Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Material und Methoden
Tabelle 27: Protokoll der PCR zur Überprüfung der analytischen Spezifität der IPC
DNA-template: Referenzstämme
Aufgereinigt mit: PureLink Hipure Plasmid Maxiprep Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
9 µl Primer- Mix
0,8 µl Exo IPC Mix 10x
0,2 µl Exo IPC DNA 50x
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: keine
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
3.2.15 Vergleichspräzision
Die Vegleichspräzision eines Tests ist die Präzision bei unterschiedlichen
Bedingungen. Um diese Bedingungen zu variieren, wurden die Untersuchungen zur
Feststellung der Vergleichspräzision von der Autorin und zwei Mitarbeiterinnen des
PCR-Labors der Außenstelle für Epidemiologie durchgeführt. Zunächst wurde 10 5 ,
10 4 , 10 3 , 10 2 , 10 1 und 10 0 GE von L. intracellularis pro µl Reaktionsmix mittels real-
time PCR absolut quantifiziert (Tab. 28). Jede Konzentrationsstufe wurde in drei
Wiederholungen untersucht.
Die Vergleichspräzision wurde auch anhand von Kotproben untersucht. Die
Kotproben wurden von Schweinen entnommen, die zur pathologisch-anatomischen
Untersuchung an die Außenstelle für Epidemiologie eingesendet wurden. Der Kot
wurde mit Einmalhandschuhen aus dem Enddarm entnommen und in
verschließbaren Bechern (Urin-Gefäße mit Schraubverschluss, 100 ml-Becher, Best.
Nummer: 75.563 und 76.564; Sarstedt AG & Co., D-51582 Nümbrecht) aufbewahrt.
Darüber hinaus wurden sieben der Kotproben verwendet, die auch in Teil 3.2 benutzt
wurden. Die Probenaufbereitung und die Vorbereitungen für die real-time PCR
wurden von den Mitarbeiterinnen der Molekularbiologie durchgeführt (Tab. 29).
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