Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

2.5.1 template
Literaturübersicht
Als template für die PCR dient immer DNA. Diese DNA kann genomischen
Ursprungs sein, es kann aber auch rekombinante DNA in verschiedenen Vektoren
eingesetzt werden (BANGSOW et al. 2007). Die empfohlene Ausgangsmenge für
genomische DNA beträgt etwa 1 bis 100 ng (MÜLLER 2001).
Soll indirekt RNA nachgewiesen werden, muss diese für die PCR zunächst durch ein
Enzym (Reverse Transkriptase) in komplementäre DNA transkribiert werden
(BANGSOW et al. 2007). Auch Amplifikate einer PCR können als template für eine
zweite PCR eingesetzt werden; diese Methode wird dann als nested-PCR bezeichnet
(DIEFFENBACH et al. 1993).
Für einen korrekten Ablauf der PCR ist die Qualität des template wichtig. In der
template-Matrix dürfen keine Inhibitoren der Polymerase vorhanden sein
(DIEFFENBACH et al. 1993).
Die optimale Länge des zu amplifizierenden DNA-Abschnittes beträgt zwischen 0,1
und 1 Kilobasen und wird von der Prozessivität der Polymerase bestimmt. In einer
long range PCR können mittels geeigneter Enzyme und PCR-Protokolle auch
längere DNA-Fragmente amplifiziert werden (LORKOWSKI u. THIEMANN 2006).
2.5.2 Primer
Die Auswahl der Primer bestimmt neben der Qualität des template den Erfolg einer
PCR. Für ein Design der Primer sollten einige wichtige Regeln beachtet werden:
Primer sollten eine Länge von 18 bis 24 bp besitzen. Diese Grenzen sollten nur bei
speziellen Fragestellungen unterschritten werden. Der Gehalt von Guanin (G)- und
Cytosin-(C)-basen sollte etwa 50 % betragen (DIEFFENBACH et al. 1993). Die
Anzahl der Basen bestimmt die Schmelztemperatur der Primer von der Matrize. Die
annealing-Temperatur der Primer ist etwa 5 °C niedriger als der Schmelzpunkt. Die
genaue annealing-Temperatur sollte immer im Versuch bestimmt werden
(BANGSOW et al. 2007), da sie die Ausbeute resp. Effizienz des PCR-Ansatzes
beeinflusst (RYCHLIK et al. 1990). Daneben sollten forward- und reverse-Primer
dieselbe Schmelztemperatur besitzen. Um Primer-Dimere zu vermeiden, sollen
komplementäre Basenpaare an den 3´-Enden nicht vorkommen (DIEFFENBACH et
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