Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

4 Ergebnisse
4.1 Etablierung und Validierung
4.1.1 Primer- und Sondendesign
Ergebnisse
Der Vergleich der Primer- und Sondensequenzen mit Genomsequenzen anderer
Organismen als L. intracellularis ergaben für den forward-Primer Li-Ubi-F eine
maximale Übereinstimmung von 73 % mit der Sequenz von Prochlorococcus
marinus str. MIT 9312, Medicago truncatula und Carteria palmata. Das equality-(e)-
value betrug 5,2. Der reverse-Primer Li-Ubi-R besitzt eine 81 %ige Übereinstimmung
mit der Sequenz von Xenopus tropicalis und Nitrosomonas europaea ATCC 19718
mit einem e-value von 1,1. Die nächste höhere Übereinstimmung von 77 % der
Basen wurde für die Sequenz von Pan troglodytes BAC und Homo sapiens PAC mit
einem e-value von 4,2 errechnet. Die Sequenz der Sonde Li-Ubi-Probe ist zu 96 %
bzw. 67 % komplementär zu einer Sequenz von Oryza sativa mit einem e-value von
0,6 und zu 64 % und einem e-value von 2,4 komplementär zu den Sequenzen von
Pan troglodytes BAC, Mus musculus und Homo sapiens. Die e-values für alle
anderen bekannten Sequenzen waren deutlich größer als 5,0. Eine 100 %ige
Übereinstimmung der Primer- und Sondensequenzen wurde für Lawsonia
intracellularis PHE/MN1-00 mit einem e-value von 0,004 angegeben.
4.1.2 Optimierung der Primer-Konzentrationen
Die erste Amplifikation spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis mit
unterschiedlichen Konzentrationen der Primer wurde mittels Gelelektrophorese
ausgewertet. Eine ausreichende Konzentration von Primern wurde zunächst anhand
einer visuellen Beurteilung der Menge synthetisierter PCR-Produkte vorgenommen.
Die mit SYBR ® Green durchgeführten real-time PCRs zeigten beiden Versuchen die
gleichen Ergebnisse (Abb. 2). Maximale ∆Rn-Werte und Ct-Werte der
Amplifikationskurven wurden bei Konzentrationen von 300 nM resp. 900 nM erzielt.
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