Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Zusammenfassung
auch zur Erstellung der Standardkurve verwendet. Die Steigung dieser
Standardkurve resp. -gerade beträgt –3,329, was einer Effizienz der real-time PCR
von 99,7 % entspricht. Der Kalibrationsbereich umfasst Konzentrationsstufen von 10 0
bis 10 7 GE / µl Reaktionseinheit. Die untere Nachweisgrenze der real-time PCR
beträgt 1 GE im Reaktionsvolumen; die obere Nachweisgrenze ist 10 8 GE / µl
Reaktionsvolumen. Eine absolute Quantifizierung ist im Bereich von 10 1 bis 10 7 GE /
µl Reaktionsvolumen möglich. Die Präzision wurde in Wiederhol- und in
Vergleichsuntersuchungen bestimmt und konnte für alle Konzentrationsstufen im
Kalibrationsbereich bestätigt werden (relative Standardabweichung ≤ 15 % resp. ≤
20 %, Grenzwert 30%).
Die Erkennung einer möglichen Inhibition der PCR Reaktion wird durch eine interne
Positivkontrolle gewährleistet. Ein möglicher Einfluss der Amplifikation dieser
Kontrolle auf die Quantifizierung wurde geprüft und ausgeschlossen. Die
Probenaufbereitung und Isolierung von DNA mit dem QIAamp ® DNA Stool Mini Kit
sind demnach geeignet, Inhibitoren sicher aus der Probenmatrix zu entfernen. Die
Wiederfindungsrate für target-DNA von L. intracellularis in Kotproben betrug
zwischen 1,8 % und 3,5 %. In einer vergleichenden Untersuchung an 300 Kotproben,
die zuvor mittels multiplex-PCR zum Nachweis spezifischer Genomfragmente von L.
intracellularis charakterisiert wurden, konnte die Nachweisrate von 50 % auf 81,7 %
erhöht werden. Aus diesen Ergebnissen wird abgeleitet, dass die real-time PCR
deutlich sensitiver als die multiplex-PCR ist. Der Test zeichnet sich durch eine hohe
Robustheit aus und ist für die Routinediagnostik geeignet.
Die Verteilung von L. intracellularis in Kotproben ist ausreichend homogen, wenn die
Probe unmittelbar vor der Untersuchung manuell durchmischt wird. Die Zugabe von
Flüssigkeit zum Probenmaterial, um dessen Viskosität herabzusetzen und so eine
bessere Verteilung zu erreichen, hatte lediglich einen Verdünnungseffekt bei
gleichbleibender Homogenität zur Folge.
Der Einfluss einer Lagerung von Proben auf den Gehalt spezifischer
Genomfragmente von L. intracellularis wurde für verschiedene Temperaturen (6 °C, -
20 °C und -70 °C) und unterschiedliche Lagerdauer ü berprüft. Der Gehalt von L.
intracellularis war unabhängig von der Temperatur bis zum Ende der Untersuchung
(Tag 132) konstant.
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