Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Diskussion
Milliliter mit 50 µl) und die Elutionslösung dann mittels PCR untersucht. Aus diesem
Grund kann die Sensitivität der multiplex-PCR ebenfalls nur indirekt mit der
Sensitivität der real-time PCR verglichen werden.
In einer nested-PCR zum Nachweis von L. intracellularis wurde die Nachweisgrenze
mit 10 3 Lawsonien pro Gramm Kot angegeben (JONES et al. 1993). Auch hier
können die Ergebnisse nicht mit denen der real-time PCR verglichen werden, weil
die Quantifizierung für die Bestimmung der Sensitivität der nested-PCR mit einem
IFT vorgenommen wurde. Es ist mit großer Wahrscheinlichkeit anzunehmen, dass
das untere Detektionslimit der nested-PCR aufgrund der genannten
Einschränkungen des IFT überschätzt wurde.
In der neu etablierten und validierten real-time PCR beträgt die untere
Nachweisgrenze 1 GE / Reaktion und entspricht somit einer zuvor beschriebenen
real-time PCR zum Nachweis von L. intracellularis (LINDECRONA et al. 2002).
Da in dieser Studie die DNA resp. GE der Bezugswert ist, wird kein direkter Vergleich
zu anderen Methoden vorgenommen, in denen die Nachweisgrenze an mittels IFT
quantifizierten Erregermengen in Kot untersucht wurde. Darüber hinaus wurde in
anderen Untersuchungen auf weitere Faktoren, wie z.B. die Wiederfindung
zugesetzter Ziel-DNA in Kotproben, nicht eingegangen; ein möglicher Einfluss dieses
Faktors kann retrospektiv nicht eingeschätzt werden.
In der real-time PCR ist die Zunahme eines Fluoreszenzsignals die Grundlage für die
Berechnung des ursprünglichen DNA Gehaltes (HIGUCHI et al. 1992, BUSTIN 2000).
Wenn die Ausgangsmenge der template-DNA zu Beginn der Reaktion bereits so
hoch ist, dass die überwiegende Zahl von Sonden hybridisiert, kann es zu keinem
oder einem geringen Anstieg der Fluoreszenz kommen. Aus diesem Grund gibt es
für die real-time PCR auch eine obere Nachweisgrenze. Das real-time PCR-System
kann in solchen Fällen keine Amplifikationskurve berechnen, da ∆Rn null oder sehr
nahe null ist. In der hier entwickelten real-time PCR liegt die obere Nachweisgrenze
bei 10 8 GE/ µl Reaktionsvolumen, da ab 10 9 GE/ µl Reaktionsvolumen eine Zunahme
des Fluoreszenzsignals vom real-time Gerät nicht mehr erkannt werden konnte. Der
Grenzwert entspricht einer Menge von 1x 10 12 GE pro ml Plasmidlösung. Da bei
infizierten Schweinen mit einer maximalen Ausscheidung von etwa 7x 10 8 Erregern
pro Gramm Kot zu rechnen ist (SMITH u. MCORIST 1997), liegt die obere
Nachweisgrenze über der zu erwartenden Erregermenge in einer Probe. In dieser
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