Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Literaturübersicht
2.6 Probenaufbereitung, Probenlagerung und Inhibitoren
2.6.1 Probenaufbereitung
Die Ziele der Probenaufbereitung sind die Reduktion vorhandener PCR-Inhibitoren,
die Homogenisierung der Probe zu einer für die Amplifikation geeigneten Matrix und
die Konzentrierung der Zielstrukturen. Die Probenmatrix bestimmt die Art der
Probenaufbereitung. Diese Aufbereitung beeinflusst wesentlich den Erfolg der
folgenden PCR (RADSTRÖM et al. 2004).
Eine einfache und schnelle Probenaufbereitung von Bakterien aus Kulturen besteht
aus einer Kombination von Probenverdünnung, Zentrifugation und Waschschritten.
Einen großen Einfluss auf die Entfernung von PCR-Inhibitoren wurde der
Probenverdünnung zugesprochen (AL-SOUD et al. 1998). Eine einfache
Zentrifugation aus Anreicherungsmedium ist nur ausreichend, wenn dieses Medium
nur sehr wenige PCR-Inhibitoren enthält (KNUTSSON et al. 2002).
Im aqueous two-phase system werden verschiedene Polymere, häufig Polyethylen-
glykol und Dextran, eingesetzt, die in Wasser nicht mischbare Phasen bilden. Zellen
verteilen sich überwiegend in der dextranreichen unteren Phase und der Interphase.
Im Gegensatz dazu sind niedermolekulare Stoffe in beiden Phasen zu finden
(ANDERSSON u. HAHN-HAGERDAL 1990). So lassen sich PCR-Inhbitoren und
Zielzellen partionieren (RADSTRÖM et al. 2004).
Eine weitere Möglichkeit der physikalischen Probenaufbereitung ist die buoyant
density centrifugaton (BDC). Aufgrund ihrer unterschiedlichen Dichte werden
Bakterien von der Probenmatrix (hier Käse und Milch) getrennt und lokal konzentriert.
PCR-Inhibitoren bleiben in der Probenmatrix zurück. Theoretisch ist mit Hilfe dieser
Technik eine Differenzierung zwischen lebenden und toten Zellen möglich
(LINDQVIST et al. 1997). Die Methode eignet sich besonders für Proben mit hohem
Gehalt an PCR-Inhibitoren (KNUTSSON et al. 2002).
Die immunomagnetic separation (IMS) ist eine Methode der Probenaufbereitung, die
auf immunologischen Reaktionen beruht. Es werden spezifische Antikörper mit
paramagnetic beads gekoppelt. Die an diese Strukturen gebundenen Bakterien (hier
Listeria monozytogenes) können isoliert und anschließend in einer PCR
nachgewiesen werden (SKJERVE et al. 1990, NIEDERHAUSER et al. 1994).
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