Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Material und Methoden
einer Probe wurde durch folgende Formel in Microsoft ® Office Excel 2003 SP2
(Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA) berechnet:
10 ∆Ct/3.33 x 10 3
10 3 entspricht der Konzentration des Standards (GE/ µl) in der Reaktion
Zur Quantifizierung wurden für Standard und Probe stets die mittleren Ct-Werte des
Dreifachansatzes verwendet. Eine ähnliche Methode wurde für die Quantifizierung
von GE des humanen Immundefizienz-Virus bereits beschrieben (PFAFFL 2001).
3.2.14 Interne Positivkontrolle
Eine PCR kann durch die Anwesenheit fremder Substanzen im Reaktionsmix (bspw.
Bilirubin, Gallensalze oder komplexe Polysaccharide aus Kot) inhibiert werden. Um
eine mögliche Inhibition in jeder Probe ausschließen zu können, wurde in diesem
Versuch zusätzlich eine interne Positivkontrolle (IPC) im Reaktionsmix (Tab. 18)
verwendet. Die IPC basiert auf einer VIC-probe; außerdem wird den eigentlichen
Proben exogene DNA zugesetzt. Entgegen den Empfehlungen des Herstellers
wurden nicht 1µl der 10X Exo IPC DNA sondern nur 0,2 µl der 10X Exo IPC DNA pro
Reaktionseinheit verwendet. Zur Überprüfung eines möglichen Einflusses auf die
Effizienz der real-time PCR wurde plasmidale DNA von L. intracellularis in den
Konzentrationen 10 7 , 10 3 , 10 0 und 10 -1 GE pro µl ohne und mit IPC im Reaktionsmix
amplifiziert und quantifiziert (Tab. 26). Die Konzentration der IPC wurde so gering
gewählt, dass ihre Amplifikation unter den Versuchsbedingungen gerade noch
detektiert wird, eine mögliche Konkurrenzreaktion mit der eigentlichen Amplifikation
von L. intracellularis aber nahezu ausgeschlossen werden kann. Werden zwei oder
mehr Zielsequenzen gleichzeitig amplifiziert, kann es bspw. durch den Verbrauch
von dNTPs zu einer verminderten Amplifikation einer Zielsequenz kommen
(kompetitive Reaktion 2. Ordnung). Diese Tatsache muss besonders dann
berücksichtigt werden, wenn eine der beiden Zielsequenzen in sehr geringer
Konzentration vorliegt. Da die Konzentration der target-DNA in der Regel nicht
bekannt ist, soll eine mögliche Verfälschung der Ergebnisse sicher ausgeschlossen
werden. Dieser Versuch wurde zweimal wiederholt.
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