Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Literaturübersicht
synthetisierten DNA-Stränge zu vervollständigen. Diese Phase sollte etwa fünf bis 10
Minuten dauern (BANGSOW et al. 2007).
Theoretisch kommt es nach jedem Zyklus zu einer Verdopplung der Ziel-DNA.
Dieses ist jedoch nur zu Beginn einer PCR der Fall. Mit zunehmender Zykluszahl
erfolgt die Vermehrung von DNA-Strängen nicht mehr exponentiell zur Basis 2
sondern linear, bis sie in eine Plateauphase übergeht; dann werden nur noch wenig
neue PCR-Produkte gebildet (LORKOWSKI u. THIEMANN 2006). Für diese Kinetik
sind mehrere Faktoren ursächlich. Der wichtigste Faktor ist die Anreicherung von
PCR-Produkten. Durch die unspezifische Bindung der DNA-Polymerase an die
bereits synthetisierte doppelsträngige DNA wird die weitere Amplifikation gehemmt
(KAINZ 2000). Zusätzlich wird durch diese Anreicherung ein reannealing der
komplementären PCR-Produkte wahrscheinlicher als ein annealing der Primer an die
Matrize (ARNHEIM u. ERLICH 1992). Im Verlauf der PCR werden außerdem Primer
und dNTP´s verbraucht. Durch das zyklische Erwärmen und Abkühlen kommt es zur
Schädigung der Polymerase. Während der PCR können auch Verbindungen
entstehen, die inhibitorische Eigenschaften besitzen. Mit dem Einbau der
Desoxyribonukleotide kommt es zur Freisetzung von Pyrophosphaten, die einen
negativen Einfluss auf die Reaktionskinetik haben (LORKOWSKI u. THIEMANN
2006).
Die Detektion von PCR-Produkten kann mittels Gelelektrophorese erfolgen. Die
Amplifikate werden zusammen mit einem Längenstandard auf ein Agarosegel
aufgetragen und im elektrischen Feld unter einer Gleichspannung von ca. einem Volt
pro Zentimeter Länge des Gels der Größe nach aufgetrennt. Anschließend werden
die DNA-Fragmente mit einem unspezifisch in doppelsträngige (ds)-DNA inter-
kalierenden Farbstoff, bspw. Ethidiumbromid, gefärbt und abschließend mittels
ultraviolettem (UV-) Licht sichtbar gemacht. Diese Technik erlaubt die visuelle
Detektion von etwa 1 ng DNA (TIEMANN 2006, HIGUCHI et al. 1992). Weitere
Verfahren zur Visualisierung von PCR-Produkten beruhen auf dem Prinzip des
ELISA oder auf der reversen Hybridisierung (TIEMANN 2006, KEMP et al. 1989).
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