Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

3.2.10 Sequenzierung
Material und Methoden
Die Spezifität der PCR-Produkte, die durch Amplifikation von DNA mit den Primern
Li-Ubi-F und Li-Ubi-R entstanden sind, wurde durch Sequenzierungen überprüft.
Dazu wurden 10 L. intracellularis-positive Kotproben nach dem einfachen
Zufallsverfahren aus solchen Proben ausgewählt, die zur Routinediagnostik an das
Labor der Außenstelle für Epidemiologie gesendet wurden. Die Proben waren in
einem Gefrierraum bei -20 °C asserviert und zuvor b ereits mittels multiplex-PCR
(NATHUES 2007) zum Nachweis spezifischer Genomfragmente von L. intracellularis
charakterisiert worden. Der korrekte Nachweis spezifischer Genomfragmente von L.
intracellularis wurde zunächst mit der real-time PCR im Einfachansatz überprüft (Tab.
19). Im Anschluss wurde die DNA aller 10 Proben erneut, jedoch ohne Sonde
amplifiziert (Tab. 20). Die PCR-Produkte wurden mit dem QIAquick ® PCR Purification
Kit (Cat. No. 28104, Lot No. 127143513, Qiagen GmbH) aufgereinigt und die Menge
von DNA spektralphotometrisch (Spektralphotometer LS 500, Dr. Lange GmbH, D-
80687 München) bestimmt. Die Sequenzen wurden nach einem single read mit der
Methode nach Sanger (SANGER et al. 1992) und dem Primer Li-Ubi-F durch die
Firma Qiagen GmbH (Qiagen Genomic Services) analysiert und elektronisch
übermittelt. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit Hilfe der Software Chromas
Version 2.31 (Technelysium Pty Ltd). Alle Sequenzen wurden im BLAST 2
SEQUENCES (http://blast.ncbi.nim.nih.gov/bl2seq/wblast2.cgi) auf ihre
Übereinstimmung mit der Sequenz des Genoms von L. intracellularis überprüft.
70