Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Diskussion
Studie betrug die maximal nachgewiesene Erregermenge in Proben natürlich
infizierter Schweine etwa 5x 10 6 GE / µl Reaktionsvolumen und war damit weit
unterhalb der oberen Nachweisgrenze.
Eine exakte Quantifizierung von L. intracellularis war mit den bislang beschriebenen
PCRs zum Nachweis spezifischer Genomfagmente nicht möglich resp. nicht
durchgeführt worden. Konventionelle PCRs müssen im Anschluss an die eigentliche
Reaktion ausgewertet werden und führen nur zu qualitativen oder semiquantitativen
Ergebnissen (HIGUCHI et al. 1992). Eine bereits beschriebene real-time PCR zum
Nachweis von L. intracellularis ist für eine Quantifizierung nicht validiert worden
(LINDECRONA et al. 2002).
In der vorliegenden Untersuchung wurden über die Nachweis- und
Quantifizierungsgrenzen hinaus weitere Güteparameter ermittelt, die zur Beurteilung
einer quantitativen Messmethode notwendig sind. Bei der Anwendung einer solchen
Methode dürfen nach allgemeiner Auffassung nur Werte zur Quantifizierung
herangezogen werden, die im Kalibrationsbereich des Testes liegen. Der
Kalibrationsbereich muss ein geeignetes Maß an Präzision und Linearität aufweisen
(ANON. 1998b). Der Kalibrationsbereich der hier beschriebenen real-time PCR
wurde an der Standardkurve berechnet und umfasst den Bereich von 10 0 bis 10 7 GE
/ µl Reaktionsvolumen. Ein ähnlicher, jedoch kleinerer Kalibrationsbereich (10 4 bis
10 9 Plasmide pro ml Ausgangsmaterial, das entspricht 10 1 bis 10 6 Plasmide pro µl)
wurde auch in der quantitativen real-time PCR zum Nachweis des porcinen
Circovirus Typ 2 ermittelt (OLVERA et al. 2004). Die untere Quantifizierungsgrenze
der real-time PCR beträgt 10 1 GE / µl Reaktionsvolumen, da sich die Ct-Werte der
Konzentrationsstufen 10 0 und 10 -1 GE / µl nicht mehr signifikant unterscheiden. Eine
Zuordnung von Ct-Werten zu einem Gehalt von GE darf unter diesen Umständen
nicht mehr erfolgen. Konzentrationen von mehr als 10 7 GE/ µl Reaktionsvolumen
führen zu Ct-Werten, die ebenfalls nicht mehr proportional zur eingesetzten Menge
der Ziel-DNA sind. Aus diesem Grund ist auch hier die Linearität der Ct-Werte nicht
mehr gegeben und bedingt somit die obere Quantifizierungsgrenze von 10 7 GE / µl
Reaktionsvolumen.
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