammen mit den Primern Li-Ubi-F und –R in einer PCR an der DNA
unterschiedlicher Referenzstämme überprüft. Ein positives Signal konnte mit DNA
von Lawsonia intracellularis MS B3903 erzeugt werden. Im Gegensatz dazu wurde
bei keiner anderen DNA ein positives Signal in der real-time PCR erzeugt (Abb. 4).
Dieses galt auch für solche Bakterien, die zunächst im SYBR ® Green System eine
unerwünschte Amplifikation mit den Primern Li-Ubi-F und -R gezeigt haben.
Lawsonia intracellularis MS B3903
Abbildung 4: amplification plot zur Überprüfung der analytischen Spezifität der
Sonde; die Sonde wurde in einer Konzentration von 200 nM
verwendet; template-DNA sind die Referenzstämme inklusive
Lawsonia intracellularis MS B3903
97

4.1.6 Sequenzierung
Ergebnisse
Die Sequenzierung der PCR-Produkte aus den Amplifikationen spezifischer
Genomfragmente von L. intracellularis, die zuvor aus Kotproben isoliert wurden,
ergab in allen 10 Fällen eine Übereinstimmung von 100 % mit einer Sequenz im
Genom von L. intracellularis PHE/MN1-00 (Tab. 39).
Tabelle 39: Ergebnisse der Sequenzierung
Probe
(Nr.)
Länge der Sequenz
(bp)
missings
(bp)
98
e-value
Übereinstimmung
(%)
1 46 0 2x10 -15 100
2 45 0 6x10 -15 100
3 45 0 6x10 -15 100
4 44 0 2x10 -14 100
5 42 0 3x10 -13 100
6 45 0 9x10 -14 100
7 45 0 9x10 -14 100
8 45 0 9x10 -14 100
9 45 0 9x10 -14 100
10 46 0 2x10 -14 100
4.1.7 Klonierung
Die optimale annealing-Temperatur der Primer Ubi-Clon-lang-F und –R, die zur
Herstellung des für die Klonierung vorgesehenen PCR-Produktes synthetisiert
wurden, ist in einer Gradienten-PCR mit anschließender Gelektrophorese überprüft
worden. Die Synthese von PCR-Produkten konnte, visuell beurteilt, ab einer
Temperatur von 60,3 °C in der annealing-Phase nicht weiter gesteigert werden (Abb.
5). Die annealing-Temperatur wurde für die Herstellung des PCR-Produktes
empirisch auf 61,6 °C festgelegt.

Ergebnisse
In der Gelelektrophorese konnte durch den Vergleich mit einem Größenmarker
gleichzeitig die Größe des PCR-Produktes bestimmt werden. Die Größe der PCR-
Produkte betrug ca. 550 bp (+/- 50 bp) und lag somit nahe der zuvor berechneten
Größe von 525 bp.
800 bp
500 bp
300 bp
100 bp
annealing-Temperatur in °C
DNA-Leiter 56,0 56,2 56,6 57,1 57,9 58,7 59,5 60,3 61,0 61,6 61,9 62,0 NTC
Abbildung 5: Gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte nach
Gradienten-PCR; template-DNA ist Lawsonia intracellularis MS
B3903; Angabe der annealing-Temperaturen in °C
Die Transformation kompetenter E. coli wurde mit Vektoren durchgeführt, denen zur
Ligation des Inserts zunächst 2 µl PCR-Produkt (70,0; 72,5 und 95 ng DNA pro µl)
resp. 3 µl PCR-Produkt (35 ng DNA pro µl) zugegeben wurde. Nach Bebrütung der
LB-Nährböden waren auf allen Agarplatten massenhaft weiße und nur vereinzelt
99

Ergebnisse
hellblaue sowie blaue Kolonien sichtbar. Da nur für weiße Kolonien angenommen
werden kann, dass die E. coli erfolgreich mit Insert tragenden Plasmiden
transformiert wurden, sind nur Bakterien der weißen Kolonien in Flüssigmedium
überimpft und anschließend mittels real-time PCR zur Kontrolle der erfolgreichen
Transformation und Klonierung untersucht worden. Das Insert konnte in allen Klonen
nachgewiesen werden (Abb. 6); zum Teil lagen so große Mengen der Plasmide mit
der Zielsequenz vor, dass das real-time Gerät aufgrund der hohen Ausgangsmenge
der template-DNA keine normierte und baseline-korrigierte Reporterfluoreszenz (∆
Rn) darstellen konnte.
Abbildung 6: amplification plot zur Überprüfung der Transformation
kompetenter E. coli; es wurden 40 Klone überprüft, die alle die
Zielsequenz trugen;
100

Ergebnisse
4.1.8 Verdünnungsreihe und Standard
Ein Klon (Kap. 4.1.7) wurde in 250 ml LB-Medium vermehrt, nach 12 Stunden lysiert
und die Plasmide anschließend mit einem spin-kit isoliert. Die spektralphotometrisch
bestimmte Extinktion der 1:10 verdünnten Plasmidlösung im Vergleich zu einem
Leerwert betrug bei einer Wellenlänge von 280 nm 0,0977 (Mittelwert aus 18
Messungen). Daraus folgt, dass die Konzentration der Plasmide im Eluat etwa 1x10 13
pro ml war. Aus dieser Lösung wurde eine Verdünnungsreihe hergestellt und zur
Erstellung der Standardkurve verwendet. Nach vier voneinander getrennten
Untersuchungen in der real-time PCR wurde aus den Mittelwerten die Standardkurve
berechnet.
Die für die Erstellung der Standardkurve verwendeten Lösungen unterschiedlicher
Konzentrationsstufen ergaben linear verteilte Ct-Werte, deren 95 %-
Vertrauensintervall als zweifache Standardabweichung und deren
Wiederholpräzision in % angegeben wurde (Tab. 40).
Tabelle 40: Ct-Mittelwerte der Verdünnungsreihe einer Plasmidlösung, 95 %-
Konzentrationsstufe
(Plasmide / µl
Reaktionseinheit)
Vertrauensintervall und Wiederholpräzision
Ct-
Mittelwert
95 %-
Vertrauensintervall
als Abweichung
vom Mittelwert
101
Präzision als
einfache
Standard-
abweichung
Wiederhol-
präzision (%)
10 7 11,99 +/- 0,28 0,14 98,83
10 6 15,33 +/- 1,10 0,55 96,41
10 5 19,53 +/- 0,82 0,41 97,90
10 4 23,10 +/- 0,56 0,28 98,79
10 3 26,86 +/- 0,70 0,35 98,79
10 2 28,94 +/- 2,14 1,07 96,30
10 1 33,84 +/- 1,10 0,55 98,37
10 0 36,83 +/- 1,16 0,58 98,43
10 -1 37,19 +/- 0,66 0,33 99,11

Ergebnisse
Mit einer Konzentration von 10 -2 GE / µl konnten in dieser Versuchsreihe keine
reproduzierbaren Daten ermittelt werden. Die Konzentration von 1x10 -3 GE / µl
Reaktionseinheit ergab einmalig einen Ct-Wert von 40,4. Dieser Wert wurde in der
Standardkurve (Abb. 7) nicht aufgetragen. Die Steigung der Standardkurve resp. -
gerade beträgt –3,329. Die Effizienz der real-time PCR ist somit 99,7 %. Die
Linearität ist zwischen den Konzentrationsstufen 10 7 und 10 0 GE / µl
Reaktionseinheit gegeben, so dass dieser Bereich als Kalibrierbereich festgelegt
werden konnte. Die untere Nachweisgrenze der real-time PCR beträgt 1 GE im
Reaktionsvolumen. Die obere Nachweisgrenze beträgt bei 10 8 GE / µl
Reaktionsvolumen. Konzentrationen von 10 9 GE / µl oder mehr konnte vom real-time
Gerät aufgrund der hohen Ausgangsmenge von template-DNA nicht mehr dargestellt
werden.
Eine absolute Quantifizierung ist im Bereich von 10 1 bis 10 7 GE / µl
Reaktionsvolumen möglich. Oberhalb von 10 7 GE / µl Reaktionsvolumen steigen die
Ct-Werte nicht mehr linear zur eingesetzten Menge der DNA an (Abb. 8). Ist die
Konzentration der template-DNA etwas geringer als 10 1 GE / µl Reaktionsvolumen,
besteht zwar ein signifikanter Unterschied zum Ct-Wert von 10 0 GE / µl
Reaktionsvolumen (p =0.0006), allerdings fehlt ein signifikanter Unterschied
zwischen 10 0 und 10 -1 GE / µl Reaktionsvolumen (p =0,11).
In einem ml Eluat aus der DNA-Isolierung beträgt die untere Nachweisgrenze
rechnerisch 4x 10 2 GE L. intracellularis, die obere Nachweisgrenze beträgt 1x 10 12
GE. Absolut quantifizierbar sind demnach Plasmidlösungen, die eine Konzentration
spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis zwischen 1x 10 5 und 1x 10 11 pro
ml besitzen.
102

Ct-Wert
45
40
35
30
25
20
15
10
5
a a
b
Ergebnisse
Standardkurve
c
0
-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8
log Konzentration (GE /µl)
Abbildung 7: Standardkurve, berechnet aus Ergebnissen der Untersuchung
103
d
einer Verdünnungsreihe von einer Plasmidlösung in GE / µl
Reaktionsvolumen (4x); eingezeichnet ist die Steigung der
Standardkurve und die zweifache Standardabweichung; mit
unterschiedlichen Buchstaben gekennzeichnete Werte
unterscheiden sich signifikant
e
f
g
h

10 8 GE / µl
Ergebnisse
10 7 bis 10 1 GE / µl
104
10 0 GE / µl 10 -1 GE / µl
Abbildung 8: amplification plot zur Detektion des oberen Quantifizierungs-
limits; dargestellt sind Plasmidverdünnungen zwischen 10 8 und
10 -1 GE / µl Reaktionsvolumen; die Amplifikationskurve und der
∆Rn-Wert für die Konzentration von 10 8 GE / µl weichen deutlich
ab.
4.1.9 Interne Positivkontrolle
Die IPC hatte in solchen Proben, in denen L. intracellularis nicht nachgewiesen
wurde, einen Ct-Wert von ca. 34. Der Ct-Wert der IPC erhöhte sich mit steigendem
Gehalt spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis in den Proben. Wurde in
Proben sehr viel der eigentlichen Ziel-DNA amplifiziert, waren PCR-Produkte der IPC
nicht mehr detektierbar.
Mit dem Ziel, einen möglichen Einfluss der Amplifikation einer IPC auf die eigentliche
Reaktion zu überprüfen, wurden Plasmidlösungen mit und ohne IPC quantifiziert. Es
konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Ct-Werten derselben Proben

Ergebnisse
mit und ohne IPC festgestellt werden (Abb. 9). Ein Einfluss der IPC auf die
Amplifikation der Zielsequenz durch eine kompetetive Reaktion konnte somit
ausgeschlossen werden. Die IPC wurde in allen folgenden Versuchen zur
Überprüfung einer möglichen Inhibition eingesetzt.
Die Amplifikation der IPC-DNA wurde während der weiteren Untersuchungen in jeder
Probe nachgewiesen, in der spezifische Genomfragmente von L. intracellularis nicht
detektiert wurden. Somit kann festgestellt werden, dass es in keiner einzigen Probe
zu einer Inhibition gekommen war.
Ct-Wert
40
35
30
25
20
15
10
5
0
ohne IPC mit IPC
Vergleich mit / ohne IPC
7 3 0 -1
ohne IPC 11.96 26.72 36.29 36.48
mit IPC 11.99 26.86 36.83 37.19
log Konzentration (GE / µl Reaktionseinheit)
Abbildung 9: Vergleich der Ct-Werte von Verdünnungen einer Plasmidlösung
mit und ohne IPC
105

4.1.10 Vergleichspräzision
Ergebnisse
Zur Vergleichspräzision wurden Verdünnungen der Plasmidlösung von drei Personen
untersucht (Abb. 10). Die relative Standardabweichung der Ct-Werte des 2. und 3.
Untersuchers zu den mittleren Ct-Werten der Standardkurve betrug 2,6 % und
weniger.
Ct-Wert
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Vergleichspräzision Plasmide
5 4 3 2 1 0
1.Untersucher 19.53 23.1 26.86 28.94 33.84 36.83
2. Untersucher 19.45 23.04 27.35 27.99 32.34 37.87
3. Untersucher 19.64 22.82 27.08 27.94 32.3 37.61
Log Konzentration (GE / µl Reaktionseinheit)
1.Untersucher 2. Untersucher 3. Untersucher
Abbildung 10: Ergebnisse der Untersuchung zur Feststellung der
Vergleichspräzision anhand einer PCR an Plasmidverdünnungen
106

Ergebnisse
Die Ergebnisse der Quantifizierung von GE in verschiedenen Proben natürlich
infizierter Schweine lagen bei allen drei Untersuchern innerhalb der einfachen
Standardabweichung. Lediglich bei zwei Proben lag jeweils ein Ct-Wert außerhalb
der einfachen Standardabweichung, jedoch innerhalb der zweifachen
Standardabweichung (Abb. 11). Die relative Standardabweichung der Menge von GE
zum jeweiligen Mittelwert dieser Untersuchung lag mit 23,7 % bei Probe 1 und
17,9 % bei Probe 10 oberhalb des Grenzwertes von 15 %. Die Vergleichspräzision
der übrigen Proben betrug 85,4 % und mehr.
5
4.5
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
Vergleichspräzision
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Probennummer
1. Untersucher 2. Untersucher 3. Untersucher Mittelw ert
Abbildung 11: Vergleich des berechneten Gehaltes von GE von L. intracellularis
nach Untersuchung derselben Proben durch drei Untersucher;
dargestellt ist die logarithmierte Menge von GE / µl Reaktions-
einheit und die einfache Standardabweichung;
107
log Quantität (GE / µl Reaktionseinheit)

4.1.11 Wiederholpräzision
Ergebnisse
Die Ergebnisse der Untersuchung von 10 Proben natürlich infizierter Schweine
zeigen, dass die berechnete Menge von GE in jeder Probe jeweils innerhalb der
einfachen Standardabweichung liegt (Abb. 12). Die Wiederholpräzision beträgt
zwischen 93,6 % und 98,3 %. Somit sind die Testergebnisse wiederholbar.
log Quantität (GE / µl Reaktionseinheit)
7
6
5
4
3
2
1
0
Wiederholpräzision
0 1 2 3 4 5 6 7
Probennummer
1.Wdh 2.Wdh 3.Wdh Mittelwert
Abbildung 12: Vergleich des Gehaltes von GE von L. intracellularis nach
dreimaliger Untersuchung von Proben natürlich infizierter
Schweine; dargestellt ist der logarithmierte Gehalt von GE und
die einfachen Standardabweichungen; Proben 7 – 10 sind nicht
quantifizierbar.
108

Ergebnisse
4.1.12 Diagnostische Sensitivität und Spezifität
Die Bestimmung der diagnostischen Sensitivität und Spezifität der real-time PCR
erfolgte anhand einer vergleichenden Untersuchung von Proben mit der multiplex-
PCR.
Die Untersuchung der nach den Ergebnissen der multiplex-PCR 150 L.
intracellularis-positiven und 150 L. intracellularis-negativen Kotproben mittels real-
time PCR ergab, dass in der real-time PCR von den 300 Proben 81,7 % positiv
waren. Lediglich vier von 150 Proben, die in der multiplex-PCR positiv waren,
konnten in der real-time PCR nicht als positiv bestätigt werden. Im Vergleich beider
Untersuchungsverfahren ergibt sich eine diagnostische Sensitivität von 97,3 % und
eine diagnostische Spezifität von 34 % für die real-time PCR (Tab. 41). Proben, die
in der multiplex-PCR negativ, in der real-time PCR jedoch positiv waren, wiesen fast
ausnahmslos Ct-Werte unterhalb der Quantifizierungsgrenze auf (Abb. 13).
Vergleicht man umgekehrt die Ergebnisse der multiplex-PCR mit denen der real-time
PCR ergeben sich für die multiplex-PCR eine diagnostische Sensitivität von 59,6 %
und eine diagnostische Spezifität von 92,7 % (Tab. 42).
109

Ergebnisse
Tabelle 41: diagnostische Sensitivität und Spezifität der real-time PCR im Vergleich
zur multiplex-PCR
multiplex-PCR positiv multiplex-PCR negativ
real-time PCR positiv 146 99
real-time PCR negativ 4 51
Diagnostische
Sensitivität:
Diagnostische
Spezifität:
110
97.3 %
34 %
Tabelle 42: diagnostische Sensitivität und Spezifität der multiplex-PCR im Vergleich
zur real-time PCR
real-time PCR positiv real-time PCR negativ
multiplex-PCR positiv 146 4
multiplex-PCR negativ 99 51
Diagnostische
Sensitivität:
Diagnostische
Spezifität:
59,6 %
92,7 %

Anzahl der Proben
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Ergebnisse
Vergleich von real-time PCR und multiplex -PCR
multiplex-PCR negativ multiplex-PCR positiv
< E+01 E+01 E+02 E+03 E+04 E+05 E+06
Gehalt an GE / µl Reaktionsvolumen
Abbildung 13: Vergleich der Ergebnisse von multiplex-PCR mit der real-time
PCR an 300 Proben, gezeigt sind nur solche Proben, die in der
real-time PCR positiv sind
4.1.13 Wiederfindungsrate
Die im Rahmen der Untersuchung zur Feststellung der Wiederfindungsrate
durchgeführte Quantifizierung der Referenzlösung ergab einen Gehalt von 2 x 10 9
GE von L. intracellularis pro ml. Anhand dieses Wertes wurde die zugegebene
Menge von GE zum Kot berechnet und mit den Ergebnissen der real-time PCR
verglichen (Abb. 14). Es konnte gezeigt werden, dass bei einer absolut zugegebenen
Menge von 2 x 10 7 GE im Anschluss an die Quantifizierung mit beschriebener
Methode eine Menge von 6,95 x 10 5 GE rechnerisch „wiedergefunden“ wurde. Das
111

Ergebnisse
entspricht einer Wiederfindungsrate von 3,5 % nach der DNA-Extraktion aus Kot und
Amplifikation mittels real-time PCR. Ist eine absolute Menge von 2 x 10 5 GE dem
Eluat zugegeben worden, konnte eine Menge von 3,6 x 10 3 GE
“wiedergefunden“ werden. Dies entspricht einer Wiederfindungrate von 1,8 %.
Quantität an GE / µl Reaktionsvolumen
1.00E+09
1.00E+08
1.00E+07
1.00E+06
1.00E+05
1.00E+04
1.00E+03
1.00E+02
Wiederfindung
zugegeben w iedergefunden
2.00E+07 2.00E+05
Konzentrationsstufe (GE)
Abbildung 14: Wiederfindung; dargestellt sind die zugegebenen Mengen von
GE von L. intracellularis mit der jeweilig wiedergefundenen
Menge von GE als Mittelwert aus sieben Untersuchungen.
112

4.1.14 Robustheit
Ergebnisse
Die Ergebnisse der Untersuchungen an 10 DNA-Extrakten nach unterschiedlicher
Herstellung des Reaktionsmixes und Behandlung der 96 well plates (s. Kap. 3.2.18)
sind in Abb. 15 dargestellt. Es wurden nur quantifizierbare Proben ausgewertet.
% Abweichung von 1. Untersuchung
11
7
3
-1
-5
-9
-13
Robustheit
1 2 3 4 5 6
Probennummer
RM 12 h bei RT RM 10x einfrieren/ auftauen RM 5 Min. UV-Licht
DNA L-Tips Platte fallen lassen Platte 5h stehen lassen
Abbildung 15: Ergebnisse zur Test-Robustheit; dargestellt sind die
prozentualen Abweichungen der logarithmierten Menge GE / µl
Reaktionseinheit zum Ergebnis der ersten Untersuchung der
Proben
113

4.1.15 Messunsicherheit
Ergebnisse
Die Messunsicherheit ist eine generelle Größe für analytische Verfahren. Sie wird als
Vertrauensintervall angegeben. Für diesen Test wurde empirisch die einfache resp.
die zweifache Standardabweichung in Abhängigkeit vom untersuchten Parameter
festgelegt. Das Vertrauensintervall beträgt dann 66 % resp. 95 %.
114

Ergebnisse
4.2 Prüfung der Homogenisierung von Kotproben zum Nachweis
von L. intracellularis
Nach Homogenisierung der naiven Kotproben waren die Ergebnisse in der real-time
PCR aus den Aliquots in der jeweiligen GE-Konzentration einheitlich, wobei in der
niedrigsten GE-Konzentration eine Probe als negativ bewertet werden musste (Tab.
43). Nach der Homogenisierung mit Verdünnung waren die Ergebnisse für jede GE-
Konzentrationsstufe ebenfalls einheitlich (Tab. 44), jedoch konnte festgestellt werden,
dass in den höheren GE-Konzentrationen die quantifizierte Menge von GE niedriger
ausfiel als bei der Homogenisierung naiver Kotproben.
Tabelle 43: Ergebnisse der Untersuchung nach Homogenisierung naiver
Aliquot
Kotproben
zugegebene Menge an GE /
µl zu 200 mg Kot
115
in der real-time PCR
nachgewiesene Menge an GE
bzw. mittlerer Ct-Wert
1-1 2,89 x 10 7 1,02 x10 4
1-2 2,89 x 10 7 1,03 x10 4
1-3 2,89 x 10 7 8,92 x10 3
2-1 2,89 x 10 5 2,30 x10 2
2-2 2,89 x 10 5 1,11 x10 2
2-3 2,89 x 10 5 1,08 x10 2
3-1 5,78 x 10 3 0
3-2 5,78 x 10 3 38,09
3-3 5,78 x 10 3 38,52

Ergebnisse
Tabelle 44: Ergebnisse der Untersuchung nach Homogenisierung verdünnter
Aliquot
Kotproben
zugegebene Menge an GE /
µl zu 200 mg Kot
116
in der real-time PCR
wiedergegebene Menge an GE
bzw. mittlerer Ct-Wert
4-1 2,89 x 10 7 7,72 x10 3
4-2 2,89 x 10 7 8,57 x10 3
4-3 2,89 x 10 7 8,48 x10 3
5-1 2,89 x 10 5 1,11 x10 2
5-2 2,89 x 10 5 4,78 x10 1
5-3 2,89 x 10 5 5,24 x10 1
6-1 5,78 x 10 3 37,77
6-2 5,78 x 10 3 37,54
6-3 5,78 x 10 3 37,58

Ergebnisse
4.3 Einfluss der Lagerung auf den Gehalt von L. intracellularis in
Kotproben
Die Untersuchungen an 10 Kotproben nach unterschiedlich langer Lagerungszeit bei
verschiedenen Temperaturen ergaben bei den quantifizierbaren Proben keine
signifikante Abweichung der jeweiligen Menge von GE zu Beginn der Untersuchung.
Die Hypothese einer signifikanten Abweichung vom Ausgangswert konnte bei den
Proben A, B, C und D verworfen werden (p = 0,27, p = 0,20, p = 0,20 und p = 0,42).
Die Ergebnisse der Verlaufsuntersuchung bis zum Tag 132 sind in den Abb. 16 bis
19 dargestellt. Die Ergebnisse von Proben, deren Gehalt von GE unterhalb der
Quantifizierungsgrenze lag, sind nicht dargestellt.
Quantität GE / µl Reaktionsvolumen
1.00E+06
1.00E+05
1.00E+04
1.00E+03
1.00E+02
1.00E+01
1.00E+00
Probe A
Tag 0, frisch Tag 3 Tag 7 Tag 14 Tag 28 Tag 56 Tag 132
Untersuchungszeitpunkt
6 °C -20 °C -70 °C
Abbildung 16: Ergebnisse der Untersuchung von Probe A nach
unterschiedlicher Lagerungszeit und –temperatur
117

Quantität GE / µl Reaktionsvolumen
1.00E+06
1.00E+05
1.00E+04
1.00E+03
1.00E+02
1.00E+01
1.00E+00
Ergebnisse
118
Probe B
Tag 0, frisch Tag 3 Tag 7 Tag 14 Tag 28 Tag 56 Tag 132
B, 4°C
Untersuchungszeitpunkt
B, -20°C B, -80°C
Abbildung 17: Ergebnisse der Untersuchung von Probe B nach
Quantität GE / µl Reaktionsvolumen
1.00E+06
1.00E+05
1.00E+04
1.00E+03
1.00E+02
1.00E+01
1.00E+00
Tag 0,
frisch
unterschiedlicher Lagerungszeit und –temperatur
Probe C
Tag 3 Tag 7 Tag 14 Tag 28 Tag 56 Tag 132
Untersuchungszeitpunkt
C, 6 °C C, -20 °C C, -70 °C
Abbildung 18: Ergebnisse der Untersuchung von Probe C nach
unterschiedlicher Lagerungszeit und –temperatur

Quantität GE / µl Reaktionsvolumen
1.00E+06
1.00E+05
1.00E+04
1.00E+03
1.00E+02
1.00E+01
1.00E+00
Ergebnisse
Probe D
Tag 0, frisch Tag 3 Tag 7 Tag 14 Tag 28 Tag 56 Tag 132
Untersuchungszeitpunkt
D, 6 °C D, -20 °C D, -70 °C
Abbildung 19: Ergebnisse der Untersuchung von Probe D nach
unterschiedlicher Lagerungszeit und –temperatur
119

5 Diskussion
Diskussion
Die vorliegende Untersuchung wurde mit dem Ziel durchgeführt, eine real-time PCR
zum Nachweis spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis in Kotproben zu
entwickeln. Die Methode soll über die einfache Detektion hinaus eine absolute
Quantifizierung der Erregermenge im Probenmaterial erlauben. Im Anschluss an die
Entwicklung der real-time PCR sollte die Methode in Anlehnung an national und
international anerkannte Empfehlungen und Richtlinien validiert werden.
Abschließend wurden mögliche Einflüsse auf das quantitative Ergebnis, wie etwa die
Verteilung des Erregers in der Probenmatrix sowie Dauer und Temperatur während
der Probenlagerung untersucht.
5.1 Etablierung und Validierung
5.1.1 Testsystem
Die PCR ist die am häufigsten verwendete Methode zum Nachweis spezifischer
DNA-Abschnitte (MACKAY 2004). Die Detektion von PCR-Produkten kann
konventionell im Anschluss an die PCR mit einer Gelelektrophorese und der
anschließenden Färbung der DNA oder real-time mittels fluoreszierender Farbstoffe
bzw. Sondentechnologie erfolgen. In der vorliegenden Untersuchung wurde die real-
time PCR in Kombination mit der Sondentechnologie als Testsystem verwendet, da
dieses Verfahren gegenüber der konventionellen PCR zahlreiche Vorteile bietet. Eine
real-time PCR erfordert zum einen keine weitere Behandlung der PCR-Produkte,
wodurch das Risiko einer Kontamination minimiert wird (SCHMITTGEN 2001,
MACKAY 2004). Zum anderen führt die real-time PCR innerhalb weniger Stunden zu
einem Ergebnis (SCHMITTGEN 2001) und ermöglicht so eine deutliche
Zeiteinsparung gegenüber der konventionellen PCR. Der größte Vorteil der real-time
PCR liegt jedoch in der Möglichkeit, die ursprüngliche Menge spezifischer DNA in
einer Probe zu quantifizieren (BUSTIN 2005).
Zur Visualisierung der PCR-Produkte wurde in dieser Untersuchung ein spezifisches
Detektionssystem, die TaqMan-Sonde, verwendet. Diese Sonde erzeugt nur in
120

Diskussion
Verbindung mit dem spezifischen PCR-Produkt ein Fluoreszenzsignal. Einfach
interaklierende Farbstoffe stellen im Gegensatz dazu jede ds-DNA der Reaktion dar
(BUSTIN u. NOLAN 2004). Zusammenfassend kann davon ausgegangen werden,
das real-time PCRs mit Sondentechnologie eine höhere analytische Spezifität
besitzen als real-time PCRs, bei denen interkalierende Farbstoffen verwendet
werden.
5.1.2 Analytische Spezifität von Primer und Sonde
Die Spezifität ist die Fähigkeit eines Testsystems, den Analyten auch dann eindeutig
in einer Probe zu identifizieren, wenn andere Komponenten in der Probenmatrix
enthalten sind (ANON. 1998b). Primer und die Sonde sind die Bestandteile der PCR,
die Einfluss auf die analytische Spezifität nehmen (BANGSOW et al. 2007). Neben
der theoretisch berechneten, spezifischen Bindung der Primer an Genomfragmente
von L. intracellularis wurde die Spezifität der Primer Li-Ubi-F und –R im SYBR
Green-System überprüft. An den Ergebnissen einer Schmelzkurvenanalyse konnte
gezeigt werden, dass die Primer bei einer Amplifikation der DNA von L. intracellularis
MS B3903 nur ein einziges PCR-Produkt bilden. Da beim Schwein zahlreiche
Bakterien regelmäßig vorkommen, wurde eine mögliche Amplifikation von deren
DNA geprüft. Nur bei wenigen Erregern konnte nach einer hohen Anzahl von Zyklen
ein Fluoreszenzsignal detektiert werden. Da diese unerwünschte Amplifikation in den
Wiederholungen des Versuches bei unterschiedlichen Erregern auftraten, ist davon
auszugehen, dass die Primer nicht an eine spezifische Genomsequenz der
jeweiligen Erreger hybridisiert haben, sondern eine unspezifische Amplifikation zu
den Signalen geführt hat. Die Möglichkeit eines hoch spezifischen Nachweises von L.
intracellularis mittels PCR wurde auch in anderen Studien anhand des Ausbleibens
einer Amplifikation der DNA anderer Bakterienstämme für die jeweiligen Primern
bestätigt (LA et al. 2006, LINDECRONA et al. 2002, NATHUES 2007).
Die Sequenz der PCR-Produkte aus Untersuchungen an Kotproben natürlich
infizierter Schweine zeigte in allen Untersuchungen eine 100 %ige Übereinstimmung
mit der Genomsequenz des Typstamms von L. intracellularis (accession number
AM180252, GenBank). Die hohe Übereinstimmung lässt den Schluss zu, dass in
diesem Ausgangsmaterial ausschließlich spezifische PCR-Produkte in großer Menge
121

Diskussion
gebildet werden. Vergleichbar hohe Übereinstimmungen wurden auch durch
Amplifikation anderer spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis mit
entsprechenden Primern erreicht (LA et al. 2006, NATHUES 2007).
Die Sonde Li-Ubi-Probe hat in der real-time PCR nur dann ein Fluoreszenzsignal
erzeugt, wenn gleichzeitig spezifische Genomfragmente von L. intracellualris mit den
Primern Li-Ubi-F und –R amplifiziert wurden. Wurde andere DNA als template
verwendet, darunter auch solche, die mit den Primern allein ein unspezifisches
Signal im SYBR Green-System erzeugt hatten, konnte dagegen keine
sondenspezifische Fluoreszenz detektiert werden. Die Emission eines
Fluoreszenzsignals während der Amplifikation in der real-time PCR durch die Sonde
kann daher als spezifisch für L. intracellularis bewertet werden.
Ein möglicher Einfluss der in dieser real-time PCR verwendeten IPC resp. der Primer
für diese IPC auf die Spezifität des Testsystems wurde ebenfalls untersucht. Die IPC
dient der Kontrolle von möglichen Inhibitionen während der PCR und basiert auf der
Amplifikation eines DNA-Fragments mit spezifischen Primern und einer Sonde. Diese
Sonde darf dabei nicht mit dem gleichen Reporter markiert sein, wie die Sonde des
eigentlichen Tests. In Fällen, in denen die eigentliche Ziel-DNA nicht nachzuweisen
ist, wird die Inhibition der Reaktion durch die Amplifizierung von DNA der IPC und
dem spezifischen Fluoreszenzsignal der Sonde ausgeschlossen.
Die Primer der IPC könnten theoretisch aber auch andere DNA als die der IPC
amplifizieren und dabei PCR-Produkte erzeugen, die mit der Sonde des eigentlichen
Tests hybridisieren. Dieser Vorgang würde zu einem falsch positiven Ergebnis im
eigentlichen Sinne des Testsystems führen. Die Spezifität der Primer und der
exogenen IPC-DNA wurde anhand einer Untersuchung mit verschiedenen
Referenzstämmen überprüft und dabei keine Fluoreszenzsignale detektiert. Die IPC
hat somit keinen nachweisbaren Einfluss auf die analytische Spezifität der real-time
PCR.
122

5.1.3 Quantifizierungsmethode
Diskussion
Eine Quantifizierung von GE mittels real-time PCR kann absolut oder relativ erfolgen.
Für eine absolute Quantifizierung sollte in jeder PCR eine Standardkurve erstellt
werden (LARIONOV et al. 2005), wodurch jedoch der materielle Aufwand und die
Arbeitszeit je Probe erheblich ansteigen. Die Kosten für die Untersuchung einer
einzigen Probe können dadurch soweit steigen, dass ein quantitatives Testsystem für
die Routinediagnostik „unbrauchbar“ wird. Die relative Quantifizierung, die in der
Regel als reverse-transcription real-time PCR angewendet wird, hat häufig zum Ziel,
die Expression eines Zielgens mit der eines Referenzgens zu vergleichen (PFAFFL
2004). Die relative Menge des Zielgens wird anschließend, normiert auf einen
Kalibrator, im Vergleich zu einer Kontrolle kalkuliert. Für eine absolute
Quantifizierung bakterieller DNA, wie sie in der vorliegenden Untersuchung
durchgeführt werden sollte, konnte diese Art der Quantifizierung nicht ohne
Änderungen übernommen werden. Für die hier beschriebene real-time PCR wurde
ein Vergleich des Ct-Wertes für eine Referenzmenge (Standard „S3“) mit dem Ct-
Wert der Proben vorgenommen. Dazu wurde das ∆∆Ct aus dem ∆Ct für den
Standard und dem ∆Ct für die jeweilige Probe gebildet und durch die negative
Steigung der Standardkurve der real-time PCR dividiert. Dieser Wert ist, als
Exponent zur Basis 10, mit der Menge von GE im Standard (hier 10 3 GE / µl) zu
multiplizieren, um die Konzentration von GE in der Probe zu berechnen. Eine
ähnliche Strategie zur Quantifizierung wurde bereits von anderen Autoren
beschrieben. In dem Fall wurde die relative Expression eines Zielgens nur anhand
der PCR-Effizienzen und des ∆∆Ct von Kontrolle und Probe berechnet. Diese
Methode setzt voraus, dass die Effizienzen der Amplifikation der Zielsequenz und
des Referenzgens bekannt oder gleich sind (PFAFFL 2001). In der real-time PCR
zum Nachweis spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis basiert der
Standard resp. das „Referenzgen“ auf Plasmiden, die ein Insert tragen, dass 450 bp
größer ist als die Zielsequenz. Diese neben der eigentlichen Zielsequenz der PCR
vorhandenen bp sind identisch mit den bp im Genom von L. intracellularis und sollen
im Plasmid stöchometrische Verhältnisse herstellen, wie sie auch im Genom des
Wildtyps vorliegen. Diese strukturell ähnlichen Verhältnisse in Plasmid und Genom
lassen erwarten, dass die Effizienzen der Amplifikation, die unter anderem von der
123

Diskussion
Bindung der Primer und der Taq-Polymerase abhängen, in beiden Reaktionen gleich
sind.
124

Diskussion
5.1.4 Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen sowie Effizienz
Die untere Nachweis- resp. Quantifizierungsgrenze ist definiert als kleinste Menge
des Analyten, die noch detektiert resp. mit ausreichender Präzision quantifiziert
werden kann (ANON. 1998b). Die Nachweisgrenze einer real-time PCR zum
Nachweis spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis wurde mit 4 x 10 4 GE
pro Gramm Kot resp. 1 GE pro Reaktion angegeben (LINDECRONA et al. 2002). In
einer multiplex-PCR zum Nachweis von L. intracellularis, B. hyodysenteriae und B.
pilosicoli wurde die Nachweisgrenze für alle drei Erreger mit 10 2 bis 10 3 Bakterien
pro Gramm Kot angegeben, wobei die Bande der PCR-Produkte bei einem Gehalt
von 10 2 Bakterien pro Gramm Kot nach der Gelelektrophorese nur sehr schwach zu
erkennen war (LA et al. 2006). Die Ergebnisse dieser Studie sind kritisch zu
bewerten, da sie voraussetzen, dass nach Zugabe von 10 2 Erregern zu 200 mg Kot
die Wiederfindungsrate der spezifischen Genomfragmente nach Extraktion der DNA
mittels QIAamp ® DNA Stool Mini Kit 100 % beträgt. Diese Ausbeute ist jedoch
aufgrund einer limitierten DNA Bindungskapazität der Säule im Kit nicht möglich
(pers. Mitteilung Dr. Klug, Qiagen, 10.10.2007). Nur wenn in den Kotproben keine
weitere DNA vorhanden gewesen wäre, hätten 100 % der zugegebenen DNA wieder
isoliert werden können. Unter dieser Voraussetzung müsste die Sensitivität der PCR
etwa 1-5 GE pro Reaktion betragen, was nach heutigem Kenntnisstand für eine
multiplex-PCR sehr unwahrscheinlich ist. Eine mögliche Erklärung für diese
Ergebnisse könnte die Bestimmung der Keimzahl mittels IFT vor der Präparation der
Proben sein. Wenn mit dieser Methode nicht jede Zelle mit einem Antikörper markiert
ist, wird die Anzahl der Zellen zwangsläufig unterschätzt. Darüber hinaus färbt der
Antikörper nur Antigen auf der Zelloberfläche an und nicht DNA bereits im Abbau
befindlicher Zellen von L. intracellularis. Diese - unter Umständen im IFT nicht
detektierten - Zellreste können noch intakte DNA enthalten und so in der PCR zu
einer Amplifikation führen. Auch hier „unterschätzt“ der IFT die Anzahl von L.
intracellularis in der Probenmatrix.
Die Nachweisgrenze für L. intracellularis in der multiplex-PCR, die als
Vergleichsmethode zur Feststellung der diagnostischen Sensitivität und Spezifität
herangezogen wurde, beträgt 10 3 GE pro ml Plasmidlösung (NATHUES 2007). Diese
Plasmidlösung, die als Ausgangsmaterial diente, wurde durch die Verwendung eines
Säulenkits um den Faktor 20 konzentriert (Elution nach Aufreinigung von einem
125

Diskussion
Milliliter mit 50 µl) und die Elutionslösung dann mittels PCR untersucht. Aus diesem
Grund kann die Sensitivität der multiplex-PCR ebenfalls nur indirekt mit der
Sensitivität der real-time PCR verglichen werden.
In einer nested-PCR zum Nachweis von L. intracellularis wurde die Nachweisgrenze
mit 10 3 Lawsonien pro Gramm Kot angegeben (JONES et al. 1993). Auch hier
können die Ergebnisse nicht mit denen der real-time PCR verglichen werden, weil
die Quantifizierung für die Bestimmung der Sensitivität der nested-PCR mit einem
IFT vorgenommen wurde. Es ist mit großer Wahrscheinlichkeit anzunehmen, dass
das untere Detektionslimit der nested-PCR aufgrund der genannten
Einschränkungen des IFT überschätzt wurde.
In der neu etablierten und validierten real-time PCR beträgt die untere
Nachweisgrenze 1 GE / Reaktion und entspricht somit einer zuvor beschriebenen
real-time PCR zum Nachweis von L. intracellularis (LINDECRONA et al. 2002).
Da in dieser Studie die DNA resp. GE der Bezugswert ist, wird kein direkter Vergleich
zu anderen Methoden vorgenommen, in denen die Nachweisgrenze an mittels IFT
quantifizierten Erregermengen in Kot untersucht wurde. Darüber hinaus wurde in
anderen Untersuchungen auf weitere Faktoren, wie z.B. die Wiederfindung
zugesetzter Ziel-DNA in Kotproben, nicht eingegangen; ein möglicher Einfluss dieses
Faktors kann retrospektiv nicht eingeschätzt werden.
In der real-time PCR ist die Zunahme eines Fluoreszenzsignals die Grundlage für die
Berechnung des ursprünglichen DNA Gehaltes (HIGUCHI et al. 1992, BUSTIN 2000).
Wenn die Ausgangsmenge der template-DNA zu Beginn der Reaktion bereits so
hoch ist, dass die überwiegende Zahl von Sonden hybridisiert, kann es zu keinem
oder einem geringen Anstieg der Fluoreszenz kommen. Aus diesem Grund gibt es
für die real-time PCR auch eine obere Nachweisgrenze. Das real-time PCR-System
kann in solchen Fällen keine Amplifikationskurve berechnen, da ∆Rn null oder sehr
nahe null ist. In der hier entwickelten real-time PCR liegt die obere Nachweisgrenze
bei 10 8 GE/ µl Reaktionsvolumen, da ab 10 9 GE/ µl Reaktionsvolumen eine Zunahme
des Fluoreszenzsignals vom real-time Gerät nicht mehr erkannt werden konnte. Der
Grenzwert entspricht einer Menge von 1x 10 12 GE pro ml Plasmidlösung. Da bei
infizierten Schweinen mit einer maximalen Ausscheidung von etwa 7x 10 8 Erregern
pro Gramm Kot zu rechnen ist (SMITH u. MCORIST 1997), liegt die obere
Nachweisgrenze über der zu erwartenden Erregermenge in einer Probe. In dieser
126

Diskussion
Studie betrug die maximal nachgewiesene Erregermenge in Proben natürlich
infizierter Schweine etwa 5x 10 6 GE / µl Reaktionsvolumen und war damit weit
unterhalb der oberen Nachweisgrenze.
Eine exakte Quantifizierung von L. intracellularis war mit den bislang beschriebenen
PCRs zum Nachweis spezifischer Genomfagmente nicht möglich resp. nicht
durchgeführt worden. Konventionelle PCRs müssen im Anschluss an die eigentliche
Reaktion ausgewertet werden und führen nur zu qualitativen oder semiquantitativen
Ergebnissen (HIGUCHI et al. 1992). Eine bereits beschriebene real-time PCR zum
Nachweis von L. intracellularis ist für eine Quantifizierung nicht validiert worden
(LINDECRONA et al. 2002).
In der vorliegenden Untersuchung wurden über die Nachweis- und
Quantifizierungsgrenzen hinaus weitere Güteparameter ermittelt, die zur Beurteilung
einer quantitativen Messmethode notwendig sind. Bei der Anwendung einer solchen
Methode dürfen nach allgemeiner Auffassung nur Werte zur Quantifizierung
herangezogen werden, die im Kalibrationsbereich des Testes liegen. Der
Kalibrationsbereich muss ein geeignetes Maß an Präzision und Linearität aufweisen
(ANON. 1998b). Der Kalibrationsbereich der hier beschriebenen real-time PCR
wurde an der Standardkurve berechnet und umfasst den Bereich von 10 0 bis 10 7 GE
/ µl Reaktionsvolumen. Ein ähnlicher, jedoch kleinerer Kalibrationsbereich (10 4 bis
10 9 Plasmide pro ml Ausgangsmaterial, das entspricht 10 1 bis 10 6 Plasmide pro µl)
wurde auch in der quantitativen real-time PCR zum Nachweis des porcinen
Circovirus Typ 2 ermittelt (OLVERA et al. 2004). Die untere Quantifizierungsgrenze
der real-time PCR beträgt 10 1 GE / µl Reaktionsvolumen, da sich die Ct-Werte der
Konzentrationsstufen 10 0 und 10 -1 GE / µl nicht mehr signifikant unterscheiden. Eine
Zuordnung von Ct-Werten zu einem Gehalt von GE darf unter diesen Umständen
nicht mehr erfolgen. Konzentrationen von mehr als 10 7 GE/ µl Reaktionsvolumen
führen zu Ct-Werten, die ebenfalls nicht mehr proportional zur eingesetzten Menge
der Ziel-DNA sind. Aus diesem Grund ist auch hier die Linearität der Ct-Werte nicht
mehr gegeben und bedingt somit die obere Quantifizierungsgrenze von 10 7 GE / µl
Reaktionsvolumen.
127

Diskussion
Die Effizienz einer Amplifikation hat für die Quantifizierung von Genomfragmenten
mittels real-time PCR eine herausragende Bedeutung und muss für Probe und
Standard gleich sein (FRONHOFFS et al. 2002). In der hier beschriebenen real-time
PCR ist die zu amplifizierende Sequenz in der Probe und im Plasmid für den
Standard identisch, so dass eine identische Effizienz für die Reaktionen
angenommen werden kann. Zu Beginn einer PCR kommt es theoretisch nach jedem
Reaktionszyklus zu einer Verdopplung der Ziel-DNA (LORKOWSKI u. THIEMANN
2006). Nach 3,33 Zyklen ist entsprechend eine Verzehnfachung der ursprünglichen
Menge der target-DNA anzunehmen; die Effizienz einer solchen Reaktion entspräche
100 %. Die Effizienz einer real-time PCR wird aus der Steigung der Standardkurve
berechnet, die idealerweise -3,33 beträgt (FRONHOFFS et al. 2002). In der hier
entwickelten real-time PCR beträgt die Steigung der Standardkurve -3,329. Aus
diesem Wert lässt sich eine Effizienz von 99,7 % ableiten, die als ideal zu bewerten
ist.
5.1.5 Präzision
Die Präzision eines quantitativen Messverfahrens entspricht der
Standardabweichung, die bei Messwiederholungen an immer denselben,
homogenen Proben erreicht wird. Grundsätzlich wird zwischen der Wiederhol- und
der Vergleichspräzision unterschieden. Die Präzision ist in der Regel von der
Konzentration des Analyten in der Probe abhängig und sollte für die jeweilige
Konzentrationsstufe angegeben werden (ANON. 1998b). Nach allgemeiner
Auffassung soll der Validierungsparameter „Präzision“ für bioanalytische Verfahren
einen Grenzwert von 15 % relativer Abweichung vom Mittelwert nicht überschreiten
(ANON. 2001). Andere Guidelines setzen diesen Grenzwert auf 20 % fest und
beurteilen erst eine relative Abweichung von 30 % als überhöht (ANON. 2004a). Die
Wiederholpräzision wurde in der vorliegenden Untersuchung anhand der
Standardkurve und an Proben natürlich infizierter Schweine geprüft. Die größte
Standardabweichung betrug 1,07 Cts bei einer Konzentration von 10 2 GE / µl
Reaktionsvolumen. Die übrigen Werte lagen unterhalb von 0,58 Cts. Daraus
errechnete sich eine Wiederholpräzision, die für die Plasmidlösung zwischen 96,3
und 99,1 % liegt. Die wiederholte Untersuchung von Proben natürlich infizierter
Schweine ergab, dass die Werte für die Menge von GE konstant innerhalb der
128

Diskussion
einfachen Standardabweichung der jeweiligen Konzentrationsstufe liegen. Die
maximale Standardabweichung betrug jeweils 0,37 vom mittleren Ct-Wert. Daraus
folgt, dass die Wiederholpräzision einen Wert von mindestens 95,8 % erreicht. Da
die Wiederholpräzision immer größer als 95 % und somit sicher innerhalb der
beschriebenen Grenzen lag, ist die Präzision bei Wiederholungsuntersuchung
gegeben.
Die Vergleichspräzision wurde an Verdünnungsreihen der Plasmidlösung und an
Proben natürlich infizierter Schweine bestimmt. Um die Bedingungen für den Test
zufällig zu variieren (ANON. 1998a), wurden die Proben an unterschiedlichen Tagen
von insgesamt drei verschiedenen Untersuchern bearbeitet und analysiert. Die
Untersuchung der Plasmidverdünnungen führte zu Ergebnissen, die mit einer
relativen Standardabweichung zwischen 0,49 und 2,6 %, immer „präzise“ waren. Die
Quantifizierung spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis in Proben
natürlich infizierter Schweine ergab eine Streuung der Messwerte, die innerhalb der
einfachen Standardabweichung (0,39) lag. Lediglich bei zwei Proben lag je ein Wert
außerhalb der einfachen, jedoch innerhalb der zweifachen Standardabweichung. Für
diese lag die Vergleichspräzision bei 76,3 % und 82,1 %, wobei eine erhöhte relative
Standardabweichung in einer Probe mit einer Quantität von etwa 10 2 GE / µl
Reaktionsvolumen festgestellt wurde. Die Betrachtung der Standardkurve lässt für
Werte von ≤10 2 GE / µl Reaktionsvolumen eine höhere Standardabweichung
erwarten, so dass die Ergebnisse für diese Konzentrationsstufen durchaus als
präzise beurteilt werden dürfen. Ergebnisse mit einer relativen Standardabweichung
von bis zu 20 % werden auch in internationalen Richtlinien noch als präzise
bezeichnet, wobei dort eine erst eine relative Standardabweichung von >30 % als
überhöht bezeichnet wird (ANON. 2004a).
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Ergebnisse dieser real-time
PCR sowohl unter gleichen wie auch unter variablen Bedingungen sowohl
wiederholbar als auch vergleichbar und damit präzise sind.
5.1.6 Interne Positivkontrolle und Inhibitoren
Zur Qualititätssicherung in der PCR-Diagnostik muss, entsprechend einem Leitfaden
der AKS, eine externe oder interne Amplifikationskontrolle oder eine Entfernung von
129

Diskussion
Inhibitoren während der Probenaufbereitung durchgeführt werden (ANON. 2005b).
Die in dieser Arbeit beschriebene Methode schließt eine externe
Amplifikationskontrolle, eine interne Amplifikationskontrolle und eine
Probenaufbereitung zur Entfernung von Inhibitoren ein (DNA-Extraktion mittels
QIAamp ® DNA Stool Mini Kit). Durch die Probenaufbereitung nach dem genannten
Verfahren können Inhibitoren aus Kot mit einer angemessenen Sicherheit entfernt
werden (NATHUES 2007). Das QIAamp ® DNA Stool Mini Kit war in einer
vergleichenden Untersuchung anderen Methoden einer Probenaufbereitung durch
Kochen oder Phenol/Chlorophorm-Präzipitation deutlich überlegen (JACOBSON et al.
2004). Durch die adäquate Probenaufbereitung und sichere Entfernung von
Inhibitoren kann die Sensitivität der PCR an Kotproben zum Nachweis spezifischer
Genomfragmente von L. intracellularis von 38 % auf 88,2 % gesteigert werden
(KNITTEL et al. 1997, SUH et al. 2000).
Während der gesamten Untersuchung konnte, wenn keine spezifischen
Genomfragmente von L. intracellularis in den Proben nachzuweisen waren, eine
Amplifikation der IPC-DNA festgestellt werden. In Übereinstimmung mit früheren
Untersuchungen kann davon ausgegangen werden, dass mit der Probenaufbereitung
Inhibitoren sicher entfernt wurden. Da die Sensitivität und die Effizienz einer PCR
häufig durch Inhibitoren beeinflusst werden (WILSON 1997), weisen auch die hohe
Sensitivität und die hohe Effizienz der real-time PCR auf eine Abwesenheit
inhibitorischer Substanzen in der Reaktion hin. Durch die Verwendung der IPC
wurden exogene DNA und die entsprechenden Primer in die Reaktion eingebracht.
Um den möglichen Einfluss der Koamplifikation zu minimieren, wurde lediglich eine
minimale Menge der IPC eingesetzt, die weit unter der vom Hersteller empfohlenen
Konzentration liegt, eine Amplifikation aber gerade noch erkennen lässt. Trotzdem
musste überprüft werden, dass auch diese Koamplifikation nicht zu einer
Beeinflussung der Amplifikation von Ziel-DNA führt. Solch ein Einfluss könnte die
Effizienz der eigentlichen real-time PCR herabsetzen und die Ergebnisse verfälschen
(BANGSOW et al. 2007). Anhand der Untersuchung von Plasmiden in
unterschiedlichen Konzentrationen sowohl mit als auch ohne IPC konnte gezeigt
werden, dass es zu keiner signifikanten Abweichung der Ct-Werte in der jeweiligen
Konzentrationsstufe kam. Aus diesem Grund kann davon ausgegangen werden,
dass die Amplifikation der IPC-DNA keinen Einfluss auf die Effizienz der real-time
PCR hat.
130

5.1.7 Wiederfindung
Diskussion
Die Wiederfindungsrate beschreibt die Ausbeute der gesamten
Untersuchungsmethode (WELLMITZ u. GLUSCHKE 2004). Da mittels PCR nur die
DNA amplifiziert werden kann, die auch isoliert worden ist, muss die
Probenaufbereitung in die Entwicklung der Methode eingehen. Nach einer DNA-
Extraktion aus Probenmaterial wird grundsätzlich nicht die gesamte Menge DNA ins
Eluat überführt (BURKARDT 2000). Mit der hier beschriebenen Methode zur
Quantifizierung von L. intracellularis ist eine Wiederfindungsrate von 1,8 % bis 3,5 %
zu erreichen, was einem Verlust von etwa ein bis zwei Magnituden entspricht. Der
Verlust von mindestens einer Magnitude kann auf die Verwendung des QIAamp ®
DNA Stool Mini Kits zurückgeführt werden, bei dem es nach Aufbereitung von
Kotproben während der Zelllysis bereits zu einem Verlust von Ziel-DNA kommt (LI et
al. 2003). Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei der Aufbereitung anderer komplexer
Probenmatrices wie Blut (hier mit dem QIAamp ® DNA Blood Mini Kit) erzielt; hier
betrug die Wiederfindungsrate 5 % für die Ziel-DNA (QUEIPO-ORTUNO et al. 2007).
Die für den eigenen Test ermittelte Wiederfindungsrate liegt damit durchaus in einem
Bereich, der nach dem Stand der Wissenschaft zu erwarten war. Andere Methoden
der Probenaufbereitung wurden nicht überprüft, weil das QIAamp ® DNA Stool Mini
Kit in einer vergleichenden Untersuchung mit drei unterschiedlichen Verfahren die
höchste Effektivität zur DNA-Exktration aus Kotproben gezeigt hat (MCORIST et al.
2002).
5.1.8 Diagnostische Sensitivität und Spezifität
Die diagnostische Sensitivität und Spezifität der real-time PCR wurde anhand eines
Vergleiches von Ergebnissen aus einer multiplex-PCR zum Nachweis spezifischer
Genomfragmente von L. intracellularis, B. hyodysenteriae und B. pilosicoli berechnet
(NATHUES 2007). Insgesamt wurden 300 Proben mit der real-time PCR untersucht,
die vorab mit der multiplex-PCR zu 50 % positiv resp. negativ für Genomfragmente
von L. intracellularis beurteilt worden waren. Die Proben stammten aus
Einsendungen zur Routinediagnostik. In der real-time PCR konnten in 81,7 % der
131

Diskussion
Proben spezifische Genomfragmente von L. intracellularis nachgewiesen werden.
Von 150 Proben, die mittels der multiplex-PCR als negativ beurteilt wurden, waren
66 % in der real-time PCR positiv. Der überwiegende Teil dieser Proben wies einen
Gehalt von GE unterhalb der Quantifizierungsgrenze auf. Die Diskrepanz der
Ergebnisse aus der real-time PCR und der multiplex-PCR kann somit durch die
niedrigere Nachweisgrenze der real-time PCR plausibel erklärt werden. Die große
Anzahl „falsch positiver“ Proben in der real-time PCR führt dazu, dass die
diagnostische Spezifität nur 34 % beträgt. Die diagnostische Sensitivität ist dagegen
mit 97,3 % sehr hoch. In lediglich vier Proben, die in der multiplex-PCR positiv waren,
konnte mittels real-time PCR keine spezifische DNA amplifiziert werden.
Da für den Nachweis von L. intracellularis derzeit kein „Goldstandard“ definiert ist,
könnte umgekehrt die real-time PCR für die Bewertung der diagnostischen
Sensitivität und Spezifität der multiplex-PCR herangezogen werden. Die Sensitivität
resp. Spezifität der multiplex-PCR beträgt dann 59,6 % resp. 92,7 %. Die immer noch
hohe Spezifität der Methode ist durch die Methodik und die Spezifität der Primer
bedingt und liegt durchaus in einem Bereich, der für PCR-Verfahren üblich ist. Die
niedrige Sensitivität im Vergleich zur real-time PCR ist ebenfalls plausibel, weil die
Detektion von Fluoreszenzsignalen mittels Kamera der visuellen Analyse von
Agarosegelen mit dem menschlichen Auge merklich überlegen ist.
5.1.9 Robustheit
Die Robustheit eines Testes beschreibt die Sicherheit der Ergebnisse, nachdem
bewusst Änderungen hinsichtlich der Ausführung der Untersuchung vorgenommen
wurden oder der Test unter den Bedingungen der Routinediagnostik angewendet
wird (ANON. 1998b). Das Ausmaß bewusster Änderungen kann nicht vorhergesagt
werden und ist daher auch nicht abschließend definiert. In der vorliegenden
Untersuchung wurden Testparameter weit über ein Maß hinaus verändert, das
während einer Testanwendung in der Routinediagnostik zu erwarten wäre. Die
Ergebnisse von sechs quantifizierbaren Proben zeigten keine deutlichen
Abweichungen zwischen der ersten Untersuchung gemäß Standardprotokoll und
sechs weiteren Untersuchungen mit veränderten Parametern. Aus diesem Grund
wird der Test als sehr robust und ist für die Routinediagnostik geeignet bewertet.
132

Diskussion
5.1.10 Anwendung des Testverfahrens in der Diagnostik
Die real-time PCR wurde mit dem Ziel entwickelt, die Methode zur Bearbeitung
wissenschatlicher Fragestellungen, aber auch in der Routinediagnostik anzuwenden.
Der Test soll die Möglichkeit bieten, zwischen verschiedenen Erregermengen im Kot
und somit auch Erregerausscheidung vom Tier zu differenzieren. Eine Interpretation
der Ergebnisse setzt jedoch voraus, dass Korrelationen zwischen der
ausgeschiedenen Erregermenge und der Ausprägung klinischer resp.
pathomorphologischer Krankheitsmerkmale bekannt sind. Besteht ein solcher
Zusammenhang, könnte in Analogie zum quantitativen Nachweis des porzinen
Circovirus Typ 2 ein „cut-off“ festgelegt und dazu verwendet werden, zwischen der
Ausscheidung klinisch relevanter resp. nicht relevanter Erregermengen zu
unterscheiden (OLVERA et al. 2004). In einem Infektionsversuch mit L. intracellularis
konnte bereits gezeigt werden, dass eine positive Korrelation zwischen der
inokulierten Erregermenge und der Ausprägung der Krankheit besteht (GUEDES et
al. 2003b).
Ein quantitatives Nachweisverfahren für L. intracellularis eignet sich potentiell zur
Untersuchung folgender Fragestellungen:
� Feststellung der minimalen Infektionsdosis für die PPE; bis heute nicht
bekannt (GUEDES et al. 2003b).
� Identifikation möglicher Infektionsquellen; „carrier“-Tiere und kontaminierte
Vektoren werden vermutet (JORDAN et al. 2004, GUEDES et al. 2004).
� Diskriminierung geimpfter und ungeimpfter Tiere im direkten Vergleich; mit
den derzeit zur Verfügung stehenden Methoden ist das nicht möglich
(GUEDES u. GEBHART 2003a). KROLL et al. stellten 2004 die Hypothese auf,
dass geimpfte Tiere „weniger“ Erreger ausgescheiden.
In epidemiologischen Studien zur Infektion mit L. intracellularis wurde bislang die
Erregerausscheidung nur qualitativ betrachtet. Die real-time PCR bietet nun die
Möglichkeit, in Verlaufs- oder Querschnittsuntersuchungen nicht nur die Anzahl
ausscheidender Schweine, sondern zusätzlich auch die ausgeschiedene
Erregermenge individuell zu erfassen.
133

Diskussion
5.2 Verteilung von L. intracellularis in Kotproben
Die Verteilung von L. intracellularis in einer Probenmatrix war bis heute nicht
untersucht. Für andere Erreger (z.B. Salmonella spp.) sind ungleiche Verteilungen
beschrieben, was bei der Untersuchung entsprechend berücksichtigt werden muss.
Da eine gleichmäßige Verteilung des Erregers in der Probenmatrix und/oder ein
geeignetes Verfahren zur Homogenisierung die Grundlage für eine quantitative
Bestimmung sind, wurden zwei Verfahren zur Homogenisierung von Kotproben
überprüft.
Im ersten Protokoll wurden native Kotproben eine Minute lang mechanisch gemischt,
während die Proben im zweiten Protokoll mit einer Flüssigkeit vermengt wurden, um
eine bessere Verteilung der Bakterien in der sehr inhomogenen und hoch viskösen
Matrix zu erreichen. In wiederholten Untersuchungen derselben Proben konnten
immer die gleichen Ergebnisse erzielt werden, die ermittelte Menge von GE lag
jedoch unterhalb der Menge, die bei einfacher Homogenisierung naiver Kotproben
gemessen wurden. Diese Tatsache lässt auf einen Verdünnungseffekt durch die
Zugabe von Flüssigkeit schließen, der die Probenqualität nicht signifikant verbessert.
Die Homogenisierung naiver Proben allein durch intensives Rühren, führte ebenfalls
zu einheitlichen Ergebnissen in den Wiederholungsuntersuchungen.
Abschließend kann die Verteilung von L. intracellularis in Kotproben zwar immer
noch nicht als gleichmäßig angenommen werden, es konnte aber gezeigt werden,
dass eine manuelle Homogenisierung ausreicht, um anschließend an einer
repräsentativen Teilprobe den Gehalt spezifischer Genomfragmente von L.
intracellularis in der Probe zu bestimmen.
134

Diskussion
5.3 Einfluss der Lagerung auf den Gehalt von L. intracellularis in
Kotproben
Der mögliche Einfluss einer Lagerung von Kotproben auf den Gehalt spezifischer
Genomfragmente von L. intracellularis wurde über einen Zeitraum von 132 Tagen
sowohl bei Kühlschranktemperatur als auch bei tieferen Temperaturen von -20 °C
resp. -70 °C überprüft. Die Dauer der Lagerung über schritt die unter
Laborbedingungen übliche Lagerdauer bei weitem. Es konnte gezeigt werden, dass
die Menge von GE von L. intracellularis bis zum letzten Untersuchungstag
unabhängig von der Temperatur während der Lagerung nicht beeinflusst wurde. Es
wird vermutet, dass die Zahl von GE auch über diesen Zeitraum hinaus noch für eine
gewisse Zeit konstant geblieben wäre. Übereinstimmend konnte mit einer nested-
PCR gezeigt werden, dass L. intracellularis-positive Kotproben noch nach sechs
Monaten Lagerung bei -80 °C positiv waren. Erst nac h zehn Monaten waren keine
spezifischen DNA-Sequenzen mehr nachzuweisen (JONES et al. 1993). Da mit der
nested-PCR der Erregergehalt nicht quantifiziert werden konnte, war eine Aussage
über die Menge verbleibender Ziel-DNA in den Proben nach Lagerung nicht möglich.
Die Überlebens- und Infektionsfähigkeit von L. intracellularis in Kot außerhalb des
Wirtes wird mit ein bis zwei Wochen angegeben (MCORIST u. GEBHART 1999a,
COLLINS et al. 2000). Dennoch kann der Erreger in Kotproben wesentlich länger
nachgewiesen werden, da die Stabilität der DNA und ihre Eignung als Matrize
während der PCR nur mittelbar von der Vitalität des Erregers abhängig ist. In Stuhl-
bzw. Kotproben kommt es nach längerer Lagerung, vor allem durch Gallensalze und
–säuren, zur Degradation von DNA, die dann nicht mehr für eine PCR verwendet
werden kann (DEUTER et al. 1995). In der real-time PCR wird eine sehr kurze
Zielsequenz von 75 bp detektiert. Die Wahrscheinlichkeit, dass gerade innerhalb
dieser Zielsequenz die DNA durch Substanzen im Kot abgebaut wird, ist wesentlich
geringer, als es bei einem längeren Fragment der Fall wäre. Konventionelle PCR-
Verfahren, die eine Matrize von bspw. 319 bp (KNITTEL et al. 1996) verwenden,
werden dagegen schneller von einer Degradation der DNA beeinträchtigt.
135

5.4 Schlussfolgerungen
Diskussion
Die in dieser Arbeit entwickelte real-time PCR zum Nachweis spezifischer
Genomfragmente von L. intracellularis wurde in Anlehnung an nationale und
internationale Richtlinien umfangreich validiert. Neben der theoretischen und
praktischen Überprüfung der analytischen Spezifität von Primer und Sonde, wurde
die diagnostische Spezifität und Sensitivität an 300 Proben mit bekanntem Status
überprüft. Die real-time PCR ist deutlich sensitiver als die zum Vergleich verwendete
multiplex-PCR (NATHUES 2007). Ein „Goldstandard“ für den Nachweis von L.
intracellularis ist derzeit nicht definiert; die real-time PCR würde sich aber aufgrund
ihrer Spezifität und Sensitivität durchaus dafür eignen.
Die Güteparameter „Präzision“, „Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen“,
„Robustheit“ und „Wiederfindung“ haben die Erwartungen an eine Methode zur
Erregerquantifizierung an Kotproben als Ausgangsmaterial deutlich übertroffen.
Eine Inhibition, die wiederkehrend im Zusammenhang mit PCR an Kotproben in der
Literatur diskutiert wird, konnte in keiner der Untersuchungen festgestellt werden.
Aus diesem Grund wird das Verfahren zur DNA-Isolierung und Entfernung von
Inhibitoren aus der Probenmatrix als sehr gut beurteilt.
Im Gegensatz zu Untersuchungen im Rahmen standardisierter wissenschaftlicher
Studien wird Probenmaterial im Rahmen der Routinediagnostik häufig nach
Lagerung von unbekannter Dauer und nicht selten auch nach ungekühltem Transport
untersucht. Die Tatsache, dass Temperatur und Dauer der Probenlagerung keinen
Einfluss auf das Ergebnis nehmen, lässt den Schluß zu, dass sich der Test auch zur
Untersuchung von Probenmaterial in der Routinediagnostik eignet.
Die real-time PCR ermöglicht in epidemiologischen Studien eine genauere
Charakterisierung der Erregermenge in Proben. Dadurch können Aussagen
bezüglich des Verlaufs der Infektion mit L. intracellularis im Bestand zukünftig
präzisiert werden.
Schlussendlich kann die real-time PCR, falls eine enge Korrelation zwischen
pathologischer Veränderungen im Tier und ausgeschiedener Erregermenge besteht,
die pathologische Untersuchung von Schweinen in gewissem Maße ersetzen resp.
die Zahl zu untersuchender Tiere reduzieren.
136

6 Zusammenfassung
Kerstin Holthaus
Zusammenfassung
„Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time PCR in
Kotproben von Schweinen“
Lawsonia (L.) intracellularis ist der Erreger der proliferativen Enteropathie beim
Schwein. Diese Darmerkrankung ist weltweit verbreitet und tritt in verschiedenen
Verlaufsformen auf. Der Nachweis einer Infektion mit L. intracellularis erfolgt intra
vitam indirekt mittels blutserologischer Verfahren und/oder durch den direkten
Erregernachweis mittels PCR resp. IFT an Kotproben. Die derzeit verfügbaren
Methoden zum direkten Nachweis bieten allerdings nicht die Möglichkeit, zwischen
einer natürlichen Infektion mit dem Wildtyp und einem möglichen Nachweis des
Impfstammes zu unterscheiden. Darüber hinaus kann anhand der Ergebnisse einer
qualitativen PCR lediglich eine qualitative Bewertung (ja/nein) aber keine quantitative
Aussage zu Erregermenge getroffen werden.
Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, eine sensitive und hochspezifische
Nachweismethode zu entwickeln und zu validieren, die eine Quantifizierung des
Gehaltes spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis in Kotproben von
Schweinen zulässt. Darüber hinaus wurden mögliche Einflüsse der Dauer und der
Temperatur während einer Probenlagerung auf den Nachweis spezifischer
Genomfragmente von L. intracellularis überprüft. Die Verteilung des Erregers in
Kotproben und ein Einfluss der Verfahren zur Homogenisierung von Probenmaterial
wurden ebenfalls untersucht.
Die real-time PCR wurde in Anlehnung an nationale und internationale Richtlinien
umfassend validiert. Die analytische Spezifität der Primer und der Sonde wurde an
verschiedenen Erregerspezies überprüft, die in Kotproben vom Schwein in
bedeutender Menge vorkommen können. In diesen Untersuchungen traten keine
„falsch positiven“ Resultate auf. Die Nukleotidsequenz der PCR-Produkte ergab eine
100 %ige Übereinstimmung mit einem Sequenzabschnitt des Typstammes von L.
intracellularis. Ein Standard zur Quantifizierung mittels der ∆∆Ct-Methode war aus
Plasmiden hergestellt worden, die als Insert eine das PCR Produkt enthaltende
Sequenz von L. intracellularis trugen. Eine Verdünnungsreihe dieser Plasmide wurde
137

Zusammenfassung
auch zur Erstellung der Standardkurve verwendet. Die Steigung dieser
Standardkurve resp. -gerade beträgt –3,329, was einer Effizienz der real-time PCR
von 99,7 % entspricht. Der Kalibrationsbereich umfasst Konzentrationsstufen von 10 0
bis 10 7 GE / µl Reaktionseinheit. Die untere Nachweisgrenze der real-time PCR
beträgt 1 GE im Reaktionsvolumen; die obere Nachweisgrenze ist 10 8 GE / µl
Reaktionsvolumen. Eine absolute Quantifizierung ist im Bereich von 10 1 bis 10 7 GE /
µl Reaktionsvolumen möglich. Die Präzision wurde in Wiederhol- und in
Vergleichsuntersuchungen bestimmt und konnte für alle Konzentrationsstufen im
Kalibrationsbereich bestätigt werden (relative Standardabweichung ≤ 15 % resp. ≤
20 %, Grenzwert 30%).
Die Erkennung einer möglichen Inhibition der PCR Reaktion wird durch eine interne
Positivkontrolle gewährleistet. Ein möglicher Einfluss der Amplifikation dieser
Kontrolle auf die Quantifizierung wurde geprüft und ausgeschlossen. Die
Probenaufbereitung und Isolierung von DNA mit dem QIAamp ® DNA Stool Mini Kit
sind demnach geeignet, Inhibitoren sicher aus der Probenmatrix zu entfernen. Die
Wiederfindungsrate für target-DNA von L. intracellularis in Kotproben betrug
zwischen 1,8 % und 3,5 %. In einer vergleichenden Untersuchung an 300 Kotproben,
die zuvor mittels multiplex-PCR zum Nachweis spezifischer Genomfragmente von L.
intracellularis charakterisiert wurden, konnte die Nachweisrate von 50 % auf 81,7 %
erhöht werden. Aus diesen Ergebnissen wird abgeleitet, dass die real-time PCR
deutlich sensitiver als die multiplex-PCR ist. Der Test zeichnet sich durch eine hohe
Robustheit aus und ist für die Routinediagnostik geeignet.
Die Verteilung von L. intracellularis in Kotproben ist ausreichend homogen, wenn die
Probe unmittelbar vor der Untersuchung manuell durchmischt wird. Die Zugabe von
Flüssigkeit zum Probenmaterial, um dessen Viskosität herabzusetzen und so eine
bessere Verteilung zu erreichen, hatte lediglich einen Verdünnungseffekt bei
gleichbleibender Homogenität zur Folge.
Der Einfluss einer Lagerung von Proben auf den Gehalt spezifischer
Genomfragmente von L. intracellularis wurde für verschiedene Temperaturen (6 °C, -
20 °C und -70 °C) und unterschiedliche Lagerdauer ü berprüft. Der Gehalt von L.
intracellularis war unabhängig von der Temperatur bis zum Ende der Untersuchung
(Tag 132) konstant.
138

7 Summary
Kerstin Holthaus
Summary
„Quantitative detection of Lawsonia intracellularis by real-time PCR in faecal
samples from pigs“
Lawsonia (L.) intracellularis is the etiologic agent of proliferative enteropathy in swine.
This intestinal disease is common worldwide and occurs in different forms. The
infection with L. intracellularis is verified intra vitam either indirectly via serology
and/or directly via the detection of the causative organism by PCR resp. IFA in faecal
samples. However, current available methods of direct detection do not offer the
possibility of distinguishing between a natural infection with the wild type and an
active immunization. Furthermore, the results of a qualitative PCR can only
distinguish between „yes“ or „no“, i.e. if the animal is infected or not. No evidence is
gained about the amount of L. intracellularis within the sample.
The aim of this study was to develop and to validate a sensitive and highly specific
detection method, which allows the quantification of the amount of L. intracellularis in
porcine faecal samples. Additionally, the possible influences of storage temperature
and duration on the sample as to the detection of L. intracellularis were tested. The
distribution of the agent in faecal samples and the influence of the method of sample
homogenization were also analysed.
This real-time PCR was validated comprehensively according to national and
international guidelines. The analytical specificity of primer and probe was tested on
several bacterial strains, all of which can occur in porcine faecal samples in
significant quantities. In this study no „false positive“-results could be detected.
Sequences of PCR-products agree with the sequence of the type strain of L.
intracellularis to 100%.
A standard, used for quantification by ∆∆Ct-method, was made from plasmids which
included the PCR-product containing sequence from L. intracellularis. A dilution
series of these plasmids was also employed to establish the standard curve. The
slope of the standard curve was -3,329. The efficiency of the real-time PCR therefore
is 99,7%. The range contains concentration stages from 10 0 to 10 7 genome
equivalents / µl reaction unit. The lower detection limit of the real-time PCR is 1
139

Summary
genome equivalent per reaction volume; the upper detection limit is 10 8 genome
equivalents / µl reaction volume. An absolute quantification is possible within the
range of 10 1 to 10 7 genome equivalents / µl reaction volume. The precision was
determined as repeatability and intermediate precision and was confirmed for all
concentration stages of the range (relative standard deviation ≤ 15% and ≤ 20%,
respectively, limit 30%).
The identification of a possible inhibition of the PCR reaction is ensured by an
internal amplification control. A possible influence of the amplification of this control
on the quantification was tested and excluded. The use of the QIAamp ® DNA Stool
Mini Kit for sample preparation and isolation of DNA is thus suitable for ensuring the
deletion of inhibitors from sample matrix. The recovery of genome equivalents from
L. intracellularis in faecal samples amounted between 1,8% and 3,5%.
In a comparative study of 300 faecal samples, which were characterized previously
by multiplex-PCR to detect specific target-DNA of L. intracellularis, the detection rate
was increased from 50% to 81,7%. According to these results, the real-time PCR is
considerably more sensitive than multiplex-PCR. The test stands out due to a high
robustness and is suitable for routine diagnostics.
The distribution of L. intracellularis in faecal samples is homogenous, if the sample is
stirred manually immediately prior to the initialisation of the test. The addition of a
liquid to the sample in order to decrease viscosity and thereby achieve a better
distribution, merely lead to a dilution of the sample.
The influence of the sample storage on the content of specific genome fragments of
L. intracellularis was examined at different temperatures (6 °C, -20 °C and -70 °C)
and duration periods. The content was constant independently of the temperature
until end of the examination (day 132), measured in GE by L. intracellularis.
140

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9 Anhang
Anhang
Tabelle 45: Zusammensetzung des Tris-EDTA Puffers
Bestandteil Herstellung
0,5 M EDTA, pH 8,0
200 µl
1,0 M Tris, pH 8,0
1 ml
Zweifach destilliertes Wasser ad 100 ml
Filtern und autoklavieren
Tabelle 46: Werte zur Berechnung der Standardkurve
Log der
eingesetzten
Konzentration an
GE / µl
Reaktionsvolumen
169
EDTA 93,05 g
Zweifach destilliertes Wasser 350 ml
NaOH (etwa 10 g, Einstellen der Lösung
auf pH 8,0)
Zweifach destilliertes Wasser ad 500 ml
Tris [Tris (Hydroxymethyl) Aminomethan]
60,57 g
Zweifach destilliertes Wasser 350 ml
HCl (etwa 21 ml, Einstellen der Lösung
auf pH 8,0)
Zweifach destilliertes Wasser ad 500 ml
Ct-Wert Mittelwert der Ct-
Werte
Gesamt- Mittelwert
der log-Stufe
7 11.98 11.9883333
7 12.05 12.03
7 12.06
7 12.04
7 11.99 12.03
7 12.06
7 11.75
7 11.8 11.7866667
7 11.81
7 12.09

Anhang
7 12.12 12.1066667
7 12.11
6 15.17 15.3316667
6 15.13 15.1233333
6 15.07
6 15.18
6 15.14 15.1266667
6 15.06
6 16.1
6 16.14 16.1466667
6 16.2
6 15
6 14.96 14.93
6 14.83
5 18.99 19.53
5 18.88 18.9433333
5 18.96
5 19.51
5 19.53 19.5466667
5 19.6
5 19.84
5 19.73 19.8
5 19.83
5 (27.29)*
5 19.83 19.83
5 19.83
4 22.79 23.0983333
4 22.61 22.6866667
4 22.66
4 23.23
4 23.3 23.2633333
4 23.26
4 23.24
4 23.03 23.1333333
4 23.13
4 23.26
4 23.39 23.31
4 23.28
3 26.38 26.8566667
3 26.47 26.39
3 26.32
3 26.91
3 26.8 26.8566667
3 26.86
3 26.95
3 26.83 26.9366667
3 27.03
3 27.09
3 27.26 27.2433333
3 27.38
2 29.62 28.9408333
2 29.66 29.5933333
2 29.5
2 30.37
2 30.07 30.0933333
170

Anhang
2 29.84
2 28.01
2 27.71 27.9266667
2 28.06
2 28.04
2 28.24 28.15
2 28.17
1 33.19 33.8441667
1 33.17 33.0966667
1 32.93
1 34.37
1 34.19 33.99
1 33.41
1 34.48
1 33.36 33.8833333
1 33.81
1 34.63
1 34.26 34.4066667
1 34.33
0 35.24 36.8266667
0 36.04 35.6633333
0 35.71
0 36.46
0 35.44 36.38
0 37.24
0 37.05
0 36.29 38.22
0 (41.32)*
0 37.05
0 36.88 37.0433333
0 37.2
-1 37.38 37.185
-1 36.8 36.8
-1 (41.1)*
-1 37.69 37.375
-1 37.06
* Werte in runden Klammern wurden als Ausreißer nicht mit in die
Berechnungen einbezogen
171

Anhang
Tabelle 47: Quantität von GE / µl Reaktionsvolumen in der Vergleichspräzision an
Kotproben natürlich infizierter Schweine
172
Quantität
Probe 1. Untersucher 2. Untersucher 3. Untersucher
1 5.48 x10 0 1.69 x10 1 1.18 x10 1
2 3.30 x10 1 1.18 x10 2 5.98 x10 1
3 9.38 x10 1 2.04 x10 2 1.42 x10 2
4 9.14 x10 0 1.86 x10 1 1.39 x10 1
5 7.31 x10 3 2.06 x10 4 1.30 x10 4
6 6.02 x10 1 1.49 x10 2 9.94 x10 1
7 0 0 0
8 0 0 0
9 1.04 x10 3 2.33 x10 3 2.14 x10 3
10 3.34 x10 2 1.54 x10 3 1.85 x10 2
Tabelle 48: Quantität von GE / µl Reaktionsvolumen in der Wiederholpräzision an
Kotproben natürlich infizierter Schweine
Probe 1.
Wiederholung
Quantität
2.
Wiederholung
3.
Wiederholung
Standard-
abweichung
1 1.36 x10 6 2.90 x10 5 3.56 x10 5 0,37
2 2.51 x10 5 7.92 x10 4 8.27 x10 4 0,28
3 5.86 x10 5 3.73 x10 5 4.43 x10 5 0,1
4 1.47 x10 4 9.84 x10 3 1.26 x10 4 0,09
5 1.13 x10 3 9.01 x10 2 1.07 x10 3 0,05
6 1.98 x10 2 2.49 x10 2 2.41 x10 2 0,05

Anhang
Tabelle 49: Ergebnisse zur Wiederfindungsrate, angegeben in GE absolut
zugegeben resp. „wiedergefunden“ in 200 mg Kot
zugegeben durch
100 µl
Referenzlösung
2.00 x10 7
„wiedergefunden“ zugegeben durch
5.35 x10 5
6.34 x10 5
1.01 x10 6
6.99 x10 5
1.04 x10 6
4.80 x10 5
4.65 x10 5
173
1 µl
Referenzlösung
2.00 x10 5
„wiedergefunden“
1.76 x10 3
2.90 x10 3
3.97 x10 3
3.76 x10 3
8.16 x10 3
2.29 x10 3
2.49 x10 3
Tabelle 50: Ergebnisse zur Robustheit, angegeben in Quantität GE / µl
Reaktionsvolumen
Quantität
Probe 1. US R1 R2 R3 R4 R5 R6
1 1.42 x10 6 6.60 x10 5 4.69 x10 5 4.56 x10 5 4.08 x10 5 4.27 x10 5 4.52 x10 5
2 2.61 x10 5 9.97 x10 4 7.77 x10 4 7.66 x10 4 7.47 x10 4 6.52 x10 4 7.47 x10 4
3 5.39 x10 5 5.49 x10 5 4.20 x10 5 3.77 x10 5 3.14 x10 5 3.32 x10 5 3.38 x10 5
4 1.40 x10 4 1.86 x10 4 1.39 x10 4 1.25 x10 4 1.25 x10 4 1.26 x10 4 1.36 x10 4
5 1.05 x10 3 1.56 x10 3 1.15 x10 3 1.16 x10 3 1.11 x10 3 9.89 x10 2 1.04 x10 3
6 1.99 x10 2 2.93 x10 2 2.03 x10 2 2.14 x10 2 1.95 x10 2 1.87 x10 2 1.92 x10 2
R1: 12 Stunden bei Raumtemperatur
R2: 10x einfrieren / auftauen
R3: 5 Minuten UV-Licht
R4: pipettieren mit L-Tips
R5: Platte erschüttern
R6: Platte stehen lassen

Anhang
Tabelle 51: Ergebnisse der quantifizierbaren Kotproben nach unterschiedlicher
Probe A:
Lagerungszeit und –temperatur, angegeben in GE / µl Reaktions-
volumen
Untersuchungszeitpunkt
Lagertemperatur
6 °C -20 °C -70 °C
Tag 0, frisch 1.46 x10 4 1.46 x10 4 1.46 x10 4
Tag 3 7.90 x10 3 2.38 x10 4 6.46 x10 3
Tag 7 1.33 x10 4 1.57 x10 4 4.97 x10 3
Tag 14 1.42 x10 4 1.79 x10 4 2.46 x10 4
Tag 28 1.32 x10 4 7.50 x10 3 1.11 x10 4
Tag 56 1.64 x10 4 1.27 x10 4 1.29 x10 4
Tag 132 2.10 x10 4 1.85 x10 4 8.79 x10 3
Probe B:
Untersuchungszeitpunkt
Lagertemperatur
6 °C -20 °C -70 °C
Tag 0, frisch 1.99 x10 2 1.99 x10 2 1.99 x10 2
Tag 3 1.25 x10 2 2.07 x10 2 1.07 x10 2
Tag 7 2.58 x10 2 1.97 x10 2 7.63 x10 1
Tag 14 3.57 x10 2 2.68 x10 2 2.20 x10 2
Tag 28 1.04 x10 2 1.16 x10 2 1.21 x10 2
Tag 56 1.44 x10 2 1.28 x10 2 1.41 x10 2
Tag 132 1.91 x10 2 1.56 x10 2 1.11 x10 2
174

Probe C:
Untersuchungszeitpunkt
Anhang
175
Lagertemperatur
6 °C -20 °C -70 °C
Tag 0, frisch 1.21 x10 2 1.21 x10 2 1.21 x10 2
Tag 3 8.73 x10 1 1.50 x10 2 6.69 x10 1
Tag 7 1.16 x10 2 1.40 x10 2 5.68 x10 1
Tag 14 1.52 x10 2 1.39 x10 2 1.55 x10 2
Tag 28 6.08 x10 1 7.64 x10 1 7.94 x10 1
Tag 56 1.25 x10 2 1.01 x10 2 7.62 x10 1
Tag 132 1.59 x10 2 1.40 x10 2 8.65 x10 1
Probe D:
Untersuchungszeitpunkt
Lagerungstemperatur
6 °C -20 °C -70 °C
Tag 0, frisch 8.59 x10 1 8.59 x10 1 8.59 x10 1
Tag 3 4.13 x10 1 1.33 x10 2 5.31 x10 1
Tag 7 8.04 x10 1 7.94 x10 1 3.15 x10 1
Tag 14 1.22 x10 2 9.64 x10 1 1.34 x10 2
Tag 28 4.12 x10 1 4.70 x10 1 4.34 x10 1
Tag 56 9.01 x10 1 6.84 x10 1 5.63 x10 1
Tag 132 9.47 x10 1 8.81 x10 1 5.49 x10 1

Danksagung
Ich danke Frau Priv.- Doz. Dr. Elisabeth große Beilage für die Überlassung des
interessanten Arbeitsthemas.
Dr. Heiko Nathues danke ich für die wissenschaftliche Unterstützung.
Mein Dank gilt der Firma Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, die mich
finanziell unterstützt hat. Speziell möchte ich mich bei Frau Dr. Ricarda Deitmer für
die freundliche Zusammenarbeit bedanken.
Ganz besonders möchte ich Mechthild und Mechthild danken, die mich in jeder
Hinsicht tatkräftig unterstützt haben und immer ein offenes Ohr für mich hatten. Es
war eine tolle Zeit in „Labor 2“!
Dem Institutsdirektor Univ.- Prof. Dr. Thomas Blaha und den Mitarbeitern der
Außenstelle für Epidemiologie bin ich dankbar für die Freundlichkeit und
Hilfsbereitschaft, die mir in der ganzen Zeit entgegen gebracht wurden.
Ein besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mir das alles ermöglicht und mir immer
mit Rat und Tat zur Seite gestanden haben.
Yvonne danke ich sehr für den moralischen Beistand und die vielen aufmunternden
Gespräche.
Schließlich möchte ich ganz besonders Michael danken, der mich jederzeit geduldig
und liebevoll unterstützt und mir immer wieder neue Motivation gegeben hat.