Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Nichtspezifische Detektionssysteme
Literaturübersicht
Erste Versuche zur Echtzeit-Visualisierung der Amplifikation wurden mit
Ethidiumbromid durchgeführt. Dieser Farbstoff interkaliert in ds-DNA und bewirkt so
einen starken Anstieg seiner Fluoreszenz. Im Verlauf der PCR steigt diese
Fluoreszenz durch die Akkumulation doppelsträngiger PCR-Produkte weiter an. Die
Bildung von ebenfalls doppelsträngigen Primer-Dimeren wird in dieser Art der PCR
als problematisch angesehen, da auch diese einen Anstieg der Fluoreszenz
bewirken und somit zu falsch positiven Ergebnissen führen können. Eine große
Menge genomischer DNA in der Ausgangsmatrix kann zu einer störenden
Hintergrundfluoreszenz führen (HIGUCHI et al. 1993, HIGUCHI et al. 1992). Heute
werden zunehmend interkalierende Cyaninfarbstoffe, wie bspw. das SYBR Green I,
eingesetzt (KUBISTA et al. 2006). Dieses bindet an ds-DNA mit hoher Affinität, in
dem es sich in der kleinen Furche der Doppelhelix anlagert. In hohen
Farbstoffkonzentrationen kann eine deutliche Affinität zu A/T-reichen Sequenzen
festgestellt werden (ZIPPER et al. 2004). Vergleicht man die Fluoreszenz von
Cyaninfarbstoffen in Lösung mit und ohne ds-DNA, ist sie in Anwesenheit von DNA
etwa 1000fach höher. Diese Erhöhung beruht auf der planaren Fixierung des
Moleküls durch die Basen des DNA-Stranges (NYGREN et al. 1998).
Die Farbstoffe der nichtspezifischen Detektionssysteme interkalieren grundsätzlich in
jede ds-DNA. Aus diesem Grund können spezifische PCR-Produkte nicht anhand der
Fluoreszenz identifiziert werden und Primer-Dimere sowie unerwünschte PCR-
Produkte bleiben unerkannt. Eine Schmelzkurvenanalyse ermöglicht Amplifikate
nach Länge, Sequenz und G/C resp. A/T-Verhältnis zu differenzieren. Dabei wird die
Fluoreszenz gegen die Temperatur aufgetragen und anschließend die 1. Ableitung
dieser Funktion betrachtet. Wird die jeweilige Schmelztemperatur eines Amplifikates
erreicht, denaturiert dieses in ss-DNA und der Farbstoff löst sich von der DNA.
Dadurch kommt es zu einem starken Abfall der Fluoreszenz. Mit dieser Methode
können Amplifikationsprodukte differenziert werden, deren Schmelztemperaturen
sich um weniger als 2 °C unterscheiden (RIRIE et al. 1997).
Interkalierende Farbstoffe bieten die Vorteile, dass sie (a) unkompliziert in
verschiedenen Protokollen eingesetzt werden können, (b) eine einfache Etablierung
von Primern in neuen Protokollen ermöglichen und (c) niedrigere Kosten im
Vergleich zu Hybridisierungssonden verursachen (BUSTIN u. NOLAN 2004).
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