Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

6 Zusammenfassung
Kerstin Holthaus
Zusammenfassung
„Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time PCR in
Kotproben von Schweinen“
Lawsonia (L.) intracellularis ist der Erreger der proliferativen Enteropathie beim
Schwein. Diese Darmerkrankung ist weltweit verbreitet und tritt in verschiedenen
Verlaufsformen auf. Der Nachweis einer Infektion mit L. intracellularis erfolgt intra
vitam indirekt mittels blutserologischer Verfahren und/oder durch den direkten
Erregernachweis mittels PCR resp. IFT an Kotproben. Die derzeit verfügbaren
Methoden zum direkten Nachweis bieten allerdings nicht die Möglichkeit, zwischen
einer natürlichen Infektion mit dem Wildtyp und einem möglichen Nachweis des
Impfstammes zu unterscheiden. Darüber hinaus kann anhand der Ergebnisse einer
qualitativen PCR lediglich eine qualitative Bewertung (ja/nein) aber keine quantitative
Aussage zu Erregermenge getroffen werden.
Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, eine sensitive und hochspezifische
Nachweismethode zu entwickeln und zu validieren, die eine Quantifizierung des
Gehaltes spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis in Kotproben von
Schweinen zulässt. Darüber hinaus wurden mögliche Einflüsse der Dauer und der
Temperatur während einer Probenlagerung auf den Nachweis spezifischer
Genomfragmente von L. intracellularis überprüft. Die Verteilung des Erregers in
Kotproben und ein Einfluss der Verfahren zur Homogenisierung von Probenmaterial
wurden ebenfalls untersucht.
Die real-time PCR wurde in Anlehnung an nationale und internationale Richtlinien
umfassend validiert. Die analytische Spezifität der Primer und der Sonde wurde an
verschiedenen Erregerspezies überprüft, die in Kotproben vom Schwein in
bedeutender Menge vorkommen können. In diesen Untersuchungen traten keine
„falsch positiven“ Resultate auf. Die Nukleotidsequenz der PCR-Produkte ergab eine
100 %ige Übereinstimmung mit einem Sequenzabschnitt des Typstammes von L.
intracellularis. Ein Standard zur Quantifizierung mittels der ∆∆Ct-Methode war aus
Plasmiden hergestellt worden, die als Insert eine das PCR Produkt enthaltende
Sequenz von L. intracellularis trugen. Eine Verdünnungsreihe dieser Plasmide wurde
137