Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Diskussion
gebildet werden. Vergleichbar hohe Übereinstimmungen wurden auch durch
Amplifikation anderer spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis mit
entsprechenden Primern erreicht (LA et al. 2006, NATHUES 2007).
Die Sonde Li-Ubi-Probe hat in der real-time PCR nur dann ein Fluoreszenzsignal
erzeugt, wenn gleichzeitig spezifische Genomfragmente von L. intracellualris mit den
Primern Li-Ubi-F und –R amplifiziert wurden. Wurde andere DNA als template
verwendet, darunter auch solche, die mit den Primern allein ein unspezifisches
Signal im SYBR Green-System erzeugt hatten, konnte dagegen keine
sondenspezifische Fluoreszenz detektiert werden. Die Emission eines
Fluoreszenzsignals während der Amplifikation in der real-time PCR durch die Sonde
kann daher als spezifisch für L. intracellularis bewertet werden.
Ein möglicher Einfluss der in dieser real-time PCR verwendeten IPC resp. der Primer
für diese IPC auf die Spezifität des Testsystems wurde ebenfalls untersucht. Die IPC
dient der Kontrolle von möglichen Inhibitionen während der PCR und basiert auf der
Amplifikation eines DNA-Fragments mit spezifischen Primern und einer Sonde. Diese
Sonde darf dabei nicht mit dem gleichen Reporter markiert sein, wie die Sonde des
eigentlichen Tests. In Fällen, in denen die eigentliche Ziel-DNA nicht nachzuweisen
ist, wird die Inhibition der Reaktion durch die Amplifizierung von DNA der IPC und
dem spezifischen Fluoreszenzsignal der Sonde ausgeschlossen.
Die Primer der IPC könnten theoretisch aber auch andere DNA als die der IPC
amplifizieren und dabei PCR-Produkte erzeugen, die mit der Sonde des eigentlichen
Tests hybridisieren. Dieser Vorgang würde zu einem falsch positiven Ergebnis im
eigentlichen Sinne des Testsystems führen. Die Spezifität der Primer und der
exogenen IPC-DNA wurde anhand einer Untersuchung mit verschiedenen
Referenzstämmen überprüft und dabei keine Fluoreszenzsignale detektiert. Die IPC
hat somit keinen nachweisbaren Einfluss auf die analytische Spezifität der real-time
PCR.
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