Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Material und Methoden
Tabelle 23: Protokoll der PCR zur Kontrolle der Transformation
DNA-template: Transformierte E. coli, Plasmide
Aufgereinigt mit: QIAprep ® Spin Miniprep Kit
Reaktionsmix:
12,5 µl TaqMan ® universal PCR Master Mix 2x
10 µl Primer- Mix
2,5 µl template-DNA
PCR-Gerät: 7500 Real-Time PCR System
PCR-Protokoll: s. Tabelle 7
Modifikationen: Zyklen: 40 statt 45
Ergebnisauswertung: Wellenlänge ~ 520 nm für FAM
Anhand der Ct-Werte (möglichst gering) und der Trübung der Flüssigmedien
(möglichst stark getrübt) wurde ein Klon für die Herstellung der Standards selektiert.
Von dieser Probe wurde 1 ml des LB-Mediums in 200 ml LB-Flüssigmedium
überführt und über Nacht bei 37 °C auf einem Schütt ler im Brutschrank inkubiert.
Nach 12 Stunden wurde die Plasmid-DNA dieser Bakterienkultur mit dem PureLink
Hipure Plasmid Maxiprep Kit (Lot: 4681, Invitrogen) entsprechend den Vorgaben des
Herstellers isoliert und aufgereinigt.
Das Eluat wurde in ein Falcon ® (BLUE MAX, 352070; Becton Dickinson Labware,
NJ. USA 07417-1886) aufgenommen und bis zur weiteren Verwendung im
Tiefkühlgefrierschrank bei -70 °C tiefgefroren.
Ein Teil der transformierten E. coli wurden kryokonserviert. Dazu wurden je 200 µl
des LB-Mediums mit 1,0 ml Glycerol gemischt und im Tiefkühlgefrierschrank bei
-70 °C eingefroren.
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