Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

3.2.2 Referenzmaterial
Material und Methoden
Der Stamm Lawsonia intracellularis MS B3903 wurde in lyophilisierter Form bezogen
(Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, D-55216 Ingelheim am Rhein). Das
Lyophilisat wurde in 100 ml Wasser für Injektionszwecke (Boehringer Ingelheim
Vetmedica GmbH) aufgelöst. Alle anderen Referenzstämme zur Überprüfung der
Spezifität von Primer und Sonde wurden der Stammsammlung der Außenstelle für
Epidemiologie (Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, D-49456 Bakum)
entnommen (Tab. 6). Die Stämme wurden im Cryobank-System (Mast Diagnostica,
Laboratoriums-Präparate GmbH, D-23858 Reinfeld) konserviert und in einem
Tiefkühlgefrierschrank (Sorvall ® Heraeus, HFU 486 Basic/40212802; Kendro
Laboratory Products GmbH, D-63450 Hanau) bei -70 °C gelagert.
Die kulturelle Anzucht der Stämme von Brachyspira spp. erfolgte auf Columbia
Blutagar (Heipha, Dr. Müller GmbH, D-69209 Eppelheim). Dazu wurden die
beimpften Platten in einem Anaerobiersystem (Anaerobiertopf (AnaeroJar, Art.-Nr.
AG0025A, Oxoid Deutschland GmbH, D-46483 Wesel) und Anaerocult ® A
(1.13829.0001, Merck KGaA, 64271 Darmstadt, Germany)) für 6 Tage bei 42 °C
bebrütet. Zur Ernte des Bakterienrasens wurde 2 ml Tris-EDTA Puffer
(Zusammensetzung s. Anhang) auf die Blutagarplatte gegeben und eine halbe
Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Bakterien durch leichtes
Abstreichen mit einer Einmalöse (Gammasterile Impfschlinge, 10 µl Schlinge, Best-
Nummer: 86.1562.010; Sarstedt AG & Co., D-51582 Nümbrecht) von der Agarplatte
gelöst und die Flüssigkeit mit einer Pipette (eppendorf Research variable, Eppendorf
AG, D-22331 Hamburg) in ein steriles DNAse- und RNAse-freies Eppendorf Cup 2.0
(Safe-Lock Tubes 2,0 ml, Eppendorf AG) überführt.
Haemophilus spp. und Actinobacillus pleuropneumoniae wurden auf Kochblutagar
(Heipha, Dr. Müller GmbH) aerob für zwei bis vier Tage bei 36 °C bebrütet. Die
Stämme von Clostridium perfringens wurden anaerob (Anaerocult ® A) im
Anaerobiertopf auf Columbia Blutagar für 1 Tag bei 45 °C bebrütet. Alle übrigen
Referenzstämme wurden auf Columbia Blutagar aerob für ein bis drei Tage bei 36 °C
bebrütet.
53