Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Primer zur spezfischen Detektion
Literaturübersicht
Auch Primer, die fluorogen gelabelt sind, können zur spezifischen Detektion von
Amplifikaten eingesetzt werden. Light upon extension (LUX)-Primer besitzen eine
Haarnadelstruktur und sind nahe dem 3´-Ende mit einem Fluorochrom verknüpft.
Das quenching erfolgt durch die Nähe zu G oder C. Mit dem annealing des Primers
wird die Haarnadelstruktur geöffnet und die Fluoreszenz aktiviert. (NAZARENKO et
al. 2002, MACKAY 2004). Scorpion primer besitzen ebenfalls eine
Haarnadelstruktur. Die Schlaufe ist komplementär zu einem Abschnitt der
Zielsequenz. Scorpion primer sind mit einem Donor- und einem Akzeptorfarbstoff
verknüpft und werden während der Amplifikation in das PCR-Produkt eingebaut. Die
Haarnadelstruktur löst sich und die Donorfluoreszenz wird detektierbar
(NAZARENKO et al. 1997, WHITCOMBE et al. 1999).
2.7.2 Ergebnisauswertung
In der real-time PCR wird die vom Detektionssystem freigesetzte Fluoreszenz in
jedem Zyklus von einem optischen Sensor im real-time Gerät gemessen und
aufgezeichnet. Ein Anstieg der Fluoreszenz verläuft proportional zur Menge des
amplifizierten Produkts (HIGUCHI et al. 1992, BUSTIN 2000). Die Messdaten des
Sensors, der die Fluoreszenz der Sonde oder des interkalierenden Farbstoffs
detektiert, werden gegen einen passiven Referenzfarbstoff, der im Reaktionsmix
enthalten ist, und ebenfalls detektiert wird, normiert. Eine Normalisierung gleicht
Schwankungen der Fluoreszenz aus, die durch unterschiedliche Konzentrationen
oder Volumina der Reaktionseinheiten entstehen können. Diese normierte
Fluoreszenz (Rn) wird als Intensität im amplification plot fortwährend gegen den
entsprechenden Zyklus aufgetragen. In den ersten PCR-Zyklen dominiert eine
niedrige, geringgradig schwankende Fluoreszenz, die durch Eigenfluoreszenz
verschiedener Komponenten (Plastikware, Thermoblock, Sonde, etc.) erzeugt und
als baseline bezeichnet wird (MACKAY 2004, ANON. 2005a). Wird diese baseline
von der normierten Reporterfluoreszenz abgezogen, so erhält man die Signalgröße
∆Rn, die durch die Amplifikation von template-DNA entstanden ist (HEID et al. 1996).
Mit dem Ziel, den zentralen Wert der real-time PCR, den threshold cycle (Ct),
feststellen zu können, muss der threshold festgelegt werden. Dieser threshold wird
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