Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Literaturübersicht
al. 1993). Außerdem sollten an diesen Enden keine drei- oder mehrfache
Wiederholung von G bzw. C und auch keine Thymin-(T)-basen vorhanden sein
(BANGSOW et al. 2007). Die Primersequenz selbst sollte keine mehrfachen
Wiederholungen von einzelnen Nukleotiden beinhalten (ABD-ELSALAM 2003).
Die Konzentration, in der die Primer im jeweiligen PCR-Ansatz verwendet werden,
muss üblicherweise empirisch bestimmt und anschließend im Versuch optimiert
werden. Eine optimale Konzentration ist etwa 50 bis 500 nM (LORKOWSKI u.
THIEMANN 2006).
In einem PCR-Ansatz können gleichzeitig mehrere Primer-Paare eingesetzt werden
(multiplex-PCR). Auf diese Weise ist es möglich, mehrere Genomfragmente simultan
zu detektieren (CHAMBERLAIN et al. 1988). Bei der nested-PCR wird das PCR-
Produkt einer vorangegangenen PCR für eine weitere Reaktion verwendet. Diesem
Ansatz werden andere Primer hinzugefügt, die innerhalb des produzierten DNA-
Fragmentes binden. Dadurch wird die Sensitivität und die Spezifität einer PCR erhöht
(ARNHEIM u. ERLICH 1992).
Heute steht diverse Software zur Verfügung, die ein Primer-Design unterstützen
kann (ABD-ELSALAM 2003).
2.5.3 Polymerase
Erste PCR-Assays wurden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase von E.
coli durchgeführt. Da dieses nicht thermostabil ist, musste nach jedem Zyklus neue
Polymerase zum Reaktionsgemisch hinzugegeben werden (MULLIS u. FALOONA
1987). Die Verwendung einer thermostabilen Taq-Polymerase (isoliert aus Thermus
aquaticus) vereinfachte die Durchführung der PCR. Da die PCR nun auch bei
höheren Temperaturen durchgeführt werden konnte, war ein Anstieg der Spezifität,
der Sensitivität und der Ausbeute der PCR festzustellen (SAIKI et al. 1988). Die Taq-
Polymerase ist die heute am häufigsten verwendete DNA-Polymerase (MÜLLER
2001). Sie besitzt eine hohe Prozessivität und eine akzeptable Lesegenauigkeit. Eine
3´-5´-Exonuklease-Aktivität (proofreading) fehlt, jedoch besitzt sie eine 5´-3´-
Exonuklease-Aktivität. Das Temperaturoptimum der Taq-Polymerase ist breit und
liegt im Bereich von 75 °C (INNIS et al. 1988, LONGLEY et al. 1990). Ein weiteres
Merkmal der Taq-Polymerase ist das matritzen-unabhängige Anfügen von dNTP´s,
vor allem Adenosin (A), an synthetisierte DNA-Stränge (CLARK 1988). Die Pfu-
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