Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Material und Methoden
Es wurde jeweils so viele Bakterienkolonien durch leichtes Abstreichen mit einer
Einmalöse in 2,0 ml Tris-EDTA Puffer aufgenommen, dass die Suspension eine
optische Dichte von 2,0 McFarland aufwies. Von diesen Suspensionen und den
Suspensionen der Stämme von Brachyspira wurde DNA für die weitere
Untersuchung verwendet. Zur Isolierung genomischer DNA von L. intracellularis
wurden 2 ml der Lösung mit dem Referenzstamm in ein Eppendorf Cup 2.0 (EC 2.0)
abgefüllt und für 6 Minuten bei 20000g zentrifugiert (Centrifuge 5424, no.: 0008452,
Eppendorf AG). Vom entstandenen Bakterienpellet wurde die DNA isoliert.
3.2.3 DNA-Isolierung
Die DNA von Referenzstämmen wurde mit dem Extraktionskit NucleoSpin ® Tissue
Kit (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, D-52355 Düren) gemäß Herstellerangaben
durchgeführt. Im letzten Schritt des Protokolls wurden 100 µl BE-Puffer zur Elution
der DNA von der Silicia-Membran eingesetzt. Das Eluat wurde anschließend im
Tiefkühlgefrierschrank bei -70 °C gelagert. Die DNA -Isolierung von L. intracellularis
wurde mit dem DNeasy ® Blood & Tissue Kit (Qiagen GmbH, D-40724 Hilden) nach
Herstellerangaben für die Isolierung von Bakterienstämmen durchgeführt.
Die zur Etablierung und Validierung notwendigen Kotproben L. intracellularis
infizierter und nicht infizierter Schweine wurden solchen Tieren aus dem Enddarm
entnommen, die zur Sektion an die Außenstelle für Epidemiologie eingesandt wurden.
Die Kotproben wurden zum Teil vor Beginn der weiterführenden Untersuchung über
unterschiedlich lange Zeiträume im Gefrierraum (Freon 22 M25/351/Kuba S6BE 71,
Bitzer Kühlmaschinenbau GmbH, D-71065 Sindelfingen) bei -20 °C gelagert. Der
andere Teil der Kotproben wurde direkt nach der Entnahme untersucht. Von jeder
Kotprobe wurden 200 mg mit dem QIAamp ® DNA Stool Mini Kit (Cat. No. 51504, Lot.
No. 130162215, Qiagen GmbH) aufgereinigt. Dabei wurde folgendes Protokoll
verwendet: Die Kotprobe wurde in einem EC 2.0 mit 1,4 ml ASL-Puffer gemischt und
unmittelbar folgend für mindestens eine Minute auf einem Vortex (Carl Stuart Ltd.,
Dublin, Irland) geschüttelt. Die Suspension wurde für fünf Minuten bei 70 °C inkubiert
(Thermomixer comfort, Modell 5355/34430; Eppendorf AG), anschließend kurz auf
dem Vortex geschüttelt und dann für eine Minute bei 20000 g zentrifugiert. Der
flüssige Überstand wurde in ein neues EC 2.0 dekantiert, in das bereits eine
InhibitEx-Tablette vorgelegt worden war. Im Anschluss wurde die Probe so lange auf
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