Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

3.2 Etablierung und Validierung
3.2.1 Primer- und Sondendesign
Material und Methoden
Die Primer und die Sonde wurden unter Anwendung der Software Primer Express ®
3.0 (Applied Biosystems, Forster City, CA 94404 USA, 2004) und der Vorgabe
spezifischer Kriterien (Tab. 2) designd. Die notwendigen Informationen zur
Genomsequenz von L. intracellularis wurden der NCBI GenBank
(http://www.pubmed.de/da ta/nlm.link.html) entnommen. Diverse Gensequenzen, die
potentiell als Zielgen in Betracht kamen, wurden in Primer Express ® 3.0 analysiert
und die Software hat, wenn möglich, zu diesen Sequenzen verschiedene Primer und
Sonden designd. Ihre Eignung für die real-time PCR wurden dann anhand ihrer
Schmelztemperatur und ihrer penalty pionts beurteilt.
Nach Überprüfung von 199 Genen wurde eine Kombination von Primern und Sonde
ausgewählt, mit deren Verwendung die höchste Effizienz und Spezifität während der
Amplifikation einer Sequenz aus einem Gen zu erwarten war (Abb. 1).
Die Sequenzen (Tab. 3 und 4) wurden nochmals mit veröffentlichten Sequenzen der
Gendatenbanken verglichen (BLAST, http://www.ncbi.nlm.gov/blast/), um mögliche
unspezifische Reaktionen durch komplementäre Sequenzen im Genom anderer
Organismen auszuschließen zu können. Die Synthese der Primer (Tab. 3) und der
Sonde (Tab. 4) erfolgte in einem externen Labor (Metabion international AG, 82152
Martinsried, Deutschland).
Mit dem Ziel plasmidale Standards für die real-time PCR herzustellen, sollte ein etwa
500 bp großes Fragment aus dem Zielgen, dass die eigentliche Zielsequenz der real-
time PCR einschließt, amplifziert und das PCR-Produkt anschließend kloniert werden.
Dazu wurde zunächst ein forward- und ein reverse-Primer (Tab. 5) in der Software
FastPCR (http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/fastpcr.htm; Institut für
Biotechnologie, Universität Helsinki, Schweden) designd und anschließend
synthetisiert (Metabion international AG). Die Primer Ubi-Clon-lang-F und –R
schließen neben der Zielsequenz 450 weitere Basenpaare ein, sodass an der
Hybridisierungsstelle der Primer Ubi-F und -R im Plasmid in etwa die gleichen
stöchometrischen Verhältnisse vorliegen, wie im isolierten Genom von L.
intracellularis.
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