Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

3.2.9 real-time PCR
Material und Methoden
Die real-time PCR wurde in einem Reaktionsvolumen von 25 µl durchgeführt. Nach
Prüfung der analytischen Spezifität und nach Evaluierung der optimalen
Konzentrationen von Primer und Sonde wurde der Reaktionsmix für die
anschließenden Versuche zunächst immer gleich zusammengestellt (Tab. 17).
Tabelle 17: Optimiertes Protokoll der real-time PCR
Reaktionsmix:
Gesamtvolumen:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR
Master Mix 2x
2,5 µl Primer Li-Ubi-F (5 pmol/ µl)
2,5 µl Primer Li-Ubi-R (5 pmol/ µl)
2,5 µl Li-Ubi-Probe (2 pmol/ µl)
2,5 µl Wasser (RNase-free water)
2,5 µl template-DNA
25 µl
67
Primer- Mix
Die Primer Li-Ubi-F und -R, die Sonde Li-Ubi-Probe und Wasser (LiChrosolv ® )
wurden zu einer Arbeitslösung „Primer-Mix“ zusammengestellt und in DNA LoBind
Tubes 1,5 ml (Order no.: 0300108175; Eppendorf AG) zu 500 µl aliquotiert. Auf diese
Weise wird eine gleichbleibende Zusammensetzung des „Primer-Mix“ in
unterschiedlichen PCR-Versuchen gewährleistet. Die Reagentien für die PCR
wurden bei -20 °C in einem eigens für die real-time PCR vorgesehenen
Gefrierschrank (Liebherr Premium Gefriergerät, Liebherr GN 1856-20D001, Liebherr-
International Deuschland GmbH, D-88400 Biberach an der Riss) gelagert. Der
TaqMan ® universal PCR Master Mix wurde in LoBind Tubes 1,5 ml zu 500 µl
aliquotiert und im Kühlschrank (Profiline FKS 2600/200051; Liebherr-International
Deuschland GmbH) bei +6 °C gelagert.