Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Diskussion
Die Effizienz einer Amplifikation hat für die Quantifizierung von Genomfragmenten
mittels real-time PCR eine herausragende Bedeutung und muss für Probe und
Standard gleich sein (FRONHOFFS et al. 2002). In der hier beschriebenen real-time
PCR ist die zu amplifizierende Sequenz in der Probe und im Plasmid für den
Standard identisch, so dass eine identische Effizienz für die Reaktionen
angenommen werden kann. Zu Beginn einer PCR kommt es theoretisch nach jedem
Reaktionszyklus zu einer Verdopplung der Ziel-DNA (LORKOWSKI u. THIEMANN
2006). Nach 3,33 Zyklen ist entsprechend eine Verzehnfachung der ursprünglichen
Menge der target-DNA anzunehmen; die Effizienz einer solchen Reaktion entspräche
100 %. Die Effizienz einer real-time PCR wird aus der Steigung der Standardkurve
berechnet, die idealerweise -3,33 beträgt (FRONHOFFS et al. 2002). In der hier
entwickelten real-time PCR beträgt die Steigung der Standardkurve -3,329. Aus
diesem Wert lässt sich eine Effizienz von 99,7 % ableiten, die als ideal zu bewerten
ist.
5.1.5 Präzision
Die Präzision eines quantitativen Messverfahrens entspricht der
Standardabweichung, die bei Messwiederholungen an immer denselben,
homogenen Proben erreicht wird. Grundsätzlich wird zwischen der Wiederhol- und
der Vergleichspräzision unterschieden. Die Präzision ist in der Regel von der
Konzentration des Analyten in der Probe abhängig und sollte für die jeweilige
Konzentrationsstufe angegeben werden (ANON. 1998b). Nach allgemeiner
Auffassung soll der Validierungsparameter „Präzision“ für bioanalytische Verfahren
einen Grenzwert von 15 % relativer Abweichung vom Mittelwert nicht überschreiten
(ANON. 2001). Andere Guidelines setzen diesen Grenzwert auf 20 % fest und
beurteilen erst eine relative Abweichung von 30 % als überhöht (ANON. 2004a). Die
Wiederholpräzision wurde in der vorliegenden Untersuchung anhand der
Standardkurve und an Proben natürlich infizierter Schweine geprüft. Die größte
Standardabweichung betrug 1,07 Cts bei einer Konzentration von 10 2 GE / µl
Reaktionsvolumen. Die übrigen Werte lagen unterhalb von 0,58 Cts. Daraus
errechnete sich eine Wiederholpräzision, die für die Plasmidlösung zwischen 96,3
und 99,1 % liegt. Die wiederholte Untersuchung von Proben natürlich infizierter
Schweine ergab, dass die Werte für die Menge von GE konstant innerhalb der
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