Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

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Quantität GE / µl Reaktionsvolumen 1.00E+06 1.00E+05 1.00E+04 1.00E+03 1.00E+02 1.00E+01 1.00E+00 Ergebnisse Probe D Tag 0, frisch Tag 3 Tag 7 Tag 14 Tag 28 Tag 56 Tag 132 Untersuchungszeitpunkt D, 6 °C D, -20 °C D, -70 °C Abbildung 19: Ergebnisse der Untersuchung von Probe D nach unterschiedlicher Lagerungszeit und –temperatur 119
5 Diskussion Diskussion Die vorliegende Untersuchung wurde mit dem Ziel durchgeführt, eine real-time PCR zum Nachweis spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis in Kotproben zu entwickeln. Die Methode soll über die einfache Detektion hinaus eine absolute Quantifizierung der Erregermenge im Probenmaterial erlauben. Im Anschluss an die Entwicklung der real-time PCR sollte die Methode in Anlehnung an national und international anerkannte Empfehlungen und Richtlinien validiert werden. Abschließend wurden mögliche Einflüsse auf das quantitative Ergebnis, wie etwa die Verteilung des Erregers in der Probenmatrix sowie Dauer und Temperatur während der Probenlagerung untersucht. 5.1 Etablierung und Validierung 5.1.1 Testsystem Die PCR ist die am häufigsten verwendete Methode zum Nachweis spezifischer DNA-Abschnitte (MACKAY 2004). Die Detektion von PCR-Produkten kann konventionell im Anschluss an die PCR mit einer Gelelektrophorese und der anschließenden Färbung der DNA oder real-time mittels fluoreszierender Farbstoffe bzw. Sondentechnologie erfolgen. In der vorliegenden Untersuchung wurde die real- time PCR in Kombination mit der Sondentechnologie als Testsystem verwendet, da dieses Verfahren gegenüber der konventionellen PCR zahlreiche Vorteile bietet. Eine real-time PCR erfordert zum einen keine weitere Behandlung der PCR-Produkte, wodurch das Risiko einer Kontamination minimiert wird (SCHMITTGEN 2001, MACKAY 2004). Zum anderen führt die real-time PCR innerhalb weniger Stunden zu einem Ergebnis (SCHMITTGEN 2001) und ermöglicht so eine deutliche Zeiteinsparung gegenüber der konventionellen PCR. Der größte Vorteil der real-time PCR liegt jedoch in der Möglichkeit, die ursprüngliche Menge spezifischer DNA in einer Probe zu quantifizieren (BUSTIN 2005). Zur Visualisierung der PCR-Produkte wurde in dieser Untersuchung ein spezifisches Detektionssystem, die TaqMan-Sonde, verwendet. Diese Sonde erzeugt nur in 120
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Quantitativer Nachweis von Lawsonia
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3.2.18 Wiederfindungsrate .........
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µg Mikrogramm (x 10 -6 ) µl Mikro
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p.i. post infectionem PCR polymeras
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2.2 Lawsonia intracellularis Litera
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Primer zur spezfischen Detektion Li
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3 Material und Methoden Material un
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Testparameter Definition Bestimmung
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Material und Methoden Tabelle 2: De
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Anhang 7 12.12 12.1066667 7 12.11 6
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Anhang Tabelle 47: Quantität von G
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Anhang Tabelle 51: Ergebnisse der q
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