Quantitativer Nachweis von Lawsonia intracellularis mittels real-time ...

Material und Methoden
Die Proben wurden anschließend mittels multiplex-PCR (NATHUES 2007) auf
spezifische Genomfragmente von L. intracellularis untersucht. Alle DNA-Extrakte
wurden nach der Untersuchung in einem Gefrierraum bei -20 °C gelagert.
3.2.4 PCR-Systeme und Ergebnisauswertung
Für die Untersuchungen standen zwei PCR-Systeme zur Verfügung:
1. Ein real-time PCR System (Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System,
Applied Biosystems). Dieses Gerät besitzt oberhalb des Thermoblocks ein Filterrad
mit fünf Farbfiltern und ermöglicht so eine spezifische Detektion von Lichtemissionen
in den Wellenlängen von 520, 550, 580, 610 und 670 nm über eine integrierte
charge-coupled-device technology (CCD)-Kamera. Das System wurde mittels der
Sequence Detection Software Version 1.4, 7500 System SDS Software (Applied
Biosystems) von einem externen Computer gesteuert. Die Software ist gemäß den
Forderungen der US Food and Drug Administration nach Title 21 CFR Part 11
zertifiziert. Vor Beginn der Untersuchungen und während der Studie wurden am
System verschiedene Maßnahmen zur Qualitätssicherung durchgeführt. Diese
beinhalteten die Kalibration der regions of interest (ROI) und des backgrounds. Die
ROI Kalibration hat zum Ziel, die Positionen der wells auf dem Thermoblock mit dem
optischen Sensor exakt zu orten. In dem System muss zur Messung der Fluoreszenz
während einer PCR die Position der Probe und der Abstand zwischen Probe und
Sensor gerätespezifisch festgestellt werden. Diese Kalibration wurde alle sechs
Monate durchgeführt. Die background-Kalibration dient der Erkennung und
Quantifizierung einer möglichen Hintergrundfluoreszenz im real-time PCR Gerät.
Diese Hintergrundfluoreszenz kann durch Kontamination, Verschmutzung und/oder
die verwendete Plastikware entstehen. Einmal ermittelte Werte für die
Hintergrundfluoreszenz werden für jedes well des Thermoblocks während einer PCR
von der gemessenen Fluoreszenz abgezogen. Diese Kalibration wurde monatlich
durchgeführt.
2. Ein Thermocycler mit Gradientenfunktion (Mastercycler ® EP gradient S, Eppendorf
AG). In diesem System wird ein 96 well block von drei einzelnd gesteuerten
Pelltierelementen temperiert, sodass während der PCR mit einem
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