Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Material und Methoden
3.2.12 Verdünnungsreihe und Standard
Die DNA-Konzentration des unter 3.2.11 hergestellten Eluates wurde
spektralphotometrisch bestimmt. Anhand der Größe und des Gewichtes eines
Plasmids konnte die Konzentration der Plasmide im Eluat nach folgenden Formeln
berechnet werden:
Länge des Vektors = 3931 bp
Länge des Inserts = 525 bp
Gewicht eines Plasmides:
5,535 x 10 -22 g/ Base x (Länge des Vektors + Insert) x 2
= 4,933 x 10 -18 g/ Plasmid
Anzahl der Plasmide pro ml:
DNA-Konzentration (g/ ml) / Gewicht pro Plasmid (g)
Mit dem Ziel, die Reinheit der Plasmid-Lösung zu überprüfen und größere Mengen
genomischer DNA von E. coli im Eluat auszuschließen, wurde eine PCR mit den E.
coli-spezifischen Primern MICF (5´-GATATTGCCAAATACCCGACC-3´) und MICR
(5´-CTTCCATACCAGCGGCAT-3´) (Metabion international AG) (NATHUES 2007)
durchgeführt. Diese Primer amplifizieren das ras-Gen von E. coli und wurden in
anderen PCR-Verfahren als interne Positivkontrolle verwendet (Tab. 24). Als positive
template-Kontrolle wurde eine Kotprobe aus der Routinediagnostik verwendet.
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