Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Diskussion
5.3 Einfluss der Lagerung auf den Gehalt von L. intracellularis in
Kotproben
Der mögliche Einfluss einer Lagerung von Kotproben auf den Gehalt spezifischer
Genomfragmente von L. intracellularis wurde über einen Zeitraum von 132 Tagen
sowohl bei Kühlschranktemperatur als auch bei tieferen Temperaturen von -20 °C
resp. -70 °C überprüft. Die Dauer der Lagerung über schritt die unter
Laborbedingungen übliche Lagerdauer bei weitem. Es konnte gezeigt werden, dass
die Menge von GE von L. intracellularis bis zum letzten Untersuchungstag
unabhängig von der Temperatur während der Lagerung nicht beeinflusst wurde. Es
wird vermutet, dass die Zahl von GE auch über diesen Zeitraum hinaus noch für eine
gewisse Zeit konstant geblieben wäre. Übereinstimmend konnte mit einer nested-
PCR gezeigt werden, dass L. intracellularis-positive Kotproben noch nach sechs
Monaten Lagerung bei -80 °C positiv waren. Erst nac h zehn Monaten waren keine
spezifischen DNA-Sequenzen mehr nachzuweisen (JONES et al. 1993). Da mit der
nested-PCR der Erregergehalt nicht quantifiziert werden konnte, war eine Aussage
über die Menge verbleibender Ziel-DNA in den Proben nach Lagerung nicht möglich.
Die Überlebens- und Infektionsfähigkeit von L. intracellularis in Kot außerhalb des
Wirtes wird mit ein bis zwei Wochen angegeben (MCORIST u. GEBHART 1999a,
COLLINS et al. 2000). Dennoch kann der Erreger in Kotproben wesentlich länger
nachgewiesen werden, da die Stabilität der DNA und ihre Eignung als Matrize
während der PCR nur mittelbar von der Vitalität des Erregers abhängig ist. In Stuhl-
bzw. Kotproben kommt es nach längerer Lagerung, vor allem durch Gallensalze und
–säuren, zur Degradation von DNA, die dann nicht mehr für eine PCR verwendet
werden kann (DEUTER et al. 1995). In der real-time PCR wird eine sehr kurze
Zielsequenz von 75 bp detektiert. Die Wahrscheinlichkeit, dass gerade innerhalb
dieser Zielsequenz die DNA durch Substanzen im Kot abgebaut wird, ist wesentlich
geringer, als es bei einem längeren Fragment der Fall wäre. Konventionelle PCR-
Verfahren, die eine Matrize von bspw. 319 bp (KNITTEL et al. 1996) verwenden,
werden dagegen schneller von einer Degradation der DNA beeinträchtigt.
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