Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

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3.2.2 Referenzmaterial Material und Methoden Der Stamm Lawsonia intracellularis MS B3903 wurde in lyophilisierter Form bezogen (Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, D-55216 Ingelheim am Rhein). Das Lyophilisat wurde in 100 ml Wasser für Injektionszwecke (Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH) aufgelöst. Alle anderen Referenzstämme zur Überprüfung der Spezifität von Primer und Sonde wurden der Stammsammlung der Außenstelle für Epidemiologie (Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, D-49456 Bakum) entnommen (Tab. 6). Die Stämme wurden im Cryobank-System (Mast Diagnostica, Laboratoriums-Präparate GmbH, D-23858 Reinfeld) konserviert und in einem Tiefkühlgefrierschrank (Sorvall ® Heraeus, HFU 486 Basic/40212802; Kendro Laboratory Products GmbH, D-63450 Hanau) bei -70 °C gelagert. Die kulturelle Anzucht der Stämme von Brachyspira spp. erfolgte auf Columbia Blutagar (Heipha, Dr. Müller GmbH, D-69209 Eppelheim). Dazu wurden die beimpften Platten in einem Anaerobiersystem (Anaerobiertopf (AnaeroJar, Art.-Nr. AG0025A, Oxoid Deutschland GmbH, D-46483 Wesel) und Anaerocult ® A (1.13829.0001, Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Germany)) für 6 Tage bei 42 °C bebrütet. Zur Ernte des Bakterienrasens wurde 2 ml Tris-EDTA Puffer (Zusammensetzung s. Anhang) auf die Blutagarplatte gegeben und eine halbe Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Bakterien durch leichtes Abstreichen mit einer Einmalöse (Gammasterile Impfschlinge, 10 µl Schlinge, Best- Nummer: 86.1562.010; Sarstedt AG & Co., D-51582 Nümbrecht) von der Agarplatte gelöst und die Flüssigkeit mit einer Pipette (eppendorf Research variable, Eppendorf AG, D-22331 Hamburg) in ein steriles DNAse- und RNAse-freies Eppendorf Cup 2.0 (Safe-Lock Tubes 2,0 ml, Eppendorf AG) überführt. Haemophilus spp. und Actinobacillus pleuropneumoniae wurden auf Kochblutagar (Heipha, Dr. Müller GmbH) aerob für zwei bis vier Tage bei 36 °C bebrütet. Die Stämme von Clostridium perfringens wurden anaerob (Anaerocult ® A) im Anaerobiertopf auf Columbia Blutagar für 1 Tag bei 45 °C bebrütet. Alle übrigen Referenzstämme wurden auf Columbia Blutagar aerob für ein bis drei Tage bei 36 °C bebrütet. 53
Tabelle 6: Referenzstämme Bakterienstamm Actinobacillus pleuropneumoniae Serotyp 2 Actinobacillus pleuropneumoniae Serotyp 9 Actinobacillus suis Arcanobacterium pyogenes Bordetella bronchiseptica Brachyspira hyodysenteriae B 78 Brachyspira innocens Brachyspira intermedia Brachyspira murdochii Brachyspira pilosicoli P 43 Clostridium perfringens Typ A * Clostridium perfringens Typ B CIP 60.61 Clostridium perfringens Typ C * Clostridium perfringens Typ D CIP 105568 Clostridium perfringens Typ E CIP 106156 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Erysipelothrix rhusiopathiae Escherichia coli ATCC 25922 Escherichia coli O101:K32 (Kalb) Escherichia coli O108:K- Escherichia coli O138:K81 Material und Methoden Escherichia coli O139:K82 Escherichia coli O141:K85ab Escherichia coli O141:K85ac Escherichia coli O147:K89 Escherichia coli O149:K91, F4 Escherichia coli O157:K- Haemophilus parasuis T1 Haemophilus somnus Klebsiella pneumonia ATCC 13883 Listeria monozytogenes Pasteurella multocida Pseudomonas aeroginosa ATCC 27853 Salmonella der Gruppe D1 Salmonella Derby Salmonella Infantis Salmonella Typhimurium Staphylococcus aureus ssp. aureus ATCC 29213/ DSM 2569 Staphylococcus hyicus Streptococcus agalactiae Streptococcus suis Serotyp 1 + 2 *stammen aus der Routinediagnostik 54
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Quantitativer Nachweis von Lawsonia
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Wissenschaftliche Betreuung: Priv.-
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3.2.18 Wiederfindungsrate .........
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µg Mikrogramm (x 10 -6 ) µl Mikro
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p.i. post infectionem PCR polymeras
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Seite 35 und 36: Literaturübersicht war 91 %, wobei
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Seite 53 und 54: Primer zur spezfischen Detektion Li
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Seite 63 und 64: Material und Methoden Tabelle 2: De
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Seite 107 und 108: 4 Ergebnisse 4.1 Etablierung und Va
Seite 109 und 110: Ergebnisse Arcanobacterium pyogenes
Seite 111 und 112: 4.1.6 Sequenzierung Ergebnisse Die
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10 8 GE / µl Ergebnisse 10 7 bis 1
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4.1.10 Vergleichspräzision Ergebni
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Ergebnisse Tabelle 41: diagnostisch
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Ergebnisse entspricht einer Wiederf
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4.1.15 Messunsicherheit Ergebnisse
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Ergebnisse Tabelle 44: Ergebnisse d
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Quantität GE / µl Reaktionsvolume
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5 Diskussion Diskussion Die vorlieg
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Diskussion gebildet werden. Verglei
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Diskussion Bindung der Primer und d
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Diskussion Milliliter mit 50 µl) u
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Diskussion Die Effizienz einer Ampl
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Diskussion Inhibitoren während der
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Diskussion Proben spezifische Genom
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Diskussion 5.2 Verteilung von L. in
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5.4 Schlussfolgerungen Diskussion D
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Zusammenfassung auch zur Erstellung
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Summary genome equivalent per react
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ANONYM (1998b): Literaturverzeichni
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Literaturverzeichnis BOESEN, H.T.,
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Literaturverzeichnis CORZO, C.A., R
Seite 161 und 162:
Literaturverzeichnis GROSS-BELLARD,
Seite 163 und 164:
Literaturverzeichnis HOLLAND, P.M.,
Seite 165 und 166:
Literaturverzeichnis JORDAN, D.M.,
Seite 167 und 168:
Literaturverzeichnis KUBISTA, M., J
Seite 169 und 170:
Literaturverzeichnis LINDECRONA, R.
Seite 171 und 172:
Literaturverzeichnis MARSTELLER, T.
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Literaturverzeichnis NIEDERHAUSER,
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SAIF, L.J., u. R.D. WESLEY (1999):
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Literaturverzeichnis SUH, D.-K., S.
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Literaturverzeichnis WIDJOJOATMODJO
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Anhang 7 12.12 12.1066667 7 12.11 6
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Anhang Tabelle 47: Quantität von G
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Anhang Tabelle 51: Ergebnisse der q
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Danksagung Ich danke Frau Priv.- Do
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