Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Material und Methoden
3.2.5 Optimierung der Primer-Konzentrationen
Die Bestimmung der optimalen Konzentrationen der Primer Li-Ubi-F und Li-Ubi-R,
die zu einer maximal effizienten Amplifikation der Zielsequenz führen, wurden an
PCRs mit unterschiedlichen Konzentrationen von Li-Ubi-F und -R durchgeführt. Die
lyophilisierten Primer wurden zunächst in LiChrosolv ® (Merck KGaA) aufgenommen,
sodass eine Stammlösung mit einer Konzentration von 100 nM für weitere Versuche
zur Verfügung stand. Anschließend wurden Aliquots der Primer hergestellt und bis
zur entsprechenden Endkonzentration (Tab. 9) mit LiChrosolv ® verdünnt. Die
Auswirkung jeder Konzentration auf die Effizienz wurde in drei Wiederholungen
überprüft. Der Master-Mix (25 µl / Probe) enthielt zusätzlich zu den Primern 12,5 µl
ReadyMix Taq PCR Reaction Mix 2x with MgCl2 (P4600-100RXN, 096K6821;
SIGMA-ALDRICH Chemie GmbH, P.O. 1120, 89552 Steinheim, Germany) bzw. 12,5
µl QuantiTect ® SYBR ® Green PCR Master Mix (Qiagen GmbH) und Wasser (RNase-
free water, Lot No. 127133117, Qiagen GmbH) sowie 2,5 µl der template-DNA je
Probe. Der Master-Mix wurde anschließend in eine 96 well plate (ABI PRISM ® 96
Well Optical Reaction Plate, Applied Biosystems) aliquotiert.
Tabelle 9: Primer-Konzentrationen in 25 µl Reaktionsvolumen
Primer Li-Ubi R
(nM)
50
300
900
Primer Li-Ubi F (nM)
50 300 900
50/50
50/300
50/900
60
300/50
300/300
300/900
900/50
900/300
900/900
Die PCR-Produkte der ersten Reaktion wurden mittels Gelelektrophorese analysiert.
Hierzu wurde ein 3 %iges Agarosegel (Midi ABgarose, Cat: AG-030013, Lot No:
H101108; ABgene, Blentheim Road, Epsom, Surrey, KT 19 9AP, UK) mit 1xTAE-
Puffer (Merck KGaA) hergestellt. Die 25 µl PCR-Produkt wurden mit 10 µl
Gelladepuffer (Reddy Run Gel Loading Buffer, Cat.#: AB-0965; ABgene) gemischt
und ein Aliquot von je 10 µl in die Geltaschen pipettiert. Ein DNA-Größenmarker