Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

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Einleitung
Lawsonia intracellularis ist der Erreger der proliferativen Enteropathie beim Schwein
(LAWSON u. GEBHART 2000). Die Krankheit kann klinisch apparent als akute oder
chronische Form auftreten; häufiger ist jedoch eine subklinische Erkrankung, deren
Bedeutung nicht selten unterschätzt wird (MCORIST u. GEBHART 1999a, KROLL et
al. 2005a). Zum Nachweis der Infektion stehen serologische
Untersuchungsmethoden und der direkte Erregernachweis in Kot und/oder Proben
der Darmschleimhaut zur Verfügung. Der direkte Nachweis wird derzeit mittels
Immunoassays oder der polymerase chain reaction (PCR) durchgeführt (MCORIST
et al. 1987, JONES et al. 1993), da der kulturelle Nachweis des Bakteriums aufgrund
anspruchsvoller Wachstumsbedingungen in Zellkulturen für die Routinediagnostik
ungeeignet ist (MCORIST et al. 1995a). Die Eignung direkter Nachweisverfahren für
die Diagnostik wird in der Literatur kontrovers diskutiert, da alle Methoden bis dato
lediglich eine qualtitative resp. semiquantitative aber keine absolut quantitative
Aussage über den Erregergehalt in einer Probe ermöglichen. Außerdem ist eine
Unterscheidung zwischen dem Wildtyp von Lawsonia intracellularis und dem
Impfstamm, der zur aktiven Immunisierung von Schweinen verwendet wird, ebenfalls
nicht möglich (GUEDES u. GEBHART 2003a). Andere Autoren diskutieren eine
Inhibition der PCR an Kotproben als Grund für die geringe Sensitivität, die in früheren
Studien für die PCR beobachtet wurde (KNITTEL et al. 1997). Zudem soll es bei der
Lagerung von Kotproben zu einer Degradation von Nukleinsäuren kommen, so dass
keine spezifischen Genomfragmente mehr nachzuweisen sind (DEUTER et al. 1995).
Das Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, eine hochsensitive und spezifische
Methode für für den Nachweis von Genomfragmenten von Lawsonia intracellularis zu
entwickeln, die gleichzeitig eine Quantifizierung des Gehaltes von spezifischen
Genomäquivalenten in einer Kotprobe erlaubt. Die anschließende Validierung der
Methode erfolgte in Anlehnung an nationale und internationale Vorgaben. Außerdem
wurde der Einfluss verschiedener Verfahren zur Homogenisierung des
Probenmaterials auf die Verteilung von Lawsonia intracellularis in Kotproben
untersucht. Abschließend wurde der Einfluss von Temperatur und Dauer der
Probenlagerung auf den quantitativen Nachweis geprüft.
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