Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Hydrolysesonde (TaqMan -Sonde)
Literaturübersicht
Das Prinzip der Hydrolysesonde beruht auf der 5´-3´-Exonucleaseaktivität der Taq-
Polymerase. Diese schneidet in einer nick-Translation während der Polymerisation
5´-terminale Nukleotide aus ds-DNA. Dadurch wird die hybridisierte Sonde degradiert
Die Hydrolysesonde ist am 5´-Ende mit einem Donorfarbstoff und am 3´-Ende mit
einem Akzeptor gelabelt. Die Moleküle befinden sich in räumlicher Nähe zueinander,
wenn die Sonde an der target-DNA hybridisiert vorliegt; es kommt zum quenching
der Fluoreszenz des Donors. Mit dem Abbau der Sonde durch die Taq-Polymerase
in der Phase der Amplifikation steigt die Fluoreszenz des Donors messbar an, da
Donor und Akzeptor räumlich voneinander getrennt werden. (HOLLAND et al. 1991,
LIVAK et al. 1995). Eine TaqMan -Sonde, deren Emission auf dem beschriebenen
Prinzip der Hydrolyse basiert, sollte so beschaffen sein, dass sie eine Länge von 20
bis 30 bp hat und dass die annealing-Temperatur der Sonde 5 °C bis 10 °C über
derjenigen der Primer liegt (LIE u. PETROPOULOS 1998). Die TaqMan -Sonde wird
bspw. in einer quantitativen real-time PCR zum Nachweis von Genomfragmenten
des porzinen Circovirus Typ 2 verwendet (OLVERA et al. 2004).
Hybridisierungssonde (FRET-Sonde, adjacent probe)
Diese Art der Sondentechnologie wurde ebenfalls 1988 erstmalig zur Detektion von
Nukleinsäuren beschrieben. Zwei kurze Oligonukleotide hybridisieren wenige bp
voneinander entfernt an der Zielsequenz. Die Sonden sind am 5´-Ende resp. am 3´-
Ende mit einem Donor resp. Akzeptor gelabelt und bringen so zwei Fluorochrome in
eine räumliche Nähe. Im Zustand der Hybridisierung wird die Fluoreszenz des
Donors unterdrückt und die Fluoreszenz des Akzeptors aktiviert (CARDULLO et al.
1988). Liegen beide Oligonukleotide getrennt voneinander in Lösung vor kommt es
nicht zum FRET (MARRAS 2008).
Molecular beacon
Die molecular beacons sind einsträngige DNA-Moleküle, die durch eigen-
komplementäre Sequenzen an ihren Enden eine Haarnadelstruktur ausbilden. Die
Sequenz der Schlaufe selbst ist wiederum komplementär zur Zielsequenz. An den
eigenkomplementären Enden befinden sich jeweils der Donor und der nicht-
fluoreszierende Akzeptor. Durch diese räumliche Nähe wird das Signal des Donors
gelöscht. In Anwesenheit spezifischer ss-DNA mit der Zielsequenz bindet die Sonde
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