Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Material und Methoden
Tabelle 24: Protokoll der PCR zur Amplifikation E. coli-spezifischer DNA-Abschnitte
DNA-template: Transformierte E. coli
Kotprobe
Aufgereinigt mit: PureLink Hipure Plasmid Maxiprep Kit
Reaktionsmix:
QIAamp ® DNA Stool Mini Kit
12,5 µl Multiplex PCR Master-Mix 2x (Qiagen GmbH)
2,5 µl Primer MICF (50 pmol/ µl)
2,5 µl Primer MICR (50 pmol/ µl)
4,5 µl Wasser
3 µl template-DNA
PCR-Gerät: Thermocycler
Reaktionsbedingungen:
Ergebnisauswertung:
Zyklen
30
77
first
denaturation
Temperatur
(°C)
Zeit (s)
95 900
denaturation 94 30
annealing 60 90
extension 72 120
final
extension
72 600
Gelelektrophorese (1,3 %ige Macro-Agarose-Gel;
Laufzeit 2,5 h)
Nach Feststellung der exakten Konzentration von Plasmiden in der Lösung, die der
Konzentration spezifischer Genomäquivalente (GE) der Zielsequenz entspricht,
wurde eine logarithmische Verdünnungsreihe hergestellt. Die Lösungen enthielten
zwischen 10 9 und 0,01 GE / µl. Je 2,5 µl dieser Verdünnungsstufen wurden
anschließend in Triplices mittels real-time PCR einer absoluten Quantifizierung
unterzogen. Der Versuch wurde dreimal wiederholt (Tab. 25).